中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 3 期 2016 年 2 月 475 DNA 条 形 码 可 从 基 因 水 平 上 提 供 一 种 分 类 依 据 本 研 究 选 用 核 基 因 ITS2 片 段 和 叶 绿 体 基 因 ps

474 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 3 期 2016 年 2 月 木 瓜 属 药 用 植 物 DNA 条 形 码 鉴 定 研 究 张 艳 艳 1, 齐 红 2, 郭 庆 梅 1*, 孙 稚 颖 1, 周 凤 琴 1, 李 圣 波 1. 山 东 中 医 药 大 学, 山 东 济 南 250355 2. 济 南 市 食 品 药 品 检 验 检 测 中 心, 山 东 济 南 250001 3. 山 东 亚 特 生 态 技 术 有 限 公 司, 山 东 临 沂 266071 摘 要 : 目 的 对 木 瓜 属 药 用 植 物 进 行 ITS2 psba-trnh 序 列 分 析, 为 其 分 子 鉴 定 提 供 依 据 方 法 对 5 种 木 瓜 属 药 用 植 物 的 19 个 样 本 ITS2 序 列 进 行 PCR 扩 增 和 测 序, 用 MEGA6.0 计 算 其 种 间 种 内 的 Kimura 2-parameter(K2P) 距 离, 及 各 序 列 变 异 位 点 并 构 建 系 统 发 育 树, 并 预 测 ITS2 二 级 结 构 结 果 ITS2 序 列 间 存 在 明 显 差 异,psbA-trnH 序 列 间 也 存 在 稳 定 差 异 ; 构 建 的 系 统 发 育 树 显 示 木 瓜 属 的 不 同 基 原 样 本 各 聚 为 一 支, 能 很 好 将 5 种 植 物 区 分, 显 示 出 单 系 性 ; 比 较 木 瓜 属 5 种 植 物 的 ITS2 二 级 结 构 存 在 明 显 差 异 结 论 ITS 和 psba-trnh 序 列 可 以 有 效 准 确 鉴 别 5 种 木 瓜 属 植 物 关 键 词 : 木 瓜 属 ;DNA 条 形 码 ;ITS;psbA-trnH; 遗 传 距 离 中 图 分 类 号 :R282.12 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :0253-2670(2016)03-0474 - 06 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.03.021 Study on DNA barcoding of medicinal plants in Chaenomeles Lindl. ZHANG Yan-yan 1, QI Hong 2, GUO Qing-mei 1, SUN Zhi-ying 1, ZHOU Feng-qin 1, LI Sheng-bo 3 1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji nan 250355, China 2. Jinan Food and Drug Control/Testing Center, Jinan 250001, China 3. Shandong Yate Eco-tech Co. Ltd., Linyi 266071, China Abstract: Objective To provide evidence for the molecular identification of medicinal plants in Chaenomeles Lindl. Methods Nineteen ITS2 and psba-trnh sequence samples of five species in Chaenomeles Lindl. were PCR amplified and sequenced. The intra-specific and inter-specific K-2P distances were calculated, and cluster analysis was performed using Neighbor-joining (NJ) method