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ISSN 1007 7626 CN 11 3870 / Q 中 国 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 报 http: / / cjbmb. bjmu. edu. cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2014 年 8 月 30(8):761 ~ 768 综 述 DOI: 10. 13865 / j. cnki. cjbmb. 2014. 08. 05 GUS 报 告 系 统 在 植 物 基 因 功 能 研 究 中 的 应 用 和 优 化 杨 丹 丹 1), 王 俊 杰 1) 1),2), 梁 卫 红 ( 1 ) 河 南 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院, 新 乡 453007; 2 ) 资 源 微 生 物 与 功 能 分 子 河 南 省 高 校 重 点 实 验 室 培 育 基 地, 新 乡 453007) 摘 要 β 葡 糖 醛 酸 酶 (GUS) 报 告 系 统 是 现 代 分 子 生 物 学 研 究 领 域 中 被 广 泛 使 用 的 一 种 重 要 工 具, 在 解 析 基 因 时 空 表 达 调 控 的 研 究 中 发 挥 着 重 要 作 用. 本 文 概 述 了 报 告 基 因 GUS 的 生 化 特 性 及 检 测 手 段, 从 启 动 子 元 件 鉴 定 基 因 诱 捕 无 标 记 转 基 因 技 术 等 方 面 论 述 GUS 的 应 用 现 状 和 优 势, 并 针 对 内 源 GUS GUS 抑 制 因 子 等 问 题 和 改 进 优 化 手 段 进 行 了 分 析, 为 该 技 术 在 植 物 功 能 基 因 研 究 中 进 一 步 拓 展 提 供 新 线 索 和 思 路. 关 键 词 中 图 分 类 号 β 葡 糖 醛 酸 酶 报 告 基 因 (GUS); 转 基 因 植 物 ; 功 能 分 析 Q556 GUS Reporter System for Analysis of Gene Function and Optimization in Plants YANG Dan Dan 1), WANG Jun Jie 1), LIANG Wei Hong 1),2) ( 1) College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China; 2) Key Laboratory of University of Henan Province, for Microorganisms and Functional Molecules, Xinxiang 453007, Henan, China) Abstract Beta glucuronidase( GUS) reporter system is widely used in modern molecular biology, and playing vital roles in analysis of regulation of gene expression in time and space. This paper analyzed and summarized detection, biochemical characteristics, application and advantages of GUS from promoter element identification, gene trap and marker free transgenic technology. Meanwhile, some problems such as endogenous GUS and GUS inhibitors were discussed, and the optimization methods were also included. This review will provide new clues and ideas for further research on functional gene in plants. Key words β glucuronidase reporter gene( GUS); transgenic plant; functional analysis 真 核 基 因 表 达 调 控 是 现 代 生 物 学 研 究 的 热 点 之 一. 但 是, 真 核 基 因 表 达 调 控 具 有 多 层 次 性, 且 功 能 基 因 大 多 以 基 因 家 族 的 形 式 存 在, 各 成 员 在 功 能 上 存 在 冗 余 现 象, 因 此, 精 细 研 究 某 一 功 能 基 因 的 表 达 调 控 费 时 费 力. 但 是, 报 告 基 因 的 应 用 使 这 一 问 题 迎 刃 而 解 [1]. 