定 量 PCR 之 標 準 作 業 流 程 (SOP) 與 注 意 事 項 所 有 準 備 進 行 定 量 PCR 分 析 之 RNA 樣 本 必 須 全 程 儲 存 於 -80 度 C, 以 確 保 total RNA 的 完 整 性 ; 本 實 驗 流 程 中 採 用 QIAGEN RNeasy Mini - RNA Purification Kit (Cat No. 74104 與 74704) 進 行 total RNA 純 化, 詳 細 實 驗 步 驟 請 見 動 物 組 織 細 胞 total RNA 萃 取 -For Liver 與 動 物 組 織 細 胞 total RNA 萃 取 -For Muscle & Heart Tissue; 3. 純 化 出 之 total RNA, 會 依 據 組 織 種 類 之 RNA 含 量 差 異, 利 用 DEPC H 2 O 進 行 不 同 程 度 之 稀 釋 (liver:60x,muscle:15 X,heart: 15X), 由 於 微 量 石 英 分 析 管 最 小 分 析 體 積 為 90 μl, 因 此 各 個 樣 本 之 稀 釋 體 積 總 量 為 90 μl(60 X = 3 μl + 177 μl [ 再 由 180 μl 取 出 90 μl 進 行 分 析 ],15 X = 6 μl + 84 μl); 4. 稀 釋 後 之 RNA 樣 本 將 以 微 量 石 英 分 析 管 在 分 光 光 譜 儀 (spectrophotometer) 讀 取 特 定 波 長 紫 外 光 [UV 光 :260 nm/ 280 nm] 之 光 學 密 度 (optical density, O.D.) 進 行 核 酸 定 量,O.D. 260 nm 數 值 最 好 介 於 0.1~1 之 間, 而 純 度 較 佳 之 RNA 樣 本 的 260 nm/ 280 nm 的 比 值 最 好 介 於 6~0 之 間 ( 若 >0 表 示 有 酒 精 殘 留, 若 <6 表 示 有 protein 污 染 ); 5. 計 算 原 始 樣 本 RNA 濃 度 之 算 法 : 原 始 樣 本 RNA 濃 度 =O.D. 260 nm 數 值 40 稀 釋 倍 數 P.S. 1 O.D. 之 260 nm 值 = 40 μg/ml 的 total RNA 6. 若 初 次 使 用 的 RNA 萃 取 Kit, 可 以 使 用 Formaldehyde Argarose Gel 進 行 電 泳, 針 對 萃 取 出 來 的 RNA 進 行 品 質 監 控 (Quality Control,QC), 詳 細 實 驗 步 驟 請 見 Formaldehyde-gel electrophoresis; 7. 計 算 出 各 個 樣 本 1 μg 之 total RNA 的 體 積 ; 8. 準 備 反 轉 錄 (reverse transcriptase) 的 試 藥 組 (iscript TM cdna Synthesis Kit, Cat# 170-8890,BioRad), 該 kit 的 每 一 個 reaction 可 將 1 μg 的 total RNA 反 轉 錄 成 2 μg 之 cdna, 故 需 準 備 1 μg 之 total RNA 供 反 轉 錄 使 用 ; 下 表 示 操 作 1 個 reaction 的 反 轉 錄 反 應 之 試 劑 組 成 與 incubation 時 間 ( 加 入 reagent 的 順 序 : RNase free water RNA Reaction mix Transcriptase); - 1 -
P.S. 反 應 結 束 後 cdna 可 以 保 存 於 4/ -20/ -80 度 C 當 中 均 可 9. 當 反 轉 錄 反 應 完 成 所 得 到 之 cdna 可 以 進 行 儲 存 或 直 接 進 行 定 量 PCR 反 應 之 用 ; 10. 進 行 定 量 PCR 實 驗 時, 首 先 需 將 所 要 分 析 基 因 之 primer( 包 含 :reverse 與 forward) 與 TaqMan Probe 準 備 完 畢 ; 1 TaqMan Probe Preparation( 儲 存 與 操 作 時 需 要 使 用 避 光 容 器 ): (1) TaqMan Probe 為 凍 乾 粉 末, 因 此 必 須 使 用 滅 菌 過 濾 的 ddh2o 將 粉 末 溶 解 ; (2) 溶 解 probe 時 先 看 廠 商 的 資 料, 確 定 內 部 粉 末 的 mole 數, 稍 後 將 內 部 粉 末 全 部 溶 解 成 10 μm 的 濃 度 ; (3) 溶 解 後 的 probe 務 必 使 用 避 光 的 褐 色 tube 管 進 行 分 裝, 以 避 免 probe 被 重 複 回 溫 影 響 品 質 ( 每 管 50 μl, 並 標 號, 請 依 序 使 用 ); (4) 由 於 TaqMan Probe 上 有 conjugate 螢 光 dye, 因 此 在 溶 解 凍 乾 粉 末 的 過 程 當 中, 務 必 使 用 pipette 進 行 mix, 千 萬 不 可 以! 進 行 vortex; (5) 配 製 範 例 : 若 有 一 probe 其 含 量 為 5 nmol 公 式 為 :mole 數 / 體 積 (L)=M 5 nmol/v(l)=10 μm V(L) = 5 10-4 (L) = 0.5 ml = 500 μl Hint: 在 5 nmol 的 數 字 後 加 兩 個 0, 單 位 為 μl, 即 為 加 入 的 水 量 (6) 在 25 μl Supermix 中 的 Probe 最 終 濃 度 為 300 nm, 則 須 加 入 多 少 體 積 之 10 μm 的 Probe, 可 得 到 300 nm 的 最 終 濃 度? <Ans> 300 nm = 0.3 μm M 1 V1 = M 2 V2 10 μm x μl = 0.3 μm 25 μl x = 0.75 μl - 2 -