by MEGA 6.0. Results The original plant of Chaenomeles Lindl. could be identified by the sequence differences of the ITS2 and psba-trnh sequences. Different samples of Chaenomeles Lindl. were gathered together and could be distinguished by NJ tree. There were significant differences among the ITS2 secondary structures in five species of Chaenomeles Lindl. Conclusion ITS2 and psba-trnh are efficient barcodes for the authentication of plants of Chaenomeles Lindl. Key words: Chaenomeles Lindl.; DNA barcoding; ITS; psba-trnh; genetic distance 3 木 瓜 属 Chaenomeles Lindl. 植 物 属 于 蔷 薇 科, 全 世 界 共 有 5 种, 包 括 木 瓜 Chaenomeles sinensis Koehne 皱 皮 木 瓜 C.speciosa (Sweet) Nakai. 毛 叶 木 瓜 C. cathayensis (Hemsl.) Schneid. 西 藏 木 瓜 C. thibetica Yü 及 日 本 木 瓜 C. japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach 木 瓜 为 一 味 传 统 中 药, 中 国 药 典 2010 年 版 规 定 : 木 瓜 为 蔷 薇 科 植 物 贴 梗 海 棠 ( 皱 皮 木 瓜 ) Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai. 的 干 燥 近 成 熟 果 实 我 国 是 木 瓜 属 植 物 起 源 中 心 和 分 布 中 心, 变 异 类 型 和 品 种 资 源 十 分 丰 富 木 瓜 属 植 物 形 态 变 异 较 大, 种 间 过 渡 性 状 多, 在 亲 缘 关 系 和 遗 传 多 样 性 的 研 究 中 存 在 诸 多 分 歧, 因 此 需 要 寻 求 一 种 快 速 且 准 确 的 方 法 进 行 鉴 别 DNA 条 形 码 鉴 定 技 术 是 通 过 比 较 一 段 通 用 DNA 片 段, 对 物 种 进 行 快 速 准 确 的 识 别 和 鉴 定 [1] 目 前 研 究 者 们 已 经 提 出 了 10 多 条 植 物 候 选 DNA 条 形 码 序 列 [2], 其 中 核 糖 体 DNA (nrdna) 中 的 ITS2 区 具 有 进 化 速 率 快 高 度 重 复 长 度 适 中 等 优 点, 成 为 药 用 植 物 DNA 条 形 码 研 究 中 最 为 重 要 候 选 序 列 之 一 [3] [4] Chen 等 分 析 比 较 了 7 个 候 选 DNA 条 形 码, 建 议 将 ITS2 作 为 药 用 植 物 标 准 DNA 条 形 码,psbA-trnH 作 为 ITS2 的 辅 助 序 列 对 药 用 植 物 进 行 鉴 定 对 于 木 瓜 属 物 种 在 分 类 学 中 难 以 区 分 的 类 群, 采 用 收 稿 日 期 :2015-05-08 基 金 项 目 : 国 家 科 技 支 撑 计 划 (2011BAI 06 B06); 山 东 省 科 技 发 展 计 划 项 目 (2011GSF 11904) 作 者 简 介 : 张 艳 艳, 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 中 药 质 量 控 制 与 资 源 研 究 E-mail: yan13579.com@qq.com * 通 信 作 者 郭 庆 梅, 女, 教 授, 博 士 生 导 师, 研 究 方 向 为 中 药 质 量 控 制 与 资 源 研 究 E-mail: qmguo@sina.com

