1 作业答案 简述负控诱导系统和正控诱导系统的异同 异 : 负控 vs 正控 负控诱导系统中调节基因表达的是阻遏蛋白正控诱导系统中调节基因表达的是激活蛋白 同 : 诱导 最终的结果都是和效应物结合后, 诱导结构基因转录
分子生物学 第七章基因的表达与调控 ( 上 ) 原核基因表达调控模式 夏玉琼 2013-10-29
3 色氨酸操纵子概述 细菌在普通培养基中, 色氨酸操纵子是开启的, 负责合成色氨酸细菌在富含色氨酸的培养基中, 色氨酸操纵子会被关闭色氨酸操纵子参与生物合成而不是降解, 因此与葡萄糖效应无关, 不受 camp-crp 复合物的调控色氨酸的合成分为 5 步, 包含 7 个基因的参与
4 色氨酸的生物合成途径 2 分支酸 邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶 1 邻氨基苯甲酸合酶 邻氨基苯甲酸 3 磷酸核糖邻氨基苯甲酸 磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶 DRP
5 色氨酸的生物合成途径 DRP 4 吲哚甘油磷酸合酶 吲哚甘油磷酸 5 色氨酸合酶 色氨酸
6 色氨酸操纵子的结构 间隔区 间隔区 P O L a E D C B A 启动子区 操纵区 前导区 阻遏物基因 R 远离 trp 基因簇 弱化子 邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶 邻氨基苯甲酸合酶 色氨酸的 β 和 α 亚基 吲哚甘油磷酸核酶
7 色氨酸操纵子的转录调控 阻遏系统 阻遏基因 R 弱化系统 弱化子
8 目录 色氨酸操纵子的阻遏系统弱化子与前导肽 trp 操纵子弱化机制的实验依据 trp 操纵子的其它调控机制
9 trp 操纵子的阻遏系统 trpr 基因突变引起 trp mrna 的组成型合成, R 的基因产物称为辅阻遏蛋白 (aporepressor) 辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物, 与操纵区结合并关闭 trp mrna 转录 辅阻遏蛋白 色氨酸含量高时, 它与辅阻遏蛋白结合, 并使之与 O 区结合, 阻遏色氨酸的合成 色氨酸含量不足时, 辅阻遏蛋白失去色氨酸, 不与 O 区结合,trp 操纵子去阻遏
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12 目录 色氨酸操纵子的阻遏系统弱化子与前导肽 trp 操纵子弱化机制的实验依据 trp 操纵子的其它调控机制
13 阻遏作为唯一调节机制的问题 问题一 : 阻遏作用的调节水平比实际达到的水平要低 色氨酸高浓度下和低浓度下观察到 trp 操纵子的表达水平相差 600 倍, 阻遏作用仅使转录降低 70 倍 问题二 : 阻遏物失活突变不能完全消除色氨酸对 trp 操纵子表达的影响
14 弱化系统 另一种调控机制是弱化作用 (attenuation) 阻遏系统是一级开关, 控制转录是否启动, 相当于 trp 操纵子的粗调开关弱化系统相当于细调开关 酶的浓度随氨基酸的浓度变化而受到调节通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的
15 弱化系统 : 前导区 162 bp 间隔区 间隔区 P O L a E D C B A 前导区 L 123-150 位碱基序列缺失,trp 基因表达提高 6-10 倍, 说明此处有抑制 trp 基因表达的作用 有色氨酸时, 转录总是在此处终止弱化子 a 123-150 位碱基序列
16 弱化子引起终止的原因 : 茎 - 环结构 +110 +120 +130 +140 具有典型的终止子 的特点 +110 +140
17 前导肽 各种实验表明衰减作用需要负载 trna Trp 参与, 意味着前导序列的某些部分被翻译了前导序列 包括 : 起始密码子 AUG 和终止密码子 UGA 若从 AUG 开始翻译, 应该产生一个含有 14 个氨基酸的多肽该多肽实际未观察到, 这个假设的多肽即前导肽
18 前导肽 前导肽可能存在 因为存在一个 N 末端序列和前导肽序列相同的蛋白质 前导肽的特点 10 位和 11 位上有相邻的两个色氨酸密码子 组氨酸操纵子中的弱化子内, 也含有 7 个相邻的组氨酸密码子 苯丙氨酸操纵子的弱化子内, 也含有 7 个苯丙氨酸密码子
19 前导肽的特点 : 相邻两个色氨酸 间隔区 间隔区 P O L a E D C B A 前导肽
20 mrna 前导区的序列分析 4 个片段, 两种不同的配对方式 抗终止构型 2-3 RNA 成功通读 1-2;3-4 RNA 暂停构型 终止转录 发卡式结构 终止构型 DNA 转录起始位点 第一个结构基因 启动子 前导肽编码区暂停位点 弱化子
