苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 89-104 苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 項 千 芸 a 侯 庭 鏞 b 陳 兆 群 c 羅 欣 宜 b 吳 世 祿 a 陳 清 助 d a 中 國 醫 藥 大 學 醫 學 系 b 中 國 醫 藥 大 學 中 醫 所 c 中 國 醫 藥 大 學 中 藥 所 d 中 國 醫 藥 大 學 附 設 醫 院 新 陳 代 謝 科 摘 要 苦 瓜 (Momordica charantia L.) 為 中 草 藥, 亦 是 民 眾 日 常 食 用 之 蔬 果 在 現 代 生 物 性 療 效 方 面, 苦 瓜 具 有 治 療 糖 尿 病 及 其 相 關 併 發 症 ( 神 經 系 統 的 損 傷 白 內 障 ) 的 功 效, 也 具 有 抗 菌 抗 病 毒 抗 腫 瘤 節 育 抗 胃 潰 瘍 抗 瘧 治 療 亁 癬 抗 發 炎 和 抗 氧 化 等 活 性, 其 中 以 苦 瓜 萃 取 物 調 整 血 糖 或 應 用 在 治 療 糖 尿 病 及 其 併 發 症 方 面 最 為 顯 著, 但 其 活 性 成 分, 尤 其 是 活 性 蛋 白 質 與 相 關 作 用 機 轉 尚 未 完 全 釐 清 目 前 我 們 已 完 成 苦 瓜 不 同 品 種 萃 取 製 程 蛋 白 萃 取 液 調 整 血 糖 之 最 適 化 研 究, 證 實 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 具 有 調 整 血 糖 功 效, 也 利 用 區 隔 性 分 離 方 式, 驗 證 調 整 血 糖 之 最 佳 分 子 量 區 間 苦 瓜 蛋 白 及 可 能 之 活 性 物 質 進 一 步 應 用 蛋 白 質 體 學 技 術 分 析 具 調 整 血 糖 功 能 苦 瓜 萃 取 液 蛋 白 質 之 組 成 成 分, 並 探 究 苦 瓜 萃 取 液 調 整 血 糖 機 轉, 以 完 成 化 學 組 成 固 定 生 物 反 應 明 確 無 生 物 安 全 性 顧 慮 之 苦 瓜 調 整 血 糖 保 健 產 品 之 開 發 由 本 研 究 的 執 行, 預 期 可 確 定 苦 瓜 調 整 血 糖 的 功 效, 進 一 步 分 析 其 有 效 機 轉 及 組 成 份, 未 來 應 可 發 展 為 治 療 或 輔 助 糖 尿 病 治 療 的 中 草 藥 保 健 食 品, 甚 至 是 導 引 糖 尿 病 之 新 藥 開 發 關 鍵 詞 : 苦 瓜, 調 整 血 糖, 保 健 產 品, 蛋 白 質 體 學
90 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 前 言 開 發 具 調 整 血 糖 活 性 之 中 醫 藥 新 藥 的 系 列 產 品, 建 立 跨 國 性 具 產 業 應 用 性 之 智 慧 財 產, 是 輔 助 生 技 產 業 開 發 之 重 要 項 目 調 整 血 糖 製 劑 在 市 場 規 模 與 範 圍 之 預 估 方 面, 根 據 WHO 的 相 關 統 計 顯 示, 糖 尿 病 病 患 的 人 口 總 數 一 直 呈 現 驚 人 的 成 長, 從 1985 年 的 3 千 萬 人 1995 年 的 1 億 3 千 5 百 萬 人, 到 今 日 全 球 糖 尿 患 者 總 數 已 超 過 1 億 7 千 7 百 萬 人, 而 WHO 更 進 ㄧ 步 指 出, 到 2030 年 時, 全 球 罹 患 糖 尿 病 的 總 人 口 將 爆 破 3 億 3 千 6 百 萬 人 此 外, 糖 尿 病 相 關 疾 病 所 造 成 的 死 亡 人 數, 已 佔 全 球 每 年 死 亡 總 人 數 的 5% 左 右, 而 且 WHO 警 告 若 各 國 再 不 積 極 的 預 防 及 治 療 糖 尿 病 及 其 相 關 疾 病, 未 來 10 年 可 預 期 因 糖 尿 病 相 關 疾 病 所 造 成 死 亡 的 總 人 數 將 再 激 增 一 倍 (http://www.who.int/diabetes/en/) 在 與 糖 尿 病 直 接 相 關 的 醫 療 費 用 統 計 方 面, 糖 尿 病 的 每 年 醫 療 費 用 幾 乎 佔 各 國 健 康 衛 生 相 關 預 算 總 額 的 2.5% 到 15% 反 觀 國 內 健 保 用 在 糖 尿 病 的 醫 療 費 用 方 面,90 年 時 約 271 億 元,91 年 健 保 糖 尿 病 人 醫 療 費 用 約 317 億 元, 年 增 率 約 17%, 所 以 糖 尿 病 在 國 內 亦 是 影 響 健 保 支 出 的 重 要 因 素 如 果 開 發 具 調 整 血 糖 活 性 之 中 醫 藥 新 藥 的 系 列 產 品, 一 方 面 可 提 高 台 灣 中 醫 之 能 見 度, 另 一 方 面 可 以 降 低 健 保 的 負 擔 而 且 台 灣 目 前 市 售 調 整 血 糖 的 保 健 產 品, 多 為 未 經 醫 師 處 方 的 中 草 藥 相 關 產 品 民 間 偏 方 或 傳 銷 商 品, 其 產 品 多 未 經 研 究 證 實 其 療 效, 在 製 程 上 是 否 經 有 GMP 認 可 亦 不 清 楚, 民 眾 服 用 後 其 效 果 堪 慮, 若 有 進 ㄧ 步 問 題 發 生, 又 多 增 健 保 醫 療 費 用 等 社 會 成 本 的 支 出 所 以 如 能 開 發 出 療 效 明 確 的 具 調 整 血 糖 活 性 之 中 醫 藥 新 藥 的 序 列 產 品, 應 能 降 低 相 關 事 件 的 發 生, 亦 能 增 進 國 民 的 健 康 糖 尿 病 是 重 要 的 慢 性 病 之 一, 主 要 可 分 為 胰 島 素 依 賴 型 與 非 胰 島 素 依 賴 型 糖 尿 病 胰 島 素 依 賴 型 的 糖 尿 病 病 人, 其 胰 臟 無 法 生 產 胰 島 素, 又 稱 做 第 一 型 糖 尿 病 非 胰 島 素 依 賴 型 糖 尿 病 病 人 則 是 胰 島 素 分 泌 不 足 或 對 胰 島 素 產 生 耐 受 性 所 導 致, 又 稱 做 第 二 型 糖 尿 病 無 論 第 一 型 糖 尿 病 或 第 二 型 糖 尿 病, 人 體 皆 會 有 高 血 糖 的 病 徵, 或 是 長 時 間 處 於 高 血 糖 的 體 液 環 境 中, 體 內 滲 透 壓 過 高, 容 易 造 成 人 體 神 經 系 統 的 持 續 傷 害, 以 及 讓 整 個 血 液 循 環 系 統 壓 力 變 大, 導 致 日 後 神 經 與 血 管 的 病 變 產 生 然 而, 對 於 糖 尿 病 致 病 機 轉 的 研 究 中, 也 發 現 有 許 多 訊 息 傳 遞 路 徑 與 葡 萄 糖 的 代 謝 相 關, 例 如, 葡 萄 糖 的 代 謝 特 定 器 官 對 葡 萄 糖 的 攝 取 路 徑 等 近 年, 除 了 從 insulin receptor 或 是 glucose transporters 的 研 究 方 向 去 研 究 糖 尿 病 的 治 療 外, 目
苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 91 前 認 為 轉 錄 因 子 peroxisome proliferator-activated receptors(ppar) 是 治 療 的 新 標 的 物 (Rosenson, 2007), 此 外 已 有 文 獻 報 告 指 出 一 些 自 然 界 作 物 在 治 療 或 改 善 糖 尿 病 的 主 題 中 慢 慢 嶄 露 頭 角 (Iwashima et al., 2001; Storling et al., 2005; Zhao et al., 2005a), 這 些 觀 念 也 逐 漸 被 用 來 作 為 治 療 糖 尿 病 體 內 試 驗 的 重 要 發 展 方 向 因 此 由 insulin receptor, 到 PPAR 相 關 基 因 及 glucose transporters, 已 成 為 糖 尿 病 及 其 藥 物 研 發 一 主 要 路 徑 由 上 述 觀 點 轉 換 成 研 究 平 台, 在 體 外 試 驗 部 份, 對 於 胰 島 素 耐 受 性 所 導 致 脂 肪 傷 害 的 研 究 中, 以 細 胞 株 murine 3T3-L1 cells(karalee et al., 2001) 與 GLUT4(Maddux et al., 2001) 做 為 glucose uptake 機 轉 探 究 的 基 礎 脂 肪 組 織 過 多 的 形 成 堆 積, 與 肥 胖 第 二 型 糖 尿 病 有 著 密 切 關 係, 且 會 進 一 步 導 致 脂 肪 中 毒 產 生 造 成 細 胞 傷 害, 使 細 胞 內 脂 肪 細 胞 對 胰 島 素 產 生 耐 受 性 (Lelliott and Vidal-Puig, 2004) 若 細 胞 對 胰 島 素 產 生 耐 受 性, 則 會 於 脂 肪 細 胞 以 及 平 滑 肌 中 形 成 高 血 糖 的 狀 態 ; 然 而, 由 不 同 部 位 產 生 之 脂 肪 細 胞 被 傷 害 後, 也 會 產 生 不 同 的 生 理 或 病 理 的 機 制 反 應 在 體 內 動 物 實 驗 部 份, 囓 齒 類 動 物 是 最 佳 的 實 驗 動 物 種 類, 也 有 學 者 將 老 鼠 的 基 因 做 修 飾 後, 成 為 knockout 的 小 鼠 或 是 基 因 轉 殖 鼠, 藉 此 進 一 步 研 究 對 糖 尿 病 的 影 響 機 轉 (Rees and Alcolado, 2005; Masiello, 2006) 糖 尿 病 的 誘 因 可 以 藉 由 藥 物 的 不 當 使 用 意 外 傷 害 或 是 基 因 遺 傳 層 面 上, 導 致 不 同 動 物 糖 尿 病 的 發 生 在 1996 到 2006 年 之 間, 許 多 民 族 重 要 天 然 物 治 療 糖 尿 病 的 研 究 文 獻 投 稿 於 Journal of Ethnopharmacology 中, 多 利 用 此 實 驗 模 式, 其 中,Streptozotocin(STZ) 以 及 alloxan 誘 發 糖 尿 病 動 物 模 式 居 多, 各 有 69% 與 31% 的 出 現 率, 其 會 誘 發 高 血 糖 產 生, 但 與 人 糖 尿 病 病 程 差 異 度 較 大 至 於 knockout 的 小 鼠 或 是 基 因 轉 殖 鼠 中, 以 ob/ob mouse 最 廣 為 被 使 用 Ob/Ob mouse, 其 血 糖 值 能 夠 維 持 在 euglycemia (80-110 mg/dl ) 以 及 持 續 補 償 對 胰 臟 ß-cell 反 應 的 狀 態, 保 持 在 高 胰 島 素 血 症 的 情 況 下 與 胰 島 素 耐 受 性 相 抗 衡 著 Ob/Ob mouse 模 式 中, 胰 島 素 的 耐 受 性 大 多 是 由 於 過 度 肥 胖 高 血 脂 以 及 高 血 糖 所 引 起, 上 述 這 些 症 狀 也 同 時 能 夠 在 第 二 型 糖 尿 病 病 人 中 被 發 現 傳 統 對 於 糖 尿 病 的 治 療, 現 代 藥 物 的 使 用 率 較 中 草 藥 來 的 廣 泛, 也 因 為 不 同 的 現 代 藥 物 在 使 用 上 有 藥 物 副 作 用 的 堪 慮,Li et al.(2004) 多 次 評 論 在 臨 床 上 常 用 來 治 療 糖 尿 病 的 傳 統 中 草 藥 處 方, 或 者 是 治 療 由 糖 尿 病 所 引 起 的 其 他 併 發 症 等, 發 現 中 草 藥 在 對 於 糖 尿 病 及 其 相 關 的 預 防 治 療 上 有
