北京大报 医版 =;,=& >9 ; 9-9%:,% 9 -# 8 论著 高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞 67 87 的影响 李相友 伍 军 罗 丹 陈晚先 朱戈丽 张艳霞 毕智敏 封宝红 武汉大附属同仁医院 武汉市第三医院肾内科 武汉 摘 要 目的 观察高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞,9, 的影响 方法 体外培养人腹膜间皮细胞株第 代 @ - 8@ @& 培养基含 D 体积分数 胎牛血清 观察 D D D 质量分数 葡萄糖腹膜透析液 < 及线粒体呼吸链复合酶 抑制剂鱼藤酮 线粒体呼吸链复合酶 抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮 # # %%& 线粒体呼吸链复合酶 抑制剂抗霉素 对细胞 9, 表达的影响 免疫印迹 通过小 干扰技术下调, 的表达 免疫印迹分析 D 高糖腹膜透析液作用下细胞 9, 的表达 通过白藜芦醇! # - 诱导自噬 甲基腺嘌呤 # @ 自噬相关蛋白 ' # % 自噬相关蛋白 # 抑制自噬 流式细胞仪分析细胞活性氧! < ' = 免疫印迹分析 9, 的表达 结果 对照组 D 高糖腹膜透析液 D 高糖腹膜透析液 D 高糖腹膜透析液 鱼藤酮 #, 抗霉素, 噻吩甲酰三氟丙酮 #, 各组细胞上清 9, 的相对表达依次为 提示 D 高糖腹膜透析液 D 高糖腹膜透析液 鱼藤酮 抗霉素 作用细胞 9, 表达明显升高 应用, 可阻断上述效应 此外 对照组 阴性对照! # - #, 诱导自噬 @ #, 抑制自噬 % 抑制自噬 # 抑制自噬 各组总线粒体荧光强度分别为 超氧化线粒体荧光强度分别为 结合免疫印迹结果 提示抑制自噬可增强线粒体 = 产生和提高 9, 表达 诱导自噬对 = 9, 无明显影响 结论 长期应用高糖腹膜透析液 腹膜间皮细胞,9, 持续激活 实时启动自噬可能成为干预,9, 持续激活 延缓腹膜透析腹腔慢性炎症及腹膜纤维化的治疗靶点 关键词 高糖腹膜透析液 人腹膜间皮细胞,9, 中图分类号 文献标志码 文章编号 6 %%#! & # 67 87 # &,9 ;,;=8 < ; # : < 9 & 8 ' ' # % ' # ;! % ' # ' '! % <'# # ' # # #, 9, ' # # # # @ - # - # ' # # # ## ' # 8@ @& D # # & # <' @ - # ' ' G % #! ' # G D < G D < G D < # # %%& G9 #! # <' 9,G #, # <', #! # <' 9, ' # # # # <' G D < G9 #! # - ' # @ # % #7 ' # # ' 7 ' # 7! < ' = = # 基金项目 国家自然科基金 湖北省自然科基金 & 武汉市卫计委科研项目 资助 '' # # & # &! & 6 # & # # @ ' # ' # 6 # 网络出版时间 网络出版地址 ' 7 7 # #
李相友 等 高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞,9, 的影响! # <' 9,G # % 9, #! <' G G G G G G G G G G G G # <' # ' # # # # ' 7 '# < '# < 9, <' G, 77 # #7 ' # 9,G9 # # = # ' #! # - @ % # G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G '! # G% #= 9, ' # ' G # # % # # # 9, @ ;, #! G - G #, ''# # ' # # #!,9, ' # # # # G% # ' #7,9,! '!! #' ' # ' # # ' # ' # #, - # ' # # # ' # # # #, 9, 腹膜透析具有良好的残肾保护作用及早期生存率优势成为终末期肾病患者的重要替代治疗方 法? 