國立宜蘭大學生物技術所

國 立 宜 蘭 大 學 生 物 技 術 研 究 所 Institute of Biotechnology National Ilan University 碩 士 論 文 Master Thesis 不 同 品 系 金 黃 色 葡 萄 球 菌 與 大 腸 桿 菌 對 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 敏 感 差 異 性 及 抗 菌 機 制 之 初 步 研 究 The preliminary study of antibacterial mechanism of low molecular weight chitosan by using differentially susceptible strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli 指 導 教 授 : 林 世 斌 博 士 Advisor:Shih-Bin Lin, Ph. D. 研 究 生 : 宮 紹 凱 Graduate Student:Shao-Kai Kung 中 華 民 國 九 十 七 年 九 月

誌 謝 時 光 飛 逝, 兩 年 的 研 究 所 生 涯 即 將 劃 下 句 點 回 首 這 段 日 子 從 只 會 執 行 實 驗 的 大 學 生, 慢 慢 學 著 收 尋 資 料 設 計 實 驗 思 考 解 決 問 題 及 清 楚 表 達 意 思, 讓 自 己 更 獨 立 與 成 熟 求 學 期 間, 首 先, 由 衷 感 謝 指 導 教 授 林 世 斌 博 士, 帶 領 著 學 生 進 入 廣 泛 深 奧 的 研 究 科 學 領 域 在 研 究 上 以 指 引 的 方 式 讓 自 己 學 習 思 考 與 設 計 實 驗, 並 總 是 能 在 遇 到 困 難 時 適 時 協 助 與 指 導, 口 試 與 論 文 提 交 時 期 不 厭 其 煩 的 批 閱 及 訂 正, 讓 研 究 表 示 的 更 加 通 順, 使 論 文 得 以 完 成 這 兩 年 的 細 心 指 導, 不 斷 著 學 習 著 身 為 科 學 人 應 有 的 學 習 精 神 思 考 方 式 與 處 事 態 度, 讓 我 獲 益 良 多 ; 在 生 活 上, 亦 師 亦 友 寒 暄 問 暖 運 動 聚 餐 等 紓 解 壓 力 的 相 處 模 式, 讓 老 師 與 學 生 間 不 在 總 是 像 傳 統 充 滿 著 緊 張 的 關 係 此 外, 特 別 感 謝 食 品 科 學 所 陳 莉 臻 老 師, 在 實 驗 室 方 面 總 是 給 予 學 生 良 好 與 充 裕 的 研 究 環 境, 教 導 學 生 管 理 與 接 洽 事 務 的 能 力, 平 時 總 以 學 姐 身 份 督 促 關 心 近 況 支 持 與 鼓 勵, 並 試 著 營 造 一 個 溫 馨 歡 樂 及 舒 適 的 實 驗 室, 讓 苦 悶 的 研 究 生 活 時 時 感 到 溫 暖 能 在 兩 年 內 提 交 初 稿 完 成 口 試 並 順 利 畢 業, 在 此 致 上 最 誠 摯 的 謝 意 研 究 與 論 文 撰 寫 期 間, 感 謝 陳 威 戎 等 生 物 技 術 所 老 師 陳 輝 煌 陳 時 欣 等 食 品 科 學 所 老 師 在 學 生 求 學 期 間 與 研 究 上 的 指 導 建 議 協 助 與 鼓 勵 台 灣 大 學 食 品 科 學 所 葉 安 義 老 師 本 校 化 材 所 及 動 物 所 即 時 提 供 實 驗 儀 器, 得 以 讓 實 驗 順 利 執 行 最 後 感 謝 陳 威 戎 老 師 陳 輝 煌 老 師 及 海 洋 大 學 食 品 科 學 所 蔡 敏 郎 老 師 能 於 百 忙 之 中 撥 冗 擔 任 擔 任 口 試 委 員, 悉 心 審 閱 批 改 論 文 及 在 口 試 過 程 提 出 寶 貴 意 見 與 指 導, 使 得 論 文 更 加 完 善, 以 上 所 有 幫 助 學 生 完 成 論 文 的 老 師 們, 有 你 們 的 熱 心 的 指 導 給 予 寶 貴 建 議 及 知 識 與 經 驗 的 傳 承, 讓 學 生 受 益 匪 淺 至 此 深 致 謝 枕 兩 年 研 究 生 活, 感 謝 一 起 奮 鬥 打 拼 的 先 進 與 夥 伴 們 已 畢 業 的 學 長 姐 山 禾 怡 君 小 曼 欣 湉 仕 達, 在 實 驗 上 無 私 教 導 所 學 的 技 術 與 實 驗 平 時 的 照 顧 與 鼓 勵, 讓 學 弟 快 速 進 入 研 究 生 狀 況 ; 生 技 所 同 儕 明 傑 彥 君 春 榮 譽 耀 楹 涵 等, 感 謝 常 提 供 最 新 資 訊 給 外 放 在 食 品 所 的 我, 回 想 起 考 前 的 讀 書 會 總 是 能 在 最 短 時 間 發 揮 最 大 的 讀 書 效 率, 也 很 開 心 能 在 每 個 禮 拜 專 討 後 的 午 餐 談 談 近 況 分 享 平 常 心 得 感 想 與 經 驗, 有 你 們 的 鼎 力 相 助 互 相 照 顧, 讓 我 在 食 品 所 都 能 感 受 到 無 比 的 關 心 ; 食 品 所 及 動 物 所 同 學 煌 展 束 筠 琇 如 明 德 等, 因 為 你 們 的 照 顧 幫 忙 以 及 帶 來 的 許 多 歡 樂, 讓 我 都 覺 得 已 經 快 成 為 食 品 所 成 員 ; 實 驗 室 工 讀 助 理 與 碩 士 級 學 弟 妹 鈺 翔 嘉 玟 容 安 宏 毅 芥 萍 雅 君, 謝 謝 你 們 時 時 關 心 學 長 的 身 心 狀 況 與 畢 業 進 度, 分 擔 實 驗 室 工 作 管 理 與 維 持 實 驗 室 運 作, 讓 我 不 用 經 常 操 煩 雜 事 而 能 專 心 做 實 驗 及 撰 寫 論 文, 並 順 利 畢 業 ; 實 驗 室 大 學 級 學 弟 妹 函 容 宜 蓁 于 婷 亦 綾 湘 婷 威 銓 鳳 儀 懿 慧 等, 雖 然 要 常 花 不 少 心 思 和 時 間 教 育 你 們, 但 也 因 此 學 習 如 何 以 更 好 的 方 式 教 導 他 人, 同 時 平 常 有 你 們 招 呼 飲 食 帶 來 許 多 歡 笑 並 陪 孤 單 的 學 長 聊 天, 讓 實 驗 室 增 加 合 諧 與 歡 樂 氣 氛, 減 緩 許 多 實 驗 與 課 業 的 壓 力 ; 大 學 時 期 的 朋 友 久 存 文 鈞 祐 宏 等, 當 初 大 家 一 起 玩 樂 唸 書 考 研 究 所, 有 你 們 的 相 互 扶 持 大 家 都 繼 續 升 學 並 朝 畢 業 及

理 想 邁 進, 感 謝 你 們 帶 給 我 許 多 歡 樂 回 憶 ; 另 外 也 感 謝 沒 點 到 名 或 在 課 業 及 生 活 上 幫 助 過 我 的 朋 友, 給 予 我 精 神 上 及 生 活 上 的 幫 助, 讓 我 能 更 加 順 利 完 成 學 業, 在 此 都 一 並 感 謝 最 後, 感 謝 摯 愛 的 家 人 父 親 母 親 哥 哥, 感 謝 父 母 對 我 之 照 顧 與 養 育 之 恩, 提 供 最 美 好 的 環 境 給 予 最 多 的 資 源 最 大 的 鼓 勵 與 支 持 在 遇 到 求 學 轉 折 與 瓶 頸 時, 適 時 給 予 最 大 的 幫 助 與 指 引, 讓 兒 子 在 生 活 和 求 學 期 間 無 後 顧 之 憂, 專 心 求 學, 得 以 完 成 學 業, 跟 隨 父 親 成 為 正 式 的 碩 士 生 ; 感 謝 家 兄, 雖 然 小 時 後 某 階 段 常 吵 架, 但 隨 年 齡 增 長 及 各 自 在 外 求 學, 讓 彼 此 更 珍 惜 兄 弟 之 情, 在 日 常 生 活 上 的 照 顧 與 關 心, 並 時 常 提 供 最 新 遊 戲 等 娛 樂 的 管 道, 舒 解 課 業 壓 力 ; 另 外 也 感 謝 關 心 我 的 親 戚 們, 在 我 就 學 期 間 不 斷 的 给 與 我 鼓 勵 與 支 持 謹 於 論 文 撰 寫 完 成 之 時, 以 此 兩 年 研 究 成 果 獻 給 親 愛 的 家 人 及 關 心 我 的 朋 友 們, 願 他 們 均 能 共 享 這 成 果 與 喜 悅 宮 紹 凱 謹 誌 於 國 立 宜 蘭 大 學 生 物 技 術 研 究 所 中 華 民 國 九 十 七 年 九 月

摘 要 幾 丁 質 (chitin) 幾 丁 聚 醣 (chitosan) 及 幾 丁 聚 醣 水 解 物 具 組 織 相 容 生 物 活 性 等 特 性, 近 年 來 在 生 物 技 術 生 物 醫 學 藥 理 農 業 等 領 域 上 受 到 廣 泛 的 重 視 本 實 驗 室 使 用 自 木 黴 菌 (Trichoderma viride, BCRC 32054) 誘 發 之 幾 丁 質 酶 (chitinase) 與 市 售 溶 菌 酶 (lysozyme) 及 纖 維 酵 素 (cellulase) 三 種 酵 素, 透 過 其 不 同 的 水 解 機 制, 對 不 同 去 乙 醯 度 (DD80 DD92) 的 幾 丁 聚 醣 進 行 水 解, 製 備 出 分 子 量 抗 菌 性 溶 解 度 電 荷 密 度 不 同 的 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 (LMWC) 幾 丁 聚 醣 的 去 乙 醯 度 明 顯 影 響 酵 素 的 水 解 行 為, 經 過 水 解 24 小 時 後, 各 組 合 產 生 之 LMWC 之 內 生 性 黏 度 分 子 量 (M V ) 大 小 排 列 依 序 為 :DD92_lys(24.8 kda) DD80_lys(14.8 kda) DD92_chit (13.5 kda) DD80_chit(9.6 kda) DD80_cel(8.1 kda) 及 DD92_cel (6.9 kda) LMWC 之 溶 解 度 與 其 分 子 量 大 小 相 關 而 與 其 製 備 所 使 用 之 酵 素 無 關 本 實 驗 以 96 微 孔 盤 抗 菌 試 驗 對 各 LMWC 進 行 抗 菌 試 驗, 結 果 顯 示 LMWC_lys 具 較 佳 的 抗 菌 效 果, 但 溶 解 度 不 佳, 而 LMWC_cel 雖 具 較 佳 的 溶 解 度, 但 不 具 抗 菌 效 果 利 用 DD92 及 chitinase 所 製 備 的 LMWC 則 有 高 溶 解 度 及 抗 菌 效 果, 故 選 擇 其 作 為 後 續 抗 菌 機 制 探 討 之 用 微 生 物 培 養 增 殖 分 析 儀 的 抗 菌 試 驗 乃 針 對 3 株 S. aureus (BCRC 10451 10780 10781) 及 2 株 E. coli (BCRC I

10314 10675) 進 行 探 討, 結 果 顯 示 不 同 品 系 的 菌 種 對 LMWC 具 不 同 程 度 的 敏 感 性 在 機 制 探 討 的 結 果 顯 示, 界 達 電 位 (zeta potential) 關 係 著 細 菌 與 LMWC 的 吸 附 力, 當 菌 體 的 負 電 荷 與 正 電 荷 的 LMWC 電 位 差 距 越 大, 其 彼 此 間 的 吸 附 力 也 跟 著 提 升, 導 致 抗 菌 性 也 有 增 強 透 過 SEM 觀 察, 對 LMWC 較 敏 感 的 品 系,S. aureus(bcrc 10451) 和 E. coli (BCRC 10314) 其 菌 體 表 面 會 被 LMWC 所 包 覆 若 將 細 菌 表 面 所 吸 附 的 LMWC 洗 去, 可 發 現 菌 體 遭 受 破 壞 及 孔 洞 形 成 而 菌 體 DNA 萃 取 的 分 析 結 果, 同 樣 指 出 BCRC 10780 的 DNA 最 難 萃 取, 意 味 著 其 細 胞 壁 可 能 較 原 本 堅 固, 不 易 破 壞 綜 合 上 述 結 果 推 測 細 菌 與 LMWC 作 用 後, 會 有 電 中 和 現 象, 且 彼 此 會 因 為 相 互 吸 附 使 得 細 菌 被 包 覆, 初 期 以 抑 制 細 菌 分 裂 達 到 抑 菌 的 效 果, 也 可 入 侵 造 成 細 菌 細 胞 壁 使 結 構 改 變, 造 成 細 菌 死 亡 關 鍵 字 : 幾 丁 聚 醣 低 分 子 量 幾 丁 聚 醣 幾 丁 質 酶 溶 菌 酶 纖 維 酵 素 抗 菌 活 性 II