92 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 加 重 的 趨 勢 因 此, 我 們 將 這 些 在 文 獻 中 已 有 使 用 的 中 草 藥 重 新 統 整, 其 中 也 有 已 找 到 其 生 物 活 性 成 分 的 天 然 化 合 物 (Chen, 1987; Wu and Li, 1992; Gu and Jiang, 1997; Yin and Chen, 2000), 這 些 具 備 活 性 成 分 的 構 造 包 含 polysaccharides terpenoids flavonoids sterols alkaloids 及 其 他 等 上 述 已 發 表 的 天 然 化 合 物 中, 由 於 polypeptides 類 成 分 的 研 究 甚 少, 及 由 insulin receptor, 到 PPAR 相 關 基 因 及 glucose transporters 之 糖 尿 病 藥 物 研 發 路 徑 判 讀,polypeptides 類 成 分 較 有 可 能 在 上 游 產 生 效 果 因 此 研 究 調 節 血 糖 相 關 polypeptides, 應 較 具 有 新 穎 性 與 可 專 利 性, 未 來 進 一 步 希 望 發 展 成 新 藥 開 發 的 新 標 的, 以 及 用 在 臨 床 上 治 療 糖 尿 病 的 新 契 機 苦 瓜 是 葫 蘆 科 Momordica charantia L. 的 果 實, 廣 泛 分 布 於 亞 洲 亞 馬 遜 河 流 域 東 非 等 地, 因 此 許 多 民 族 經 常 把 苦 瓜 列 入 傳 統 藥 物 之 一, 用 於 治 療 及 預 防 一 些 慢 性 疾 病, 如 糖 尿 病 經 痛 痛 風 濕 疹 節 育 墮 胎 腎 結 石 肺 炎 亁 癬 等 方 面 在 台 灣, 苦 瓜 同 時 也 是 一 般 民 眾 經 常 食 用 的 蔬 果 之 一, 而 在 中 醫 藥 重 要 的 典 籍 中 亦 有 記 載, 如 本 草 綱 目 中 認 為 苦 瓜 有 苦 寒 無 毒 除 邪 熱 解 勞 乏 清 心 明 目 " 等 功 效 在 現 代 生 物 性 療 效 方 面, 苦 瓜 也 有 近 百 篇 的 相 關 文 獻, 其 中 主 要 有 針 對 幾 個 方 向, 如 治 療 糖 尿 病 及 其 相 關 的 併 發 症 ( 神 經 系 統 的 損 傷 白 內 障 ) 抗 菌 抗 病 毒 (HIV HSV) 抗 腫 瘤 節 育 抗 胃 潰 瘍 抗 瘧 治 療 亁 癬 抗 發 炎 和 抗 氧 化 等 活 性 (Grover and Yadav, 2004), 而 其 中 以 苦 瓜 萃 取 物 調 整 血 糖 或 應 用 在 糖 尿 病 及 其 併 發 症 最 為 顯 著, 但 這 些 研 究 多 偏 重 在 動 物 實 驗, 少 有 苦 瓜 調 整 血 糖 之 相 關 機 制 及 其 功 能 性 成 分 之 研 究 目 前 有 關 苦 瓜 在 糖 尿 病 方 面 的 研 究 有 降 低 正 常 動 物 血 糖 (Bailey et al., 1985; Day et al., 1990; Shibib et al., 1993; Ali et al., 1993; Cakici et al., 1994; Sarkar et al., 1996; Jayasooriya et al., 2000) 抗 alloxan 及 streptozotocin 所 誘 發 的 高 血 糖 (Akhtar, 1982; Karunanayake et al., 1984; Singh et al., 1989; Pari et al., 2001; Rathi et al., 2002a; Kar et al., 2003; Kedar and Chakrabarti, 1982; Bailey et al., 1985;Day et al., 1990; Karunanayake et al., 1990; Higashino et al., 1992; Shibib et al., 1993; Sarkar et al., 1996; Ahmed et al., 1998; Ahmed et al., 2001; Sitasawad et al., 2000; Grover et al., 2002; Rathi et al., 2002) 增 加 胰 臟 功 能 而 達 到 降 血 糖 的 作 用 (Day et al., 1990; Sarkar et al., 1996) 增 加 beta cells 的 數 目 (Ahmed et al., 1998) 促 進 胰 島 素 分 泌 及 胰 島 素 樣 作 用 (Welihinda et al.,1986; Higashino et al., 1992) 抑 制 糖 尿 病 大 鼠 肝 中
苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 93 hexokinase, glucokinase, phosphofructokinase 及 受 質 glucose-6-phosphate 的 活 性 (Rathi et al., 2002) 等 而 根 據 相 關 研 究 指 出, 苦 瓜 的 化 學 成 分 有 皂 苷 生 物 鹼 三 萜 固 醇 及 蛋 白 質 等 成 分, 其 中 固 醇 類 皂 苷 化 合 物, 如 charantins, 及 一 些 蛋 白 質 成 分 被 認 為 具 有 降 血 糖 的 活 性 (Raman and Lau, 1996) 在 許 多 種 類 的 植 物 中, 皂 苷 類 成 分 的 降 血 糖 活 性 已 有 許 多 相 關 研 究, 甚 至 已 有 文 獻 研 究 該 類 成 分 結 構 與 降 血 糖 活 性 之 關 係 (Matsuda et al., 1998) 但 是 相 對 於 其 他 植 物 成 分 的 研 究, 苦 瓜 中 已 分 離 出 具 降 血 糖 活 性 的 蛋 白 質 成 分, 在 糖 尿 病 動 物 模 式 的 研 究 相 對 較 少, 且 也 缺 乏 進 ㄧ 步 的 分 子 機 轉 的 研 究, 因 此 我 們 希 望 鎖 定 小 分 子 量 的 蛋 白 質, 設 立 萃 取 小 分 子 量 蛋 白 質 的 萃 取 製 程, 以 進 一 步 針 對 苦 瓜 機 能 性 蛋 白 質 進 行 深 入 的 研 究 機 能 性 食 品 必 須 具 備 含 有 已 被 闡 明 化 學 結 構 的 功 能 因 子 且 功 能 因 子 在 食 品 中 穩 定 存 在 等 要 件, 而 苦 瓜 中 負 責 調 整 血 糖 的 功 能 因 子 尚 需 進 一 步 之 研 究, 因 此, 實 驗 室 擬 由 已 建 立 之 調 整 血 糖 分 析 系 統, 對 台 灣 省 產 之 各 苦 瓜 品 種 進 行 評 估, 並 以 胰 島 素 信 息 傳 導 路 徑 分 析 其 調 節 血 糖 之 相 關 機 轉 進 一 步 再 經 由 不 同 萃 取 方 法 搭 配 分 析 化 學 及 蛋 白 質 體 學 技 術 等 方 法, 搜 尋 苦 瓜 中 功 能 性 成 分 及 其 對 胰 島 素 信 息 傳 導 的 影 