报 告 基 因 是 编 码 易 被 检 测 蛋 白 质 或 酶 的 基 因 [2], 它 不 仅 可 以 与 目 的 基 因 融 合, 方 便 后 续 检 测, 而 且 表 达 产 物 不 会 对 细 胞 的 生 理 代 谢 产 生 影 响. 目 前, 常 用 的 报 告 基 因 有 很 多 种, 其 中 β 葡 糖 醛 酸 酶 (β glucuronidase, GUS) 是 被 广 泛 使 用 的 报 告 基 [3] 因 系 统 之 一. 自 1987 年 Jefferson 等 克 隆 GUS 基 因 后,GUS 已 被 广 泛 应 用 于 转 基 因 植 物 的 研 究 中. 据 统 计, 目 前 已 有 上 千 种 转 基 因 植 物 是 利 用 GUS 作 为 报 告 基 因 的. 1 GUS 的 基 本 特 征 收 稿 日 期 : 2014 01 03; 接 受 日 期 : 2014 03 22 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 (No. 31171182), 河 南 省 高 校 科 技 创 新 团 队 支 持 计 划 ( No. 13IRTSTHN009), 河 南 省 基 础 与 前 沿 技 术 研 究 项 目 (No. 132300410137, No. 132300410455), 河 南 省 自 然 科 学 研 究 计 划 项 目 (No. 2010A180012) 联 系 人 GUS 由 大 肠 杆 菌 K12 菌 株 ( Escherichia coli K Tel: 0373 3326340; E mail: liangwh@ htu. cn Received: January 3, 2014; Accepted: March 22, 2014 Supported by National Natural Science Foundation of China ( No. 31171182), Program for Innovative Research Team of Science and Technology in University of Henan Province ( No. 13IRTSTHN009 ), Natural Science Research Project of Henan Province( No. 132300410137, No. 132300410455, No. 2010A180012) Corresponding author Tel: 0373 3326340; E mail: liangwh@ htu. cn

762 中 国 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 报 第 30 卷 12) 的 uida 基 因 编 码 [4], 表 达 产 物 为 β 葡 糖 醛 酸 糖 苷 酶 ( E. C. 3 2 1 31 ), 系 统 命 名 为 β D glucuronosohydrolase, 是 68 kd 的 同 源 四 聚 体, 最 适 ph 为 5 2 ~ 8 0 [5]. 该 酶 是 一 种 外 切 水 解 酶, 具 有 非 常 广 泛 的 水 解 底 物, 可 以 催 化 通 过 β O 糖 苷 键 连 接 并 含 有 D 葡 糖 醛 酸 的 葡 糖 苷 酸 的 水 解, 且 具 有 热 稳 定 性. 在 转 化 植 物 细 胞 内 也 非 常 稳 定, 例 如 : 在 叶 肉 细 胞 原 生 质 中 其 半 衰 期 可 达 50 h. 作 为 报 告 基 因,GUS 与 其 它 广 泛 使 用 报 告 基 因 如 GFP 和 LUC 相 比, 具 有 许 多 优 势. 尽 管 GFP 和 LUC 这 两 种 报 告 基 因 都 可 以 进 行 实 时 的 活 体 检 测 [6 8]. 但 是,GFP 在 使 用 时 会 受 到 一 些 植 物 本 身 很 强 的 自 发 荧 光 的 干 扰, 不 能 进 行 定 量 分 析, 而 且 需 要 借 助 荧 光 显 微 镜 观 察 ;LUC 的 半 衰 期 很 短, 而 且 它 催 化 氧 化 荧 光 素 的 释 放 是 非 常 缓 慢 的, 实 验 的 时 间 较 长 [9 11]. 而 GUS 作 为 报 告 基 因, 检 测 方 法 简 便 快 速 多 样, 包 括 分 光 光 度 法 [12] 组 织 化 学 染 色 定 位 法 [3] [3, 13 15] 荧 光 法 等, 并 且 对 实 验 设 备 的 要 求 也 不 高. 2 GUS 的 应 用 2 1 启 动 子 及 其 元 件 功 能 分 析 GUS 作 为 报 告 基 因 最 常 用 于 启 动 子 功 能 的 分 析, 不 仅 可 以 进 行 瞬 时 表 达 分 析, 也 可 以 进 行 稳 定 遗 传 实 验. 将 目 的 基 因 启 动 子 与 GUS 融 合 后, 不 仅 可 以 借 助 组 织 化 学 染 色 法 对 目 的 基 因 表 达 进 行 定 位, 还 可 以 借 助 荧 光 定 量 分 析 目 的 基 因 表 达 的 模 式. 