中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 3 期 2016 年 2 月 475 DNA 条 形 码 可 从 基 因 水 平 上 提 供 一 种 分 类 依 据 本 研 究 选 用 核 基 因 ITS2 片 段 和 叶 绿 体 基 因 psba-trnh 片 段 对 木 瓜 属 植 物 进 行 DNA 分 子 鉴 定, 为 解 决 分 类 学 争 议 提 供 分 子 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 试 剂 及 仪 器 1.1.1 材 料 2014 年 4 月 在 山 东 亚 特 生 物 有 限 公 司 木 瓜 种 植 基 地 采 集, 采 摘 各 植 株 的 幼 嫩 叶 片, 硅 胶 干 燥 保 存 原 植 物 经 山 东 中 医 药 大 学 周 凤 琴 教 授 鉴 定 为 毛 叶 木 瓜 C. cathayensis (Hemsel) Schneid. 皱 皮 木 瓜 C. speciosa (Sweet) Nakai 日 本 木 瓜 C. japonica (Thunb.) Lindl ex Spach 西 藏 木 瓜 C. thibetica Y 和 光 皮 木 瓜 C. sinensis (Thouin) Koehne, 数 字 影 像 信 息 及 凭 证 标 本 保 存 于 山 东 中 医 药 大 学 实 验 样 品 材 料 见 表 1 表 1 样 品 信 息 Table 1 Samples information 编 号 材 料 登 录 号 XZ01 西 藏 木 瓜 YC0131MT01 XZ02 西 藏 木 瓜 Y0131CMT02 RB01 日 本 木 瓜 YC0132MT01 RB02 日 本 木 瓜 YC0132MT02 RB03 日 本 木 瓜 YC0132MT03 ZP01 皱 皮 木 瓜 YC0133MT01 ZP02 皱 皮 木 瓜 YC0133MT02 ZP03 皱 皮 木 瓜 YC0133MT03 ZP04 皱 皮 木 瓜 YC0133MT04 ZP05 皱 皮 木 瓜 YC0133MT05 ZP06 皱 皮 木 瓜 YC0133MT06 ZP07 皱 皮 木 瓜 YC0133MT07 ZP08 皱 皮 木 瓜 YC0133MT08 ZP09 皱 皮 木 瓜 YC0133MT09 GP01 光 皮 木 瓜 YC0134MT01 GP02 光 皮 木 瓜 YC0134MT02 MY01 毛 叶 木 瓜 YC0135MT01 MY02 毛 叶 木 瓜 YC0135MT02 MY03 毛 叶 木 瓜 YC0135MT03 1.1.2 试 剂 植 物 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 和 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 回 收 试 剂 盒 购 自 北 京 天 根 生 物 技 术 有 限 公 司 ;2 Master Mix ( Taq DNA Polymerase )( recombinant ); D2000 plus DNA Ladder(100~5 000)(Solarbio); 氯 仿 β- 巯 基 乙 醇 无 水 乙 醇 ( 山 东 禹 王 实 业 有 限 公 司 ); 引 物 由 上 海 生 工 有 限 公 司 合 成 1.1.3 仪 器 Takara PCR 扩 增 仪 (GJD35-TP600); DYY-8C 型 电 泳 仪 和 电 泳 槽 ( 北 京 六 一 仪 器 厂 ); 微 波 炉 ( 美 的 );ESJ 系 列 电 子 分 析 天 平 ; 数 显 恒 温 水 浴 锅 HH-4( 国 华 电 器 有 限 公 司 ); 离 心 机 ( 德 国 Eppendorf);KEDA 成 像 仪 及 操 作 系 统 ( 美 国 柯 达 公 司 ); 紫 外 分 析 仪 UV-2000( 上 海 天 能 科 技 有 限 公 司 ); DNA 测 序 仪 3730XL(Applied Biosystems 公 司 ) 1.2 方 法 1.2.1 DNA 提 取 实 验 材 料 均 为 硅 胶 干 燥 叶 片, 