中 国 细 胞 生 物 学 学 报 Chinese Journal of Cell Biology 2016, 38(3): 257 264 DOI: 10.11844/cjcb.2016.03.0335 亚 油 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 李 大 彪 * 李 红 磊 邢 媛 媛 于 永 强 王 卫 云 陈 玲 李 平 ( 内 蒙 古 农 业 大 学 动 物 科 学 学 院, 呼 和 浩 特 010018) 摘 要 该 文 主 要 研 究 了 添 加 不 同 浓 度 的 亚 油 酸 ( 顺 -9, 顺 -12- 十 八 碳 二 烯 酸 )(0 20 40 80 120 μmol/l) 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 (bovine mammary epithelial cells, BMECs) 乳 脂 和 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 通 过 MTT 法 检 测 细 胞 活 力, 利 用 甘 油 三 酯 试 剂 盒 检 测 BMECs 内 甘 油 三 酯 (triglyceride, TAG) 的 合 成 量, 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 乳 脂 和 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 的 表 达 结 果 表 明 : (1) 添 加 20 μmol/l 的 亚 油 酸 能 促 进 BMECs 的 增 殖, 120 μmol/l 的 亚 油 酸 组 BMECs 的 相 对 增 殖 率 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05); (2)40 μmol/l 和 80 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 BMECs 中 TAG 的 合 成 量 显 著 高 于 对 照 组 (P<0.05); (3) 添 加 20 μmol/l 亚 油 酸 显 著 上 调 αs1- 酪 蛋 白 (casein alpha s1 identifiers symbols, CSN1S1) 和 κ- 酪 蛋 白 (κ-casein, CSN3) 基 因 的 表 达, 而 80 μmol/l 和 120 μmol/l 亚 油 酸 显 著 下 调 CSN1S1 和 CSN3 基 因 的 表 达 (P<0.05); (4)120 μmol/l 亚 油 酸 上 调 了 真 核 启 始 4E 结 合 蛋 白 -1(eukaryotic initiation factor 4E-binding-protein-1, 4EBP1) 基 因 的 表 达, 下 调 了 核 糖 体 蛋 白 S6 激 酶 -1(ribosomal protein S6 kinase-1, RPS6K1) 基 因 的 表 达 (P<0.05); (5) 添 加 20~120 μmol/l 亚 油 酸 显 著 下 调 脂 肪 酸 合 酶 (fatty acid synthase, FASN) 硬 脂 酰 辅 酶 A 去 饱 和 酶 (stearoyl-coa desaturase, SCD) 脂 肪 酸 结 合 蛋 白 -3(fatty acid-binding protein-3, FABP3) 的 基 因 表 达 (P<0.05); (6)20 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 (peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARG) 基 因 表 达 量 显 著 高 于 对 照 组, 而 120 μmol/l 亚 油 酸 组 PPARG 固 醇 调 节 元 件 结 合 因 子 -1(sterol regulatory element binding factor-1, SREBF1) 的 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 综 上 所 述, 20~40 μmol/l 的 亚 油 酸 对 BMECs 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 合 成 有 较 好 的 促 进 效 果 关 键 词 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 ; 细 胞 活 力 ; αs1- 酪 蛋 白 ; κ- 酪 蛋 白 ; 甘 油 三 酯 ; 乳 脂 合 成 相 关 基 因 Effect of Linoleic Acid on the Expression of Genes Associated with Milk Fat and Milk Protein Synthesis of Bovine Mammary Epithelial Cells Li Dabiao*, Li Honglei, Xing Yuanyuan, Yu Yongqiang, Wang Weiyun, Chen Ling, Li Ping (College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010031, China) Abstract The aim of this study was to determine the effect of linoleic acid supplementation (0, 20, 40, 80, 120 μmol/l) on expression of genes involved in milk fat and protein synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs). Cell viability was detected by MTT. Triglyceride (TAG) content was measured by using triglyceride de- 收 稿 日 期 : 2015-10-22 接 受 日 期 : 2016-01-22 内 蒙 古 自 治 区 高 等 学 校 青 年 科 技 英 才 支 持 计 划 ( 批 准 号 : NJYT-14-B05) 资 助 的 课 题 * 通 讯 作 者 Tel: 0471-4307726, E-mail: dkyldb@imau.edu.cn Received: October 22, 2015 Accepted: January 22, 2016 This work was supported by the Inner Mongolia Autonomous Region Young Talents of Science and Technology Support Project of Institutions of Higher Learning (Grant No.NJYT-14-B05) *Corresponding author. Tel: +86-471-4307726, E-mail: dkyldb@imau.edu.cn 网 络 出 版 时 间 : 2016-03-17 17:56:09 URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/31.2035.q.20160317.1756.004.html