在 条 件 允 许 的 情 况 下, 可 以 将 整 株 植 物 进 行 染 色, 了 解 目 的 基 因 在 整 个 植 株 不 同 组 织 器 官 的 表 达 特 性, 也 可 以 对 特 定 的 组 织 器 官 染 色 后 做 石 蜡 切 片, 通 过 显 微 观 察 了 解 目 的 基 因 产 物 在 组 织 细 胞 中 的 分 布 特 点. 与 5 缺 失 技 术 结 合,GUS 报 告 基 因 系 统 还 可 以 [16] 分 析 启 动 子 元 件. 例 如,Liu 等 将 Osgrp 2 基 因 启 动 子 及 其 一 系 列 5 端 缺 失 片 段 分 别 与 GUS 融 合, 驱 动 GUS 在 烟 草 原 生 质 体 中 瞬 时 表 达, 确 定 在 启 动 子 - 2 290 ~ - 1 406 bp 处 存 在 1 个 正 调 节 区, 在 - 2 401 ~ - 2 291 bp 和 - 1 405 ~ - 1 022 bp 处 存 在 2 个 负 调 节 区. 进 一 步 将 该 启 动 子 的 - 1 021 + 2 片 段 与 GUS 融 合, 转 入 烟 草, 通 过 GUS 组 织 化 学 染 色 法, 确 定 了 该 基 因 微 管 特 异 表 达 特 征, 而 将 微 管 特 异 性 表 达 的 顺 式 作 用 元 件 定 位 在 - 497 ~ 范 围 内. 2 2 基 因 诱 捕 - 399 bp 作 为 报 告 基 因,GUS 的 应 用 为 基 因 诱 捕 ( gene trap) 提 供 了 有 效 的 筛 选 和 鉴 定 的 方 式. 由 于 GUS 的 检 测 方 法 多 样 简 单, 后 续 既 可 以 对 目 的 基 因 进 行 定 位, 又 可 以 进 行 定 量 检 测 目 的 基 因 的 表 达 特 征, 因 此,GUS 作 为 报 告 基 因 常 广 泛 应 用 于 增 强 子 和 启 动 子 诱 捕 载 体 的 构 建, 如 pop / LhG4 增 强 子 诱 捕 系 统 [17]. 由 于 配 子 体 只 能 在 显 微 镜 下 才 能 观 察 到, 因 而 对 其 突 变 体 的 筛 选 是 一 个 非 常 困 难 的 工 作. 已 报 道 的 雄 配 子 突 变 体 筛 选 方 法 有 两 种 : 一 是 通 过 苯 胺 蓝 对 花 粉 管 的 胼 胝 质 染 色 来 检 测 [18] ; 二 是 利 用 插 入 突 变 体 群 体 异 常 的 分 离 比, 筛 选 出 雄 配 子 突 变 体 [19]. 而 使 用 包 含 GUS 报 告 基 因 的 启 动 子 诱 捕 载 体, 可 以 通 过 组 织 化 学 染 色 非 常 方 便 地 筛 选 出 突 变 体, 在 应 用 上 优 势 明 显 [20,21]. 目 前, 诱 捕 载 体 上 常 用 的 报 告 基 因 有 GUS LUC 和 GFP 等. 它 们 单 独 使 用 时 各 有 利 弊, 但 联 合 使 用 时 不 仅 可 提 高 诱 捕 阳 性 率, 而 且 还 有 利 于 对 诱 捕 基 因 进 行 分 析, 使 基 因 诱 捕 技 术 得 以 优 化. 2007 年, [22] Koo 等 构 建 了 包 含 GUS / LUC 两 个 报 告 基 因 的 pigl 基 因 诱 捕 载 体 (Fig. 1), 利 用 LUC 快 速 筛 选 诱 捕 植 株, 利 用 GUS 用 来 定 位 和 分 析 基 因 的 表 达 调 控, 该 双 报 告 基 因 系 统 载 体 已 成 功 用 于 基 因 诱 捕. Fig. 1 Physical map of the pigl gene trap vector RB and LB indicate the right and left border of the T DNA, respectively. pbs SK is cloned from pbluescript SK vector; p35s indicate the CaMV 35S promoter. The XbaI site used for plasmid rescue is unique in the vector [22] 2 3 无 标 记 转 基 因 技 术 抗 生 素 抗 性 基 因 和 抗 除 草 剂 基 因 是 转 基 因 植 物 筛 选 常 用 标 记, 但 可 能 存 在 一 定 的 环 境 和 生 态 等 安 全 隐 患. 因 此, 无 标 记 转 基 因 技 术 受 到 关 注. 并 已 有