響 經 由 本 研 究 的 執 行, 預 期 可 發 現 苦 瓜 中 的 功 能 性 成 分, 未 來 應 可 進 一 步 發 展 為 治 療 或 輔 助 糖 尿 病 治 療 的 中 草 藥 保 健 食 品 內 容 苦 瓜 為 中 草 藥, 本 草 綱 目 中 認 為 苦 瓜 有 苦 寒 無 毒 除 邪 熱 解 勞 乏 清 心 明 目 " 等 功 效, 而 其 中 以 苦 瓜 萃 取 物 調 整 血 糖 或 應 用 在 治 療 糖 尿 病 及 其 併 發 症 方 面 最 為 顯 著, 但 這 些 研 究 多 偏 重 在 動 物 實 驗, 少 有 苦 瓜 調 整 血 糖 之 相 關 機 制 及 其 功 能 性 成 分 之 研 究 一 般 而 言, 機 能 性 食 品 必 須 具 備 含 有 已 被 闡 明 化 學 結 構 的 功 能 因 子 且 功 能 因 子 在 食 品 中 穩 定 存 在 等 要 件, 而 苦 瓜 中 負 責 調 整 血 糖 的 功 能 因 子 尚 需 進 一 步 之 研 究 因 此, 實 驗 室 已 建 立 之 調 整 血 糖 的 動 物 模 式, 已 確 定 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 具 調 整 血 糖 功 效, 進 一 步 也 利 用 區 隔 性 分 離 方 式 驗 證 調 整 血 糖 之 最 佳 分 子 量 區 間 苦 瓜 蛋 白 目 前 已 建 立 超 音 波 震 盪 透 析 分 子 量 及 等 電 點 分 離 等 不 同 苦 瓜 特 定 品 種 萃 取 製 程, 已 確 定 特 定 品 種 苦 瓜 之 萃 取 液 在 動 物 試 驗 中 具 調 整 血 糖 功 效 因 從 上 述 Khanna 等 人 的 研 究 中 發 現 苦 瓜 調 整 血 糖 的 功 能 性 蛋 白 主 要
94 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 為 小 分 子 量 的 蛋 白 質, 為 了 快 速 分 析 出 苦 瓜 中 功 能 性 蛋 白 質 之 類 型, 我 們 分 別 以 熱 水 水 甲 醇 乙 醇 酸 性 乙 醇 等 溶 媒 萃 取 不 同 極 性 的 蛋 白 質 成 分, 並 將 各 種 苦 瓜 的 不 同 部 位 直 接 均 質 後 萃 取 蛋 白 質 成 分, 再 以 SDS-PAGE 分 析 其 小 分 子 量 蛋 白 質 所 佔 之 比 例 和 比 較 各 品 種 苦 瓜 蛋 白 質 之 差 異, 以 找 出 萃 取 苦 瓜 小 分 子 量 蛋 白 質 最 有 效 的 方 法 進 一 步 搭 配 凝 膠 層 析 (gel filtration) 等 方 法, 製 備 苦 瓜 可 能 調 整 血 糖 之 區 隔 性 成 分 本 項 研 究 中 主 要 以 活 性 分 析 平 台 及 動 物 模 式 交 叉 實 驗, 引 導 苦 瓜 活 性 蛋 白 的 萃 取 與 純 化 策 略 調 整 血 糖 動 物 模 式 之 建 立 根 據 Day 等 人 的 方 法, 建 立 正 常 動 物 降 血 糖 模 式 動 物 模 式 是 以 8 週 齡 體 重 20±1 公 克 的 雌 性 BALB/c 小 鼠 為 實 驗 動 物, 在 禁 食 18 小 時 後, 分 別 以 口 服 或 腹 腔 注 射 方 式 給 予 高 濃 度 的 葡 萄 糖 溶 液 (2g/kg 體 重 ) 經 實 驗 證 實 葡 萄 糖 溶 液 以 腹 腔 注 射 的 方 式 給 予 小 鼠, 可 以 使 小 鼠 維 持 穩 定 的 高 血 糖 狀 態 ( 左 圖 ) 而 以 腹 腔 注 射 葡 萄 糖 溶 液 (0.5~4 g/kg 體 重 ) 進 行 劑 量 反 應 的 測 試, 發 現 血 糖 濃 度 會 隨 著 葡 萄 糖 注 射 濃 度 的 上 升 而 增 加, 在 腹 腔 注 射 30 分 鐘 後, 血 糖 濃 度 會 達 到 高 峰, 而 2 小 時 後, 血 糖 濃 度 會 下 降 成 背 景 值 ( 右 圖 ) 因 此 我 們 利 用 每 公 斤 體 重 4 公 克 的 葡 萄 糖 濃 度 腹 腔 注 射 的 條 件, 進 行 後 續 苦 瓜 萃 取 液 調 整 血 糖 的 實 驗 目 前 已 確 定 至 少 一 種 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 (MCSE) 調 整 血 糖 的 效 果 將 不 同 濃 度 的 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 以 口 服 方 式 的 方 式 投 與 小 白 鼠, 再 注 射 葡 萄 糖 溶 液 (4g/kg 體 重 ) 後, 檢 測 其 血 糖 的 變 化 結 果 顯 示, 血 糖 濃 度 隨 著 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 濃 度 的 增 加 而 下 降, 而 於 2 小 時 後, 血 糖 濃 度 會 下 降 成 背 景 值, 證 明 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 確 實 具 有 調
苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 95 整 血 糖 的 功 能 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 之 療 效 進 一 步 以 糖 尿 病 動 物 模 式 分 析 其 療 效, 糖 尿 病 有 許 多 動 物 模 式, 因 本 研 究 希 望 以 第 二 型 糖 尿 病 為 主 要 之 標 的, 因 此 經 由 本 研 究 團 隊 過 去 之 經 驗, 選 擇 果 糖 誘 導 的 胰 島 素 耐 受 型 Sprague-Dawley(SD) 大 鼠 糖 尿 病 模 式, 進 行 苦 瓜 蛋 白 質 萃 取 液 在 調 整 血 糖 方 面 療 效 的 活 性 評 估 (Chen et al., 2001) 依 照 本 團 隊 過 去 的 研 究 顯 示, 高 果 糖 飲 食 組 的 胰 島 素 及 游 離 脂 肪 酸 含 量 約 為 正 常 組 的 兩 倍, 而 在 三 酸 甘 油 脂 方 面 則 約 為 2.5 