258 研 究 论 文 termination kit. Expression of genes involved in milk fat and milk protein synthesis were measured by RT-qPCR. The results showed as follows. (1) 20 μmol/l linoleic acid promoted the proliferation of BMECs. However, 120 μmol/l linoleic acid significantly decreased the relative proliferation rate of BMECs (P<0.05). (2) The content of TAG in BMECs were significantly higher in groups with addition of 40 μmol/l and 80 μmol/l linoleic acid than that of control group (P<0.05). (3) 20 μmol/l linoleic acid significantly upregulated the transcription of CSN1S1 and CSN3, whereas 80 μmol/l and 120 μmol/l linoleic acid significantly downregulated the transcription of CSN1S1 and CSN3 (P<0.05). (4) 120 μmol/l linoleic acid significantly upregulated the transcription of 4EBP1, and downregulated the transcription of RPS6K1 (P<0.05). (5) The mrna levels of FASN, SCD and FABP3 in linoleic acid supplementation groups were significantly lower than those of control group (P<0.05). (6) 20 μmol/l linoleic acid significantly upregulated the transcription of PPARG, whereas 120 μmol/l linoleic acid significantly downregulated the transcription of PPARG and SREBF1 (P<0.05). In conclusion, 20~40 umol/l linoleic acid are optimal, considering its simulative effects on milk fat and protein synthesis. Keywords BMECs; cell viability; αs1-casein; κ-casein; TAG; genes associated with milk fat synthesis 在 日 益 追 求 健 康 饮 食 的 今 天, 牛 奶 成 为 越 来 越 多 人 的 选 择, 对 牛 奶 质 量 的 要 求 也 越 来 越 高 脂 肪 和 蛋 白 质 作 为 牛 奶 中 重 要 的 营 养 物 质, 是 衡 量 牛 奶 品 质 的 重 要 指 标, 是 牛 奶 作 为 高 营 养 食 品 的 物 质 基 础 我 国 生 鲜 乳 的 品 质 比 较 低, 乳 蛋 白 和 乳 脂 肪 的 [1] 含 量 普 遍 低 于 发 达 国 家 所 以, 加 快 奶 业 发 展 进 度 提 高 牛 奶 中 各 种 营 养 成 分 的 含 量 促 进 奶 类 消 [2] 费, 是 增 强 全 民 族 体 质 的 迫 切 需 要 血 液 中 乳 成 分 前 体 物 (milk components precursor, MCP) 的 含 量 和 组 成 直 接 影 响 着 牛 奶 中 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 的 含 量 为 了 改 善 牛 乳 品 质, 前 人 开 展 了 大 量 研 究 工 作 在 体 内 试 验 中, 往 往 通 过 饲 料 添 加 或 灌 注 的 方 法 来 研 究 MCP 对 牛 乳 合 成 的 影 响 有 研 究 表 明, 饲 喂 泌 乳 奶 牛 含 有 脂 和 油 的 饲 粮, 会 降 低 乳 腺 中 脂 肪 酸 的 从 [3] [4] 头 合 成 Purdie 等 研 究 发 现, 灌 注 乙 酸 盐 会 引 起 奶 牛 动 脉 血 中 葡 萄 糖 和 胰 岛 素 的 浓 度 显 著 增 加 而 体 外 实 验 主 要 以 培 养 的 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 (bovine mammary epithelial cells, BMECs) 和 组 织 块 为 模 型, 研 究 乳 腺 的 发 育 机 制 和 乳 汁 的 合 成 分 泌 机 制 雷 帕 霉 素 靶 蛋 白 (mammalian target of rapamycin, mtor) 信 号 通 路 在 调 节 乳 蛋 白 和 乳 脂 肪 合 成 方 面 起 重 要 作 用, 除 了 内 分 泌 信 号 外, 乳 腺 氨 基 酸 的 利 用 和 细 胞 能 [5] 量 水 平 都 受 到 mtor 信 号 途 径 的 调 控 亚 油 酸 是 人 体 必 需 脂 肪 酸, 具 有 抗 肿 瘤 抗 氧 化 抗 动 脉 粥 样 硬 化 提 高 免 疫 力 提 高 骨 骼 密 度 防 治 糖 尿 病 等 多 种 生 理 功 能 关 于 亚 油 酸 在 动 物 机 体 中 的 重 [6] 要 作 用, 前 人 做 了 大 量 研 究 刘 仕 军 等 的 研 究 表 明, 在 饲 粮 中 添 加 亚 油 酸 一 定 程 度 上 可 以 降 低 乳 蛋 白 质 酪 蛋 白 以 及 乳 清 蛋 白 的 含 量 崔 瑞 莲 等 [7] 的 研 究 表 明, 在 细 胞 增 殖 不 受 抑 制 的 脂 肪 酸 添 加 浓 度 范 围 内, BMECs 甘 油 三 酯 的 合 成 对 硬 脂 酸 油 酸 亚 油 酸 及 亚 麻 酸 均 有 剂 量 依 赖 效 应 Yonezawa 等 [8] 的 研 究 表 明, 在 培 养 液 中 添 加 棕 榈 酸 硬 脂 酸 油 酸 和 亚 油 酸 均 能 促 进 BMECs 中 CSN1S1(casein alpha s1 identifiers symbols) 的 表 达 齐 利 枝 等 [9] 的 研 究 表 明, mtor 的 mrna 相 对 表 达 量 随 着 油 