其使用人数在发展中国家特别是在中国迅速增长 尽管新型腹膜透析液不断涌现 但基于葡萄糖的传统透析液仍然是绝大多数腹膜透析患者的首选 这种高糖 高渗 低 ' 值的腹膜透析液是一种非生物相容性的透析液 长期使用可导致腹膜炎症因子的产生 血管新生 腹膜纤维化 最终导致超滤衰竭 患者不得不放弃腹膜透析治疗 腹膜间皮细胞是构成腹膜的主要细胞群体之一 其位于腹膜巨噬细胞和间皮下微血管之间紧密连接的关键部位 在高浓度葡萄糖腹膜透析液持续作用下 间皮细胞产生活性氧! < ' = 分泌炎症因子 细胞长期处于慢性炎症状态 从而启动新生血管形成及腹膜组织纤维化 当前, 炎症小体在机体炎症相关疾病中的作用备受关注 是近年研究的热点 其可被病原相关模式分子 ' # # ' @ 或危险相关模式分子 # # ' 8 @ 激活 通过 = 共同信号通路 促进促炎症蛋白酶 ' 活化 活化的 ' 切割位于炎症反应上游的 9, 前体 产生成熟的 9, 启 动系列炎症反应? 本实验旨在探讨高糖腹膜透析液对腹膜间皮细胞,9, 的影响 资料与方法 研究对象人腹膜间皮细胞株 @ - 购自美国模式培养物集存库 ' # # % 主要试剂 D D D 质量分数 葡萄糖腹膜透析液 < 购自广州百特 中国 医疗有限公司 种线粒体荧光染料 7 ' 7 和 = 购自美国 9! 公司 线粒体呼吸链复合酶 抑制剂鱼藤酮 线粒体呼吸链复合酶 抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮 # # %%& 线粒体呼吸链复合酶 抑制剂抗霉素 白藜芦醇! # - 甲基腺嘌呤 # @ 自噬抑制剂 购自美国 公司, 激动剂尿酸钠晶体 @ ; 和尼日利亚菌素 购自法国 9!! 公司 9, ' 9, 自噬相关蛋白 ' # % 自噬相关蛋白 #, 购自美国 # # % # 公司, 购自美国 8 公司 % 和 # 购自美国 9! 公司 实验分组及方法 高糖腹膜透析液对腹膜间皮细胞 9, 表达的影响 人腹膜间皮细胞株 @ - 为研究对象 采用第 代细胞 按照本课题组以前报道的方法进行细胞活力的检测 以备进行后续实验 对照组 D 高糖腹膜透析液组 D 高糖腹膜透析液组 D 高糖腹膜透析液组 鱼藤酮组 #, 噻吩甲酰三氟丙酮组 #, 抗霉素 组, 用 # 法分别测定细胞上清内 9, 及细胞胞浆内 ' 9, 的表达 下调, 对于高糖腹膜透析液对腹膜间
北京大报 医版 =;,=& >9 ; 9-9%:,% 9 -# 8 皮细胞 9, 表达的影响 在上述实验基础上 实验组分为阴性对照! # 及, 组 亚组分为 对照组 D < 鱼藤酮组 #, 抗霉素 组,@ ; 组, # 分别测定细胞上清内 9, 及细胞胞浆内 ' 9,, 的表达 调节细胞自噬对腹膜间皮细胞线粒体活性氧的影响 @ - 细胞分为 组 对照组 阴性对照 白藜芦醇 - 组 #, 诱导自噬 @ 组 #, 抑制自噬 % 组 抑制自噬 # 抑制自噬 作用细胞后 加入线粒体荧光染料 7 ' 7 和 = 染色 流式细胞仪分析 调节细胞自噬对腹膜间皮细胞,9, 的影响 @ - 细胞分为 组 对照组 阴性对照 白藜芦醇组 #, 诱导自噬 @ 组 #, 抑制自噬 % 组 抑制自噬 # 抑制自噬 作用细胞后 # 分别测定细胞上清内 9, 及细胞胞浆内 ' 9, % # 的表达 @ - 细胞分为 组 阴性对照 白藜芦醇组 #, 诱导自噬 % 组 抑制自噬 # 抑制自噬 亚组分为对照组 @ ; 组, 组 #, # 分别测定细胞上清内 9, 及细胞胞浆内 ' 9, 的表达 统计分析采用 统计软件 计量资料以 - 表示 根据方差齐性检验结果 多组比较采用单因素方差分析 认为差异具有统计意义 结果 高糖腹膜透析液对腹膜间皮细胞 9, 表达的影响 图 对照组 D 高糖腹膜透析液组 D 高糖腹膜透析液组 D 高糖腹膜透析液组 鱼藤酮 #, 组 抗霉素, 组 噻吩甲酰三氟丙酮 #, 组细胞上清 9, 相对表达依次为 G 高糖腹膜透析液 DD 和 D 组 鱼藤酮 抗霉素 组细胞上清 ' 9, 表达明显升高 与对照组比较 差异具有统计意义 %%& 组上调 9, 作用不明显 ' 9' < 8 < %%& # # 8 # # ' ' ' # 图 高糖腹膜透析液对腹膜间皮细胞 9, 表达的影响 %# % # ' # # # 9, <' @ - #