倍, 在 陽 性 對 照 組 方 面 則 降 回 背 景 值 左 右 故 本 實 驗 以 150-200g SD 大 鼠, 分 別 給 予 正 常 與 高 果 糖 的 飲 食 連 續 6 週 陽 性 對 照 組 與 苦 瓜 組 則 分 別 在 高 果 糖 飲 食 中 同 時 給 予 troglitazone 和 苦 瓜 蛋 白 萃 取 液 或 其 功 能 性 成 分 進 行 治 療, 最 後 再 測 定 其 血 壓 胰 島 素 游 離 脂 肪 酸 三 酸 甘 油 脂 等 相 關 生 化 數 值 之 改 變 除 了 SD 大 鼠 糖 尿 病 模 式 外, 另 有 其 它 胰 島 素 非 依 賴 型 糖 尿 病 動 物 模 式, 以 雙 重 驗 證 苦 瓜 蛋 白 質 萃 取 液 調 整 血 糖 的 活 性 (Luo et al., 1998; Apweiler and Freund, 1993; Chen and Wang, 2005; Rees and Alcolado, 2005) 動 物 模 式 的 建 立 方 法 如 下.. 以 3 週 週 齡 的 C57BL/6J 小 鼠, 分 別 給 予 正 常 與 高 脂 肪 (35.5% 脂 肪 ) 的 飼 料 3 週 後, 再 以 STZ 100mg/kg 誘 發 糖 尿 病, 對 照 組 則 注 射 等 體 積 之 溶 媒 (0.05 M citric acid, ph4.5), 持 續 給 予 相 同 之 飲 食 在 STZ 注 射 後 的 適 當 時 間 給 予 不 同 的 苦 瓜 蛋 白 萃 取 液 治 療 及 抽 血 檢 測 其 血 糖 之 變 化, 陽 性 對 照 組 則 投 予 tolbutamide(200 mg/kg) 進 行 治 療 STZ 注 射 後 的 第 31 天 將 小 鼠 犧 牲 採 集 其 血 液 與 相 關 組 織, 進 行 血 糖 組 織 切 片 與 糖 尿 病 控 制 相 關 機 轉 之 檢 測 以 6~7 週 的 Obese(fa/fa) Zucker 大 鼠 正 常 飼 養 12 週, 待 其 自 行 產 生 胰 島 素 耐 受 性 及 高 血 糖 等 糖 尿 病 症 狀 後, 再 給 與 藥 物 治 療 並 觀 察 相 關 生 化 數 值 的 變 化 本 實 驗 以 上 述 動 物 模 式 為 基 礎, 將 測 試 不 同 苦 瓜 萃 取 液 在 不 同 動 物 模 式 交 叉 實 驗, 以 引 導 較 高 療 效, 較 低 成 本 之 調 整 血 糖 保 健 產 品 之 開 發 應 用 蛋 白 質 體 學 技 術, 搜 尋 具 調 整 血 糖 功 能 苦 瓜 萃 取 液 中 蛋 白 質 組 成 成 分, 利 用 苦 瓜 可 能 調 整 血 糖 之 區 隔 性 成 分 為 基 礎, 以 2D-PAGE-MS 進 行 其 組 成 蛋 白 質 成 分 之 鑑 定 與 分 析 簡 述 如 下 : 將 製 備 好 的 苦 瓜 各 部 位 樣 品, 先 以 二 維 凝 膠 電 泳 分 析, 再 以 影 像 成 像 系 統 擷 取 並 分 析 其 結 果 之 後, 切 下 欲 檢 測 蛋 白 質 的 點 並 消 化 後, 再 以 質 譜 儀 進 行 序 列 分 析, 最 後 將 胺 基 酸 序 列 利 用 蛋 白 質 資 料 庫 進 行 搜 尋 比 對 蛋 白 質 序 列 比 對 資 料 經 生 物 資 訊 學 工 具
96 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 分 析, 歸 類 其 蛋 白 質 家 族, 推 測 可 能 功 能 後, 進 一 步 分 析 基 因 啟 動 子 上 轉 錄 因 子 結 合 位 的 種 類, 研 究 其 生 合 成 的 調 控 機 制 下 圖 為 本 研 究 團 隊 利 用 已 建 立 之 蛋 白 質 體 相 關 技 術 平 台, 進 行 兩 個 不 同 部 位 的 蛋 白 質 二 維 凝 膠 電 泳 分 析 之 初 步 成 果, 相 同 點 以 綠 色 表 示, 相 異 點 以 紅 色 表 示 在 此 蛋 白 質 體 相 關 技 術 平 台 中, 兩 個 不 同 部 位 的 蛋 白 質 二 維 凝 膠 電 泳 分 析 選 擇 最 具 有 意 義 的 點 進 行 液 相 層 析 串 連 質 譜 儀 液 相 層 析 串 連 質 譜 儀 水 解 特 定 胜 肽 所 形 成 之 圖 譜, 經 資 料 庫 比 對 後 可 分 析 出 胺 基 酸 序 列 最 後 將 相 關 序 列 經 NCBI 蛋 白 質 資 料 庫 進 行 比 對 分 析, 分 析 其 胺 基 酸 序 列 二 維 凝 膠 電 泳 分 析 選 擇 最 具 有 意 義 的 點, 至 少 需 分 析 5 段 胺 基 酸 序 列, 其 中 至 少 須 有 3 段 胺 基 酸 序 列 與 NCBI 蛋 白 質 資 料 庫 比 對 分 析 具 高 度 相 似 性, 方 能 判 讀 其 蛋 白 質 之 種 類 臨 床 上 治 療 糖 尿 病 的 藥 物, 主 要 是 以 biguanides sulphonylureas thiazolidinediones D-phenylalanine 衍 生 物 等 藥 物 為 主, 而 這 些 藥 物 的 共 同 點 都 是 藉 由 影 響 胰 島 素 分 泌 或 改 變 其 訊 息 傳 導 路 徑 來 發 揮 其 療 效 因 此, 可 先 將 具 有 胰 島 素 受 體 的 細 胞 株 3T3-L1 誘 發 分 化 成 脂 肪 細 胞 後, 處 理 不 同 的 苦 瓜 萃 取 物 或 其 成 分, 再 投 與 放 射 線 標 定 的 葡 萄 糖 後, 觀 察 各 種 處 理 組 的 細 胞 是 否 會 將 葡 萄 糖 攝 入 細 胞 內, 以 分 析 不 同 的 苦 瓜 萃 取 物 或 其 成 分 是 否 具 有 調 整 血 糖 的 功 能 下 圖 為 本 研 究 團 隊 誘 發 細 胞 分 化 的 初 步 結 果, 分 別 是 以 顯 微 鏡 在 固 定 放 大 倍 率 (200X) 下 觀 察 3T3-L1 在 誘 發 分 化 前 後 的 細 胞 形 態 變 化 左 圖 為 在 Oil Red 染 色 下, 觀 察 3T3-L1 原 來 的 細 胞 形 態,3T3-L1 呈 現 出 原 本
苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 97 的 纖 維 母 細 胞 的 形 態 特 徵 中 間 圖 則 為 3T3-L1 在 誘 發 分 化 後 所 形 成 的 脂 肪 細 胞, 從 圖 中 可 觀 察 到 細 胞 內 具 有 明 亮 的 油 室, 此 即 是 脂 肪 細 胞 的 特 徵 之 一 右 圖 是 中 間 圖 的 細 胞 再 經 由 Oil Red 染 色 後 進 行 觀 察, 從 圖 中 可 以 更 清 楚 的 看 到 被 染 成 紅 色 的 油 室, 證 明 3T3-L1 已 經 確 實 被 誘 導 分 化 成 脂 肪 細 胞 Preadipocytes(Oil Red) adipocytes adipocytes(oil Red) 下 圖 為 3T3-L1 分 化 成 的 脂 肪 細 胞 經 胰 島 素 及 藥 物 等 處 裡 後, 其 對 氚 (3H) 標 定 葡 萄 糖 的 不 同 攝 取 能 力 陰 性 對 照 組 只 有 誘 導 分 化 未 做 任 何 其 他 處 理, 以 胰 島 素 刺 激 葡 萄 糖 的 攝 取 為 陽 性 控 制 組, 最 後 給 予 藥 物 看 藥 物 是 否 能 刺 激 其 葡 萄 糖 的 攝 取 由 下 圖 結 果 顯 示 藥 物 可 以 成 功 的 促 進 脂 肪 細 胞 葡 萄 糖 的 攝 取
98 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 上 述 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 (MCSE) 調 整 血 糖 的 效 果 可 能 與 促 進 3T3-L1 脂 肪 細 胞 攝 取 葡 萄 糖 有 關 3T3-L1 分 化 成 的 脂 肪 細 胞 後, 再 經 胰 島 素 或 不 同 濃 度 的 MCSE 處 理, 測 定 對 氚 (3H) 標 定 葡 萄 糖 的 攝 取 能 力 結 果 顯 示 隨 著 MCSE 濃 度 的 上 升, 細 胞 攝 取 葡 萄 糖 的 能 力 也 增 加, 證 明 MCSE 可 以 藉 由 促 進 細 胞 攝 取 葡 萄 糖, 而 降 低 血 糖 濃 度 3T3-L1 細 胞 經 胰 島 素 刺 激 後, 會 經 由 下 圖 兩 條 主 要 路 徑 調 節 葡 萄 糖 轉 運 分 子 (GLUT4) 在 細 胞 膜 上 的 量, 以 促 進 細 胞 膜 外 的 葡 萄 糖 攝 入 細 胞 內 第 一 條 主 要 路 徑 是 經 由 胰 島 素 刺 激 後 活 化 insulin receptor-β subunit(ir), 之 後 藉 由 將 insulin receptor substrate 磷 酸 化 後, 活 化 phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K), 再 經 由 相 關 路 徑, 活 化 下 游 的 protein kinase C(PKC) 和 Akt, 最 後 促 進 GLUT4 轉 運 與 細 胞 內 的 糖 質 新 生 另 ㄧ 條 路 徑 是 經 胰 島 素 刺 激 活 化 Ras 後, 活 化 MAPK 相 關 路 徑 之 轉 錄 因 子 ( 包 括 PPARγ AP-1), 增 加 GLUT4 的 產 生, 以 達 到 降 低 血 糖 的 反 應 因 此 本 研 究 擬 以 Western blot 分 析 相 關 訊 息 傳 導 以 electrophoretic mobility shift assay 探 討 對 轉 錄 因 子 的 影 響 及 以 免 疫 螢 光 分 析 法 測 定 細 胞 表 面 GLUT4 的 translocation, 分 析 苦 瓜 機 能 性 成 份 調 整 血 糖 之 可 能 機 轉 本 項 研 究 與 本 校 附 醫 新 陳 代 謝 科 陳 清 助 醫 師 合 作 執 行
苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 99 化 學 組 成 固 定 生 物 反 應 明 確 及 無 安 全 性 顧 慮 之 苦 瓜 調 整 血 糖 保 健 產 品 之 開 發, 主 要 以 活 性 分 析 平 台 及 動 物 模 式 交 叉 實 驗, 引 導 苦 瓜 最 大 活 性 物 質 的 萃 取 策 略 的 製 定 未 來 如 進 一 步 確 認 某 一 種 蛋 白 質 為 苦 瓜 中 之 可 能 相 關 調 整 血 糖 因 子, 進 一 步 可 設 計 為 大 量 富 集 活 性 蛋 白 及 固 定 蛋 白 質 組 成 的 苦 瓜 萃 取 製 程 目 前 已 確 定 在 苦 瓜 在 在 特 定 分 子 量 區 間 具 較 佳 之 血 糖 調 整 效 應 苦 瓜 調 節 血 糖 保 健 食 品 的 產 品 設 計 可 與 產 業 界 協 同 進 行 由 本 研 究 篩 選 出 具 調 整 血 糖 之 功 能 性 蛋 白 後, 配 合 前 述 的 苦 瓜 特 定 製 程 蛋 白 萃 取 液 分 析, 找 出 哪 一 品 種 苦 瓜 的 特 定 部 位 含 量 最 高, 再 以 不 同 的 方 法 進 行 活 性 蛋 白 質 的 萃 取 及 純 化, 進 ㄧ 步 以 本 研 究 的 活 性 平 台 與 動 物 實 驗 進 行 驗 證, 製 訂 出 合 理 的 各 種 活 性 蛋 白 含 量 範 圍 之 後 再 採 用 cgmp 之 製 程 將 市 售 苦 瓜, 進 行 萃 取 與 部 分 純 化 後, 製 造 成 苦 瓜 調 整 血 糖 保 健 食 品 之 原 型 產 品, 在 原 型 產 品 療 效 確 認 後, 同 時 確 立 並 修 正 其 製 程, 以 加 速 相 關 保 健 產 品 的 開 發 時 程