酸 亚 油 酸 或 亚 麻 酸 添 加 浓 度 的 增 加 呈 一 次 线 性 或 二 次 线 性 曲 线 增 加, 并 呈 剂 量 依 赖 关 系 本 实 验 以 体 外 培 养 的 BMECs 为 模 型, 研 究 添 加 不 同 浓 度 的 亚 油 酸 对 BMECs 活 力 和 胞 内 甘 油 三 酯 (triglyceride, TAG) 含 量 的 变 化 规 律 以 及 对 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响, 旨 在 为 调 控 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 合 成 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 材 料 DMEM/F12 胎 牛 血 清 无 脂 肪 酸 的 牛 血 清 白 蛋 白 氢 化 可 的 松 胰 岛 素 转 铁 蛋 白 硒 溶 液 均 购 自 Gibco 公 司, 表 皮 生 长 因 子 催 乳 素 胶 原 酶 II 粉 剂 双 抗 胰 蛋 白 酶 /EDTA 混 合 液 MTT 粉 剂 和 亚 油 酸 二 甲 基 亚 砜 均 购 自 Sigma 公 司 ; 磷 酸 缓 冲 液 (phosphate buffer solution, PBS) 溶 液 购 自 HyClone 公 司 ; 总 RNA 提 取 试 剂 盒 RNA Isoplus RT-PCR 试 剂 盒 Prime Script TM RT Reagent Kit Real-time PCR 试 剂 盒 均 购 自 TaKaRa 公 司 ; TAG 试 剂 盒 购 自 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所
李 大 彪 等 : 亚 油 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 259 1.2 BMECs 的 培 养 与 鉴 定 用 胶 原 酶 消 化 法 获 得 原 代 BMECs 选 取 泌 乳 期 的 荷 斯 坦 奶 牛 3 头, 经 伦 理 委 员 会 同 意, 通 过 宰 杀 的 方 式 采 集 结 缔 组 织 和 脂 肪 组 织 较 少 的 乳 腺 组 织, 将 乳 腺 组 织 在 配 液 瓶 中 清 洗, 用 3 双 抗 PBS 缓 冲 液 清 洗 3 次, 经 75% 酒 精 浸 泡 漂 洗, 再 将 组 织 放 入 1 双 抗 PBS 缓 冲 液 瓶, 清 洗 3 次, 此 时 已 基 本 清 洗 干 净 用 眼 科 剪 分 离 去 除 脂 肪 和 结 缔 组 织, 得 到 腺 泡 组 织 后 将 其 剪 碎 至 1 mm 3 [10] 左 右 的 大 小, 用 弯 头 吸 管 转 移 至 离 心 管, 加 入 0.5% II 型 胶 原 酶 溶 液, 置 于 37 C 5% CO 2 浓 度 的 恒 温 培 养 箱 中 消 化 1~1.5 h, 期 间 每 隔 20 min 晃 动 离 心 管 消 化 液 用 孔 径 100 目 的 细 胞 滤 器 过 滤, 收 集 细 胞 滤 液 转 入 10 ml 离 心 管, 800 r/min, 离 心 8 min, 弃 去 上 清 液 用 生 长 培 养 基 悬 浮 细 胞 后 接 种 于 一 次 性 培 养 瓶 内, 于 37 C 5% CO 2 浓 度 的 恒 温 培 养 箱 培 养, 待 原 代 细 胞 生 长 至 70%~80% 汇 合 时, 根 据 不 同 的 贴 壁 时 间 和 对 胰 蛋 白 酶 的 敏 感 度 不 同 来 纯 化 BMECs 并 传 代 实 验 时 用 0.25% 胰 蛋 白 酶 3 ml 在 37 C 5% CO 2 及 饱 和 湿 度 的 培 养 箱 中 消 化 3 min, 待 成 纤 维 细 胞 变 圆 后 小 心 倒 掉 胰 酶 消 化 液, 加 入 PBS 清 洗 1 遍, 再 加 入 0.25% 胰 蛋 白 酶 2.5 ml 0.02% EDTA 2.5 ml, 放 入 37 C 5% CO 2 及 饱 和 湿 度 的 培 养 箱 中 消 化 5 min, 等 80% 的 细 胞 悬 浮 在 培 养 瓶 中, 即 用 终 止 培 养 基 终 止 消 化 BMECs 传 至 第 2 代 (P2) 备 用 原 代 培 养 所 得 到 的 BMECs 见 图 1 应 用 荧 光 免 疫 染 色 法 鉴 定 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 骨 架 蛋 白 CK-18 的 表 达 情 况 经 检 测 所 培 养 的 BMECs 呈 阳 性, 说 明 本 试 验 分 离 培 养 的 细 胞 是 BMECs( 图 2) 1.3 实 验 设 计 采 用 单 因 子 完 全 随 机 实 验 设 计 采 集 3 头 健 康 的 泌 乳 期 荷 斯 坦 奶 牛 的 BMECs 进 行 实 验 实 验 设 计 5 个 处 理 组, 亚 油 酸 的 终 浓 度 分 别 是 0( 对 照 ) 20 40 80 120 μmol/l, 每 组 3 个 重 复, 培 养 液 中 的 胎 牛 血 清 用 1 g/l 的 牛 血 清 白 蛋 白 代 替 亚 油 酸 ( 顺 -9, 顺 -12- 十 八 碳 二 烯 酸 ) 的 配 置 : 将 亚 油 酸 溶 于 无 水 乙 醇 中, 终 浓 度 为 35.66 mmol/l, 保 存 于 80 C 备 用 在 配 置 培 养 基 时, 将 亚 油 酸 添 加 到 不 含 有 脂 肪 酸 的 牛 血 清 白 蛋 白 中, 使 亚 油 酸 与 牛 血 清 白 蛋 白 结 合, 再 加 入 到 液 体 培 养 基 中, 防 止 亚 油 酸 析 出 1.4 测 定 指 标 与 方 法 1.4.1 MTT 法 测 定 BMECs 活 力 利 用 MTT 法 检 测 BMECs 的 活 力 将 细 胞 悬 浮 液 以 1 10 4 的 密 度 接 种 在 96 孔 培 养 板 上, 于 37 C 5% CO 2 恒 温 培 养 箱 中 培 养 待 细 胞 长 到 70%~80% 汇 合 后 分 别 添 加 含 有 不 同 浓 度 亚 油 酸 的 诱 导 培 养 液, 继 续 培 养 24 h, 每 实 验 组 设 7 个 重 复 在 培 养 结 束 前 4 h, 各 培 养 孔 加 入 MTT(5 mg/ml) 20 μl, 4 h 后 弃 去 上 清 液, 每 孔 加 入 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 100 μl/ 孔, 振 荡 10 min, 用 全 自 动 酶 标 仪 检 测 各 孔 490 nm 波 长 下 的 吸 光 光 度 (D 490 ) 值 细 胞 相 对 增 殖 率 (relative growth rate, RGR)= 试 验 组 D 490 / 对 照 组 D 490 1.4.2 BMECs 中 TAG 含 量 的 测 定 将 P2 代 的 BMECs 用 胰 酶 /EDTA 消 化 后, 以 8 10 5 / 瓶 的 密 度 接 种 于 75 cm 2 的 培 养 瓶 中, 待 细 胞 生 长 至 