李相友 等 高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞,9, 的影响 下调, 对高糖腹膜透析液作用于腹膜间皮细胞 9, 表达的影响为进一步证实高糖腹膜透析液上调 @ - 细胞 9, 表达是否通过, 发挥作用 通过小 干扰技术下调, 的表达 观察 D 高 糖腹膜透析液 鱼藤酮 抗霉素 @ ; 作用下 @ - 细胞 9, 的表达情况 图, 转染细胞后, 表达明显下调 D 高糖腹膜透析液 鱼藤酮 抗霉素 @ ; 上调 9, 表达的作用明显减弱 ' 9' < 8 < @ ; 8 # # ' ' 图 下调, 对高糖腹膜透析液作用于腹膜间皮细胞 9, 表达的影响 %# %, # 9, <' # # ' # # # 调节细胞自噬对腹膜间皮细胞线粒体活性氧的影响选择白藜芦醇作为细胞自噬的诱导剂 应用自噬抑制剂 @ 及干扰自噬体形成的关键蛋白分子 % # % # 作为自噬阻断剂 观察上述不同自噬状态下 @ - 细胞 = 的情况 对照组 阴性对照组 白藜芦醇组 @ 组 # 组 % 组荧光强度分别为 @ % 及 # 组与对照组比较 差异具有统计意义 图 - 作用后细胞总线粒体无明显变化 对照组 阴性对照组 白藜芦醇组 @ 组 # 组 % 组荧光强度分别为 @ % 及 # 组与对照组比较差异具有统计意义 图 - 作用后超氧化线粒体无明显变化 调节细胞自噬对腹膜间皮细胞,9, 的影响由图 可见 @ % 及 # 作用细胞后 9, 表达上调 与上述第 节的结果 @ % 及 # 作用细胞后 = 增加的趋势一致 - 对 9, 表达无明显影响 由图 可见 阻断细胞自噬 % # 后, 炎症小体激活 @ ; 上调 9, 表达的效应增强 相反诱导细胞自噬 - 后, 炎症小体激活 @ ; 上调 9, 表达的效应减弱 讨论 持续不卧床腹膜透析是目前治疗终末期肾病的主要替代治疗方法之一 腹膜透析患者 年生存率与血液透析相似 而 年生存率却明显低于血液透析患者 基于葡萄糖的传统透析液仍然是绝大多数腹透患者的首选 特别是在中国 作为腹腔主要细胞群体之一的腹膜间皮细胞长期暴露于高糖环境中 可能产生 = 分泌炎症因子并启动新生血管形成及腹膜组织纤维化 在人腹膜间皮细胞 大鼠腹膜间皮细胞的研究已证实高糖腹膜透析液可导 致细胞内 = 升高? 本课题组的前期研究也得到类似的结论 本研究发现 高糖腹膜透析液作用 @ - 9, 表达升高 以 D 高糖腹膜透析
北 CMR 京 大 报! 医 版 # Z ay@lkda8g>b L?YL E>@[ 7X! A>KD7A[H >LH>[# E 'CL OV #%!P 液最明显&与此同时鱼藤酮%抗霉素 K作用细胞后 注!# c!& 其中@a[ 是激活 LD@G& 炎症小体的共同! 表 达 同 样 升 高 根 据 本 课 题 组 前 期 研 究 结 通路之一 M 本研究应用高糖腹膜透析液或线粒 果!! 推测! 的高表达与高浓度葡萄糖作用后 体呼吸链抑制剂所导致的 @a[ 升高及! 的高 细胞 @a[ 升高有关也与线粒体呼吸链抑制后线粒 表达是否由 LD@G& 炎症小体介导本课题组利用 体 @a[ 产生增加有关 小 @LK干扰技术下调 LD@G& 的表达发现 LD@G& 处于炎症反应上游的! 是启动系列炎症 表达明显下降' #Mh高糖腹膜透析液%鱼藤酮%抗 反应的重要分子过度和 或持续激活可造成广泛的 霉素 K%d[Y上调! 表达的作用明显减弱 体 组织损伤参与人类许多急慢性炎症相关疾病的发 外实验初步证实高糖腹膜透析液在 @a[ LD@G& 生LD@G& 炎症小体是调控! 表达的关键分子! 中 的 作 用 进 一 步 的 体 内 实 验 证 据 需 要 在 近年来在机体炎症相关疾病中的作用备受关 F;,& cc基因敲除鼠中完成 @[E & & dk & ; = :6 6& K7?M, 9= : 6,Q% %M ;9 : < = 6 图 IG不同自噬状态对细胞总线粒体的影响 7 'IG7=-, 9= 6 ; = 6: 6 有者报道!' '因自噬!线粒体自噬#受阻细胞 受损 @a[ 线粒体清除障碍@a[ 积累越来越多随后 激活 LD@G&!提示线粒体自噬与 LD@G&! 联系紧密 参照以往研究!M c!o 本研究选择白藜芦
CMC 李相友等高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞 LD@G&!的影响 醇作为细胞自噬的诱导剂应用自噬抑制剂 & dk及 @a[ LD@G&!无明显影响 本研究在人腹膜间 干扰 自 噬 体 形 成 的 关 键 蛋 白 分 子 K7? ] 6! 皮细胞中的发现与巨噬细胞的一致!' 提示实时启动!K7?M @LK%] 6! @LK#作为自噬阻断剂证实 自噬对细胞过度激活的 @a[ LD@G &!可能发挥一 抑制 自 噬 可 增 强 @a[ LD@G&! 诱 导 自 噬 对 定的保护作用进一步的实验需在体内加以证实 @[E & & dk & ; = :6 6& K7?M, 9= : 6,Q% %M ;9 : < = 6 图 JG不同自噬状态对细胞超氧化线粒体! 线粒体 @a[# 的影响 7 'JG7=-, 9= 6 @a[ 6 6; = 6: 6