21 转录的弱化作用 mrna 转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的 因为前导肽中含有相邻的色氨酸残基, 前导肽的合成必定对 trna Trp 敏感 色氨酸浓度低,tRNA Trp 很少, 翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,4 区完成, 核糖体才到 1 区, 此时 2-3 配对, 转录继续进行色氨酸浓度高, 翻译通过相邻色氨酸密码子的速度快,4 区完成, 核糖体到达 2 区,3-4 配对, 转录停止
22 色氨酸浓度和配对方式直接相关 色氨酸浓度低 色氨酸浓度高 4 区完成转录时, 核糖体还在 1 区, 形成 2-3 配对, 转录继续进行 核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,4 区转录之前, 核糖体已经到达 2 区,2-3 不能配对,3-4 配对成茎环终止子
23 转录的弱化作用 弱化子对 RNA 聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置其它的操纵子, 如组氨酸操纵子和苯丙氨酸操纵子都有类似的机制
24 目录 色氨酸操纵子的阻遏系统弱化子与前导肽 trp 操纵子弱化机制的实验依据 trp 操纵子的其它调控机制
25 弱化系统的实验证据 色氨酰 trna 合成酶缺陷型大肠杆菌 色氨酸浓度较高时,trp 操纵子结构基因的表达没有被完全抑制实验 : 用温度敏感型突变株 trps5 为模型 :30 o C 时合成酶有活性, 能生成 trna Trp,42 o C 时合成酶无活性, 不能生成 trna Trp 实验结果 :30 o C 时 trp 操纵子的结构基因表达被抑制 ;42 o C 时没有被完全抑制
26 弱化系统的实验证据 前导区及 D 基因缺失的 trp 操纵子突变体 (trp LD102) 缺失弱化子 (trpa - ) 和 D 基因该突变体的色氨酸合成酶活性比野生型高 8-10 倍 株系 trpr + trpr - 野生型 Trp ED53(trpa + ) 0.17 11.8 突变型 Trp LD102(trpa - ) 1.82 100
27 弱化系统的实验证据 增强终止的突变型 trpl29 29 位 G A AUG AUA 不能起始蛋白质的合成, 有利于 trp mrna 形成 1-23-4 的结构, 从而增强终止结果 : 邻氨基苯甲酸合成酶活性低, 对色氨酸不敏感
28 弱化系统的实验证据 增强终止的突变型 trpl75 75 位 G A G 在 2 区内, 本来 G 可以和 3 区的 118 位的 C 形成氢键变为 A 后,2 区和 3 区的作用减弱, 从而终止增强结果 : 对色氨酸饥饿不能作出反应
29 弱化系统的实验证据 导致终止解除的突变型 ΔtrpLC1419 缺失 3' 端 UUUU 说明 UUUU 对转录终止起作用
30 弱化系统的意义 阻遏物从有活性到无活性的转变较慢, 需要一个能更快作出反应的系统, 以保持培养基中适当的氨基酸水平 弱化子能够较快地通过抗终止来增加 trp 基因表达, 迅速提高内源色氨酸浓度 为什么还需要阻遏系统 阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在时, 阻止非必需的先导 mrna 的合成, 它使这个合成系统更经济
31 目录 色氨酸操纵子的阻遏系统弱化子与前导肽 trp 操纵子弱化机制的实验依据 trp 操纵子的其它调控机制
32 trp 操纵子的其他调控机制 大肠杆菌 trp 操纵子有两个启动子 一个在操纵子 5' 端 另一个在 trpg-d 编码区, 内源启动子 间隔区 间隔区 P O L a E G-D C-F B A 5' 端启动子内源启动子
33 trp 操纵子的其他调控机制 枯草埃希菌 trp 操纵子含有 7 个色氨酸合成基因, 第 7 个 trpg 在叶酸操纵子里枯草埃希菌 trp 操纵子含有两个启动子区 色氨酸 (trp) 操纵子 启动子 启动子弱化子 叶酸 (folate) 操纵子 终止子内源启动子
34 枯草埃希菌色氨酸操纵子的调控方式 存在充分的色氨酸, 转录过程终止 Trp 激活 TRAP 蛋白, 结合于 GAG 重复单元上, 破坏了抗终止子结构的形成, 使终止子形成 转录被终止 激活的 TRAP 蛋白
35 枯草埃希菌色氨酸操纵子的调控方式 缺乏色氨酸, 转录过程继续进行 形成抗终止结构 RNA 聚合酶继续转录 缺乏色氨酸 TRAP 蛋白失活
36 枯草埃希菌色氨酸操纵子的调控方式 存在色氨酸, 但缺乏负载的 trna Trp, 转录过程继续进行 抗终止子结构形成 RNA 聚合酶继续转录 AT 蛋白的结合, 使 Trp 激活的 TRAP 失活
37 小结 色氨酸操纵子的结构 : 调控区和结构区色氨酸操纵子的阻遏系统 : 辅阻遏蛋白色氨酸操纵子的弱化系统 : 前导肽 发卡结构色氨酸操纵子的其它调控机制 : 大肠杆菌色氨酸操纵子的双启动子 枯草埃希菌色氨酸操纵子的特殊调控机制
38 作业十六 画出色氨酸操纵子的结构示意图 描述色氨酸操纵子的负控阻遏系统的作用 机制