70%~80% 汇 合 时, 添 加 含 有 亚 油 酸 的 诱 导 培 养 液 继 续 培 养 24 h, 利 用 胰 蛋 白 酶 /EDTA 消 化 细 胞, 用 TAG 试 剂 盒 测 定 BMECs 中 TAG 的 含 量 1.4.3 BMECs 乳 脂 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 量 的 测 定 利 用 实 时 定 量 PCR 法 测 定 BMECs 乳 脂 乳 图 1 原 代 培 养 的 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 (100 ) Fig.1 Primary cultured bovine mammary cells (100 ) 图 2 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 的 免 疫 细 胞 化 学 分 析 (100 ) Fig.2 Immunocytochemistry of bovine mammary epithelial epithelial cells (100 )
260 研 究 论 文 蛋 白 合 成 相 关 基 因 的 表 达 量 将 P2 代 细 胞 悬 浮 液 接 种 于 75 cm 2 培 养 瓶 中, 每 瓶 10 ml 含 有 8 10 5 细 胞, 置 于 37 C 5% CO 2 恒 温 培 养 箱 中 培 养 待 细 胞 生 长 至 70%~80% 汇 合 后 分 别 添 加 含 有 不 同 浓 度 亚 油 酸 的 DMEM/F12 诱 导 培 养 液, 于 37 C 5% CO 2 恒 温 培 养 箱 中 继 续 培 养 24 h, 用 0.25% 胰 蛋 白 酶 /EDTA 于 37 C 消 化 细 胞, 将 细 胞 悬 浮 液 以 800 r/min 离 心 10 min, 弃 去 上 清 液, 用 PBS 清 洗 2 次 细 胞 总 RNA 的 提 取 采 用 试 剂 盒 按 说 明 进 行, 用 分 光 光 度 计 测 定 提 取 的 总 RNA 的 浓 度 及 D 260 /D 280, 反 转 录 PCR 按 照 试 剂 盒 说 明 进 行 操 作 引 物 序 列 及 参 数 见 表 1 1.5 数 据 统 计 分 析 实 验 数 据 采 用 Excel 2007 进 行 计 算 和 整 理, 实 时 定 量 PCR 实 验 结 果 采 用 2 ΔΔCt 法 进 行 相 对 定 量 数 据 [11] 分 析 利 用 SAS 9.0 软 件 的 ANOVA 程 序 对 数 据 进 行 方 差 分 析, 多 重 比 较 采 用 Duncan 氏 法 P<0.05 表 示 差 异 显 著 2 结 果 2.1 不 同 浓 度 亚 油 酸 对 BMECs 增 殖 的 影 响 由 表 2 可 以 看 出, 添 加 20 μmol/l 亚 油 酸, BMECs 的 相 对 增 殖 率 有 高 于 对 照 组 的 趋 势, 但 统 计 分 析 差 异 不 显 著 (P>0.05); 40~120 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 BMECs 相 对 增 殖 率 均 低 于 对 照 组, 其 中, 120 μmol/l 组 与 对 照 组 相 比 差 异 显 著 (P<0.05) 2.2 不 同 浓 度 的 亚 油 酸 对 BMECs 中 TAG 含 量 的 影 响 由 表 3 可 知, 40 μmol/l 和 80 μmol/l 亚 油 酸 组 BMECs 中 TAG 的 合 成 量 显 著 高 于 对 照 组 (P<0.05), 而 120 μmol/l 亚 油 酸 组 TAG 合 成 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05); 20 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 TAG 合 成 量 高 于 对 照 组, 但 统 计 分 析 差 异 不 显 著 (P>0.05) 2.3 不 同 浓 度 的 亚 油 酸 对 BMECs 乳 脂 肪 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 从 表 4 可 以 看 出, 添 加 20~120 μmol/l 亚 油 酸 会 基 因 名 称 Genes GAPDH CSN1S1 表 1 引 物 序 列 及 参 数 Table 1 Primer sequences and paramter 引 物 序 列 Primer sequences F: 5 -GTT TGT GAT GGG CGT GAA C-3 R: 5 -CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA T-3 F: 5 -TTC CCT CTT TCA TAC TGT GAA GTC GT-3 R: 5 -GGC TAT GGC TCC TAA GCA CA-3 CSN3 F: 5 -CCA GCT GCA GTT AGG TCA C -3 R: 5 -GGT GGA ATG GCC ATA AAT GAT-3 mtor F: 5 -TGT GGA GTT TGA GGT GAA GC-3 R: 5 -ATT ATC AAA GAA GGG CTG CAC-3 STAT5 F: 5 - TGT GGA GTT TGA GGT GAA GC-3 R: 5 - ATT ATC AAA GAA GGG CTG CAC-3 AKT F: 5 -CCT GCT CTC TGG GCT ACT CAA-3 R: 5 -CAC GAT GCT GGC GAA GAA-3 4EBP1 F: 5 -GAA CTC ACC TGT GAC CAA GA-3 R: 5 -CTC AAA CTG TGA CTC TTC ACC-3 PRS6K1 F: 5 -ATG AAA GCA TGG ACC ATG GG-3 R: 5 -CCG GTA TTT GCT CCT GTT AC-3 ACACA F: 5 -GTT TGT GAT GGG CGT GAA CC-3 R: 5 -CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA T-3 FASN F: 5 -GTT TGT GAT GGG CGT GAA CC-3 R: 5 -CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA T-3 DGAT2 F: 5 -CAT GAA GAC CCT CAT AGC CG-3 R: 5 -ACC AGC CAG GTG AAG TAG AGC-3 SCD F: 5 -TCC TGT TGT TGT GCT TCA TCC-3 R: 5 -GGC ATA ACG GAA TAA GGT GGC-3 FABP3 F: 5 -GAA CTC GAC TCC CAG CTT GAA-3 R: 5 -AAG CCT ACC ACA ATC ATC GAA G-3 PPARG F: 5 -ATG TCT CAT AAT GCC ATC AGG TT-3 R: 5 -GAT AAC AAA CGG TGA TTT GTC TGT C-3 SREBF1 F: 5 -CGC TCT TCC ATC AAT GAC AA-3 R: 5 -TTC AGC GAT TTG CTT TTG TG-3 Gene bank 序 列 号 Gene bank accessions No. XM-001034034.1 NM_181029.2 NM_174294.1 XM_002694043.1 NM_001012673 NM_005163 BC120290.1 NM -205816.1 NM_174224 NM_001012699 NM_205793 AY241993 DN518905 NM_181024 NM_001113302