北 CO% 京 大 报! 医 版 # Z ay@lkda8g>b L?YL E>@[ 7X! A>KD7A[H >LH>[# E 'CL OV #%!P [L,9 6 6 & 69, & @[E & & dk & ; = :6 6& K7?M, 9= : 6 图 KG不同自噬状态下 Ad [EM 细胞!的表达 7 'KG7=-, 9= 6! 9 6 6 [L,9 6 6 & 69, & @[E & d[y ; 6 :,;, & & dk & ; = :6 6& K7?M, 9= : 6 图 LG调控自噬对 Ad [EM 细胞 LD@G&!的影响 7 'LG7=-, 9= 6 LD@G&! 6 综上所述长期应用葡萄糖腹膜透析液特别是 高糖腹膜透析液腹膜间皮细胞 LD@G&! 持续! 持 激活实时启动自噬可能成为干预 LD@G& 续激活的潜在靶点并有可能成为延缓腹膜透析腹 腔慢性炎症及腹膜纤维化的治疗靶点 参考文献! X, S X 6S A, 6Ld 6 ;6 9 : < 69 6 : 9 9, 6 =-8 K : A 9 [,6 X [6 Y6 Z G V 6 #%!' &'! [,99# # ' [&! c[&' # 伍军 阳晓 余清腹膜透析与血液透析' 哪种透析治疗方 式具有更好的生存率 Z 中华肾脏病杂志 #%%R #'!!# # ' C&! cc&& & X,6[ H= 6 7d 6 6 ' ; = 6 9 6, 6 ;; 6 6:, 6 Z G V 6 #%%C #C! [,99## ' [#! c[#p ' [ = :b 7 = 99 Z 7=- ;; D ; Z H #%!%!'%!O# ' R#! cr&# M V H Gu E E 6 ], 6 @ 66 - ;;,6 6 =, = L 9& ;; ;- 6 6 J 6: Z [ 6 #%%R &#%!MRPO# ' OP' copp O I, Z X 6S l= 6X8?, J : 9 6 :, :: <6, 7D@ 6: = 9 9 6 6 9 = 6 : ;, 9 6 6 =,; 6 9 6 ; = Z H 6 E 6- ;;,6 #%!%!P! M # ' PMP c PO& P [ 6 @ DX @ J 6 6 ] Y[ @6 : ;#%!M 66, : 9 ' 9 :; U :6: - 6 =-Y6 : [ Z K;Zb :6V #%!O OP!& [,99!# ' [! c[&%m R H v 6 ] Gu f d w 6f8H d 6,:[ K 6 :, = =, - 6 9 6 ; = Z G V 6 #%!! &!!&# ' &#M c&&! C l= 6A I 6Z I S, X >! &' : = : # : 6 : - ;, : J= =, 9=6 6 =,; 6 9 6 ; = Z Z 6d: @ #%!# '%!&# ' C'& ccm&!% D, X [=6 A [=S A : 6, :- ; = =, - 6 9 6 ; = J 6, 6 : - Z L9= 6 > 9 L9= #%!'!#O! & # '!MP c!om!! 伍军 何敏 张健 等葡萄糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞 线粒体活 性 氧 的 影 响 Z 中 国 现 代 医 药 杂 志 #%!M!P!!%# ' M cr!# V 6 HKK 6 9 9 -!J =- U9 ;; 6 Z >,Z ;;,6 #%!! '!! M # '!#%& c!#!p!& KJ: f U K [ 7 H, = -V LD@G& ;; D ;' ;: 6 6 6, 6 :- : - 6: ;; : Z @: ] #%!M '' #CO c&%p!' l=, @ X f :K[ d6, G K - ; = 6: 6 LD@G& ;; ;- 6 Z L, #%!! 'OC!P&#C# ' ##! c##m!m H= 6XG b[d A, IA @ 6= J LD@G& ;; ;- 6 J9 6; = 6: 6 6:, ;6 6, 9= Z ZH G= #%!M #&%!P# '!MOP c!mpc!o H=6 dd XD Z 6 S @ 6,, 6 : = ;; 6 J 6:, 6, 9= =, = = KdG 6 69 =< Z K, 9= #%!& C!!## ' #%&& c #%'M!#%!P %&!P 收稿#! 本文编辑'王蕾#