第 8 期 杨 丹 丹 等 : GUS 报 告 系 统 在 植 物 基 因 功 能 研 究 中 的 应 用 和 优 化 763 一 些 获 得 无 标 记 转 基 因 植 物 的 报 道, 其 筛 选 方 法 包 括 转 化 株 的 PCR 筛 选 [23] [24] 共 转 化 和 位 点 特 异 性 重 组 [25]. 近 来,MAT( multi auto transformation) 载 体 系 统 在 多 种 植 物 转 化 中 的 广 泛 使 用, 为 无 标 记 转 基 因 植 物 生 产 提 供 了 一 种 新 方 法 [26],MAT 系 统 中 使 用 最 多 的 报 告 基 因 是 GUS, 使 筛 选 工 作 更 加 准 确 方 便 和 快 捷 2011 年,Khan 等 报 道 了 利 用 MAT 系 统 获 得 抗 病 番 茄 的 技 术 [27], 所 使 用 的 MAT 载 体 系 统 包 含 了 筛 选 标 记 ipt(isopentenyltransferase) 基 因 抗 病 基 因 WD(wasabia defensin) 酵 母 重 组 系 统 R / RS 系 统 及 GUS 报 告 基 因 (Fig. 2). 受 体 植 株 经 重 组 载 体 转 化 后, ipt 基 因 的 过 表 达 使 植 株 內 源 细 胞 分 裂 素 水 平 上 升, 植 株 产 生 大 量 的 毛 状 根. 由 于 毛 状 根 不 具 有 顶 端 优 势, 缺 乏 生 根 能 力, 形 态 异 常, 据 此 就 可 以 根 据 形 态 初 步 筛 选 出 阳 性 植 株. 随 后 由 于 酵 母 R / RS 系 统 的 重 组 删 除 功 能, 使 位 于 两 个 特 定 重 组 位 点 之 间 的 ipt 基 因 被 删 除, 阳 性 植 株 细 胞 分 裂 素 水 平 恢 复 正 常, 阳 性 转 基 因 植 株 得 以 正 常 生 长. 经 过 植 株 形 态 的 初 步 筛 选, 结 合 GUS 组 织 化 学 染 色 的 细 胞 生 物 学 分 析, 再 通 过 检 测 靶 基 因 WD 的 表 达 就 可 以 完 成 阳 性 植 株 的 鉴 定 和 筛 选. 该 方 法 成 功 应 用 于 诸 如 番 茄 [27] 矮 牵 牛 [28] 苜 蓿 [29] [30] 长 寿 花 等 高 等 植 物 的 转 化. Fig. 2 Physical map of the MAT vector system RB and LB indicate the right and left border of the T DNA, respectively. RS indicate the recombination site. The CaMV 35S promoter drives the R( recambinase) and WD genes. The ipt and GUS genes are driven by native ipt and nopaline synthase promoters, respectively. The terminators of ipt, R, GUS and WD genes are derived from the nopaline synthase [27] 2 4 高 效 的 转 基 因 方 案 农 杆 菌 介 导 的 转 基 因 技 术 是 目 前 最 常 用 的 植 物 转 基 因 方 法. 但 是 由 于 菌 株 植 物 种 类 培 养 条 件 等 的 差 异, 在 某 些 植 物 中 转 化 效 率 很 低. 因 此 一 些 针 对 特 定 植 物 的 高 效 转 基 因 方 法 不 断 涌 现 [31 36]. 如 [37] Thirukkumaran 等 在 将 含 GUS 的 瞬 时 表 达 载 体 通 过 农 杆 菌 介 导 转 入 矮 牵 牛 外 植 体 时, 在 共 培 养 的 MS 培 养 基 中 加 入 生 长 调 节 剂 苯 基 噻 二 唑 脲 (thidiazuron,tdz), 由 于 TDZ 同 时 具 备 了 细 胞 分 裂 素 和 植 物 生 长 素 的 生 理 活 性, 可 以 大 幅 提 高 新 芽 的 再 生 率, 从 而 使 转 化 效 率 有 效 提 高. 转 化 植 株 移 栽 后, 在 96 孔 板 上 同 时 对 96 个 株 系 的 叶 片 进 行 GUS 染 色, 快 速 的 筛 选 出 了 阳 性 转 基 因 株 系 (Fig. 3). 2 5 聚 丙 烯 凝 胶 电 泳 原 位 分 析 有 报 道 显 示, 在 不 同 离 子 或 去 垢 剂 存 在 的 条 件 下, 由 于 GUS 依 然 表 现 出 稳 定 的 酶 活 性, 因 此 可 以 用 于 蛋 白 的 活 性 分 析. 从 新 鲜 含 有 GUS 报 告 基 因 的 转 基 因 植 株 中 提 取 蛋 白, 经 非 变 性 PAGE 后, 使 作 为 底 物 的 X Gluc(5 溴 4 氯 3 吲 哚 β D 葡 萄 糖 ) 进 入 凝 胶 后, 可 以 直 接 在 凝 胶 中 与 GUS 反 应, 进 行 原 位 分 析, 确 定 GUS 的 表 达 水 平 和 活 性. 实 验 结 果 可 以 和 Western 杂 交 相 媲 美, 不 仅 简 便 实 用, 可 以 快 速 定 性 检 验, 而 且 灵 敏 度 高 [38]. 3 GUS 在 应 用 中 存 在 的 问 题 与 展 望 3 1 消 除 农 杆 菌 自 身 GUS 的 影 响 报 告 基 因 的 使 用 为 转 基 因 研 究 带 来 了 许 多 便 利. 