100 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 參 考 文 獻 1.Ahmed, I., Adeghate, E., Sharma, A.K., Pallot, D.J., Singh, J., 1998. Effects of Momordica charantia fruit juice on islet morphology in the pancreas of the streptozotocin-diabetic rat. Diabetes Research Clinical Practices 40, 145 151. 2.Ahmed, I., Lakhani, M.S., Gillett, M., John, A., Raza, H., 2001. Hypotriglyceridemic and hypocholesterolemic effects of anti-diabetic Momordica charantia(karela) fruit extract in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes Research Clinical Practices 51, 155 161. 3.Akhtar, M.S., 1982. Trial of Momordica charantia Linn(karela) powder in patients with maturity-onset diabetes. Journal of Pakistan Med Association 32, 106 107. 4.Ali, L., Khan, A.K., Mamun, M.I., Mosihuzzaman, M., Nahar, N., Nur-e-Alam, M., Rokeya, B., 1993. Studies on hypoglycemic effects of fruit pulp, seed, and whole plant of Momordica charantia on normal and diabetic model rats. Planta Medicine 59, 408 412. 5.Bailey, C.J., Day, C., Turner, S.L., Leatherdale, B.A., 1985. Cerasee, a traditional treatment for diabetes. Studies in normal and streptozotocin diabetic mice. Diabetes Research 2, 81 84. 6.Cakici, I., Hurmoglu, C., Tunctan, B., Abacioglu, N., Kanzik, I., Sener, B., 1994. Hypoglycaemic effect of Momordica charantia extracts in norrmoglycaemic or cyproheptadine-induced hyperglycaemic mice. Journal of Ethnopharmacology 44, 117 121. 7.Chen, F.C., 1987. Present advance in chemical and pharmacological research of natural products for anti-hyperglycemia. Chinese Traditional and Herbal Drugs 18: 39 44. 8.Day, C., Cartwright, T., Provost, J., Bailey, C.J., 1990. Hypoglycaemic effect of Momordica charantia extracts. Planta Medica 56, 426 429. 9.Fröde TS, Medeiros YS. 2008 Animal models to test drugs with potential antidiabetic activity. Journal of Ethnopharmacology 115:173-183. 10.Grover, J.K., Rathi, S.S., Vats, V., 2002. Amelioration of experimental diabetic neuropathy and gastropathy in rats following oral administration of
苦 瓜 蛋 白 調 整 血 糖 機 制 及 其 應 用 之 研 究 101 plant(eugenia jambolana, Mucuna pruriens and Tinospora cordifolia) extracts. Indian Journal of Experimental Biology 40, 273 276. 11.Gu, G.Y. and Jiang, Y., 1997. A survey on anti-hyperglycemic constituents from plants. World Phytomedicines 12: 55 58. 12.Higashino, H., Suzuki, A., Tanaka, Y., Pootakham, K., 1992. [Hypoglycemic effects of Siamese Momordica charantia and Phyllanthus urinaria extracts in streptozotocin-induced diabetic rats(the 1st report)] Nippon Yakurigaku Zasshi 100, 415 421. 13.Iwashima, Y., Abiko, A., Ushikubi, F., Hata, A., Kaku,K., Sano, H., Eto, M. 2001Downregulation of the voltage-dependent calcium channel(vdcc) β-subunit mrnas in pancreatic islets of type 2 diabeticrats. Biochemical and Biophysical Research Communications 280: 923 932. 14.Jayasooriya, A.P., Sakono, M., Yukizaki, C., Kawano, M., Yamamoto, K., Fukuda, N., 2000. Effects of Momordica charantia powder on serum glucose levels and various lipid parameters in rats fed with cholesterolfree and cholesterol-enriched diets. Journal of Ethnopharmacology 72, 331 336. 