Abstract Chitin, chitosan and chitosan hydrolysates possess histocompatibility and biological activity, in addition, they have been widely applied in the biotechnology, biomedical, pharmacological and agricultural fields recently. In this study, the low molecular weight chitosans (LMWCs) were prepared by using crude chitinase (induced from Trichoderma viride), commercial lysozyme and cellulase. Due to these enzymes have different hydrolysis mechanism on chitosan with different DD, a diverse characteristics of LMWC including Mw, antibacterial activity, solubility, zeta potential could prepared from DD of 80 and 92%. The intrinsic viscosity molecular weight (M V ) of LMWC form each of the combination was decreased steeply in 24 hours (from 370 kda to 13-37 kda) and, the order of M V were DD92_lys (24.8 kda), DD80_lys (14.8 kda), DD92_chit (13.5 kda), DD80_chit (9.6 kda), DD80_cel (8.1 kda) and DD92_cel (6.9 kda). The solubility of LMWC was affected strongly by Mw but not the enzyme by which LMWC was prepared. The minimum inhibition concentration (MIC) of LMWC was done by 96 microplate method. The results show that LMWC_lys has better antibacterial activity and poor solubility; in opposition, LMWC_cel had better solubility but ineffective antibacterial activity. The LMWC made from DD92 and chitinase had high solubility and good antibacterial activity. Therefore, the LMWC_DD92_chit was used for the following antibacterial activity study. The antibacterial activity test performed by using biophotorecorder method against three strains of S. aureus (BCRC 10451, 10780, 10781) and two strains of E. coli (BCRC 10314, 10675) revealed that various III

strains of antibacterial action of bacteria had different susceptibility to LMWC. The antimicrobial action of LMWC was strongly related to zeta potential. The more charge disparity between positive LMWC and negative bacteria, the more adsorptive power between each other, which led to higher antibacterial activity. SEM was used to observe the interaction between LMWC and the most sensitive strains S. aureus (BCRC 10451) and E. coli (BCRC 10314), and results revealed bacteria were heavily coated with LMWC. While the LMWC coat was washed away with acetic buffer, the surface integrity of bacteria was destroyed which resulted in the membrane poration on the surface. The bacterial DNA extraction analysis showed that DNA of BCRC 10780 was the most difficult to be extracted. It suggested that cell wall of BCRC 10780 was thicker, more rigid and not easy to be destroyed. In the early stage, the surface covering of LMWC can possibly cease cell division by charge neutralization. It could also invade into and cause deterioration of cell wall which leads bacteria to death. Key words : chitosan, low molecular weight chitosan, chitinase, lysozyme, cellulase, antibacterial activity IV

目 錄 中 文 摘 要...Ⅰ 英 文 摘 要...Ⅲ 目 錄...Ⅴ 圖 目 錄...Ⅸ 表 目 錄... XII 第 一 章 前 言...1 第 二 章 文 獻 回 顧...3 2.1. 幾 丁 質...3 2.2. 幾 丁 聚 醣...5 2.3. 幾 丁 聚 醣 水 解 物...6 2.3.1. 製 備 方 法...6 2.3.2. 化 學 法...7 2.3.3. 酵 素 法...7 2.3.4. 常 見 的 水 解 酵 素...7 2.3.4.1. 幾 丁 質 酶...8 2.3.4.2. 溶 菌 酶...9 2.3.4.3. 纖 維 酵 素...10 2.4. 幾 丁 聚 醣 及 其 水 解 物 的 功 能 與 應 用...12 V

2.4.1. 降 低 脂 肪 與 膽 固 醇...12 2.4.2. 提 高 免 疫 力...13 2.4.3. 抗 腫 瘤 活 性...13 2.4.4. 抗 氧 化 性...13 2.4.5. 促 進 傷 口 癒 合 凝 血...14 2.4.6. 幾 丁 聚 醣 及 其 水 解 物 的 抗 菌 活 性...14 2.5. 影 響 抗 菌 活 性 之 因 子...15 2.5.1. 去 乙 醯 度...15 2.5.2. 分 子 量...16 2.5.3. 溶 解 度...16 2.5.4. 電 荷 密 度...17 2.6. 目 前 研 究 的 抗 菌 機 制...17 2.7. 細 菌 細 胞 壁 的 介 紹...19 2.7.1. 革 蘭 氏 陽 性 菌...20 2.7.2. 革 蘭 氏 陰 性 菌...21 2.7.3. 革 蘭 氏 陽 性 菌 與 陰 性 菌 比 較...23 第 三 章 實 驗 材 料 與 方 法...24 3.1. 研 究 架 構...24 3.2. 實 驗 器 材...25 VI

3.2.1. 儀 器 及 設 備...25 3.2.2. 樣 品...26 3.2.3. 實 驗 菌 株...26 3.2.4. 藥 品 清 單...27 3.2.5. 商 購 酵 素...27 3.3. 實 驗 方 法...27 3.3.1. 幾 丁 質 酶 粗 酵 素 之 誘 發...27 3.3.2. LMWC 製 備...29 3.3.3. LMWC 分 析...29 3.3.3.1. 分 子 量 測 定...29 3.3.3.2. 溶 解 度...30 3.3.3.3. 粒 徑 與 界 達 電 位 分 析...30 3.4. 抗 菌 活 性 試 驗 與 機 制 探 討...31 3.3.4.1. 菌 株 培 養...31 3.3.4.2. 菌 種 鑑 定...31 3.3.4.3. 不 同 ph 值 培 養 條 件 下 的 影 響...32 3.3.4.4. 抑 菌 試 驗...32 3.3.4.5. 菌 體 吸 附 試 驗...33 3.3.4.6. 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡...33 VII

3.3.4.7. Genomic DNA 之 抽 取 ( 使 用 ZR Fungal/Bacterial DNA Kit 進 行 萃 取 )...34 第 四 章 結 果 與 討 論...36 4.1. LMWC 分 析...36 4.1.1. 分 子 量 與 粒 徑 變 化...37 4.1.2. 溶 解 度 測 定...38 4.1.3. 界 達 電 位 測 定...39 4.2. 水 解 產 物 抗 菌 活 性 分 析...40 4.2.1. 96 微 量 孔 盤 ( 微 量 試 驗 )...40 4.2.2. 微 生 物 培 養 增 值 分 析 儀 ( 增 量 試 驗 )...43 4.3. 菌 體 吸 附 試 驗...44 4.4. 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡...46 4.5. 菌 體 DNA 萃 取 分 析...49 第 五 章 總 結...50 第 六 章 圖 表...52 第 七 章 附 錄...71 第 八 章 參 考 文 獻...76 VIII

圖 目 錄 圖 一 幾 丁 質 結 構...4 圖 二 α- chitin 的 排 列 方 式...4 圖 三 β- chitin 的 排 列 方 式...4 圖 四 幾 丁 聚 醣 結 構...6 圖 五 在 酸 性 下 帶 正 電 荷 的 幾 丁 聚 醣...6 圖 六 幾 丁 質 酶 作 用 不 同 去 乙 醯 度 幾 丁 聚 醣 之 機 制...9 圖 七 溶 菌 酶 水 解 作 用 於 兩 種 型 態 的 幾 丁 聚 糖...10 圖 八 幾 丁 寡 糖 - 單 體 混 合 物 對 B.cereus 和 E. coli 的 殺 菌 反 應 模 擬 機 制...19 圖 九 革 蘭 氏 陽 性 菌 結 構...21 圖 十 革 蘭 氏 陰 性 菌 結 構...22 圖 十 一 分 子 量 變 化 對 溶 解 度 與 表 面 電 位 之 影 響...53 圖 十 二 三 種 品 系 金 黃 色 葡 萄 球 菌 在 濃 度 在 400 ppm LMWC_DD92_ chit 下 之 生 長 曲 線 圖...55 圖 十 三 三 種 品 系 金 黃 色 葡 萄 球 菌 在 濃 度 在 800 ppm LMWC_DD92_ chit 下 之 生 長 曲 線 圖...56 圖 十 四 二 種 品 系 大 腸 桿 菌 與 濃 度 在 100 ppm LMWC_DD92_chit 下 之 生 長 曲 線 圖...57 IX

圖 十 五 二 種 品 系 大 腸 桿 菌 與 濃 度 在 200 ppm LMWC_DD92_chit 下 之 生 長 曲 線 圖...58 圖 十 六 在 不 同 ph 值 下 金 黃 色 葡 萄 球 菌 BCRC 10451 的 生 長 情 形...59 圖 十 七 在 不 同 ph 值 下 金 黃 色 葡 萄 球 菌 BCRC 10780 的 生 長 情 形...60 圖 十 八 在 不 同 ph 值 下 金 黃 色 葡 萄 球 菌 BCRC 10781 的 生 長 情 形...61 圖 十 九 根 據 懸 浮 液 殘 菌 變 化 量 評 估 不 同 濃 度 LMWC 對 3 株 金 黃 色 葡 萄 球 菌 吸 附 作 用 變 化 情 形...62 圖 二 十 根 據 懸 浮 液 殘 菌 變 化 量 評 估 不 同 濃 度 LMWC 對 2 株 大 腸 桿 菌 吸 附 作 用 變 化 情 形...63 圖 二 十 一 正 常 狀 態 下 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 電 子 顯 微...64 圖 二 十 二 LMWC 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (BCRC 10451) 作 用 1 小 時 (A) 並 比 較 20 mm 醋 酸 緩 衝 液 沖 洗 後 (B) 的 電 子 顯 微 圖...65 圖 二 十 三 LMWC 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (BCRC 10781) 作 用 1 小 時 (A) 並 比 較 20 mm 醋 酸 緩 衝 液 沖 洗 後 (B) 的 電 子 顯 微 圖...66 圖 二 十 四 LMWC 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (BCRC 10780) 作 用 1 小 時 (A) 並 比 較 20 mm 醋 酸 緩 衝 液 沖 洗 後 (B) 的 電 子 顯 微 圖...67 圖 二 十 五 LMWC 與 大 腸 桿 菌 (BCRC 10314) 作 用 1 小 時 (A) 並 比 較 20 mm 醋 酸 緩 衝 液 沖 洗 後 (B) 的 電 子 顯 微 圖...68 圖 二 十 六 LMWC 與 大 腸 桿 菌 (BCRC 10675) 作 用 1 小 時 (A) 並 比 X

較 20 mm 醋 酸 緩 衝 液 沖 洗 後 (B) 的 電 子 顯 微 圖...69 圖 二 十 七 萃 取 3 株 金 黃 色 葡 萄 球 菌 DNA 並 比 較 其 量...70 XI

表 目 錄 表 一 利 用 幾 丁 質 酶 纖 維 素 溶 菌 酶 水 解 不 同 去 以 醯 度 幾 丁 聚 醣 所 製 備 之 水 解 產 物 及 其 物 理 特 性 探 討...52 表 二 E. coli 及 S. aureus 之 界 達 電 位 利 用 幾 丁 質 酶 纖 維 酵 素 溶 菌 酶 水 解 所 製 備 的 LMWC 之 最 低 抑 制 濃 度 的 關 係...54 表 三 界 達 電 位 分 散 體 系 穩 定 的 標 誌...71 表 四 3 株 金 黃 色 葡 萄 球 菌 Biolog 之 GP2 MicroPlate 微 生 物 鑑 定 套 組 的 96 種 碳 水 化 合 物 生 化 特 性 試 驗 結 果...72 XII

第 一 章 前 言 幾 丁 質 (Chitin) 為 蝦 蟹 殼 的 主 要 成 分, 在 我 國 傳 統 醫 學 對 蝦 蟹 殼 的 藥 食 作 用 有 所 研 究, 包 括 神 農 本 草 經 本 草 綱 目 食 療 本 草 日 華 子 本 草 等 都 記 載 幾 丁 質 的 各 方 面 藥 性 1811 至 1823 年 間, 法 國 科 學 家 首 度 將 幾 丁 質 從 蕈 菇 類 植 物 及 甲 殼 類 外 殼 中 分 離 出 並 命 名, 至 今 已 有 百 餘 年 歷 史 幾 丁 質 ( 甲 殼 素 ) 在 自 然 界 產 量 豐 富, 但 先 前 並 未 廣 泛 被 應 用, 直 至 1980 年 代, 科 學 家 發 現 幾 丁 質 在 生 化 科 技 上, 具 有 多 項 獨 特 的 用 途, 如 抗 菌 劑 除 臭 劑 生 醫 材 料 等 幾 丁 質 通 常 是 從 蝦 蟹 外 殼 中 提 煉 出, 如 此 不 僅 是 將 剩 餘 廢 棄 物 做 利 用, 減 低 對 環 境 的 污 染, 同 時 還 增 加 經 濟 價 值 的 利 用 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 具 抗 菌 等 特 性, 使 其 在 應 用 上 更 被 關 注, 目 前 在 微 生 物 防 治 上 的 主 要 應 用 包 括 防 治 植 物 病 原 菌 防 止 食 品 病 原 菌 生 長 和 延 長 食 品 保 存 期 等, 有 發 展 成 天 然 殺 菌 劑 的 潛 力 儘 管 幾 丁 聚 醣 具 有 許 多 生 物 活 性, 但 是 由 聚 分 子 所 鍵 結 的 高 分 子 長 鏈 造 成 水 溶 性 低 的 問 題, 限 制 其 在 醫 藥 及 食 品 工 業 上 的 發 展, 降 低 分 子 量 提 高 溶 解 度 又 能 維 持 其 生 物 活 性, 為 研 究 的 重 要 目 標 之 一 本 研 究 利 用 不 同 酵 素 ( 以 Trichoderma viride 誘 發 之 幾 丁 質 酶 粗 酵 素 液 溶 菌 酶 纖 維 酵 素 ), 水 解 不 同 去 乙 醯 度 的 幾 丁 聚 醣 然 而 各 組 合 產 生 1

之 LMWC, 其 特 性 皆 有 所 不 同, 篩 選 出 既 不 影 響 抗 菌 性 又 能 提 升 溶 解 度 的 水 解 產 物, 進 而 透 過 不 同 品 系 菌 種 對 LMWC 的 敏 感 性 差 異, 利 用 界 達 電 位 菌 體 吸 附 力 SEM 等 方 法, 探 討 其 抗 菌 機 制 2

第 二 章 文 獻 回 顧 2.1. 幾 丁 質 幾 丁 質 為 葡 萄 糖 的 衍 生 物, 是 一 種 類 似 纖 維 素 的 高 分 子 聚 合 物, 其 不 同 之 處 在 二 號 碳 上 所 接 的 是 乙 醯 胺 基 (acetyl amino group), 由 N-acetyl-glucosamine 以 β-1,4 鍵 結 合 所 組 成 的 直 鏈 聚 合 物 ( 圖 一 ) 幾 丁 質 是 自 然 界 中 僅 次 於 纖 維 素 的 天 然 聚 合 物, 此 結 構 廣 泛 的 存 在 於 節 肢 動 物 ( 甲 殼 類 昆 蟲 ) 的 外 殼 及 真 菌 藻 類 的 細 胞 壁, 此 外 也 會 在 少 數 低 等 動 植 物 界 中, 具 保 護 與 支 持 生 物 體 的 結 構 (Shahidi et al., 1999; Ravi Kumar, 2000; Rinaudo, 2006) 幾 丁 質 普 遍 存 在 很 多 生 物 體 中, 但 會 隨 著 來 源 不 同 而 有 所 差 異, 在 自 然 狀 態 下 可 依 其 晶 體 結 構 排 列 方 式 而 有 三 種 不 同 的 形 式, 分 為 α- chitin β- chitin 和 γ- chitin α- chitin( 圖 二 ) 為 反 平 行 (anti-parallel, ) 的 雙 股 螺 旋 多 醣 鏈, 可 形 成 較 多 的 分 子 間 及 分 子 內 氫 鍵, 使 得 構 型 較 為 緊 密 穩 定, 自 然 界 中 此 類 型 的 幾 丁 質 最 為 普 遍, 大 部 分 的 昆 蟲 或 蝦 蟹 等 甲 殼 類 外 殼 的 幾 丁 質 即 屬 此 類 而 β-chitin( 圖 三 ) 的 雙 股 螺 旋 多 醣 鏈 為 對 稱 平 行 (parallel, ) 排 列 所 形 成 的 晶 型, 其 分 子 間 及 分 子 內 氫 鍵 較 少, 故 構 造 較 為 鬆 散, 存 在 於 魷 魚 軟 骨 或 烏 賊 軟 骨 中 的 幾 丁 質 屬 於 此 類 而 γ-chitin 則 為 α- 型 及 β- 型 的 混 3