取 样 约 20 mg, 液 氮 充 分 研 磨, 利 用 DNA 提 取 试 剂 盒 提 取 DNA 1.2.2 PCR 扩 增 及 测 序 利 用 ITS2 psba-trnh 2 个 序 列 的 通 用 引 物 分 别 对 所 提 取 的 DNA 中 靶 序 列 进 行 PCR 扩 增 反 向 PCR 反 应 体 积 为 20 μl, 体 系 内 含 : 2 Taq master mix 12.5 μl ddh 2 O 9.5 μl 引 物 各 1 μl (2.5 μmol/l) DNA 模 板 1 μl(30 ng) 扩 增 程 序 为 94,5 min;94 30 s,56 30 s,72 45 s,40 个 循 环 ;72 10 min PCR 扩 增 产 物 电 泳 检 测 后, 切 胶 纯 化, 使 用 ABI 3730XL 测 序 仪 双 向 测 序 ITS psba-trnh 2 个 序 列 的 引 物 序 列 见 表 2 表 2 DNA 条 形 码 引 物 Table 2 DNA barcode primers information 序 列 引 物 名 称 引 物 序 列 (5 3 ) ITS2 2F ATGCGATACTTGGTGTGAAT ITS2 3R GACGCTTCTCCAGACTACAAT psba-trnh F GTTATGCATGAACGTAATGCTC psba-trnh R CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 1.2.3 数 据 处 理 测 序 峰 图 利 用 CodonCode Aligner V 2.06(CodonCode Co., 美 国 ) 校 对 拼 接, 去 除 引 物 区,ITS2 序 列 使 用 基 于 隐 马 尔 可 夫 模 型 的 HMMer 注 释 方 法 除 去 两 端 的 5.8S 和 28S 区 段 获 得 ITS2 间 隔 区 序 列 [5] psba-trnh 序 列 切 除 两 端 引 物 获 得 完 整 序 列 然 后, 将 所 有 序 列 用 软 件 MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)6.0 分 析 比 对 并 计 算 Kimura-2-parameter(K2P) 距 离, 用 NJ 邻 接 法 (neighbor-2-joining method) 构 建 系 统 发 育 树 利 用 相 似 性 搜 索 法 (BLAST1) 最 近 距 离 法 (Nearest distance) 等 方 法 进 行 鉴 定 分 析 利 用 bootstrap(1 000 次 重 复 ) 检 验 各 分 支 的 支 持 率 利 [6] 用 Schultz 等 建 立 的 ITS2 数 据 库 及 其 网 站 (http://its2.bioapps.ibiozentrum.uni-wuerzburg.de) 预 测 ITS2 二 级 结 构

476 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 3 期 2016 年 2 月 2 结 果 与 分 析 2.1 相 似 性 搜 索 法 鉴 定 结 果 进 入 NCBI 对 实 验 样 品 的 ITS2 psba-trnh 序 列 使 用 BLAST 方 法 进 行 鉴 定 和 序 列 验 证 [7], 结 果 显 示 实 验 样 品 与 木 瓜 属 查 询 序 列 的 相 似 度 达 96% 以 上, 此 鉴 定 结 果 说 明 实 验 药 材 样 本 来 源 于 蔷 薇 科 木 瓜 属 2.2 ITS2 序 列 种 内 种 间 比 较 分 析 木 瓜 属 5 种 不 同 种 质 植 物 ( 皱 皮 木 瓜 光 皮 木 瓜 西 藏 木 瓜 日 本 木 瓜 毛 叶 木 瓜 ) 序 列 比 对 后 长 度 为 225 bp,g+c 量 在 69.6%( 表 3) 对 比 实 验 中 木 瓜 属 19 个 样 本 的 种 间 ITS2 序 列 ( 图 1) 发 现 共 有 40 处 位 点 变 异, 其 中 光 皮 木 瓜 的 总 变 异 率 最 低 (0.88%), 毛 叶 木 瓜 的 总 变 异 率 最 高 (4.94%) 根 据 