1 Primer Preparation (1) 我 們 所 購 買 的 Primer 之 原 始 濃 度 均 為 100 μm, 因 此 我 們 會 先 由 stock 中 抽 取 10 μl 的 Primer 加 入 90 μl 滅 菌 過 濾 的 ddh2o, 將 原 液 稀 釋 成 10 μm, 並 利 用 此 稀 釋 Primer 進 行 PCR 反 應 之 操 作 ; (2) 在 25 μl Supermix 中 的 Primer 最 終 濃 度 為 400 nm, 則 須 加 入 多 少 體 積 之 10 μm 的 Primer, 可 得 到 400 nm 的 最 終 濃 度? <Ans> 400 nm = 0.4 μm M 1 V1 = M 2 V2 10 μm x μl = 0.4 μm 25 μl x = 1 μl 13. 序 列 稀 釋 的 方 法 ( 用 於 測 試 每 個 新 設 計 的 基 因 Probe 與 Primers 在 進 行 PCR 反 應 時 的 Efficiency 與 Concentration Dynamic, 並 做 出 Standard Curve, 作 為 後 續 分 析 之 用 ) (1) 一 般 製 作 standard curve 時, 至 少 會 需 要 有 4 個 不 同 稀 釋 倍 數 的 樣 本, 所 以 採 用 的 濃 度 大 約 會 是 在 10 2 X~ 10 5 X 之 間, 每 個 稀 釋 樣 本 間 的 差 距 為 10 倍 ( 若 樣 本 濃 度 真 的 太 稀, 也 可 使 用 5 倍 間 距 的 稀 釋 倍 數 ); (2) 製 作 cdna 的 序 列 稀 釋 樣 本 時, 會 先 由 原 始 樣 本 取 出 10 μl 的 sample 加 入 90 μl 的 滅 菌 過 濾 的 ddh2o 中 先 行 稀 釋 10 倍, 之 後 以 該 10 倍 稀 釋 樣 本 為 原 液, 連 續 作 四 次 的 10 倍 稀 釋, 並 以 最 終 稀 釋 倍 數 為 10 2 X~ 10 5 X 間 的 四 個 樣 本 作 為 序 列 稀 釋 的 操 作 樣 本 ; (3) 進 行 序 列 稀 釋 時, 須 注 意 每 次 抽 取 10 μl 的 樣 本 前, 務 必 將 該 樣 本 vortex 完 全 並 進 行 spin down 的 動 作 ( 操 作 核 酸 時, 因 為 單 股 核 酸 帶 負 電, 會 黏 合 在 tube 管 壁 上 ), 以 確 保 序 列 稀 釋 的 資 料 準 確 性 ; (4) 詳 細 操 作 流 程 請 見 下 圖 ; 14. 操 作 Real Time PCR 之 詳 細 步 驟 與 方 法 (1) 配 製 iq Supermix(Cat#170-8860,BioRad), 用 於 進 行 PCR 反 應 之 用, Supermix 含 有 PCR 反 應 所 需 的 dntps buffer 鎂 離 子 等, 當 Supermix 與 cdna template 混 合 後 ( 請 勿 vortex, 內 有 DNA polymerase), 即 可 放 入 Real time PCR 機 器 進 行 分 析 ; - 3 -
(2) 一 般 而 言, 我 們 會 將 Supermix 減 半 使 用 以 節 省 reagent 與 sample, 一 個 基 因 的 一 個 reaction 所 需 的 體 積 是 20 μl( 不 包 含 5 μl 之 cdna template), 所 以 要 進 行 PCR 反 應 之 前, 以 單 一 基 因 為 單 位, 可 以 先 進 行 估 算 要 進 行 的 reaction 數 量 ( 可 多 估 計 1~3 個 reaction 的 量, 以 避 免 pipetting error), 計 算 共 需 多 少 Supermix Buffer 進 行 反 應 ; (3) 加 入 Reagent 與 樣 本 的 順 序 ( Supermix 滅 菌 過 濾 的 ddh2o Primer 1 Primer 2 Probe 最 後 加!) (4) 注 意!! 