在 早 期 的 瞬 时 转 化 实 验 中, 由 于 使 用 的 GUS 报 告 基 因 既 可 以 整 合 到 受 体 植 株 中 表 达 也 可 以 在 农 杆 菌 中 表 达, 造 成 实 验 结 果 准 确 性 存 在 一 定 的 问 题. 为 [39] 此,Vancanneyt 等 通 过 基 因 重 组 技 术 对 GUS 基 因 进 行 了 改 造, 将 一 种 源 于 植 物 的 内 含 子 引 入 到 GUS 基 因 中, 构 建 了 一 个 嵌 合 基 因. 经 农 杆 菌 介 导 转 化 植 物 后, 这 种 重 组 的 嵌 合 基 因 在 高 等 植 物 细 胞 内 能 被 有 效 的 剪 接, 从 而 表 达 出 GUS 活 性. 作 为 原 核 细 胞, 农 杆 菌 缺 少 转 录 后 的 加 工 剪 接 机 制, 所 以 该 嵌 合 基 因 不 能 在 农 杆 菌 中 正 确 表 达, 无 法 表 现 出 GUS 活 性. 这 种 含 有 植 物 内 含 子 的 嵌 合 GUS 报 告 基 因 的 应

７６４ 中国生物化学与分子生物学报 用 消除了在农杆菌中表达 ＧＵＳ 的可能 使结果更 加准确可靠 ３ ２ 消除植物內源 ＧＵＳ 的影响 ＧＵＳ 基因被广泛使用的一个最主要的原因是最 初在高等 植 物 中 没 有 检 测 到 其 內 源 基 因 但 随 着 ＧＵＳ 的广泛使用 越来越多的研究者在进行 ＧＵＳ 活 性检测时 出现了假阳性或者检测出内源基因表达 的情况 ４０ ４８ １９９０ 年 Ｈｕ 等 ４９ 使用多种方法检测 了 ５２ 种植物的多个组织器官 发现其中存在与大肠 杆菌 ＧＵＳ 相似的酶类物质 １９９８ 年 Ｍｕｈｉｔｃｈ 等 ５０ 在检测玉米花梗中 ＧＵＳ 的表达时 发现在排除了内 共生细菌的干扰后 仍然能够检测到 ＧＵＳ 活性 表 明高等植物体确实具有 ＧＵＳ 的內源物 此后 更多 的研究相继对內源 ＧＵＳ 活性进行了报道 １４ ５１ ５４ 第 ３０ 卷 ＧＵＳ 检测缓冲液的 ｐｈ 和组织器官的生长成熟 度对 ＧＵＳ 活性的检测有重要的影响 ５５ 在中性 ｐｈ 时 大部分植物都不能定性的检测到內源 ＧＵＳ 的表 达 ＧＵＳ 在幼嫩和分生组织中的表达活性比老的和 成熟组织器官中的表达活性高 內源 ＧＵＳ 在生长 发 育 过 程 中 具 有 重 要 的 作 用 主 要 参 与 细 胞 延 伸 ５５ ５７ 细胞壁的动力学 ５４ 和次级代谢物的新陈代 谢 ４３ ４５ ５８ 等过程 对 ＧＵＳ 报 告 系 统 实 验 方 法 的 改 进 始 于 １９９２ 年 ５９ 之后又报道了许多改善的方法 ６０ ６６ 主要是 基于植物內源的 ＧＵＳ 与大肠杆菌 ＧＵＳ 的最适 ｐｈ 的不同 调整缓冲溶液的 ｐｈ 并加入一些有机溶剂 然而这些方法都不能完全的消除植物细胞內源的 ＧＵＳ 活 性 ６５ ６７ ２０１１ 年 Ａｂｄｏｌｌａｈｉ 等 ６８ 对 ＧＵＳ 的 Ｆｉｇ ３ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ＧＵＳ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ９６ ｒａｎｄｏｍ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ＧＵＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ９１ ｓｈｏｗ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ５ ｌｉｎｅｓ ｆａｉｌｅｄ ｔｏ ｓｈｏｗ ａｎｙ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ３７ Ｆｉｇ ４ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｈｏｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ＧＵＳ ＷＴ ｇｅｎｅ ｔｏｐ ａｎｄ ｔｈｅ ＧＵＳ ＴＲ３３７ ｇｅｎｅ ｂｏｔｔｏｍ Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｖａｒｉｏｕｓ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｘ Ｇｌｕ ａｔ ４５ ｔｏｐ ａｎｄ ６０ ｂｏｔｔｏｍ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ａ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂ ６０ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ Ｃ ６０ ｆｏｒ １０ ｍｉｎ Ｄ ６０ ｆｏｒ ２０ ｍｉｎ Ｅ ７０ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ Ｆ ７０ ｆｏｒ １０ ｍｉｎ ６９