K2P 参 数 遗 传 距 离 模 型 计 算 得 到 种 间 最 大 遗 传 距 离 为 0.124, 在 光 皮 木 瓜 与 皱 皮 木 瓜 之 间 不 同 种 间 最 小 遗 传 距 离 0.005, 在 皱 皮 木 瓜 与 日 本 木 瓜 之 间, 说 明 这 2 种 亲 缘 关 系 较 近 种 内 遗 传 距 离 分 布 于 0~0.015 由 此 可 知 ITS2 序 列 可 以 用 于 木 瓜 属 植 物 的 分 子 鉴 定, 但 部 分 种 间 差 异 则 不 能 通 过 ITS2 序 列 的 位 点 碱 基 差 异 区 分 开 表 3 ITS2 序 列 信 息 Table 3 Main information of ITS2 sequences 物 种 全 长 /bp G+C/% 缺 失 率 /% ( 转 换 / 颠 换 )/% 总 变 异 率 /% 西 藏 木 瓜 221 69.0 1.77 0.90 2.67 日 本 木 瓜 221 69.1 1.77 0.45 2.22 皱 皮 木 瓜 222 69.6 1.33 2.25 3.58 光 皮 木 瓜 223 70.0 0.88 0.00 0.88 毛 叶 木 瓜 219 69.4 2.66 2.28 4.94 表 示 该 位 点 碱 基 缺 失, 下 同 means the site base deletion, same as below 图 1 木 瓜 属 植 物 的 ITS2 变 异 位 点 图 Fig. 1 Variable sites of ITS2 sequence of plants in Chaenomeles Lindl. 2.3 psba-trnh 序 列 种 内 种 间 比 较 分 析 对 比 过 程 中 发 现 各 物 种 的 psba-trnh 的 长 度 不 一, 序 列 长 度 变 异 从 260~313 bp 波 动,G+C 量 25.1%~28.5%, 见 表 4 对 序 列 进 行 分 析, 结 果 日 本 木 瓜 和 皱 皮 木 瓜 总 变 异 率 最 低 (0.64%), 毛 叶 木 瓜 的 总 变 异 率 最 高 (17.20%) 序 列 比 对 结 果 显 示 ( 图 2), 把 空 位 当 作 缺 失 发 现, 西 藏 木 瓜 和 毛 叶 木 瓜 2 个 种 在 162 bp 有 一 大 段 缺 失 53 个 碱 基, 与 皱 皮 木 瓜 相 比, 日 本 木 瓜 毛 叶 木 瓜 分 别 缺 失 1 个 碱 基, 光 皮 木 瓜 缺 失 4 个 碱 基, 种 间 的 位 点 变 异 较 少 木 瓜 属 psba-trnh 序 列 K2P 遗 传 距 离 分 布 于 0~0.036, 其 中 光 皮 木 瓜 与 皱 皮 木 瓜 的 K2P 遗 传 距 离 最 大, 毛 叶 木 瓜 和 西 藏 木 瓜 种 间 遗 传 距 离 为 0, 亲 缘 关 系 很 近, 与 ITS2 结 果 一 致 psba-trnh 种 间 平 均 K2P 遗 传 距 离 0.007, 种 内 最 大 遗 传 距 离 为 0.007 2.4 ITS2 序 列 二 级 结 构 从 木 瓜 属 5 个 种 的 二 级 结 构 比 较 可 以 看 出 不 同 基 原 植 物 间 ITS2 二 级 结 构 非 常 相 似, 均 由 一 个 中 心 环 及 4 个 螺 旋 (Helix) 区 构 成 ( 图 3), 比 较 木 瓜 属 二 级 结 构 发 现, 其 中 IV 区 较 为 保 守, 主 要 差 异 在 螺 旋 I II III 区, 其 中 光 皮 木 瓜 无 论 是 从 茎 环 (Loop) 的 数 目 大 小 角 度 和 长 度 等 方 面, 都 与 其 他 4 种 有 很 大 区 别 毛 叶 木 瓜 在 螺 旋 II 区 较 其 他 种 缺 少 一 个 茎 环, 日 本 木 瓜 在 螺 旋 I 区 多 一 个 茎 环, 不 同 物 种 间 茎 环 大 小 位 置 有 或 多 或 少 的 区 别, 见 图 中 方 框 所 示 因 此, 通 过 ITS2 二 级 结 构, 可 以 将 木 瓜 属 5 个 近 缘 种 直 观 地 鉴 别 出 来