合 體, 多 醣 鏈 之 間 為 上 下 相 互 排 列 ( ), 主 要 存 在 一 般 藻 類 和 真 菌 類 細 胞 壁 結 構 中 (Minke and Blackwell, 1978; Wood and Kellogg, 1988; Uragami and Tokura, 2006) 圖 一 幾 丁 質 結 構 圖 二 α - chitin 的 排 列 方 式 圖 三 β - chitin 的 排 列 方 式 4

2.2. 幾 丁 聚 醣 幾 丁 聚 醣 ( 圖 四 ) 是 由 葡 萄 糖 胺 (D-glucoseamine) 以 β -(1-4) 鍵 結 而 成 的 高 分 子 多 醣 類, 將 幾 丁 質 經 過 去 乙 醯 作 用 所 製 成 的 產 物, 去 乙 醯 度 (degree of deacetylation, DD) 大 於 40-50% 即 可 稱 為 幾 丁 聚 醣, 一 般 幾 丁 聚 醣 的 去 乙 醯 程 度 介 於 65%-99%(Muzzarelli and Rocchetti, 1985) 目 前 去 乙 醯 的 方 式 有 :(1) 熱 鹼 處 理 法 : 利 用 高 溫 強 鹼 的 反 應 環 境 進 行 去 乙 醯 化 作 用, 其 去 乙 醯 程 度 明 顯 受 不 同 鹼 濃 度 反 應 溫 度 高 低 及 時 間 影 響, 此 方 法 最 快 速 簡 單 且 成 本 低, 但 所 得 幾 丁 聚 醣 品 質 及 物 化 特 性 較 不 穩 定, 易 造 成 環 境 污 染 (2) 酵 素 法 : 利 用 幾 丁 質 去 乙 醯 酵 素 (chitin deacetylase) 進 行 去 乙 醯 作 用, 產 物 較 穩 定 且 低 污 染, 但 作 用 時 間 長 且 反 應 效 率 低 (3) 真 菌 發 酵 法 : 許 多 絲 狀 真 菌 的 細 胞 壁 中, 含 有 幾 丁 質 或 幾 丁 聚 醣, 此 方 法 的 產 物 品 質 穩 定 純 度 高, 但 技 術 尚 未 純 熟 仍 尚 待 研 發 因 此, 以 其 中 處 理 時 間 較 短 的 熱 鹼 法 最 為 常 用 (Kurita et al., 1977; 陳, 2001; 王, 2003) 幾 丁 質 和 幾 丁 聚 醣 不 溶 於 中 性 及 鹼 性 溶 劑 中, 但 幾 丁 聚 醣 可 以 溶 在 弱 酸 性 或 酸 性 的 有 機 酸 及 無 機 酸 中, 溶 在 酸 性 狀 態 下 使 得 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 會 成 為 陽 電 荷 聚 電 解 質 (-NH + 3 )( 圖 五 ), 這 也 是 幾 丁 聚 醣 較 幾 丁 質 具 有 生 物 活 性 且 更 能 應 用 的 原 因 之 ㄧ 幾 丁 聚 醣 具 有 生 物 降 解 性 生 物 相 容 性 和 無 毒 等 特 性, 在 許 多 領 5

域 都 有 應 用 的 潛 力, 包 含 食 品 (Shahidi and Synowiecki, 1991) 化 妝 品 (Ravi Kumar, 2000) 生 物 醫 學 (Felt et al., 1998) 農 業 (Yamada et al., 1993) 環 保 產 品 (Peniche-covas et al., 1987) 和 廢 水 處 理 (Jeuniaux,1986) 等 圖 四 幾 丁 聚 醣 結 構 圖 五 在 酸 性 下 帶 正 電 荷 的 幾 丁 聚 醣 2.3. 幾 丁 聚 醣 水 解 物 (chitosan hydrolysate) 2.3.1. 製 備 方 法 幾 丁 質 及 幾 丁 聚 醣 降 解 方 法 有 酵 素 法 (Kuroiwa et al., 2002; Zhang et al., 1999) 化 學 酸 水 解 法 (Il'ina and Varlamov, 2004) 化 學 酵 素 法 (Akiyama et al., 1995) 氧 化 降 解 法 (Mao et al., 2004) 超 音 波 與 剪 力 降 解 法 (Chen and Chen, 2000) 及 高 速 微 射 流 降 解 法 等 6

( 吳, 2002; Kim and Rajapakse, 2005), 其 中 化 學 及 酵 素 法 最 廣 為 使 用 2.3.2. 化 學 法 化 學 法 為 降 解 幾 丁 聚 醣 的 傳 統 方 法, 常 使 用 鹽 酸 (Kendra and Hadwiger, 1984) 磷 酸 (Hasegawa et al., 1993), 亦 有 研 究 使 用 硝 酸 (Allan and Peyron, 1995a,b) 硫 酸 醋 酸 等 來 破 壞 醣 苷 鍵, 此 方 法 處 理 時 間 短 且 操 作 簡 單, 成 本 低 適 合 大 量 製 備, 然 而 酸 水 解 為 隨 意 的 水 解 方 式, 反 應 條 件 不 易 掌 控, 其 產 品 再 現 性 低, 同 時 製 備 過 程 大 量 酸 性 廢 液 不 但 會 造 成 環 境 污 染, 中 和 反 應 後 會 造 成 鹽 類 的 殘 留 2.3.3. 酵 素 法 酵 素 法 為 利 用 生 物 性 的 酵 素 來 水 解 幾 丁 質 或 幾 丁 聚 醣, 此 方 法 沒 有 鹽 類 殘 留 問 題, 產 量 較 高, 再 現 性 也 較 佳, 缺 點 則 是 成 本 偏 高 2.3.4. 常 見 的 水 解 酵 素 用 來 水 解 幾 丁 質 之 酵 素 稱 為 幾 丁 質 水 解 酵 素 (chitinolytic enzymes), 主 要 分 為 兩 大 類 : 專 一 性 酵 素 (specific enzyme) 及 非 專 一 性 酵 素 (non-specific enzyme) 專 一 性 酵 素 為 幾 丁 質 酶 (chitinase), 多 以 膠 體 幾 丁 質 誘 發 菌 體 所 產 生 常 見 的 幾 丁 質 酶 產 生 菌 有 Streptomyces griseus(aiba, 1994a) Trichoderma harzianum, Rhizoctonia solani(del Soglio et al., 1998) B. licheniformis SK-1, B. 7

cepacia TU09(Pichyangkura et al., 2002) Aeromonas hydrophila H-2330(Sashiwa et al., 2002) Penicillium aculeatum NRRL 2129 (Binod et al., 2005) Lecanicillium fungicola(ramírez-coutiño et al., 2006) 等 菌 株 而 非 專 一 性 酵 素 多 為 目 前 市 售 可 利 用 來 降 解 幾 丁 聚 醣 的 商 業 酵 素, 如 lysozyme(aiba, 1992; 1994b) cellulase, α-amylase, proteinase(zhang et al., 1999) hemicellulase, lipase, pectinase (Sukwattanasinitt et al., 2002; Sashiwa et al., 2003) pepsin, papain, (Ilankovan et al., 2006) 等 酵 素 2.3.4.1. 幾 丁 質 酶 最 近 幾 年, 能 製 造 chitinase 的 微 生 物 被 認 為 對 真 菌 和 線 蟲 所 引 起 的 農 作 物 疾 病, 有 很 好 的 生 防 治 作 用, 在 植 物 中 存 在 的 chitinase 通 常 被 認 為 是 抵 抗 外 來 病 原 體 的 一 種 自 我 防 禦 機 制, 其 chitinase 表 現 和 外 界 環 境 刺 激 有 關, 如 : 真 菌 的 入 侵 滲 透 壓 的 改 變 或 與 成 長 的 階 段 有 關, 如 : 果 實 的 成 熟 ( 鐘, 2004) 這 類 的 酵 素 屬 於 glycosidases(ec 3.2.1.14), 用 在 切 斷 glycosidic bond,chitinase 依 其 催 化 功 能 區 (catalytic domain) 被 歸 類 於 family 18 和 19 中 若 根 據 其 特 性 以 及 作 用 方 式 的 不 同 則 可 以 分 為 二 大 類 : 一 為 endochitinase(ec 3.2.1.14), 可 以 隨 機 將 大 分 子 chitin 由 中 間 切 開, 成 水 解 成 較 小 片 段 的 chitosan; 另 一 類 為 exochitinase, 可 分 為 兩 種 : 8

chitobiosidases(ec 3.2.1.29), 兩 者 可 分 別 從 小 分 子 chitin 之 非 還 原 端 (non-reducing end) 水 解, 釋 放 出 dimer 及 N-acetyl-glucosaminidases(EC 3.2.1.30)(Patil et al., 2000) 圖 六 為 幾 丁 質 酶 降 解 幾 丁 質 之 水 解 機 制 (Aiba, 1994a) (a) 為 去 乙 醯 度 90% (b) 為 去 乙 醯 度 70% (c) 為 去 乙 醯 度 50%, 白 圈 所 代 表 的 為 glucosamine, 黑 圈 代 表 的 為 N-acetyl-D- glucosamine, chitinase 能 隨 意 的 從 N-acetyl-D- glucosamine 端 將 切 除 glycosidic bond, 而 無 法 從 glucosamine 的 還 原 端 進 行 水 解 圖 六 幾 丁 質 酶 作 用 不 同 去 乙 醯 度 幾 丁 聚 醣 之 機 制 (Aiba, 1994a) 2.3.4.2. 溶 菌 酶 溶 菌 酶 (EC 3.2.1.17) 是 醣 苷 水 解 酶, 分 子 量 為 14-15 kda, 等 電 點 為 11 溶 菌 酶 以 溶 解 革 蘭 氏 菌 的 細 胞 壁, 使 其 崩 壞 而 產 生 溶 菌 作 用 其 機 制 是 在 於 能 水 解 N- 乙 醯 葡 萄 胺 醣 與 N- 乙 醯 壁 酸 之 間 的 ß-1.4 醣 苷 鍵, 也 因 此 命 名 為 溶 菌 酶 溶 菌 酶 發 揮 溶 菌 作 用 的 最 適 ph 值 在 8.0-9.0 左 右 (Davies et al., 1969), 其 最 佳 反 應 溫 度 和 進 行 溶 菌 作 用 溫 度 相 同, 條 件 皆 在 50 範 9

圍 內 溶 菌 酶 在 ph 1.2~11.3 的 廣 泛 範 圍 內, 都 沒 有 發 現 溶 菌 酶 活 性 有 任 何 改 變, 因 此 溶 菌 酶 對 酸 鹼 度 的 變 化 不 敏 感 目 前 已 證 實 溶 菌 酶 必 須 有 三 至 六 個 N- 乙 醯 葡 萄 胺 醣 才 具 有 水 解 切 點 ( 圖 七 )(Aiba, 1992) 而 以 lysozyme 作 為 水 解 酵 素 時, 最 佳 的 水 解 樣 品 其 去 乙 醯 度 為 56%, 當 樣 品 去 乙 醯 度 為 11% 或 97% 時 均 無 法 水 解 (Kurita et al., 2000) 圖 七 溶 菌 酶 水 解 作 用 於 兩 種 型 態 的 幾 丁 聚 糖 ( )N- 乙 醯 -D- 葡 萄 胺 醣,( )D- 葡 萄 胺 醣,(E) 溶 菌 酶 (Aiba, 1992) 2.3.4.3. 纖 維 酵 素 纖 維 酵 素 為 一 複 合 酵 素, 可 將 不 具 溶 解 性 的 纖 維 素 分 解 成 單 糖 (Wood, 1985), 於 蝸 牛 的 消 化 液 吃 木 質 部 的 昆 蟲 類 微 生 物 等 含 有 此 酵 素, 而 反 芻 動 物 則 是 其 腸 道 內 的 微 生 物 會 產 生 纖 維 酵 素, 故 可 分 解 纖 維 素 該 酵 素 系 統 包 括 三 大 型 式 : (1) 內 切 型 纖 維 素 纖 維 分 解 酵 素 (Endo-β-1,4-D-glucanase,E.C. 3.2.1.4): 內 切 型 纖 維 素 纖 維 分 解 酵 素 又 稱 為 Cx CMCase 10

carboxymethylcellulase endoglucanase β-1,4-d-glucanhydrolase β-1,4-d-glucan-4-glucanhydrolase, 為 一 種 glycoprotein, 分 子 量 約 為 53 kda~145 kda 該 酵 素 之 可 以 作 用 在 纖 維 素 內 部 的 非 結 晶 區, 以 非 特 異 性 的 方 式 打 斷 纖 維 素 的 β-1,4 鍵 結, 減 少 纖 維 素 聚 合 度 之 程 度, 並 得 水 解 產 物 葡 萄 糖 纖 維 二 糖 纖 維 糊 精, 也 可 分 解 羧 甲 基 化 纖 維 素 (CMC) (2) 外 切 型 纖 維 素 纖 維 分 解 酵 素 (exo-β-1,4-d-glucanase,e.c. 3.2.1.91): 外 切 型 纖 維 素 纖 維 分 解 酵 素 又 稱 C 1 avicelase cellobiohydrolase exocellobiohydrolase cellulose-β-1,4-glucancellobiohydrolase 或 Exo-glucanase, 也 是 為 一 種 glycoprotein, 分 子 量 約 為 42 kda - 65 kda ( 吳, 2005) 該 酵 素 此 酵 素 可 分 解 結 晶 型 纖 維 素, 亦 可 從 纖 維 素 的 非 還 原 端 開 始 降 解, 每 次 以 纖 維 二 醣 為 一 單 位 水 解 成 纖 維 二 糖, 與 內 切 酶 共 同 作 用 時, 對 分 解 結 晶 型 纖 維 素 具 有 良 好 的 效 果 ( 程, 2001) (3) β- 葡 萄 醣 苷 酵 素 (β-1,4-d-glucosidase, E.C. 3.2.1.21.): β- 葡 萄 醣 苷 酵 素, 亦 稱 為 β-glucosidase cellobiase 或 β-1,4-glucohydrolase, 同 樣 是 一 種 glycoprotein, 分 子 量 約 為 50 kda - 410 kda 此 酵 素 是 針 對 纖 維 雙 醣 或 纖 維 寡 醣 自 非 還 原 端 以 葡 萄 糖 為 一 個 單 位 水 解 ( 尤, 2003; 吳, 2005) 此 外, 該 酵 素 可 水 解 纖 維 二 醣 和 水 溶 性 11