第 8 期 杨 丹 丹 等 : GUS 报 告 系 统 在 植 物 基 因 功 能 研 究 中 的 应 用 和 优 化 765 检 测 方 法 进 行 了 改 进. 将 组 织 化 学 染 色 染 液 (0 5 mol / L NaH 2 PO 4 ; 0 1% Triton X 100; 10 mmol / L EDTA; 2 mmol / L X Gluc 和 0 78 μl 2 mercapto ethanol;1 mmol / L K 3 [ Fe( CN) 6 ]; 1 mmol / L K 4 [ Fe (CN) 6 ] 3H 2 O;)pH 调 整 为 8, 并 加 入 28% 甲 醇, 于 38 ( 不 同 植 物 的 最 适 孵 育 温 度 不 同, 如 油 菜 的 最 适 孵 育 温 度 55, 而 烟 草 为 45, 可 做 梯 度 预 实 验 选 取 不 同 的 温 度 孵 育 ), 黑 暗 孵 育 24 h. 这 种 方 法 可 以 明 显 的 降 低 內 源 GUS 对 实 验 产 生 的 干 扰, 提 高 实 [69] 验 的 可 信 度. 2011 年, Xiong 等 通 过 定 向 进 化 (directed evolution) 的 方 法 获 得 了 一 种 耐 高 温 的 GUS 变 体 ( variant) GUS TR3337 ( GenBank No. 513152). 这 种 变 体 在 经 过 80,30 min 的 处 理 后 依 然 可 以 检 测 到 活 性, 而 內 源 GUS 活 性 在 该 条 件 下 已 完 全 失 活. 因 此 以 这 种 GUS 变 体 构 建 报 告 系 统, 就 可 以 排 除 內 源 GUS 对 实 验 的 干 扰 ( Fig. 4). 使 用 这 种 GUS 变 体 报 告 系 统 时, 植 物 样 品 首 先 在 60 水 浴 处 理 20 min 或 者 70 水 浴 处 理 5 min, 然 后 在 染 液 (50 mmol / L sodium phosphate; ph7 0;0 5 mmol / L K 3 [Fe(CN) 6 ]; 0 5 mmol / L K 4 [ Fe( CN) 6 ] 3H 2 O; 1 mmol / L EDTA;0 1% Triton X 100;1 mg / ml X Glu;0 02% NaN 3 ) 中,60 黑 暗 孵 育 过 夜, 最 后 经 70% 酒 精 脱 色 后 观 察 结 果. 3 3 消 除 GUS 抑 制 因 子 的 影 响 [70] 1992 年,Rao 等 发 现 高 等 植 物 中 存 在 GUS 抑 制 因 子. 随 后, 其 它 高 等 植 物, 如 烟 草 [63] 小 麦 [71] [72] 康 乃 馨 等 植 物 中 也 相 继 报 道 了 GUS 抑 制 因 子 的 存 在. 目 前 已 报 道 的 GUS 抑 制 因 子 有 两 类, 一 类 是 非 蛋 白 类 物 质, 包 括 酚 类 化 合 物 黄 酮 醇 花 [73] 青 素 等 ; 另 一 类 是 Fior 等 发 现 的 小 于 10 kd 的 蛋 白 类 GUS 抑 制 因 子, 与 GUS 存 在 可 逆 的 竞 争 抑 制 [74] 关 系. 2011 年,Ramadan 等 也 报 道 了 小 麦 中 的 葡 糖 醛 酸 和 D 葡 糖 二 酸 1,4 内 酯 对 GUS 呈 现 很 强 的 抑 制 性, 且 与 其 浓 度 成 正 相 关. 鉴 于 GUS 抑 制 因 子 的 存 在 可 能 导 致 检 测 到 的 [61] GUS 活 性 数 据 出 现 偏 差, 其 中 Serres 等 在 检 测 蔓 越 莓 叶 片 中 GUS 活 性 时, 在 提 取 液 (150 mmol / L sodium phosphate, ph 7 0; 10 mmol / L Na 2 EDTA; 0 1% Triton X 100;10 mmol / L β mercaptoethanol; 0 1% N lauroylsarcosine ( sodium salt ); 25 μg / ml PMSF) 中 加 入 了 聚 乙 烯 聚 吡 咯 烷 酮 (PVPP), 消 除 酚 类 化 合 物 对 GUS 的 抑 制. 实 验 结 果 显 示, 这 种 方 法 可 以 提 高 GUS 酶 活 近 200 倍, 有 效 的 降 低 了 酚 类 化 合 物 对 GUS 的 影 响. 作 为 报 告 基 因,GUS 已 在 植 物 基 因 功 能 的 研 究 中 广 泛 的 应 用. 尽 管 GUS 在 应 用 中 也 存 在 一 些 问 题, 但 通 过 实 验 方 法 的 改 进 和 优 化,GUS 检 测 手 段 更 加 完 善. 但 是 一 些 问 题 仍 在 探 索 中, 如 建 立 一 种 简 单 有 效 可 以 被 广 泛 使 用 的 解 决 內 源 GUS 及 抑 制 因 子 干 扰 的 方 法 ; 将 GUS 应 用 于 活 体 实 验, 进 行 动 态 的 研 究 等. 相 信 随 着 技 术 的 进 步 和 改 善,GUS 必 将 在 转 基 因 植 物 研 究 中 继 续 发 挥 其 重 要 作 用. 