中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 3 期 2016 年 2 月 477 表 4 psba-trnh 序 列 信 息 Table 4 Main information of psba-trnh sequences 物 种 全 长 /bp G+C/% 缺 失 率 /% ( 转 换 / 颠 换 )/% 总 变 异 率 /% 西 藏 木 瓜 260 28.5 16.90 0.00 16.90 日 本 木 瓜 312 25.3 0.32 0.32 0.64 皱 皮 木 瓜 313 25.8 0.00 0.64 0.64 光 皮 木 瓜 309 25.1 1.28 0.64 1.92 毛 叶 木 瓜 259 28.2 17.20 0.00 17.20 图 2 木 瓜 属 植 物 的 psba-trnh 变 异 位 点 图 Fig. 2 Variable sites of psba-trnh sequence of plants in Chaenomeles Lindl. I IV II III 皱 皮 木 瓜 日 本 木 瓜 西 藏 木 瓜 毛 叶 木 瓜 木 瓜 图 3 ITS2 二 级 结 构 比 较 Fig. 3 Comparison on secondary structure of ITS2 2.5 聚 类 分 析 木 瓜 属 植 物 分 布 广 泛, 种 间 性 状 交 叉 普 遍, 种 间 关 系 不 清 晰, 导 致 木 瓜 属 植 物 在 分 类 处 理 上 存 在 较 大 争 议, 而 基 于 DNA 条 形 码 序 列 构 建 木 瓜 属 系 统 发 育 树, 不 仅 能 通 过 树 形 图 分 支 结 果 判 断 物 种, 还 能 在 一 定 程 度 上 还 原 其 系 统 进 化 关 系 从 ITS2 序 列 聚 类 分 析 结 果 来 看 ( 图 4-A), 木 瓜 属 5 个 种 种 内 的 不 同 样 本 分 别 聚 为 一 支, 其 中, 样 本 中 皱 皮 木 瓜 聚 为 一 支, 后 与 日 本 木 瓜 分 支 聚 为 一 支, 呈 现 较 近 的 亲 缘 关 系 西 藏 木 瓜 与 毛 叶 木 瓜 分 支 聚 为 一 支 持 率 较 高 的 分 支, 亲 缘 关 系 较 高 而 光 皮 木 瓜 形 成 支 持 率 为 100% 单 独 分 支, 表 现 出 单 系 性, 与 其 他 同 属 能 够 很 明 显 区 分 开 依 据 ITS2 序 列 构 建 的 分 子 系 统 树 可 将 木 瓜 属 5 个 种 很 好 地 区 分 开 psba-trnh 序 列 的 NJ 树 ( 图 4-B) 中, 光 皮 木 瓜 与 其 他 种 间 呈 现 明 显 的 单 系 性 ; 日 本 木 瓜 毛 叶 木 瓜 皱 皮 木 瓜 种 质 品 种 内 优 选 聚 类 ; 西 藏 木 瓜 与

478 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 3 期 2016 年 2 月 Bootsrap 1 000 次 重 复, 仅 显 示 支 持 率 50% 的 分 支 Bootsrap 1 000 repeated, the support rate 50% were shown above branches 图 4 基 于 ITS2 (A) 和 psba-trnh (B) 序 列 构 建 NJ 树 Fig. 4 sequences A B ZP08 ZP09 ZP05 ZP01 ZP02 ZP06 ZP03 ZP07 ZP04 RB01 RB02 RB03 XZ01 XZ02 MY01 MY02 MY03 GP01 GP02 ZP03 ZP05 ZP01 ZP09 ZP04 ZP06 ZP08 ZP02 ZP07 XZ02 XZ01 MY03 MY01 MY02 RB01 RB02 RB03 GP01 GP02 NJ tree based on ITS2 (A) and psba-trnh (B) 毛 叶 木 瓜 种 质 共 聚 为 一 个 类 群, 表 明 2 个 物 种 间 亲 缘 关 系 密 切 日 本 木 瓜 种 质 与 皱 皮 木 瓜 种 质 亲 缘 关 系 较 远 皱 皮 木 瓜 种 质 聚 为 一 个 类 群, 但 与 ITS2 序 列 相 比 较, 种 内 样 品 在 树 状 图 中 位 置 不 稳 定 3 讨 论 木 瓜 