cello-oligosaccharides 變 成 葡 萄 糖, 而 減 少 纖 維 二 醣 對 Cx 酵 素 或 C l 酵 素 抑 制 作 用, 而 β-glucosidase 的 活 性, 亦 會 受 產 物 葡 萄 糖 的 抑 制 2.4. 幾 丁 聚 醣 及 其 水 解 物 的 功 能 與 應 用 幾 丁 質 與 幾 丁 聚 醣 與 生 物 體 細 胞 有 良 好 的 生 物 相 容 性, 不 具 毒 性 且 可 以 被 生 物 體 分 解, 並 具 有 生 物 活 性, 因 此 可 應 用 的 領 域 非 常 廣 泛, 包 括 機 能 保 健 食 品 醫 藥 用 品 食 品 加 工 化 妝 品 紡 織 環 保 農 業 化 學 工 業 及 抗 菌 等 在 醫 藥 方 面, 可 作 為 人 造 皮 膚 創 傷 敷 材 和 手 術 縫 紉 線 等 醫 療 用 品 在 保 健 食 品 方 面, 有 增 強 免 疫 及 防 止 老 化 等 效 果 於 食 品 加 工 上, 可 作 為 防 腐 劑 結 合 劑 等 在 農 業 上, 屬 於 無 公 害 農 藥 且 能 促 進 植 物 之 生 長 在 化 工 應 用 上, 可 用 於 製 造 保 濕 化 妝 品 或 機 能 性 紡 織 品 在 環 保 應 用 上, 能 淨 化 水 質 和 吸 附 重 金 屬 在 生 醫 材 料 應 用 上, 可 作 為 藥 物 或 營 養 素 之 控 制 釋 放 性 擔 體 (delivery system) 或 抗 菌 化 材 ( 莊, 2006), 以 下 介 紹 其 幾 個 重 要 生 理 活 性 : 2.4.1. 降 低 脂 肪 與 膽 固 醇 幾 丁 聚 醣 本 身 的 正 電 荷 會 與 帶 負 電 的 脂 肪 結 合, 形 成 膠 狀 物 質, 因 此 阻 斷 脂 肪 被 小 腸 吸 收 代 謝 (Deuchi et al., 1994;Ormrod et al., 1998), 目 前 市 面 常 有 所 謂 減 肥 之 健 康 食 品 甲 殼 素, 便 是 利 用 此 特 性 降 低 脂 肪, 並 配 合 適 當 飲 食 及 運 動 達 到 減 重 瘦 身 效 果 ( 袁, 2000) 12

2.4.2. 提 高 免 疫 力 幾 丁 質 類 物 質 能 夠 增 進 免 疫 球 蛋 白 的 活 性, 誘 發 巨 噬 細 胞, 有 助 於 增 強 免 疫 系 統 (Maeda et al., 1992;Shibata et al., 1997) 2.4.3. 抗 腫 瘤 活 性 有 研 究 指 出 幾 丁 質 及 其 衍 生 物 具 有 抑 制 腫 瘤 細 胞 生 長 的 特 性, 其 會 在 腫 瘤 細 胞 外 圍 形 成 一 個 膜, 導 致 腫 瘤 細 胞 生 長 受 到 限 制 (Saiki et al.,1990;tsukada et al., 1990) 此 外 也 有 學 者 將 幾 丁 聚 醣 製 備 成 幾 丁 聚 醣 奈 米 顆 粒 (chitosan nanoparticle, CNP), 進 行 對 肝 癌 細 胞 體 外 及 體 內 生 長 抑 制 之 研 究, 在 體 外 (in vitro) 及 體 外 試 驗 (in vivo) 中, CNP 能 殺 死 裸 鼠 肝 癌 細 胞 (BEL7402), 顯 示 CNP 具 有 高 度 的 抗 腫 瘤 活 性 在 電 子 顯 微 鏡 下 發 現 CNP 能 誘 導 細 胞 壞 死 (necrosis) 及 DNA 片 斷 化 (DNA fragmentation), 造 成 腫 瘤 組 織 的 型 態 有 壞 死 的 現 象, 對 正 常 肝 組 織 並 無 異 常 現 象 發 生 (Qi, 2007) 2.4.4. 抗 氧 化 性 目 前 已 發 現 幾 丁 質 及 其 衍 生 物 具 有 良 好 的 抗 氧 化 力, 已 發 現 其 能 夠 抑 制 脂 質 過 氧 化 抑 制 TBARS(thiobarbituric acid reactive substance) 生 成, 且 對 羥 基 自 由 基 (hydroxy radical) 有 良 好 的 清 除 能 力 (Matsugo et al., 1998;Xue et al., 1998;Xie et al., 2001;Huang et al., 2005;Chien et al., 2007;Kim and Thomas, 2007;Yen et al., 2007) 13

2.4.5. 促 進 傷 口 癒 合 凝 血 幾 丁 質 類 物 質 使 用 在 傷 口 上, 除 了 具 有 抗 菌 的 功 效 且 其 不 會 引 起 發 炎 反 應, 在 受 傷 部 位 會 促 進 受 傷 區 域 重 新 生 成, 故 有 促 進 傷 口 癒 合 之 能 力 (Biagini et al., 1991;Chung et al., 1994) 除 此 之 外 幾 丁 質 類 物 質 被 發 現 具 有 凝 集 作 用, 會 促 進 血 小 板 分 泌 凝 血 因 子, 進 而 達 到 止 血 的 效 果 (Subar et al., 1992;Shigehiro, 1999) 2.4.6. 幾 丁 聚 醣 及 其 水 解 物 的 抗 菌 活 性 利 用 生 物 性 物 質 如 幾 丁 聚 醣 或 其 衍 生 物 作 為 防 制 儲 藏 性 的 細 菌 真 菌 等 微 生 物 病 害 的 抗 菌 劑, 已 受 到 相 當 的 重 視 因 為 化 學 防 治 法 已 面 臨 了 以 下 的 問 題, 包 含 (1) 對 抗 生 素 產 品 產 生 抗 藥 性,(2) 許 多 化 學 性 抗 菌 劑 普 遍 具 有 副 作 用,(3) 消 費 者 是 水 準 提 升, 普 遍 標 榜 天 然 的 物 質 才 具 有 吸 引 力 先 前 研 究 發 現 在 培 養 基 中 添 加 高 濃 度 的 幾 丁 聚 醣 (1-1.5%), 以 2% 醋 酸 調 整 ph 值 至 5.5 或 6.5, 於 作 用 2 天 後 即 能 對 S. aureus, 達 到 完 全 抑 制 的 效 果 (Wang, 1992) 此 外 由 蝦 殼 萃 取 製 成 的 幾 丁 聚 醣, 其 濃 度 只 要 超 過 0.02% 以 上 即 對 Bacillus cereus 有 抑 制 效 果, 而 對 於 E. coli 與 Proteus vulgarls 而 言 只 需 超 過 0.0075% 以 上 便 能 抑 制 (Simpson et al., 1997 ) Rege 等 學 者 發 現, 總 括 具 有 抗 菌 活 性 的 幾 丁 聚 醣 其 去 乙 醯 度 介 於 70% 至 95%, 而 其 分 子 量 介 於 50 至 2000 kda(rege et al., 14

2003) 而 去 乙 醯 度 70% 之 幾 丁 聚 醣 可 抑 制 革 蘭 氏 陽 性 菌 10-20% 及 革 蘭 氏 陰 性 菌 20-40%, 當 幾 丁 聚 醣 之 去 乙 醯 度 提 高 至 90% 可 抑 制 革 蘭 氏 陽 性 菌 15-35% 及 革 蘭 氏 陰 性 菌 40-60%(Chen et al., 2002) 對 抗 真 菌 作 用 方 面, 研 究 以 指 出 幾 丁 聚 醣 亦 具 有 抗 真 菌 活 性, 其 ( 含 7.2% NH 2 ) 在 高 濃 度 下 能 明 顯 抑 制 Rhizopus stolonifer Botrytis cinerea 及 Alternaria alternata 等 生 長, 且 抑 菌 活 性 也 是 隨 去 乙 醯 度 增 加 而 提 升 此 外 有 學 者 (Fang, 1994) 將 幾 丁 聚 醣 添 加 至 低 糖 金 桔 蜜 餞 中 進 行 防 腐 試 驗, 其 結 果 發 現 當 濃 度 達 4-5 mg/ml(ph5.4), 對 Aspergillus niger 有 抑 制 效 果, 雖 然 能 力 較 己 二 烯 酸 甲 低 (1.3 mg/ml), 但 可 完 全 抑 制 A. parasiticus 所 生 合 成 的 黃 趨 毒 素 雖 然 幾 丁 聚 醣 具 有 抗 真 菌 活 性, 但 ㄧ 般 而 言, 其 抗 菌 效 果 低 於 對 細 菌 的 作 用, 除 了 對 部 份 植 物 病 原 菌 具 良 好 的 抑 制 效 果, 對 許 多 食 物 污 染 的 黴 菌, 其 效 果 普 遍 需 在 高 濃 度 下 才 具 可 接 受 的 抑 制 作 用 2.5. 影 響 抗 菌 活 性 之 因 子 有 關 於 幾 丁 聚 醣 抗 菌 活 性 應 用 在 各 領 域 的 議 題, 已 受 許 多 學 者 研 究 及 討 論, 影 響 幾 丁 聚 醣 的 抗 菌 能 力 因 素 很 多, 主 要 包 括 以 下 幾 點 : 2.5.1. 去 乙 醯 度 研 究 指 出 ( 蔡, 1993) 利 用 蟹 殼 所 製 備 的 幾 丁 聚 醣, 針 對 幾 丁 聚 醣 的 去 乙 醯 度 對 細 菌 的 抗 菌 效 果 有 明 顯 影 響, 此 研 究 的 抑 菌 效 果 分 別 15

為 Samonella typhi >E. coli >S. aureus >B. cereus 其 他 研 究 中 發 現, 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 的 不 同 會 影 響 其 抑 菌 強 弱,DD80 DD60 對 Shigella sonnei 的 抑 菌 力 分 別 為 32.7 及 11.4%, 而 對 Pseudomonas fluorescens 則 為 30.5 及 13.4% 雖 然 文 獻 間 會 因 為 所 使 用 的 菌 種 各 有 不 同, 其 抗 菌 活 性 也 會 有 所 差 異, 但 皆 受 去 乙 醯 度 的 影 響 幾 丁 聚 醣 的 抗 菌 能 力 主 要 來 自 於 胺 基 官 能 基 的 作 用, 皆 呈 現 隨 去 乙 醯 度 增 加, 其 抗 菌 活 性 會 有 所 提 升 (Tsai and Su, 1999; Chen, 2002; Chung, 2004) 2.5.2. 分 子 量 幾 丁 聚 醣 之 功 能 除 了 與 化 學 結 構 有 關, 另 外 也 與 分 子 大 小 有 關 (Babiker, 2002;Qin et al., 2002;Qin et al., 2004) 低 分 子 量 之 幾 丁 聚 醣 具 有 較 佳 之 滲 透 性 (Chen and Hwa, 1996), 而 研 究 指 出 幾 丁 聚 醣 的 聚 合 度 大 於 六 個 才 具 有 較 強 的 生 物 活 性 (Tsai et al., 2000; Jeon et al., 2001; Muzzarelli, 2002; Kim and Rajapakse, 2005), 但 當 分 子 過 大 時 會 使 其 溶 解 度 低, 不 適 合 應 用 於 醫 藥 及 食 品 工 業 上 (Belmonte et al., 1997;Ilyina et al., 2000) 2.5.3. 溶 解 度 因 為 幾 丁 聚 醣 在 中 性 下 溶 解 度 差, 縱 使 有 不 錯 的 生 物 活 性, 仍 會 影 響 其 在 食 品 等 領 域 上 的 應 用 目 前 有 許 多 幾 丁 質 類 的 產 品, 可 藉 由 16

酵 素 物 理 或 化 學 水 解 降 低 分 子 量 成 寡 醣 或 單 醣 等 形 式, 有 效 提 升 免 疫 力 進 年 來, 幾 丁 質 及 其 衍 生 物 有 著 不 同 的 作 用 及 應 用 範 圍, 不 同 分 子 量 與 去 乙 醯 度 的 幾 丁 聚 醣, 其 溶 解 度 都 不 一 樣, 因 此 幾 丁 聚 醣 的 應 用 形 式 與 其 用 途, 可 根 據 其 溶 解 特 性 不 同, 使 用 在 不 同 領 域, 如 低 溶 解 度 可 作 為 生 醫 材 料 的 敷 料 高 溶 解 度 可 以 用 在 食 品 醫 藥 等 抗 菌 或 抗 腫 瘤 試 劑 ( 陳, 2000; 袁, 2000) 2.5.4. 電 荷 密 度 幾 丁 聚 醣 在 酸 性 的 條 件 下 會 受 質 子 化 作 用 成 具 帶 正 電 荷 (-NH + 3 ) 的 官 能 基, 此 電 荷 會 干 擾 並 中 和 細 菌 表 面 所 帶 的 陰 電 荷 (Strand et al., 2001, 2002, 2003), 改 變 細 胞 壁 結 構 並 增 加 其 通 透 性, 造 成 其 胞 器 外 漏, 使 細 胞 死 亡, 此 研 究 中 也 指 出 幾 丁 聚 醣 的 電 荷 密 度 越 強, 其 抗 菌 活 性 也 會 跟 著 提 升 ; 相 反 當 細 菌 表 面 帶 越 多 負 電 荷, 其 也 越 容 易 受 幾 丁 聚 醣 的 影 響 2.6. 目 前 研 究 的 抗 菌 機 制 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 的 抗 菌 活 性 已 研 究 許 多 年, 許 多 影 響 抗 菌 因 子 皆 已 確 定, 但 其 確 切 的 抗 菌 機 制 尚 不 明 朗, 但 原 因 大 致 有 二, 一 為 當 幾 丁 聚 醣 溶 於 ph 值 小 於 6.0 的 溶 液 時, 幾 丁 聚 醣 會 呈 現 正 電 荷, 而 所 產 生 的 正 電 分 子 會 和 細 菌 細 胞 膜 所 漏 出 的 蛋 白 質 或 其 他 負 電 分 子 17