李 大 彪 等 : 亚 油 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 261 表 2 亚 油 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 活 力 的 影 响 Table 2 Effect of linoleic acid on activity of bovine mammary epithelial cells 亚 油 酸 浓 度 (μmol/l) 项 目 Linoleic acid concentration (μmol/l) Items 0 20 40 80 120 RGR 1±0.06 ab 1.07±0.08 a 0.99±0.04 ab 0.89±0.02 bc 0.85±0.02 c 同 行 数 据 肩 注 不 包 含 相 同 小 写 字 母 表 示 差 异 显 著 (P<0.05) 下 表 同 Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below. 项 目 Items 表 3 添 加 亚 油 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 内 TAG 合 成 的 影 响 Table 3 Effect of linoleic acid on the triglyceride content of bovine mammary epithelial cells 亚 油 酸 浓 度 (μmol/l) Linoleic acid concentration (μmol/l) 0 20 40 80 120 TAG 0.0142±0.003 b 0.0154±0.002 b 0.019±0.004 a 0.022±0.004 a 0.012±0.003 c 表 4 不 同 浓 度 亚 油 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 乳 脂 肪 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 Table 4 Effects of supplementation of linoleic acid on the expression of genes associated with milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells 亚 油 酸 浓 度 (μmol/l) 项 目 Linoleic acid concentration (μmol/l) Items 0 20 40 80 120 ACACA 1.00±0.31 a 0.95±0.18 a 0.67±0.11 b 0.80±0.15 ab 0.73±0.07 ab FASN 1.00±0.09 a 0.62±0.12 b 0.22±0.03 c 0.18±0.01 c 0.22±0.03 c DGAT2 SCD FABP3 SREBF1 PPARG 1.00±0.65 bc 1.00±0.49 a 1.0±0.001 a 1.00±0.23 a 1.00±0.32 b 1.52±0.24 a 0.54±0.13 b 0.70±0.10 b 0.76±0.03 a 1.35±0.19 a 1.10±0.11 b 0.27±0.13 c 0.31±0.06 c 0.44±0.04 b 0.47±0.14 c 1.08±0.18 b 0.25±0.05 c 0.30±0.05 c 0.19±0.1 b 0.91±0.13 b 0.69±0.16 c 0.22±0.03 c 0.20±0.02 d 0.20±0.1 b 0.64±0.02 c 表 5 不 同 浓 度 亚 油 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 Table 5 Effects of supplementation of linoleic acid on the expression of genes associated with milk protein synthesis in bovine mammary epithelial cells 亚 油 酸 浓 度 (μmol/l) 项 目 Linoleic acid concentration (μmol/l) Items 0 20 40 80 120 CSN1S1 1.00±0.11 b 1.67±0.38 a 0.70±0.12 bc 0.39±0.01 cd 0.25±0.02 d CSN3 1.00±0.32 b 1.21±0.02 a 1.07±0.11 bc 0.47±0.06 cd 0.61±0.12 d STAT5 1.00±0.15 b 1.22±0.08 a 0.83±0.13 bc 0.33±0.50 c 0.63±0.13 c mtor 1.00±0.24 ab 1.22±0.10 a 1.00±0.17 ab 0.76±0.12 b 0.87±0.14 b AKT 1.00±0.30 a 0.74±0.09 b 0.96±0.17 a 0.57±0.16 b 0.64±0.14 b 4EBP1 1.00±0.11 bc 1.32±0.38 ab 1.24±0.12 ab 0.66±0.01 c 1.45±0.02 a RPS6K1 1.00±0.03 ab 1.58±0.12 a 1.30±0.20 b 1.36±0.05 ab 0.67±0.09 d 抑 制 BMECs 中 ACACA(acetyl-coenzyme a carboxylase a) 基 因 的 表 达, 其 中, 40 μmol/l 亚 油 酸 组 ACACA 基 因 的 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 添 加 不 同 浓 度 亚 油 酸 会 显 著 抑 制 FASN(fatty acid synthase) SCD(stearoyl-CoA desaturase) 和 FABP3(fatty acidbinding protein-3) 基 因 表 达 (P<0.05); 20 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 DGAT2(diacylgycerol acyltransferase 2) 基 因 表 达 量 显 著 高 于 对 照 组 (P<0.05); 40 μmol/l 