属 植 物 变 异 类 型 多 变 异 幅 度 大, 种 间 杂 交 容 易, 传 统 的 形 态 分 类 鉴 别 法 并 不 能 完 全 区 分 各 种 质 资 源 近 年 来 随 着 分 子 生 物 学 的 不 断 发 展, 已 有 研 究 通 过 RAPD AFLP 及 SRAP 等 方 法 对 木 瓜 种 质 的 遗 传 多 样 性 进 行 了 分 析 [8-14], 但 在 种 间 种 内 显 示 出 的 多 态 性 程 度 并 不 完 全 一 致, 且 各 种 分 子 标 记 技 术 之 间 缺 乏 一 定 的 相 互 印 证 基 于 遗 传 物 质 DNA 的 条 形 码 鉴 定 技 术, 具 有 稳 定 可 靠 不 受 外 界 影 响 的 特 点, 是 一 种 新 的 分 子 生 物 鉴 定 技 术 本 实 验 应 用 DNA 条 形 码 技 术 测 定 了 木 瓜 属 的 ITS2 和 psba-trnh 序 列, 从 分 子 水 平 证 明 了 5 个 种 间 的 亲 缘 关 系 研 究 结 果 表 明,ITS2 序 列 在 木 瓜 不 同 种 质 个 体 间 存 在 丰 富 的 变 异,psbA-trnH 序 列 的 种 内 种 间 变 异 位 点 较 少 ITS2 序 列 种 内 种 间 的 K2P 遗 传 距 离 接 近, 说 明 遗 传 相 似 度 高, 亲 缘 关 系 较 近 psba-trnh 序 列 K2P 遗 传 距 离 显 示 光 皮 木 瓜 与 皱 皮 木 瓜 之 间 遗 传 距 离 最 远, 而 毛 叶 木 瓜 和 西 藏 木 瓜 种 间 遗 传 距 离 较 小, 亲 缘 关 系 紧 密, 与 ITS2 结 果 一 致 木 瓜 属 5 个 种 的 ITS2 二 级 结 构 存 在 明 显 不 同, 说 明 ITS2 二 级 结 构 有 助 于 更 直 观 地 鉴 定 物 种 本 研 究 中 ITS2 序 列 信 息 聚 类 结 果 与 psba-trnh 基 本 一 致,5 个 不 同 种 质 分 别 聚 为 一 支, 可 以 很 好 地 区 分 开, 其 中 4 个 种 的 亲 缘 关 系 较 近, 仅 有 光 皮 木 瓜 表 现 出 显 著 的 单 系 性 ;2 个 聚 类 图 中 西 藏 木 瓜 与 毛 叶 木 瓜 均 聚 为 一 支, 显 示 密 切 的 亲 缘 关 系, 本 研 [15] 究 支 持 王 明 明 等 对 木 瓜 属 品 种 亲 缘 关 系 的 SRAP [16] 分 析 的 研 究 结 果 同 时, 王 明 明 等 的 数 量 分 类 学 研 究 表 明 日 本 木 瓜 种 系 较 为 独 立, 与 psba-trnh 聚 类 结 果 基 本 一 致 ITS2 序 列 各 分 支 的 支 持 率 较 高, 在 物 种 水 平 的 鉴 定 成 功 率 高, 但 psba-trnh 序 列 各 分 支 的 支 持 率 不 高, 主 要 原 因 在 于 种 内 种 间 变 异 位 点 较 少, 各 品 种 区 分 度 不 高 以 上 结 论 说 明 采 用 以 ITS2 序 列 为 主,psbA-trnH 序 列 为 辅 的 鉴 定 方 法 能 够 从 分 子 角 度 区 分 木 瓜 属 的 种 间 遗 传 性, 对 于 探 讨 木 瓜 属 不 同 物 种 间 的 分 类 学 关 系 以 及 药 材 资 源 的 合 理 开 发 利 用 亦 具 有 重 要 的 参 考 价 值 本 研 究 结 果 验 证 了 ITS2 psba-trnh 序 列 在 木 瓜 属 的 鉴 别 能 力, 对 于 实 现 木 瓜 分 子 水 平 的 快 速 准 确 鉴 定 具 有 重 要 意 义, 可 为 研 究 木 瓜 种 质 资 源 的 起 源 和 进 化 提 供 参 考 本 研 究 中 DNA 条 形 码 候 选 序 列 ITS2 与 psba-trnh 片 段 表 现 了 较 好 的 物 种 鉴 定 能 力, 从 分 子 水 平 揭 示 木 瓜 属 各 种 间 的 亲 缘 关 系, 适 用 于 木 瓜 属 植 物 物 种 鉴 定 志 谢 : 山 东 省 农 业 科 学 研 究 院 生 物 信 息 中 心 王 兴 军 教 授 的 课 题 组 提 供 本 研 究 分 子 实 验 平 台