形 成 交 聯, 而 且 幾 丁 聚 醣 會 選 擇 性 的 與 金 屬 離 子 結 合, 因 此 可 將 幾 丁 聚 醣 視 為 一 種 螯 合 劑, 可 能 會 以 吸 附 或 穿 孔 的 兩 種 狀 態 造 成 細 胞 膜 之 瓦 解 (Tsai et al., 2000;Helander et al., 2001;Liu et al., 2004;Li et al., 2007); 二 是 小 分 子 的 幾 丁 聚 醣 可 能 會 滲 入 菌 體, 之 後 與 結 合 DNA 而 阻 止 mrna 的 轉 錄 及 降 低 細 胞 活 性 有 研 究 指 出, 短 鏈 幾 丁 聚 醣 進 入 細 胞 後, 藉 由 與 DNA 錯 合 影 響 染 色 體 結 構, 進 而 阻 止 RNA 生 合 成 並 降 低 細 胞 生 命 力, 達 到 抑 菌 的 效 果 (Hadwiger et al., 1986;Shahidi et al., 1999) 根 據 學 者 的 研 究, 幾 丁 聚 醣 其 單 體 及 寡 聚 體 對 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 革 蘭 氏 陰 性 菌 的 抗 菌 機 制 有 所 差 異 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 B. cereus 主 要 是 以 單 體 或 寡 聚 體 與 細 胞 膜 壁 表 面 形 成 氫 鍵, 造 成 細 胞 膜 壁 的 扭 曲 變 形, 內 部 物 質 流 出 而 造 成 菌 體 死 亡 對 革 蘭 氏 陰 性 菌 E. coli 則 是 幾 丁 寡 醣 會 與 脂 多 醣 體 (lipo-polysaccharide, LPS) 作 用, 形 成 吸 附 於 細 胞 膜 壁 表 面 的 情 形, 造 成 營 養 代 謝 及 通 透 的 障 礙 (Tsai et al, 2000; Helander et al., 2001;Vishu Kumar et al., 2005), 圖 八 為 兩 種 可 能 機 制 的 示 意 圖 18

圖 八 幾 丁 寡 糖 - 單 體 混 合 物 對 B.cereus 和 E. coli 的 殺 菌 反 應 模 擬 機 制 (Vishu Kumar et al., 2005) 2.7. 細 菌 細 胞 壁 的 介 紹 細 胞 壁 是 細 菌 外 層 的 一 種 堅 固 結 構, 主 要 由 胜 肽 聚 醣 (peptidoglycan) 所 構 成 胜 肽 聚 醣 顧 名 思 義 是 胜 肽 (peptides) 與 多 醣 glycans 的 聚 合 物, 主 要 成 分 有 兩 種 醣 類 :N-acetylglucosamine (NAG) 和 N-acetylmuramic acid(nam) 每 條 glycan 接 著 很 多 短 胜 肽, 這 些 胜 肽 類 一 般 以 四 個 氨 基 酸 連 成 一 串 接 上 NAM 上, 形 成 側 19

鏈, 各 側 鏈 再 以 胜 肽 鍵 (peptide bond) 連 接, 如 此 的 聯 結 使 得 細 胞 壁 形 成 複 雜 的 網 狀 結 構, 緊 密 的 堆 積 在 細 胞 膜 外 細 胞 壁 除 了 具 有 保 護 與 支 持 菌 體 的 作 用, 也 是 細 胞 生 長 與 分 裂 所 必 須 細 胞 壁 的 一 些 成 分 具 有 抗 原 性, 可 引 發 抗 體 的 產 生, 也 與 病 原 菌 的 致 病 性 有 關, 更 是 決 定 對 抗 菌 劑 及 噬 菌 體 敏 感 性 的 所 在 細 菌 因 細 胞 壁 結 構 的 不 同, 可 透 過 染 色 鍵 定, 分 為 兩 種 類 型.. 革 蘭 氏 陽 性 (Gram-positive) 菌 和 革 蘭 氏 陰 性 (Gram-negative) 菌, 染 色 的 差 異 反 映 了 結 構 和 化 學 組 成 的 不 同 ( 鄧, 1987) 2.7.1. 革 蘭 氏 陽 性 菌 革 蘭 氏 陽 性 菌 ( 圖 九 ) 的 細 胞 壁, 主 要 由 厚 的 胜 肽 聚 醣 加 上 台 口 酸 (teichoic acid) 所 形 成 ㄧ 層 厚 而 堅 固 的 結 構, 細 胞 壁 厚 達 15-35 nm 組 成 成 分 中 的 台 口 酸 是 由 磷 酸 雙 酯 所 連 結 的 甘 油 或 核 糖 醇 (ribitol) 聚 合 物, 台 口 酸 與 脂 台 口 酸 (lipo-teichoic acid) 可 由 胜 肽 聚 醣 層 中 伸 出 細 胞 外, 是 決 定 陽 性 菌 表 面 抗 原 的 所 在, 也 與 離 子 進 出 細 胞 有 關 (Campbell and Reece, 2002; 楊, 2003) 20

圖 九 革 蘭 氏 陽 性 菌 結 構 2.7.2. 革 蘭 氏 陰 性 菌 革 蘭 氏 陰 性 菌 ( 圖 十 ) 的 細 胞 壁 較 薄 (10-15 nm), 在 結 構 上 有 明 顯 的 差 異, 其 中 胜 肽 聚 醣 含 量 很 少, 主 要 為 脂 蛋 白 (lipoprotein) 外 膜 (outer membrane) 與 脂 多 醣 等 結 構 組 成 (1) 脂 蛋 白 是 胜 肽 聚 醣 層 與 外 膜 間 的 連 接 橋 樑 ;(2) 外 膜 是 細 胞 膜 的 雙 層 磷 脂 質 結 構, 外 膜 內 含 特 殊 的 蛋 白 質, 提 供 一 定 的 孔 隙 以 供 管 控 進 出, 對 於 大 分 子 物 質 如 抗 菌 劑 或 酵 素 便 有 主 阻 礙 的 作 用 (3) 脂 多 醣, 是 由 脂 質 A (lipid A) 與 多 醣 類 (polysaccharide) 所 構 成 負 電 荷 結 構, 其 中 脂 質 A 與 外 膜 相 連, 當 菌 體 溶 解 後 便 會 釋 出, 脂 質 A 具 有 毒 性 且 為 細 胞 壁 的 成 分 之 ㄧ, 所 以 也 稱 為 內 毒 素 (endotoxin) 脂 多 醣 的 多 醣 體 是 由 多 種 不 同 單 醣 聚 集 而 成 的 核 心 多 醣, 利 用 側 鏈 附 著 在 外 膜 上, 形 成 菌 體 的 最 表 面 結 構, 具 有 抗 原 性, 稱 為 O 抗 原 (O-antigen)(Campbell 21

and Reece, 2002; 楊, 2003) 圖 十 革 蘭 氏 陰 性 菌 結 構 22

2.7.3. 革 蘭 氏 陽 性 菌 與 陰 性 菌 比 較 性 質 革 蘭 氏 陽 性 菌 革 蘭 氏 陰 性 菌 1. 染 色 結 果 仍 維 持 紫 色 由 紫 色 變 為 紅 色 2. 細 胞 壁 組 成 脂 質 含 量 較 少 (1-4%) 脂 質 含 量 較 多 (11-22%) 3. 細 胞 壁 結 構 單 層, 且 較 厚 (15-80 nm) 三 層, 且 較 薄 (10-15 nm) 4. 對 鹼 液 的 抵 抗 力 不 溶 於 10% KOH 中 可 溶 於 10% KOH 中 5. 孢 子 之 產 生 常 見 少 見 6. 對 物 理 狀 況 之 抵 抗 力 大 小 7. 營 養 需 求 多 數 都 較 複 雜 需 求 簡 單 8. 常 見 的 菌 種 大 多 數 的 球 菌 和 產 孢 桿 菌 非 產 孢 桿 菌 ( 網 路 資 料 :http://www.tchcvs.tc.edu.tw/nerc/home/u1/ch7/poison/aaa-3.htm) 23

第 三 章 實 驗 材 料 與 方 法 3.1. 研 究 架 構 幾 丁 聚 醣 (DD80 DD92) 水 解 酵 素 (chitinase, lysozyme, cellulase) LMWC 製 備 LMWC 物 理 性 質 分 析 溶 解 度 粒 徑 分 析 Zeta potential Zeta potential LMWC 抗 菌 相 關 特 性 分 析 MIC 殘 菌 分 析 菌 體 吸 附 分 DNA 分 析 SEM Staphylococcus aureus BCRC 10451 10780 10781 Escherichia coli BCRC 10314 10675 機 制 探 討 24

3.2. 實 驗 器 材 3.2.1. 儀 器 及 設 備 1. 無 菌 無 塵 操 作 台 : 晉 暉 機 械 股 份 有 限 公 司, H2-VCM420, 台 中 2. 低 溫 培 養 箱 (low-temp incubator):kansin instrument co., LTD, LTI601, 台 灣 3. 迴 轉 式 震 盪 培 養 箱 :Kansin instrument co., LTD, RT01A, 台 灣 4. 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡 (SEM):Tescan s.r.o., Vega TS 5136 MM, Brno, Czech 5. 鍍 金 機 (gold and carbon sputter coater):cressington scientific instruments Ltd., cressington 108, England (U.K.) 6. 離 心 機 :Hermle machine company LLC, Z323 MK-2, German 7. 顯 微 鏡 :Nikon corporation, optiphot-2 upright, Japan 8. 滅 菌 釜 :Tominaga co. LTD., SS320, Japan 9. 分 光 光 度 計 :Thermo fisher scientific Inc., Bionate 3, U.S.A. 10. 水 浴 槽 :Firstek scientific Co., Ltd, 台 灣 11. ph meter: 上 泰 儀 器 股 份 有 限 公 司, Suntex SP-701 ph/mv/temp meter, 高 雄 12. 黏 度 計 : 安 邦 儀 器 有 限 公 司, Bro okfield HADV-Ⅱ+ (Programmable DV-Ⅱ+viscometer), U.S.A. 13. 震 盪 器 :Firstek Scientific Co., Ltd, Firstek scientific shaker S 102, 台 25

灣 14. 微 生 物 培 養 增 殖 分 析 儀 (Bio-photorecorder):Advantec MFS Inc., TN-1506, Tokyo(Japan) 15. MicroStation System : BioLog Inc., U.S.A. 16. Microstation ELISA reader:biolog Inc.,E11010, U.S.A. 17. Microlog software : Biolog MicroLog3 release 4.2 18. Microlog Turbidimeter : BioLog Inc., U.S.A. 19. Biolog microplate : Biolog Inc., U.S.A. 20. 迷 你 電 泳 槽 及 鑄 膠 器 :MJ-105, Violet Bioscience inc, U.S.A. 21. 紫 外 光 透 照 箱 ( UV Transilluminators ): BioRed, U.S.A. 22. 影 像 分 析 系 統 (Digital gel image system):biored, DGIS-7, U.S.A. 23. 數 位 相 機 :C765UZ, Olympus, Japan 24. 粒 徑 分 析 儀 - 分 子 量 (Zetasizer nano S90):ZEN1590, Malvern, U.K. 25. 粒 徑 分 析 儀 - 界 達 電 位 (Zetasizer nano Z):ZEN2500, Malvern, U.K. 3.2.2. 樣 品 幾 丁 質 幾 丁 聚 醣 購 自 應 化 企 業 有 限 公 司, 台 北 幾 丁 聚 醣 去 乙 醯 度 80 % 92 %, 分 子 量 約 300 kda 3.2.3. 實 驗 菌 株 木 黴 菌 (Trichoderma viride):bcrc 32054 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus):bcrc 10451 BCRC 26

大 腸 桿 菌 (Escherichia coli):bcrc 10314 BCRC 10675 菌 株 皆 購 自 於 食 品 工 業 發 展 研 究 所, 生 物 資 源 與 發 展 中 心 3.2.4. 藥 品 清 單 Acetic acid ( Fluka, Switzerland);Glucose sucrose NaNO 3 MgSO 4 7H 2 O KCl FeSO 4 7H 2 O(Yakuri, Japan);K 2 HPO 4 NaHPO 4 H 2 O Na 2 HPO 4 (Merck, USA);CH 3 COOH(Fluka, Switzerland);CH 3 COONa(RDH, Germany);trytone soya broth (TSB) (Himedia M011);soyabean casein digest agar, trytone soya agar(tsa) (Himedia M290);potato dextrose broth(pda)(himedia M403) (Himedia, India);agar bacteriological (agar No.1 )(Oxoid LP0011, UK);ethidium brmide (Amrel S10, USA);Agarose(VIO-A500)(Basic Life,USA) 3.2.5. 商 購 酵 素 Cellulase(EC 3.2.1.4):C2730, from Trichoderma reesei ATCC 26921 aqueous solution, 700 units/g, 購 自 於 Sigma (U.S.A.) Lysozyme(EC 3.2.1.17):L7651, from chicken egg white lyophilized powder, protein 90 %, 40000 units/mg, 購 自 於 Sigma (U.S.A.) 3.3. 實 驗 方 法 3.3.1. 幾 丁 質 酶 粗 酵 素 之 誘 發 1. 膠 體 幾 丁 質 製 備 27