80 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 DGAT2 的 表 达 量 有 上 调 趋 势, 而 120 μmol/l 的 亚 油 酸 组 DGAT2 的 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 添 加 40~120 μmol/l 亚 油 酸 组 SREBF1(sterol regulatory element binding factor 1) 基 因 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 和 20 μmol/l 亚 油 酸 组 (P<0.05), 而 20 μmol/l 亚 油 酸 组 与 对 照 组 无 显 著 差 异 20 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 PPARG(peroxisome proliferator-activated receptor γ) 基 因 表 达 量 显 著 高 于
262 研 究 论 文 对 照 组 (P<0.05), 而 40 μmol/l 和 120 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 则 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 2.4 不 同 浓 度 的 亚 油 酸 对 BMECs 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 从 表 5 可 以 看 出, 20 μmol/l 的 亚 油 酸 添 加 组, CSN1S1 CSN3(κ-casein) 信 号 转 导 和 转 录 激 活 因 子 5(signal transducer and activator of transcription 5, STAT5) 基 因 相 对 表 达 水 平 显 著 高 于 对 照 组 (P<0.05), 80 μmol/l 和 120 μmol/l 的 亚 油 酸 组, CSN1S1 CSN3 STAT5 基 因 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 20 μmol/l 的 亚 油 酸 组, mtor 的 表 达 量 与 对 照 组 相 比 有 增 加 的 趋 势, 80 μmol/l 和 120 μmol/l 的 亚 油 酸 组, mtor 表 达 量 有 下 降 的 趋 势, 但 统 计 分 析 差 异 不 显 著 (P>0.05) 20 80 120 μmol/l 的 亚 油 酸 添 加 组, AKT(serine-threonine protein kinase) 的 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 120 μmol/l 的 亚 油 酸 添 加 组, 4EBP1(eukaryotic initiation factor 4E-binding-protein-1) 的 表 达 量 显 著 高 于 对 照 组 (P<0.05), RPS6K1 (ribosomal protein S6 kinase-1) 的 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 3 讨 论 3.1 亚 油 酸 对 BMECs 的 活 力 的 影 响 体 外 培 养 BMECs 的 增 殖 分 化 生 理 功 能 等 受 多 种 因 素 的 影 响 脂 肪 酸 作 为 乳 脂 肪 合 成 的 前 体 物, 其 对 乳 腺 上 皮 细 胞 的 增 殖 具 有 一 定 的 作 用 王 治 国 等 [12] 研 究 发 现, 饱 和 脂 肪 酸 和 不 饱 和 脂 肪 酸 都 会 抑 制 BMECs 的 增 殖, 其 抑 制 情 况 呈 现 浓 度 依 赖 效 应 孙 晓 菊 等 [13] 研 究 表 明, 低 浓 度 的 亚 油 酸 会 促 进 BMECs 的 增 殖, 高 浓 度 则 抑 制 细 胞 的 增 殖 本 研 究 发 现, 添 加 较 高 浓 度 的 亚 油 酸 (120 μmol/l) 会 显 著 抑 制 BMECs 相 对 增 殖 率, 这 与 前 人 研 究 结 果 是 一 致 的 3.2 亚 油 酸 对 BMECs 乳 脂 肪 合 成 相 关 基 因 表 达 及 TAG 合 成 的 影 响 针 对 如 何 提 高 牛 奶 中 乳 脂 肪 的 含 量 和 改 善 乳 脂 肪 酸 组 成, 研 究 者 们 开 展 了 大 量 的 研 究 工 作 乳 脂 肪 在 BMECs 的 合 成 和 分 泌 是 一 个 复 杂 而 协 同 的 过 程, 需 要 多 种 基 因 或 蛋 白 的 参 与 ACACA FASN 是 乳 腺 脂 肪 酸 从 头 合 成 的 关 键 酶 前 人 研 究 发 现, 长 链 脂 肪 酸 的 供 给 会 抑 制 短 链 脂 肪 酸 的 从 头 合 成 [14] 添 加 十 八 碳 脂 肪 酸 会 抑 制 胞 质 内 TAG 的 合 [15] [7] 成 崔 瑞 莲 等 研 究 发 现, 添 加 不 饱 和 脂 肪 酸, 会 抑 制 ACACA FASN 和 SCD 基 因 的 表 达 本 研 究 得 出, 亚 油 酸 添 加 组 FASN 和 40 μmol/l 亚 油 酸 组 ACACA 基 因 表 达 量 均 显 著 低 于 对 照 组, 这 与 前 人 的 研 究 结 果 是 一 致 的 DGAT2 是 TAG 合 成 过 程 中 的 限 速 酶, 其 主 要 作 用 是 催 化 二 酰 甘 油 生 物 合 成 TAG 有 研 究 表 明, 在 体 外 培 养 BMECs 中 添 加 长 链 脂 肪 酸 能 促 进 TAG 的 合 [16-17] 成, 并 对 DGAT2 的 基 因 表 达 有 一 定 的 上 调 作 用 本 研 究 结 果 表 明, 20 μm/l 亚 油 酸 促 进 DGAT2 的 表 达, 而 120 μm/l 亚 油 酸 则 显 著 抑 制 DGAT2 的 表 达, 这 与 120 μm/l 亚 油 酸 组 TAG 含 量 显 著 低 于 对 照 组 的 结 果 相 吻 合 SCD 是 一 种 主 要 的 Δ9 去 饱 和 酶, 为 细 胞 内 单 不 饱 和 脂 肪 酸 合 成 的 限 速 酶, 也 参 与 胆 固 醇 的 [17] 合 成 卜 登 攀 等 研 究 表 明, 日 粮 中 添 加 豆 油 鱼 油 均 会 导 致 奶 牛 乳 腺 组 织 SCD mrna 表 达 量 的 下 [18] 降 胡 菡 等 研 究 指 出, 亚 麻 酸 浓 度 大 于 5 μmol/l 时, 乳 腺 上 皮 细 胞 SCD mrna 表 达 量 显 著 下 降 本 研 究 得 出, 添 加 20~120 μm/l 亚 油 酸 显 著 下 调 了 SCD 基 因 表 达, 表 明 添 加 多 不 饱 和 脂 肪 酸 可 能 会 影 响 乳 脂 肪 酸 的 组 成 FABP(fatty acid-binding-protein) 是 一 组 结 合 长 链 脂 肪 酸 的 胞 质 蛋 白 质, 