第 ３５ 卷第 ７ 期 V ３５, N ７ 草 业 科 学 PRATACULTURALSCIENCE DOI: １０ １１８２９/ n １００１ ０６２９ ２０１７ ０４６３ j １６８５ １６９４ ７/２０１８ 刁桂萍,杨帅,遇文婧 棘孢木霉葡聚糖酶基因 G 草业科学, １ 的克隆及原核表达 ２０１８, ３５( ７): １６８５ １６９４ D GP, YngS, YWJ C n ngndp k xp n g n gng １ m T d m p m P S n, ２０１８, ３５( ７): １６８５ １６９４ 棘孢木霉葡聚糖酶基因 G １ 的 克隆及原核表达 植物 生产层 刁桂萍１,杨 帅１,遇文婧２ ( 东北林业大学林学院,黑龙江 哈尔滨 １５００４０;２ 黑龙江省林科院森林保护研究所,黑龙江 哈尔滨 １５００４０) １ 摘要:从棘孢木霉( T d m p m ) ACCC３０５３６ 中克隆获 得 一 个 葡 聚 糖 酶 基 因 G １,其 DNA 全 长 ９８４bp, 编码 ３２７ 个氨基酸.该葡聚糖 酶 属 于 G d １２ 家 族,推 测 为 β １, ４ 葡 聚 糖 酶,与 深 绿 木 霉 IMI２０６０４０ 的 G d １２ 家族蛋白( XP_０１３９４０３９７ １)有 ９１ 相似性,且亲缘关系较近.运用 qrtpcr 技术检测 ９ 种诱 导 条 件 下 棘 孢 木霉 G １ 基因的表达水平,结果表明, G １ 基因 能 参 与 棘 孢 木 霉 对 山 新 杨 ( Pp d d n P b p md )或杨树病原菌的识别.构建原 核 表 达 载 体 并 获 得 重 组 蛋 白 G １. 酶 活 特 性 分 析 结 果 表 明,该 酶 最 适 ph 为 ４ ５,最适温度为 ４５,且酶活性随诱导时间延长逐渐升高,在 ５ 达到稳定. 关键词:生物防治;山新杨;序列分析; qrtpcr;原核表达;酶活特性分析;生物农药 中图分类号: Q９４３ ２ 文献标志码: A 文章编号: １００１ ０６２９( ２０１８) ０７ １６８５ １０ C n ngndp k xp n g n n G １ mt d m p m g D G ng１,yngs １,Y Wn ng２ p j ( １ S F N F b n,１５００４０,h ng ng,c n; Un,H j ２ F ni n,h ng nga dm F b n,１５００４０,h ng ng,c n) P j,h j Ab :A９８４ bpg n gn ( G １)w nd m T d m p m ACCC３０５３６,nd w, nd n d qn ３２７m n d TG １ p n w b ng G d １２ m, p d d bβ １,４ n TG １ m n d qn ９１ dn n g nd _ w G d １ ２ m nx P ０ １ ３ ９ ４ ０ ３ ９ ７ １ T d I M I ２ ０ ６ ０ ４ ０ U n R T P C R p p gq n,g １ xp n nt p m w mn dnd n nd n nd nnd n, w nd d G １ mp n gn nb w nt p m ndpp pp ng p p gn A p k xp n w dnd mb nn p ng １ p n w b nd Enz nd d p mm phnd mp G １ ４ ５ m n nd４５, p G １ d n w p ng n nd nd np,nd g ５ K d :b n ;Pp d d n P b ; qn n ;qrtpcr;p k pmd w xp n;nz ;b g gn m C ng :D G ng Em : dgp２００３ １２６ m p pnd 收稿日期: 接受日期: ２０１７ ０９ １４ ２０１７ １２ ２１ 基金项目:中央高校基础科研业务费专项基金项目( ２５７２０１４BA０８);哈 尔 滨 市 科 技 局 青 年 科 技 创 新 人 才 项 目( ２０１３RFQXJ ０２);黑 龙 江 省 级 基 本科研业务费资助项目;哈尔滨市科技局青年科技创新人才项目( ２０１６RQQXJ ２３５) 通讯作者:刁桂萍( １９８１ ),女,黑龙江哈尔滨人,副教授,博士,主要从事森林保护研究.Em : dgp２００３ １２６ m z d n p: kx