参 考 文 献 (References) [ 1 ] Groskreutz D, Schenborn E T. Reporter systems[ J]. Methods Mol Biol, 1997, 63:11 30 [ 2 ] Alam J, Cook J L. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription [ J]. Anal Biochem, 1990, 188 (2):245 254 [ 3 ] Jefferson R A, Kavanagh T A, Bevan M W. GUS fusions: beta glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants [ J]. EMBO J, 1987, 6(13):3901 3907 [ 4 ] Novel G, Novel M. Mutants of E. coli K 12 unable to grow on methyl beta D glucuronide: map location of uid A. locus of the structural gene of beta D glucuronidase [ J]. Mol Gen Genet, 1973, 120(4):319 [ 5 ] Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system[ J]. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5(4):387 405 [ 6 ] Verhees J, van der Krol A R, Vreugdenhil D, et al. Characterization of gene expression during potato tuber development in individuals and populations using the luciferase reporter system[ J]. Plant Mol Biol, 2002, 50(4 5):653 665 [ 7 ] Miki B, Mchugh S. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety[ J]. J Biotechnol, 2004, 107(3):193 232 [ 8 ] Haseloff J, Siemering K R. The uses of green fluorescent protein in plants, In: Chalfie M, Kain S R. eds. Green fluorescent protein: properties, applications and protocals[ M]. 2 rd. New York: Wiley Liss, 1998:191 220 [ 9 ] Millar A J, Short S R, Chua N H, et al. A novel circadian phenotype based on firefly luciferase expression in transgenic plants[ J]. Plant Cell, 1992, 4(9):1075 1087 [10] Millar A J, Short S R, Hiratsuka K, et al. Firefly luciferase as a reporter of regulated gene expression in higher plants[ J]. Plant Mol Biol Rep, 1992, 10(4):324 337 [11] Van Leeuwen W, Hagendoorn M J, Ruttink T, et al. The use of the luciferase reporter system for in planta gene expression studies [J]. Plant Mol Biol Rep, 2000, 18(2):143 144 [12] 王 关 林, 方 宏 筠. 植 物 基 因 工 程 [ M]. 第 二 版. 北 京 : 科 学 出 版 社 ( Wang G L, Fang H J. Plant Genetic Engineering [ M ]. Beijing: Science Press),2004:518 523 [13] Crow R M, Gartland J S, Mchugh A T, et al. Real time GUS analysis using Q PCR instrumentation [ J ]. J Biolthechnol, 2006, 126(2):135 139

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