將 25 g 幾 丁 質 粉 末 緩 緩 加 入 500 ml 濃 硫 酸 中, 並 作 充 分 攪 拌 約 2 小 時 加 入 5 L 蒸 餾 水 至 該 幾 丁 質 懸 浮 液 中, 過 程 中 持 續 進 行 攪 拌, 待 其 成 為 白 色 沉 澱 的 膠 體 幾 丁 質, 以 大 量 蒸 餾 水 反 覆 洗 滌, 使 其 ph 值 達 中 性, 最 後 將 固 形 物 懸 浮 於 蒸 餾 水 中 取 懸 浮 液 利 用 熱 風 乾 燥 測 其 固 形 物 含 量, 最 後 將 懸 浮 液 配 製 成 含 量 約 1.5 % 固 形 物 之 膠 體 幾 丁 質 (Roberts and Selitrenkoff, 1985) 2. Trichoderma viride 之 幾 丁 質 粗 酵 素 誘 發 將 Trichoderma viride 菌 種 凍 管 於 37 o C 快 速 解 凍, 取 100 μl 菌 種 保 存 液 於 PDA 平 板 中, 置 室 溫 培 養 7 天 的 條 件 下, 連 續 接 種 兩 代 促 使 菌 株 恢 復 活 性 以 2 ml 無 菌 蒸 餾 水 將 活 化 後 之 木 黴 菌 孢 子 洗 下, 接 種 至 一 培 培 養 基 中, 在 室 溫 下 震 盪 (150 rpm) 培 養 5 天 無 菌 紗 布 過 濾 後, 取 得 菌 絲 體, 用 蒸 餾 水 將 菌 絲 體 表 面 糖 分 洗 去, 接 種 至 二 培 培 養 基, 在 室 溫 下 震 盪 培 養 4 天 ( 林, 2007), 發 酵 液 經 離 心 去 除 沉 澱 物 後, 視 為 幾 丁 質 粗 酵 素 液, 並 保 存 於 -20 o C(Chen and Lin, 2004) 幾 丁 質 酵 素 誘 發 培 養 液 配 方 如 下 : 一 培 培 養 基 ( 菌 絲 體 增 殖 培 養 基 ):40 g glucose,12 g sucrose, 1.2 g NaNO 3,0.2 g MgSO 4 7H 2 O,0.2 g KCl,0.004 g FeSO 4 7H 2 O,0.4 g K 2 HPO 4,ddH 2 O 定 量 至 400 ml,ph 調 至 7.2 28

二 培 培 養 基 ( 酵 素 誘 發 培 養 基 ):6 g 膠 體 幾 丁 質 (final 1.5 %),1.2 g NaNO 3,0.2 g MgSO 4 7H 2 O,0.2 g KCl,0.004 g FeSO 4 7H 2 O,0.4 g K 2 HPO 4,ddH 2 O 定 量 至 400 ml,ph 調 至 7.2 3.3.2. LMWC 製 備 幾 丁 聚 醣 粉 末 溶 於 100 mm 醋 酸 緩 衝 液 中 (ph 4.0) 配 製 成 1 % (w/v) 幾 丁 聚 醣 溶 液, 分 別 加 入 三 種 酵 素 : 幾 丁 質 粗 酵 素 液 (200 Unit/g chitosan) 溶 菌 酶 (4 x 10 7 Unit/g chitosan) 纖 維 酵 素 (700 Unit/g chitosan), 在 42 水 浴 下 震 盪 反 應, 取 水 解 時 間 1 天 之 水 解 產 物, 於 100 o C 下 水 浴 加 熱 15 分 鐘 使 酵 素 失 活, 冷 卻 至 室 溫 後 再 沸 水 浴 煮 30 分 鐘, 並 重 複 冷 卻 及 水 浴 三 次, 使 水 解 產 物 達 無 菌 狀 態 ( 此 方 法 可 避 免 在 121 下 造 成 樣 品 產 生 褐 變 反 應 )( 陳, 2006) 3.3.3. LMWC 分 析 3.3.3.1. 分 子 量 測 定 使 用 黏 度 計 Brookfield HADV-Ⅱ+(programmable DV-Ⅱ+ viscometer), 探 頭 為 H1 探 頭, 設 定 轉 速 為 100 rpm 取 不 同 組 合 的 酵 素 水 解 產 物 400 ml 至 燒 杯 中, 於 室 溫 下 (30 ) 測 其 黏 度 (cp) 變 化, 並 以 Mark-Houwink-Sakurada 方 程 式 求 得 intrinsic viscosity 分 子 量 (Kasaai et al., 2000; Sobhanmanesh and Hajizadeh, 2005; Ramírez- Coutiño et al., 2006; Li et al., 2007) Mark-Houwink-Sakurada 方 程 式 : 29

[η] = K.q MHS.MW a = 1.49 x 10-4. MW 0.79 3.3.3.2. 溶 解 度 酵 素 水 解 產 物 於 室 溫 下 經 過 200 mm phosphate buffer(ph 7.0) 以 1:1 的 比 例 中 和 後,6000 rpm 離 心 20 分 鐘, 將 上 清 液 與 沈 澱 物 分 離, 取 其 沈 澱 物 水 洗 三 次, 以 去 除 溶 劑, 於 60 的 烘 箱 中 烘 乾 後 秤 重, 計 算 其 溶 解 度 ( 林, 2007) 溶 解 度 (%)=[( 樣 品 重 - 烘 乾 後 重 )/ 樣 品 重 ] 100 為 了 解 抗 菌 實 驗 之 培 養 環 境 ph 值 對 LMWC 溶 解 度 之 影 響, 將 LWMC 加 入 至 不 同 ph 值 的 TSB 培 養 基 中 (ph 4.5-7.5), 混 勻 後 以 濁 度 計 偵 測 其 透 光 率 3.3.3.3. 粒 徑 與 界 達 電 位 分 析 將 酵 素 水 解 物 ( 溶 在 ph 4.0 醋 酸 緩 衝 液 中 ) 以 0.2 μm 濾 膜 過 濾 可 能 的 雜 質, 菌 體 方 面 是 先 將 細 菌 活 化 培 養 (16-24 小 時 ), 直 接 吸 取 菌 液 進 行 偵 測, 在 吸 取 樣 品 時, 需 小 心 避 免 產 生 氣 泡 將 樣 品 溶 液 打 入 界 面 電 位 測 量 槽 中 (cuvette), 利 用 zetasizer nano S90 及 zetasizer nano Z 的 動 態 光 散 射 法 測 定 平 均 粒 徑 界 達 電 位 與 分 佈, 動 態 光 散 射 之 操 作 條 件 為 : 波 長 633.0 nm 室 溫 下 光 散 射 角 度 90 o 30

3.4. 抗 菌 活 性 試 驗 與 機 制 探 討 3.3.4.1. 菌 株 培 養 S. aureus(bcrc 10780, BCRC 10781, BCRC 10451) 於 TSB 培 養 基 ;E. coli(bcrc 10314, BCRC 10675) 培 養 於 NB, 兩 種 菌 株 皆 在 37 o C 下 培 養 14-16 小 時, 此 時 為 stationary phase, 菌 液 菌 數 約 為 1-5 x 10 9 cfu/ml 3.3.4.2. 菌 種 鑑 定 利 用 針 對 表 現 型 (phenotype) 進 行 分 析 的 Microstation Biolog 微 生 物 鑑 定 套 組, 以 測 試 生 化 特 性 進 行 菌 種 鑑 定 此 菌 種 鑑 定 系 統 利 用 含 95 種 脫 水 碳 水 化 合 物 的 生 化 套 組 (96 孔 微 量 盤 ) 進 行 反 應, 針 對 其 對 不 同 碳 源 產 生 表 現 型 差 異 之 數 據, 與 Microstation Biolog 提 供 的 菌 種 資 料 庫 進 行 比 對 與 鑑 定 菌 株 接 種 於 含 5 % 羊 血 的 BUG 固 體 培 養 基 (BUG + B), 在 37 o C 下 培 養 14-16 小 時, 利 用 無 菌 棉 棒 抹 取 培 養 於 BUG+B 培 養 基 之 菌 株 菌 落, 並 將 沾 有 菌 落 之 棉 棒 均 勻 在 含 3 滴 5 mm Sodium thioglycolate 試 劑 之 GN/GP-IF 溶 液 中, 並 配 合 使 用 Microlog Turbidometer 調 整 接 種 液 透 光 度, 達 20 %T 時, 分 別 取 150 μl 之 接 種 液 至 GP2 Microplate 之 96 孔 洞,37 o C 下 培 養 16-24 小 時, 使 用 Biolog Microlog 4.2 軟 體 判 讀 結 果, 進 行 菌 種 比 對 與 鑑 定 31

3.3.4.3. 不 同 ph 值 培 養 條 件 下 的 影 響 取 20 μl 活 化 後 的 菌 液 至 調 整 不 同 ph 值 (ph 4.5-7.5) 之 TSB 培 養 基 中, 觀 察 ph 對 S. aureus 與 E. coli 生 長 的 影 響 3.3.4.4. 抑 菌 試 驗 (1) 96 微 孔 盤 抗 菌 活 性 測 試 ( 微 量 試 驗 ) 水 解 物 以 20 mm acetic buffer (ph 4.0) 作 連 續 對 半 稀 釋, 取 50 μl 置 入 96 微 孔 盤 中, 再 加 入 50 μl 之 40 mm phosphate buffer( ph 7.0), 最 後 加 入 100 μl 活 化 後 的 菌 液, 培 養 於 37 下, 以 ELISA reader OD 590 於 每 12 小 時 測 其 濁 度 變 化, 繪 出 生 長 曲 線, 判 斷 最 低 抑 制 濃 度 ( 林, 2007) 抑 制 時 間 (inhibitory time, IT) 定 義 為 菌 株 生 長 在 遲 滯 期 (lag phase) 狀 態 所 延 長 之 時 間 抑 制 時 間 =( 實 驗 組 菌 株 生 長 於 lag phase 之 時 間 )-( 對 照 組 菌 株 生 長 於 lag phase 之 時 間 ) 最 小 抑 菌 濃 度 (minimum inhibitory concentration, MIC) 定 義 為 菌 株 在 與 樣 品 培 養 後, 其 遲 滯 期 (lag phase) 比 對 照 組 多 48 小 時 的 濃 度 (2) 微 生 物 培 養 增 殖 分 析 儀 抗 菌 活 性 測 試 ( 增 量 試 驗 ) 將 水 解 物 以 100 mm acetic buffer(ph 4.0) 稀 釋, 添 加 至 裝 有 TSB 培 養 基 的 L 型 管 中, 加 入 與 水 解 物 等 量 的 200 mm phosphate 32

buffer(ph 7.0), 最 後 加 入 10 μl 活 化 後 的 菌 液, 使 用 微 生 物 培 養 增 值 分 析 儀 進 行 培 養 及 觀 測 其 濁 度 變 化 ( 陳, 2006) 3.3.4.5. 菌 體 吸 附 試 驗 將 不 同 濃 度 水 解 產 物 加 入 事 先 培 養 之 10mL 菌 液, 震 盪 反 應 1 小 時, 靜 置 約 30 分 鐘 待 其 沉 澱, 隨 後 吸 取 上 清 液 以 塗 抹 方 式 計 算 其 尚 未 被 水 解 物 作 用 吸 附 的 剩 餘 菌 數 3.3.4.6. 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡 分 別 將 S. aureus (BRCR10451 10780 10781) 與 E. coli(brcr 10314 BCRC 10675) 於 37 下 培 養 14-16 小 時 (1~5 x 10 9 CFU/mL) 加 入 800 ppm 之 幾 丁 聚 醣 酵 素 水 解 物 於 菌 液 中, 菌 液 與 幾 丁 聚 醣 水 解 產 物 震 盪 培 養 1 小 時, 沉 澱 靜 置 約 30 分 後 取 樣 樣 品 菌 液 分 別 以 (1) 未 經 100 mm 醋 酸 緩 衝 液 洗 滌 幾 丁 聚 醣 水 解 物, 及 (2) 有 100 mm 醋 酸 緩 衝 液 將 包 覆 細 菌 之 幾 丁 聚 醣 水 解 物 洗 下, 稍 後 將 兩 種 不 同 處 理 方 式 之 菌 液 樣 品 以 12,000 x g 離 心 10 分 鐘, 去 上 清 液 後 加 入 1-2.5 % formaldehyde 或 glutaradehyde 電 顯 固 定 液 體 中 ( 以 200 mm 磷 酸 緩 衝 液 配 置,pH 7.0), 於 4 下 浸 泡 1 小 時, 隨 後 以 50-100 % 乙 醇 進 行 系 列 脫 水, 將 已 乾 燥 之 樣 品 粉 末 黏 附 於 載 物 檯 上 並 進 行 鍍 金 包 覆 (120 秒 ), 最 後 在 電 子 顯 微 鏡 下 檢 視 樣 品 (20 kv) 33

3.3.4.7. Genomic DNA 之 抽 取 ( 使 用 ZR Fungal/Bacterial DNA Kit 進 行 萃 取 ) 取 2 ml 的 菌 液,4,000 x g 離 心 10 分 鐘, 去 上 清 液 後 將 沉 澱 物 以 二 次 水 或 200mM 磷 酸 緩 衝 液 ( 等 張 溶 液 ) 回 溶, 並 重 複 2-3 次 以 去 除 培 養 基, 最 後 將 沉 澱 的 菌 以 200 μl 回 溶 並 移 至 裝 有 lysis buffer 的 ZR bashingbead lysis tube 中 高 速 震 盪 5 分 鐘, 再 以 10,000 x g 離 心 1 分 鐘 取 400 μl 上 清 液 至 Zymo-Spin IV Spin Filter 並 套 上 收 集 管 後, 以 7,000 x g 離 心 1 分 鐘, 後 加 入 1,200 μl Fungal/Bacterial DNA Binding Buffer 至 Zymo-Spin IV Spin Filter, 7,000 x g 離 心 1 分 鐘, 收 集 管 內 取 得 1,600 μl 混 合 液 取 800 μl 混 合 液 至 Zymo-Spin IIC Column 並 接 上 新 的 收 集 管,10,000 x g 離 心 1 分 鐘, 重 複 二 次, 隨 後 將 此 收 集 管 丟 棄 加 入 200 μl DNA Pre-Wash Buffer 至 已 接 上 新 收 集 管 的 Zymo-Spin IIC Column, 10,000 x g 離 心 1 分 鐘, 再 加 入 500 μl Fungal/Bacterial DNA Wash Buffer 並 10,000 x g 離 心 1 分 鐘 最 後 將 Zymo-Spin IIC Column 接 上 無 菌 微 量 離 心 管, 加 入 100 μl DNA Elution Buffer,10,000 x g 離 心 30 秒, 可 取 得 回 溶 於 buffer 中 的 DNA 0.2 g 洋 菜 粉 末 加 入 20 ml 1x TBE buffer 製 備 1% agarose gel, 置 於 微 波 爐 中 加 熱 使 洋 菜 粒 全 溶, 倒 入 鑄 膠 器 內 待 其 凝 結 樣 品 34

加 入 追 蹤 染 劑, 與 DNA marker 進 行 電 泳, 連 接 電 源 插 頭 ( 黑 色 為 負 極, 紅 色 為 正 極 ) 到 電 源, 帶 負 電 荷 的 DNA 分 子 會 由 負 極 移 向 正 極, 在 50V 下 跑 膠 約 1 小 時 之 後 以 EtBr(~0.5µg/mL) 染 色 30 分 鐘, 在 以 水 退 染 5 分 鐘, 把 洋 菜 膠 放 在 UV 透 射 光 源 板 上 觀 察 與 拍 照 35