在 很 多 组 织 的 脂 肪 酸 摄 取 和 转 运 过 程 中 起 重 要 作 用 FABP3 对 长 链 脂 肪 酸 有 高 亲 和 力, 能 协 同 其 他 酶 一 起 将 长 链 脂 肪 酸 酯 化 成 甘 油 三 酯 前 人 研 究 表 明, 饱 和 长 链 脂 肪 酸 会 增 加 BMECs 中 FABP3 的 基 因 表 达 量, 而 不 饱 和 长 [18] 链 脂 肪 酸 则 降 低 FABP3 的 基 因 表 达 量 本 研 究 得 出, 亚 油 酸 添 加 组 FABP3 的 基 因 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组, 这 与 前 人 研 究 结 果 相 一 致 SREBP(sterol-regulatory element binding protein) 和 PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor) 在 乳 脂 合 成 基 因 中 具 有 主 导 调 控 作 用, 是 脂 肪 酸 和 胆 固 醇 合 成 过 程 中 一 些 关 键 酶 基 因 的 主 要 激 [16] 活 剂 Kadegowda 等 研 究 报 道, c9 18:1, t10 18:1, t10c12cla 和 C20:5 都 降 低 了 BMECs 中 SREBF1 的 基 因 表 达, 而 对 PPARG 的 基 因 表 达 没 有 显 著 影 响 胡 [18] 菡 等 研 究 指 出, 添 加 亚 麻 酸 显 著 降 低 了 SREBF1 mrna 的 转 录 水 平, 高 浓 度 的 亚 麻 酸 会 下 调 PPARG mrna 转 录 水 平 本 研 究 发 现, 120 μmol/l 亚 油 酸 添 加 组 SREBF1 和 PPARG 的 基 因 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组, 这 可 能 是 导 致 该 处 理 组 TAG 含 量 显 著 降 低 的 主 要 原 因
李 大 彪 等 : 亚 油 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 263 3.3 油 酸 对 BMECs 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响 乳 蛋 白 合 成 过 程 存 在 两 条 重 要 的 信 号 通 路 : 一 条 是 JAK-STAT(Janus kinase 2-signal transducer and activator) 信 号 通 路, 调 控 乳 腺 组 织 内 的 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 的 转 录 激 活 ; 另 一 条 是 mtor 信 号 通 路, 在 [19] 蛋 白 质 翻 译 水 平 上 影 响 蛋 白 质 合 成 前 人 研 究 发 现, 乳 脂 合 成 前 体 物 影 响 乳 蛋 白 合 成, 但 结 果 不 尽 一 [20] 致 Yonezawa 等 利 用 体 外 研 究 发 现, 外 源 补 加 棕 榈 酸 油 酸 和 亚 油 酸 等 长 链 脂 肪 酸 促 进 了 CSN1S1 基 因 的 表 达 然 而, 也 有 研 究 报 道, 添 加 乳 脂 合 成 前 [21] 体 物 会 抑 制 乳 蛋 白 的 合 成 Jenkins 等 指 出, 奶 牛 日 粮 中 添 加 脂 肪 能 提 高 乳 脂 率 和 泌 乳 量, 但 通 常 会 [11] 降 低 乳 蛋 白 率, 而 且 以 酪 蛋 白 下 降 最 多 塔 娜 等 研 究 发 现, BMECs 中 同 时 添 加 乙 酸 钠 和 β- 羟 丁 酸 钠 显 著 下 调 CSN1S1 CSN3 基 因 表 达, 而 mtor 基 因 表 达 则 显 著 上 调 本 研 究 发 现, 20 μmol/l 的 亚 油 酸 组 CSN1S1 和 CSN3 基 因 的 表 达 量 显 著 高 于 对 照 组, 而 80 μmol/l 和 120 μmol/l 的 亚 油 酸 组 显 著 低 于 对 照 组 结 合 JAK-STAT 和 mtor 信 号 通 路 上 下 游 基 因 表 达 的 变 化 规 律, 本 文 得 出 低 浓 度 的 亚 油 酸 可 能 会 通 过 上 调 STAT5 mtor 和 RPS6K1 基 因 表 达, 促 进 酪 蛋 白 的 合 成 ; 而 高 浓 度 的 亚 油 酸 则 会 下 调 STAT5 mtor 和 RPS6K1 基 因 表 达, 上 调 4EBP1 基 因 表 达, 抑 制 酪 蛋 白 的 转 录 和 翻 译 过 程, 这 还 有 待 进 一 步 研 究 的 证 实 本 研 究 得 出, 40 μmol/l 和 80 μmol/l 亚 油 酸 显 著 增 加 了 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 TAG 的 合 成 20 μmol/l 亚 油 酸 显 著 上 调 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 CSN1S1 CSN3 STAT5 的 基 因 表 达 120 μmol/l 亚 油 酸 显 著 减 少 了 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 TAG 的 合 成, 上 调 4EBP1 基 因 的 表 达, 下 调 了 FASN SCD FABP3 SREBF1 PPARG CSN1S1 CSN3 STAT5 mtor RPS6K1 的 基 因 表 达 综 合 各 项 指 标, 20~40 μmol/l 的 亚 油 酸 对 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 的 合 成 有 较 好 的 促 进 效 果 参 考 文 献 (References) 1 王 加 启. 牛 奶 乳 脂 肪 和 乳 蛋 白 的 合 成 与 调 控 机 理. 饲 料 营 养 研 究 进 展 (Wang Jiaqi. Milk fat and milk protein synthesis and regulation mechanisms. Research Progress of Feed Nutrition) 2010; 12: 67-78. 2 韩 高 举. 中 国 奶 业 发 展 问 题 研 究. 华 中 农 业 大 学 博 士 论 文 (Han Gaoju. Studies on the development of dairy industry in China. Hua zhong Agricultural University doctoral thesis), 2005. 3 Lacount DW, Drackley JK, Laesch SO. Secretion of oleic acid in milk fat in response toabomasal infusion of canola or high oleic sunflower fatty acids. J Dairy Sci 1994; 77(2): 1372-85. 