15.Kar, A., Choudhary, B.K., Bandyopadhyay, N.G., 2003. Comparative evaluation of hypoglycaemic activity of some Indian medicinal plants in alloxan diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology 84, 105 108. 16.Karalee, J.J., Anderson, R.A., Graves, D.A. 2001 A hydroxychalcone derived from cinnamon functions as a mimetic for insulin in 3T3-L1 adipocytes. Journal of the American College of Nutrition 20:327 336. 17.Karunanayake, E.H., Jeevathayaparan, S., Tennekoon, K.H., 1990. Effect of Momordica charantia fruit juice on streptozotocin-induced diabetes in rats. Journal of Ethnopharmacology 30, 199 204. 18.Karunanayake, E.H., Welihinda, J., Sirimanne, S.R., Sinnadorai, G., 1984. Oral hypoglycaemic activity of some medicinal plants of Sri Lanka. Journal of Ethnopharmacology 11, 223 231 19.Kedar, P., Chakrabarti, C.H., 1982. Effects of bittergourd(momordica charantia ) seed & glibenclamide in streptozotocin induced diabetes mellitus. Indian Journal of Experimental Biology 20, 232 235. 20.Lelliott, Vidal-Puig, A.J. 2004 Lipotoxicity, an imbalance between
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104 苦 瓜 產 業 與 保 健 功 效 研 討 會 刊 ABSTRACT Bitter gourd(momordica charantia L.) is a commonly known vegetable and medicinal herb. Severalscientific papers indicated that bitter gourd extracts are used for the treatment of diabetes and its complications, such as nephropathy, cataract and insulin resistance, by regulating the levels of blood glucose. However, the active components of bitter gourd responsible for hypoglycemic activities remained to be identified. In the first-year project, we have demonstrated that the protein extracts of bitter gourd exhibited the hypoglycemic activities by glucose tolerance test in mice. By molecular weight cutting assay, we identified that specific protein components were responsible for the regulation of blood glucose. In the second- year and third-year project, we will compare the effects of various species and parts of bitter gourd on the regulation of blood glucose. The protein components of bitter gourd will be identified by proteomic approach and the hypoglycemic mechanism of protein components will be demonstrated by molecular biology approach. The chemical defined, bioactivity defined, and biosafe bitter gourd health food for the regulation of blood glucose will be further developed. The better understanding of the functional proteins could provide the molecular evidences for the hypoglycemic activity of bitter gourd and further develop as the health food for the improvement of diabetes. Key words:bitter gourd, hypoglycemic activity, health food, proteomics