一 個 基 因 會 有 一 個 搭 配 的 Probe 與 兩 個 搭 配 的 Primers, 所 以 請 不 要 加 錯 管 子, 一 般 會 一 個 基 因 準 備 一 個 Supermix 的 配 方, 所 以 也 需 要 一 個 單 獨 的 specific NTC(No Template Control 用 於 觀 察 Probe 是 否 水 解 ); (5) 當 Supermix 與 primers probe 混 合 好 後, 小 心 地 將 20 μl 的 Supermix 混 和 液 加 入 96 well plate 或 8 連 排 的 PCR 專 用 試 管 當 中 ( 注 意! 請 勿 杯 壁 下 流 ); (6) 最 後 加 入 5 μl 的 cdna template( 若 是 NTC, 則 加 入 5 μl 滅 菌 過 濾 的 ddh2o), 並 利 用 pipette 進 行 mix, 加 入 sample 完 畢 後, 將 96 well plate 利 用 3M 刮 刀 將 封 膜 密 封, 確 認 樣 本 盤 之 tube 底 部 無 氣 泡 ( 底 部 氣 泡 會 影 響 螢 光 偵 測 準 確 性 ), 即 可 放 入 機 器 中 進 行 PCR 反 應 ; 15. Real Time PCR 機 器 與 軟 體 操 作 方 法 (1) 開 機 順 序 ( 光 源 PCR PC 放 入 樣 本 盤 ); (2) 設 定 樣 本 盤 的 排 列 順 序 與 PCR 的 溫 度 Program; (3) 上 機 開 始 PCR 反 應, 約 5~2 小 時 可 以 完 成 實 驗 ; (4) 詳 細 步 驟, 如 下 : 選 擇 或 編 輯 已 有 的 Protocol 在 Protocol 按 鍵 下, 利 用 瀏 覽 視 窗 找 到 資 料 夾 的 位 置 選 擇 欲 使 用 的 protocol 檔 案, 被 選 擇 的 protocol 詳 細 設 定 會 出 現 在 下 方 視 窗 3. 注 意 : 程 式 內 有 Protocol 範 本 可 直 接 使 用, 一 般 SYBR Green I 使 用 者 選 擇 2StepAmp+Melt.tmo 3. 在 Selected Protocol 視 窗 下, 按 下 Edit 可 以 編 輯 目 前 選 - 4 -
擇 的 protocol 注 意 : 按 下 Edit 後 會 開 啟 如 下 列 所 示 Protocol Editor 視 窗 使 用 Gradient 功 能 決 定 收 光 步 驟 增 減 Step 或 cycle 數 在 Spreadsheet 可 以 編 輯 所 需 的 protocol, 設 定 完 成 後 按 下 Save & Exit Protocol Editing, 在 Save As 的 視 窗 下 鍵 入 protocol 的 名 稱, 然 後 按 下 Save 注 意 : 只 有 當 你 選 擇 Save & Exit Protocol Editing 或 Cancel & Edit Protocol Editing 後, 才 能 離 開 Protocol Editor 設 定 畫 面 編 輯 新 的 Plate 在 Plate 按 鍵 下, 利 用 瀏 覽 視 窗 找 到 資 料 夾 的 位 置 在 Selected Plate Setup 視 窗 下 按 下 Create New 可 以 創 造 新 的 plate 注 意 : 在 Selected Plate Setup 視 窗 下, 按 下 Create New 會 開 啟 如 下 方 所 示 Plate Editor 視 窗 - 5 -
4. 3. 輸 入 本 次 實 驗 所 使 用 的 sample 體 積, 密 封 方 式 以 及 反 應 管 種 類 利 用 滑 鼠 選 擇 欲 設 立 的 Sample 種 類 3. 如 果 有 定 義 standard, 可 以 利 用 Dilution Series 的 功 能, 定 義 standard 的 濃 度 4. 當 設 定 完 成 後, 按 下 Save & Exit Plate Editing, 在 Save As 的 視 窗 下 鍵 入 plate 的 名 稱, 然 後 按 下 Save 注 意 : 只 有 當 你 選 擇 Save & Exit Plate Editing 或 Cancel & Edit Plate Editing 後, 才 能 離 開 Plate Editor 設 定 畫 面 Begin a Run 當 Plate 及 Protocol 設 定 完 成, 回 到 Workshop 模 組 下, 便 可 按 下 右 上 方 的 Run 會 進 入 Run-Time Central 模 組 下 的 Initiate Run 的 視 窗 下 確 定 Protocol 及 Plate 的 設 定 無 誤 選 擇 well factor 收 集 方 式 3. 注 意 : 請 選 擇 下 方 的 Collect well Factors From Experimental Plate - 6 -
3. 按 下 Begin Run 4. 在 Save Optical Data File 對 話 視 窗 下, 輸 入 data 的 名 稱 5. 按 下 OK During a Run 當 實 驗 開 始 進 行, 程 式 會 自 動 切 換 到 Monitor Run 視 窗, 可 以 即 時 監 測 反 應 的 進 行 過 程, 當 反 應 已 經 進 入 Hot start 後, 始 可 離 開 - 7 -