第 四 章 結 果 與 討 論 4.1. LMWC 分 析 幾 丁 聚 醣 為 一 良 好 的 天 然 殺 菌 劑, 去 乙 醯 度 與 分 子 量 為 影 響 幾 丁 聚 醣 性 質 最 主 要 之 因 素 之 一 然 而 幾 丁 聚 醣 水 溶 性 低, 因 此 利 用 酵 素 水 解 製 備 LMWC 以 增 加 溶 解 度, 提 升 應 用 性 幾 丁 聚 醣 可 以 在 弱 酸 下 溶 解 成 膠 體 溶 液 (colloidal solution), 透 過 酵 素 水 解 可 降 低 其 分 子 量 使 其 黏 度 下 降 根 據 Kurita et al. (2000) 的 研 究 指 出, 以 lysozyme 作 為 水 解 酵 素 時, 最 佳 的 水 解 樣 品 去 乙 醯 度 為 56%, 當 去 乙 醯 度 為 11% 或 97% 時, 會 因 為 攜 帶 過 多 或 過 少 的 乙 醯 基 而 造 成 水 解 程 度 不 佳 的 現 象 chitinase 則 對 NAG 單 體 有 較 高 的 水 解 專 一 性, 當 去 乙 醯 度 高 時, 僅 能 切 割 部 分 乙 醯 化 的 部 位, 大 部 分 以 大 分 子 產 物 為 主 (Aiba, 1994a) Cellulase 具 有 水 解 NAG/AG 活 性 (Pantaleome, 1992), 水 解 活 性 會 隨 去 乙 醯 度 的 增 加 而 有 所 提 升, 因 為 較 高 的 去 乙 醯 度 能 增 加 幾 丁 聚 醣 的 溶 解 度 ( 通 常 高 於 70%), 其 溶 解 度 較 佳, 使 得 酵 素 作 用 較 完 全 (Tsai, 2000) 本 實 驗 使 用 DD80 與 DD92 作 為 酵 素 水 解 的 基 質, 以 商 業 酵 素 lysozyme cellulase 與 實 驗 室 自 行 誘 發 之 chitinase 作 為 水 解 酵 素, 製 備 高 溶 解 度 的 LMWC 36

4.1.1. 分 子 量 與 粒 徑 變 化 學 者 (Kasaai et al., 2000) 已 發 現 黏 度 與 分 子 量 之 間 的 相 關 性, 透 過 Mark-Houwink- Sakurada 方 程 式 可 以 推 算 水 解 物 的 平 均 分 子 量 雖 然 酵 素 活 性 的 強 弱 會 影 響 水 解 速 度, 但 本 實 驗 著 重 於 酵 素 水 解 的 結 果, 由 於 酵 素 本 身 專 一 性 特 性 所 致, 在 充 足 反 應 時 間 內, 水 解 產 物 的 分 子 量 會 趨 向 穩 定 表 一 的 結 果 顯 示, 幾 丁 聚 醣 的 分 子 量 (M V ) 會 在 水 解 3 小 時 內 由 300 kda 驟 降 至 13-37 kda, 經 過 水 解 24 小 時 後 便 會 趨 近 穩 定 的 大 小, 其 分 子 量 (M V ) 大 小 排 列 依 序 為 :DD92_lys (24.8 kda) DD80_lys (14.8 kda) DD92_chit (13.5 kda) DD80_chit (9.6 kda) DD80_cel (8.1 kda) DD92_cel (6.9 kda) 從 lysozyme 和 chitinase 水 解 產 物 皆 出 現 高 去 乙 醯 度 之 幾 丁 聚 醣 產 製 之 LMWC 分 子 量 大 於 低 去 乙 醯 度 者 由 於 lysozyme 必 須 有 三 至 六 個 N- 乙 醯 葡 萄 胺 醣 ((NAG) 3-6 ) 才 具 有 水 解 切 點,chitinase 只 需 一 個 N- 乙 醯 葡 萄 胺 醣 (NAG), 此 說 明 了 lysozyme 水 解 切 點 較 少, 因 此 LMWC_chit 分 子 量 會 大 於 LMWC_ lys; 同 理 低 去 乙 醯 度 之 切 點 較 高 去 乙 醯 度 者 多, 越 容 易 被 水 解 Cellulase 能 辨 識 β-1,4- 葡 萄 醣 苷 鍵, 幾 乎 能 完 全 水 解 幾 丁 聚 醣, 得 到 分 子 量 最 小 的 水 解 產 物, 然 而 LMWC_cel 不 同 於 其 他 兩 種 水 解 產 物, 其 分 子 量 為 DD80_cel 大 於 DD92_cel, 推 測 水 解 活 性 較 不 受 N- 乙 醯 葡 萄 胺 醣 量 的 多 寡 影 響, 而 是 與 溶 解 度 有 關, 因 為 低 去 乙 醯 度 的 幾 丁 聚 醣 37

其 溶 解 度 較 低, 故 限 制 了 酵 素 的 作 用 速 率, 產 生 較 高 分 子 量 的 水 解 產 物 粒 徑 分 析 的 結 果 如 同 分 子 量 皆 隨 水 解 時 間 增 加, 平 均 粒 徑 呈 現 大 幅 下 降 的 趨 勢, 經 過 水 解 24 小 時 後 粒 徑 大 小 排 序 與 分 子 量 的 結 果 相 同,DD92_lys 達 到 微 米 級 約 992 nm, 由 於 所 有 產 物 皆 過 0.22 µm 的 濾 膜, 但 所 測 出 的 粒 徑 還 會 超 過 200 nm, 推 測 幾 丁 聚 醣 屬 於 膠 體 物 質, 經 外 力 強 行 通 過 小 孔 徑 孔 洞 時 會 使 部 份 大 分 子 的 膠 體 變 形 得 以 0.22 µm 的 膜, 通 過 隨 後 又 恢 復 成 原 來 的 形 狀, 因 此 計 算 平 均 粒 徑 時 會 超 過 200 nm 測 得 的 水 解 產 物 最 小 的 DD80_cel 能 達 到 100-300 nm 接 近 於 奈 米 的 層 級, 使 得 幾 丁 聚 糖 水 解 產 物 可 能 有 不 同 於 未 水 解 之 物 理 特 性 及 可 能 延 伸 的 生 物 特 性 4.1.2. 溶 解 度 測 定 幾 丁 質 和 幾 丁 聚 醣 僅 溶 於 酸 性 環 境 下, 然 而 在 食 品 類 的 產 品 中, 除 了 飲 料 外, 易 腐 敗 的 產 品 中 仍 以 中 性 環 境 居 多, 其 在 中 性 環 境 溶 解 度 不 佳 的 問 題, 在 食 品 等 領 域 應 用 上 便 受 到 相 當 大 的 限 制 影 響 幾 丁 聚 醣 在 中 性 環 境 下 溶 解 度 的 主 要 因 子 為 分 子 量 及 去 乙 醯 度, 透 過 酵 素 水 解 不 但 能 降 低 分 子 量, 依 chitosan 及 lysozyme 的 水 解 特 性 也 有 提 高 去 乙 醯 度 的 可 能 性, 所 製 備 的 小 分 子 量 幾 丁 聚 醣 不 但 能 提 升 溶 解 度, 也 能 影 響 其 抗 菌 性 (Sekiguchi et al., 1994), 因 此 以 酵 素 降 解 獲 得 低 分 子 38

量, 在 至 少 不 影 響 抗 菌 性 的 前 提 下 來 提 升 溶 解 度, 為 此 領 域 的 重 要 議 題 先 前 得 知 幾 丁 聚 醣 水 解 後 分 子 量 便 立 即 下 降, 其 結 果 同 樣 反 應 在 溶 解 度 方 面, 使 得 溶 解 度 明 顯 提 升, 低 分 子 量 (DD80_cel) 的 溶 解 度 高 於 高 分 子 量 ( 圖 十 一 ), 其 中 cellulase 製 備 之 LMWC 的 溶 解 度 最 佳, 甚 至 能 在 24 小 時 後 達 到 100% 若 比 較 DD92 與 DD80 的 水 解 產 物, lysozyme 和 chitinase 以 DD80 產 生 之 LMWC 有 較 高 溶 解 度 ; 而 cellulase 產 物 卻 與 前 者 相 反, 其 原 因 可 能 受 基 質 溶 解 度 高 低 (DD92 >DD80) 所 影 響 4.1.3. 界 達 電 位 測 定 幾 丁 聚 醣 及 衍 生 物 溶 解 在 酸 性 環 境 下, 為 一 帶 陽 電 荷 聚 電 解 質, 此 電 荷 可 能 會 吸 附 干 擾 細 菌 細 胞 壁 表 面 所 帶 的 負 電 荷, 以 達 到 抑 菌 的 效 果 (Tsai et al., 1997) 粒 子 在 溶 液 中 電 性 彼 此 相 異 之 離 子 會 於 膜 面 附 近 極 化, 形 成 所 謂 的 電 雙 層 (electric double layer) 由 於 介 面 間 真 實 電 位 不 易 求 得, 習 慣 上 以 界 達 電 位 來 說 明 其 所 帶 電 荷 之 多 寡 (Hunter, 1981), 因 此 本 研 究 分 別 測 量 LMWC 與 細 菌 的 界 達 電 位, 以 評 估 其 表 面 的 帶 電 狀 態, 進 而 探 討 兩 者 之 間 的 吸 附 關 係 由 於 界 達 電 位 會 受 許 多 因 素 而 影 響, 其 中 包 含 分 子 量 與 粒 子 型 39

態, 因 此 可 預 期 LMWC 會 因 為 水 解 時 間 而 有 所 變 化, 表 一 的 結 果 顯 示, 六 種 水 解 產 物 的 界 達 電 位 會 隨 分 子 量 下 降 而 減 少,LMWC_cel 更 低 到 25-27 mv, 但 在 與 分 散 體 系 穩 定 標 誌 ( 附 錄 ) 進 行 比 對, 指 出 分 子 量 8.3 kda 以 上 的 LMWC 仍 具 相 當 穩 定 的 狀 態 (60 mv 以 上 ) 若 進 一 步 探 討 分 子 量 與 界 達 電 位 的 關 係 ( 圖 十 ㄧ), 首 先 發 現 電 位 隨 分 子 量 增 加, 但 達 到 分 子 量 高 峰 (LMWC_24 及 LMWC_168) 時 電 位 便 開 始 下 降, 推 測 原 因 可 能 為,lysozyme 需 要 辨 識 (NAG) 3-5, 導 致 LMWC_lys 除 了 較 大 外, 其 攜 帶 正 電 的 葡 萄 醣 胺 官 能 基 減 少 ( 即 去 乙 醯 度 較 低 ), 造 成 電 位 有 下 降 的 現 象 4.2. 水 解 產 物 抗 菌 活 性 分 析 4.2.1. 96 微 量 孔 盤 ( 微 量 試 驗 ) 水 解 產 物 因 不 同 酵 素 水 解 時 間 而 有 所 差 異, 其 生 物 活 性 亦 然, 有 關 幾 丁 聚 醣 及 其 衍 生 物 的 抗 菌 活 性, 在 過 去 學 者 研 究 及 討 論 指 出, 抗 菌 因 子 除 了 受 其 濃 度 強 弱 影 響 外, 還 包 含 菌 株 種 類 去 乙 醯 度 分 子 量 ( 聚 合 度 ) 及 溶 解 度 等, 目 前 普 遍 接 受 去 乙 醯 度 的 增 加 會 提 升 其 抗 菌 性, 而 分 子 量 大 小 與 抗 菌 性 的 相 關 性 影 響 則 較 沒 定 論 本 實 驗 是 以 常 見 病 原 菌 S. aureus 和 E. coli 分 別 作 為 革 蘭 氏 陽 性 與 陰 性 菌 的 代 表, 並 與 實 驗 室 製 備 之 LMWC 作 用, 進 行 抗 菌 的 探 討 由 表 二 結 果 明 顯 的 發 現, 高 去 乙 醯 度 的 LMWC_DD92 抗 菌 效 果 會 大 40

於 低 去 乙 醯 度 的 LMWC_DD80, 分 子 量 方 面 會 隨 著 分 子 量 降 低 致 使 抗 菌 效 果 下 降, 分 子 量 低 於 6 kda 則 會 無 法 抑 制 細 菌 生 長 而 在 LMWC 的 表 面 電 荷 方 面, 也 可 發 現 LMWC 界 達 電 位 越 強 其 抗 菌 效 果 會 越 強 就 菌 株 而 言,E. coli 對 LMWC 的 敏 感 性 大 於 S. areus, 若 以 菌 的 種 類 區 分, 則 顯 示 革 蘭 氏 陰 性 菌 對 幾 丁 聚 醣 的 抗 性 會 小 於 革 蘭 氏 陽 性 菌, 趨 勢 與 Chen 等 (2002) 研 究 相 符, 推 測 原 因 可 能 與 細 菌 表 面 的 電 荷 有 關, 因 此 本 實 驗 也 測 量 S. aureus 和 E. col 表 面 所 帶 的 電 荷 由 結 果 可 以 發 現 陰 性 菌 細 胞 壁 表 面 帶 的 負 電 荷 多 於 陽 性 菌 帶 的 負 電 荷, 說 明 正 電 荷 的 LMWC 與 負 電 荷 的 細 菌 所 發 生 的 電 中 和 作 用 可 導 致 細 菌 死 亡 然 而 幾 丁 聚 醣 水 解 物 對 兩 株 E. coli 和 三 株 S. aureusi 皆 具 有 不 同 的 抗 菌 活 性 E. coli 方 面, 其 抗 菌 活 性 BCRC 10314>BCRC 10675, 而 S. aureus 為 BCRC 10451>BCRC 10781>BCRC 10780, 其 中 甚 至 出 現 大 多 數 水 解 產 物 無 法 抑 制 BCRC 10780 的 情 形, 因 此 必 須 更 深 入 探 討 為 何 同 種 不 同 品 系 的 菌 株, 卻 有 如 此 的 差 異 對 於 幾 丁 聚 醣 及 其 水 解 物 對 菌 株 產 生 不 同 的 抗 菌 活 性, 許 多 學 者 曾 對 其 中 的 抗 菌 機 制 做 深 入 的 研 究, 雖 然 其 抗 菌 機 制 尚 未 明 確, 仍 歸 納 出 幾 種 可 能, 其 中 以 電 荷 的 影 響 較 受 重 視 本 研 究 在 比 較 細 菌 界 達 41