4 Purdie NG, Trout DR, Poppi DP, Cant JP. Milk synthetic response of the bovine mammary gland to an increase in the local concentration of amino acids and acetate. J Dairy Sci 2008; 91(1): 218-28. 5 Burgos SA, Dai M, Cant JP. Nutrient availability and lactogenic hormones regulate mammary protein synthesis through the mammalian target of rapamycin signaling pathway. J Dairy Sci 2010; 93(1): 153-61. 6 刘 仕 军, 卜 登 攀, 王 加 启, 梁 松, 刘 亮, 魏 宏 阳, 等. 日 粮 添 加 LA 和 DHA 对 乳 脂 脂 肪 酸 含 量 及 比 值 的 影 响. 动 物 营 养 学 报 (Liu Shijun, Pu Dengpan, Wang Jiaqi, Liang Song, Liu Liang, Wei Hongyang, et al. Chinese Journal of Animal Nutrition) 2008; 20(5): 515-21. 7 崔 瑞 莲, 王 加 启, 卜 登 攀, 魏 宏 阳, 南 雪 梅, 胡 菡, 等. 不 同 十 八 碳 脂 肪 酸 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 增 殖 及 甘 油 三 酯 合 成 的 影 响. 畜 牧 兽 医 学 报 (Cui Ruilian, Wang Jiaqi, Pu Dengpan, Wei Hongyang, Nan Xuemei, Hu Han, et al. Effects of 18-carbon fatty acids on cell prdiferation and friacylglycerol accumulation in bovin mammary epithelial cell in vitro. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica) 2012; 43(7): 1064-70. 8 Yonezawa T, Yonekura S, Kobayashi Y. Effects of long-chain fatty acids on cytosolic triacylglycerol accumulation and lipid droplet formation in primary cultured bovine mammary epithelial cells. J Dairy Sci 2004; 87(8): 2527-34. 9 齐 利 枝. 乳 脂 前 体 物 及 其 配 比 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 内 乳 脂 及 乳 蛋 白 合 成 的 影 响 机 理 研 究. 内 蒙 古 农 业 大 学 博 士 论 文 (Qi Lizhi. Effects of milk fat precursors and the ratios among them on the synthesis of milk fat and protein in bovine mammary epithelial cell and underlying mechanisms. Inner Mongolia Agricultural University doctoral thesis), 2013. 10 王 亨, 韩 超, 邱 昌 伟, 吴 培 福, 齐 长 明. 体 外 培 养 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 的 形 态 学 观 察. 中 国 兽 医 杂 志 (Wang Heng, Han Chao, Qiu Chang, Wu Peifu, Qi Changming. Morphology observation of bovin mammary epithelial cell in vitro culture. Chinese Journal of Veterinary Medicine) 2001; 43(6): 15-7. 11 塔 娜, 李 红 磊, 侯 先 志, 考 桂 兰, 高 民, 李 大 彪. 乙 酸 钠 和 β- 羟 丁 酸 钠 对 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 乳 脂 和 乳 蛋 白 合 成 相 关 基 因 表 达 的 影 响. 动 物 营 养 学 报 (Ta Na, Li Honglei, Hou Xianzhi, Kao Guilan, Gao Min, Li Dabiao. Effects of sodium acetate and sodium β-hydroxybutyrate on expressions of genes involved in milk fat and protein synthesis in bovine mammary epithelial cells. Chinese Journal of Animal Nutrition) 2014; 26(6): 1527-34. 12 王 治 国. 奶 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 的 体 外 培 养 及 应 用. 中 国 农 业 科 学 院 (Wang Zhiguo. In vitro culture and application of bovine mammary epithelial cell. Chinese Academy of Agricultural Sciences), 2007. 13 孙 晓 菊. 十 八 碳 不 饱 和 脂 肪 酸 对 乳 腺 上 皮 细 胞 脂 肪 代 谢 的 影 响 及 其 研 究 机 制 ( 硕 士 论 文 ). 内 蒙 古 农 业 大 学 (Sun Xiaoju. Effects of C 18 unsaturated fatty acids on lipid metabolism and its mechanisms in mammar epithelial cell. Inner Mongolia Agricultural University), 2012. 14 Warntjes JL, Robinson PH, Galo E. Effects off feeding supplemental palmitic acid (C16:0) on performance and milk fatty acid profile of lactating dairy cows under summer heat. Anim
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