中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 3 期 2016 年 2 月 479 参 考 文 献 [1] Hebert P D, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identifications through DNA barcodes [J]. Proc Biol Sci, 2003, 270(1512): 313-321. [2] Ning S P, Yan H F, Gang H, et al. Current advances of DNA barcoding study in plants [J]. Biodiv Sci, 2008, 16: 417-425. [3] 陈 士 林, 姚 辉, 宋 经 元, 等. 基 于 DNA barcoding ( 条 形 码 ) 技 术 的 中 药 材 鉴 定 [J]. 世 界 科 学 技 术 中 医 药 现 代 化, 2007, 9(3): 7-12. [4] Chen S L, Yao H, Han J P, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species [J]. PLoS ONE, 2010, 5: e8613. [5] Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rrna interaction and HMM-based ITS2 annotation [J]. Gene, 2009, 430: 50-57. [6] Schultz J, Muller T, Achtziger M, et al. The internal transcribed spacer2 database-a web server for (not only) low level phylogenetic analyses [J]. Nucl Acids Res, 2006, 34: W704-W707. [7] 陈 士 林, 庞 晓 慧, 姚 辉, 等. 中 药 DNA 条 形 码 鉴 定 体 系 及 研 究 方 向 [J]. 世 界 科 学 技 术 中 医 药 现 代 化, 2011, 13(5): 747-754. [8] 陈 红, 张 雷, 吕 晓 贞, 等. 适 于 木 瓜 属 植 物 AFLP 分 析 用 DNA 提 取 方 法 研 究 [J]. 北 方 园 艺, 2008(12): 161-163. [9] 尹 长 虹, 马 燕, 臧 德 奎. 木 瓜 属 植 物 AFLP 分 析 体 系 的 建 立 与 应 用 [J]. 北 方 园 艺, 2010(13): 116-119. [10] 张 亚 利. 形 态 学 性 状 及 AFLP 标 记 在 木 瓜 海 棠 新 种 质 鉴 别 和 分 类 中 的 应 用 [J]. 江 苏 农 科 学, 2010(4): 145-147. [11] 陈 红. 木 瓜 属 种 质 资 源 的 RAPD AFLP 亲 缘 关 系 鉴 定 及 遗 传 多 样 性 分 析 [D]. 济 南 : 山 东 农 业 大 学, 2008. [12] 臧 德 奎, 陈 红, 郑 林, 等. 木 瓜 属 优 良 品 种 亲 缘 关 系 的 AFLP 分 析 [J]. 林 业 科 学, 2009(8): 39-43. [13] 夏 永 秀, 曾 秀 丽, 廖 明 安, 等. SRAP 在 西 藏 木 瓜 属 种 质 资 源 研 究 中 的 应 用 [J]. 果 树 学 报, 2010, 27(6): 1014-1018. [14] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theor Appl Genet, 2001, 103: 455-461. [15] 王 明 明, 陈 化 榜, 王 建 华, 等. 木 瓜 属 品 种 亲 缘 关 系 的 SRAP 分 析 [J]. 中 国 农 业 科 学, 2010(3): 542-551. [16] 王 明 明, 王 建 华, 宋 振 巧, 等. 木 瓜 属 品 种 资 源 的 数 量 分 类 研 究 [J]. 园 艺 学 报, 2009(5): 701-710.