電 位 的 結 果 發 現,E. coli:bcrc 10314 為 -13.7 mv BCRC10675 為 -7.84 mv;s. aureu:bcrc 1041 為 -5.99 mv BCRC 10781 為 -5.47 mv BCRC10780 為 -4.26 mv( 表 二 ), 分 別 就 兩 種 菌 株 不 同 品 系 間 作 比 較, 其 負 電 荷 帶 的 越 多, 越 容 易 受 到 對 帶 正 電 的 LMWC 影 響, 其 抗 菌 效 果 也 越 強 若 以 全 部 菌 株 一 起 做 比 較, 其 趨 勢 同 樣 呈 現 帶 負 電 荷 最 多 的 BCRC 10314 (-13.7 mv) 所 需 的 MIC 濃 度 越 低 ; 反 之 帶 負 電 荷 最 少 的 BCRC 10780 (-4.26 mv) 是 抗 性 最 強 的 菌 株, 而 本 實 驗 結 果 與 Chung (2004) 等 學 者 所 認 為 負 電 荷 量 為 抗 菌 機 制 的 理 論 是 一 樣 的, 而 且 LMWC 對 菌 體 吸 附 量 ( 力 ) 和 抑 制 效 果 成 正 比 另 外,Liu 於 2004 年 的 研 究 中 指 出, 在 醋 酸 鹽 下,E. coli 及 S. aureus 之 細 胞 膜 會 吸 附 幾 丁 聚 醣, 進 而 中 和 細 菌 的 表 面 電 位 (Sashiwa et al., 2002, 2003), 使 細 胞 膜 結 構 改 變 (Liu et al., 2004), 造 成 細 胞 膜 破 裂, 最 後 造 成 細 胞 瓦 解 死 亡 此 外, 探 討 溶 解 度 與 MIC 之 間 的 關 係 發 現 幾 丁 聚 醣 雖 然 可 透 過 酵 素 水 解 降 低 分 子 量 以 提 高 溶 解 度, 然 而 可 能 會 影 響 其 抗 菌 性 因 此 在 製 備 LMWC 同 時 必 須 兼 顧 溶 解 度 及 抗 菌 性 等 兩 個 重 要 因 子 綜 合 表 一 與 表 二 結 果 發 現, 不 同 酵 素 所 製 備 的 產 物, 即 使 有 接 近 的 分 子 量, 抗 菌 性 卻 有 所 不 同, 但 皆 呈 現 溶 解 度 提 升 則 MIC 也 隨 之 提 升 的 情 形 LMWC_cel 雖 然 能 提 升 溶 解 度 達 60-100%, 卻 也 喪 失 了 部 份 的 抗 菌 42

性 ;LMWC_lys 仍 具 有 不 錯 的 抗 菌 性, 但 溶 解 度 提 升 有 限, 也 因 此 無 法 達 到 本 實 驗 預 定 之 目 的 從 實 驗 數 據 獲 得 證 實, 不 同 水 解 機 制 的 酵 素, 透 過 不 同 去 乙 醯 度 的 幾 丁 聚 醣, 可 以 製 備 在 分 子 量 溶 解 度 表 面 電 位 及 抗 菌 上 不 同 特 性 的 LMWC 由 於 本 實 驗 誘 發 的 chitinase 為 製 備 簡 單 之 酵 素, 數 據 顯 示 其 水 解 產 物 DD92_chit 對 兩 種 菌 皆 表 現 有 效 的 抗 菌 活 性, 同 時 也 兼 顧 溶 解 度, 在 食 品 應 用 的 彈 性 上 較 具 有 潛 力, 因 此 選 擇 DD92_chit 作 為 探 討 後 續 抗 菌 活 性 與 機 制 的 水 解 產 物 4.2.2. 微 生 物 培 養 增 值 分 析 儀 ( 增 量 試 驗 ) 利 用 96 微 孔 盤 所 進 行 的 抗 菌 活 性 測 試, 僅 能 表 示 LMWC 在 靜 置 下 對 菌 體 的 抑 制 活 性, 且 受 是 體 積 小, 僅 能 最 作 為 初 步 篩 選 之 用 從 MIC 的 結 果 篩 選 出 DD92_chit, 進 行 以 下 的 菌 種 生 長 曲 線 研 究, 以 了 解 LMWC 受 測 菌 種 生 長 之 影 響 本 實 驗 使 用 Bio-photorecorder 觀 察 細 菌 生 長, 為 避 免 不 同 細 菌 本 身 生 長 會 受 生 長 條 件 影 響, 造 成 抗 菌 效 果 的 偏 差, 因 此 對 3 株 S. aureus 及 2 株 E. coli 的 生 長 情 形 做 彼 此 間 的 評 估, 可 發 現 在 一 般 生 長 條 件 (40 rpm, 37 o C) 下, 各 菌 株 間 其 菌 數 及 生 長 情 形 其 實 是 相 當 接 近 的 ( 圖 十 二 及 圖 十 三 的 對 照 組 ) 從 圖 十 二 及 圖 十 三 表 示 DD92_chit 對 S. aureus 抑 制 之 生 長 曲 線 43

圖, 在 添 加 400 ppm DD92_chit 後, 發 現 BCRC 10780 被 抑 制 的 時 間 最 短 約 7 小 時,BCRC 10781 約 18 小 時,BCRC 10451 的 耐 受 性 最 差, 抑 制 時 間 可 達 22 小 時 DD92_chit 濃 度 增 加 至 800 ppm, 其 耐 受 性 趨 勢 仍 呈 現 BCRC 10780>BCRC 10781>BCRC 10451, 抑 制 時 間 分 別 延 長 至 10 20 及 30 小 時 圖 十 四 及 圖 十 五 表 示 DD92_chit 對 E. coli 抑 制 之 生 長 曲 線 圖, 當 添 加 100 ppm DD_92chit 後, 對 BCRC 10675 只 能 抑 制 約 4 小 時, 但 能 抑 制 BCRC 10314 達 15 小 時 濃 度 增 加 至 200 ppm 時, 對 BCRC 10675 能 延 長 至 23 小 時, 此 時 BCRC 10314 則 完 全 被 抑 制,BCRC 10675 耐 受 性 明 顯 高 於 BCRC 10314 由 兩 種 抗 菌 活 性 試 驗 皆 得 同 一 趨 勢, 即 細 菌 表 面 電 位 的 強 弱 明 顯 影 響 其 對 LMWC 耐 受 性 同 種 不 同 品 系 的 菌 株, 仍 呈 現 出 不 同 的 抗 菌 效 果, 應 與 表 面 電 位 相 關 為 了 進 ㄧ 步 探 討 LMWC 的 抑 菌 機 制, 後 續 實 驗 便 透 過 吸 附 與 電 子 顯 微 鏡 作 為 探 討 幾 丁 聚 醣 與 細 菌 表 面 作 用 情 形 4.3. 菌 體 吸 附 試 驗 葡 萄 醣 胺 的 amino groups 在 溶 液 中 質 子 化 作 用, 使 幾 丁 聚 醣 帶 正 電 荷 自 然 界 中 許 多 膠 體 顆 粒 例 如 細 菌 和 聚 分 子 通 常 帶 負 電 荷, 因 此 彼 此 間 會 相 互 作 用 產 生 吸 附 力, 進 而 導 致 菌 體 產 生 凝 聚 及 沉 澱 的 現 44

象 除 了 先 前 的 表 面 電 荷 外, 作 用 環 境 的 ph 值 也 是 影 響 其 吸 附 作 用 的 因 子 之 ㄧ, 因 此 必 須 選 擇 最 適 的 ph 值 環 境 才 能 達 到 其 最 佳 的 吸 附 能 力 由 Strand et al. (2002, 2003) 的 研 究 便 探 討 幾 丁 聚 醣 與 E.coli 的 吸 附 環 境 ph 值, 其 結 果 指 出 適 當 的 ph 值 條 件 (ph5.0 到 6.5) 下, 隨 著 ph 值 增 加, 會 使 LMWC 析 出, 使 其 吸 附 力 也 會 跟 著 提 升, 其 中 以 ph6.0-6.5 最 佳, 並 且 不 會 影 響 E. coli 的 生 長 在 此 同 時, 本 實 驗 也 對 S. aureus 在 不 同 ph 值 環 境 的 生 長 進 行 評 估, 以 盡 可 能 維 持 在 最 佳 吸 附 力 ph 值 又 不 影 響 細 菌 本 身 生 長 的 條 件 下 進 行 後 續 實 驗 圖 十 六 圖 十 七 圖 十 八 在 探 討 的 3 株 S. aureus 從 中 性 ph7 到 ph4.5 間 的 生 長 情 形, 由 結 果 得 知,3 株 S. aureus 在 低 於 ph6.5 之 生 長 會 受 影 響, 故 本 研 究 選 在 ph6.5 下 進 行 LMWC 與 S. aureus 及 E.coli 的 吸 附 力 實 驗 3 種 不 同 品 系 金 黃 色 葡 萄 球 菌 與 不 同 濃 度 DD92_chit 作 用 後, 彼 此 會 產 生 凝 聚 沉 澱 現 象, 使 得 細 菌 被 LMWC 所 吸 附, 因 此 從 培 養 基 中 懸 浮 殘 菌 的 多 寡, 可 判 定 彼 此 間 吸 附 力 的 差 異 從 圖 十 九 可 以 得 知,3 株 菌 在 起 始 菌 數 接 近 的 情 況 下, 加 入 200 ppm DD92_chit 後, 各 菌 體 明 顯 被 吸 附, 其 中 BCRC 10451 減 少 約 3 個 log 的 菌 數 隨 著 DD92_chit 濃 度 的 增 加, 所 得 細 菌 殘 菌 數 便 跟 著 減 少, 濃 度 與 殘 菌 數 45

的 log 值 幾 乎 呈 負 向 線 性 趨 勢, 當 添 加 到 800 ppm 時,BCRC 10451 僅 剩 10 4 cfu/ml, 而 BCRC 10780 所 剩 菌 數 最 多, 故 3 株 菌 與 LMWC 吸 附 力 強 弱 依 序 為 BCRC 10451 BCRC 10781 BCRC 10780 圖 二 十 則 是 2 種 不 同 品 系 大 腸 桿 菌 與 不 同 濃 度 DD92_chit 吸 附 作 用 後 殘 菌 的 變 化, 結 果 顯 示 只 加 入 100 ppm,bcrc 10314 的 log 菌 數 便 減 少 ㄧ 半, 隨 著 濃 度 增 加,LMWC 所 吸 附 的 菌 數 越 多, 當 加 入 200 ppm 時,BCRC 10314 幾 乎 全 為 LMWC 所 吸 附 雖 然 BCRC 10675 跟 BCRC 10314 的 吸 附 力 有 ㄧ 段 差 距, 但 還 是 能 在 加 入 400 ppm 時, 將 菌 數 吸 附 超 過 6 個 log 上 述 之 結 果 與 先 前 抗 菌 實 驗 (MIC) 比 較, 呈 現 一 致 的 結 果 受 吸 附 量 越 多 的 菌 種 其 MIC 越 低, 表 示 越 容 易 受 LMWC 所 抑 制, 此 外 細 菌 被 LMWC 吸 附 的 強 弱, 恰 與 zeta potential 所 帶 的 負 電 荷 多 寡 是 一 致 的, 以 BCRC 10314 帶 最 多 負 電 荷, 被 吸 附 的 能 力 最 佳, 而 BCRC 10780 帶 最 少 負 電 荷, 最 不 容 易 受 LMWC 所 吸 附, 由 此 證 實 LMWC 的 抗 菌 特 性 與 其 對 細 菌 的 吸 附 力 有 很 大 的 關 係 4.4. 掃 瞄 式 電 子 顯 微 鏡 細 菌 是 如 何 被 LMWC 吸 附, 其 吸 附 的 情 形 為 何, 是 否 以 包 覆 作 用 達 到 抑 制 細 菌 生 長, 或 是 如 同 先 前 研 究, 其 會 破 壞 細 胞 壁 導 致 菌 體 破 裂 而 亡 (Vishu Kumar et al., 2007; Liu et al., 2003; Chung et al. ), 上 46

述 問 題 可 透 過 SEM 觀 察, 得 到 部 份 答 案 圖 二 十 ㄧ 為 菌 體 未 以 LMWC 處 理 的 電 顯 圖, 可 以 看 出 雖 然 是 不 同 品 系 的 菌, 但 就 外 觀 外 型 而 言 差 異 不 大, 所 以 可 以 排 除 外 型 為 影 響 抗 性 的 因 子 圖 二 十 二 為 BCRC 10451 與 LMWC 作 用 一 小 時 後 的 電 顯 圖, BCRC 10451 為 S.aureus 最 容 易 受 到 影 響 的 品 系, 其 結 果 明 顯 的 如 預 期 推 測, 菌 體 表 面 被 LMWC 所 包 覆, 由 圖 二 十 二 (A) 可 以 發 現 有 類 似 長 桿 形 狀 的 菌 體, 推 測 為 圓 形 的 菌 體 先 被 LMWC 所 包 覆, 但 尚 未 完 全 終 止 細 菌 的 生 長, 因 此 細 菌 仍 可 運 用 有 限 的 養 分 繼 續 進 行 細 胞 分 裂, 然 而 受 到 LMWC 阻 斷 了 養 分 的 攝 取 及 空 間 上 的 阻 礙, 細 菌 未 能 完 成 細 胞 分 裂 而 停 止 其 動 作 為 了 繼 續 了 解 細 菌 細 胞 壁 的 狀 況, 小 心 以 低 濃 度 醋 酸 緩 衝 液 (20 mm) 將 細 菌 表 面 所 吸 附 的 LMWC 洗 去, 可 以 發 現 細 菌 表 面 被 LMWC 所 破 壞, 使 得 細 菌 有 明 顯 孔 洞 破 裂 ( 圖 B), 可 見 LMWC 可 深 入 細 胞 壁, 與 細 胞 壁 形 成 複 合 的 結 構, 導 致 菌 體 在 移 除 LMWC 的 過 程 中, 造 成 細 胞 外 壁 的 破 裂 因 此 亦 可 推 論, 菌 體 細 胞 壁 被 LMWC 干 擾 後, 除 了 電 中 和 外 會 導 致 菌 體 生 理 功 能 包 括 運 輸 生 殖 代 謝 與 其 他 菌 體 溝 通 等 能 力 停 止 外, 也 會 由 於 包 覆 而 導 致 細 胞 壁 變 形 破 壞, 繼 而 死 亡 圖 二 十 三 為 BCRC 10781 與 LMWC 作 用 後 的 電 顯 圖,BCRC 47