1686 草业科学第 35 卷 植物致病真菌的细胞壁主要由几丁质 β G1,3G 葡 聚糖 αg1,3g 葡聚糖和 αg1,4g 葡聚糖组成 [1G3]. 葡聚糖 酶具有分解植物病原真菌细胞壁的能力, 因此能够起 [4G6] [7] 到抑制植物真菌的作用.Cdd 等从番茄 (Lpnnm) 的代谢产物中分离纯化到 一种葡聚糖酶, 体外抑菌试验表明, 其能抑制番茄病原 真菌茄链格孢菌 (Amn) 的菌丝生长. 而 在豌豆 (Pmm) 种子中发现分子量为 26kD 的葡聚糖酶, 能抑制菜豆炭疽菌 (CmnG dmnm) 和香蕉炭疽菌 (Gpm mg m) 菌丝的生长 [8]. 此外, 大豆疫霉菌 (PpG j) 能诱导大豆葡聚糖酶活性的增强已被证实, 而且大豆 (Gn mx) 对大豆疫霉根腐病 (P.G j) 的抗性与葡聚糖酶的活性呈正相关关系 [9]. 木霉菌 (Tdmpp.) 在防治植物真菌病害 中起到非常重要的作用 [10]. 它可通过分泌裂解液分 解宿主菌丝的细胞壁, 而这些裂解液中就包括葡聚糖 酶 [11]. 有研究表明, 哈茨木霉 (T.znm) 和绿木 霉 (T.n) 的 βg1,6g 葡聚糖酶对病原菌有较好的生 物防治能力. 哈茨木霉 CECT2413 的 βg1,6g 葡聚糖 酶基因 Bgn16.3 的过表达能使其更有效地抑制灰霉 病菌 (Bn) 核盘菌 (SnG m) 和柑桔褐腐疫霉菌 (PppG [12G13] [14] ) 菌丝的生长.Djn 等将 βg1,6g 葡聚糖 酶基因 TGbgn3 进行沉默和过量表达, 证明绿木霉的 βg1,6g 葡聚糖酶基因 TGbgn3 在其生防机制中起到关键作用. 为进一步探究棘孢木霉 ACCC30536 葡聚糖 酶的生防功能, 揭示木霉生防分子机理奠定理论基础, 也为棘孢木霉酶制剂类生物农药的开发与应用提供理 论与技术参考, 本研究克隆了棘孢木霉 ACCC30536 的葡聚糖酶基因 G1, 并分析了该基因在 9 种诱导条 件下的调控表达水平, 在此基础上, 构建原核表达载体 获得重组葡聚糖酶, 并对重组葡聚糖酶的酶活特性进 行了初步研究. 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试菌株棘孢木霉 (T.pm)ACCC30536, 由中国农业微生物保藏管理中心 (ACCC) 提供. 1.2 葡聚糖酶基因 G1 的克隆及序列分析 利用 Tz 法提取棘孢木霉 ACCC30536 的总 RNA, 并反转录获得 DNA. 根据引物 g1:5 GATG GACGATCCGCATCCTCGTCG3 和 g2:3 GGGTGG GAGGATGTTTCTATATCG5 进行 DNA 的 PCR 扩增, 扩增产物转化到大肠杆菌 Tp10 中, 经过 PCR 检测后进行测序 [15]. 对获得的 DNA 序列进行生物 信息学分析 :NCBI Cnd Dmn (p: www.nb.nm.n.g/) 进行保守区和蛋白 家族预测, 并寻找相似序列 ;MEGA5.1 软件进行多序 列比对和进化树的建立 ;ExPASPPm(p: www.xp.g/) 分析分子量 等电点和疏水性 ;SgG np4.0(p: www.b.d.dk//sgnp/) 预测信号肽 ;PCmp9.0 进行亚细胞定位分析 ; Swmd(p: www.wmd.xp.g/) 预测蛋白的三维结构, 模式选自动建模 [16G17]. 1.3 葡聚糖酶基因 G1 在不同培养条件下表达分析 将棘孢木霉 ACCC30536 菌丝体分别培养在 MM [0.5% 葡萄糖,15 g L -1 NH2PO4,5 g L -1 (NH4 ) 2SO4,600 mg L -1 CC2 2H2O,600 mg L -1 MgSO4 7H2O,5 mg L -1 FSO4,2 mg L -1 CC2,1.6 mg L -1 MnSO4,1.4 mg L -1 ZnSO4] C 饥饿 (MMG 葡萄糖 ),N 饥饿 (MMG (NH4) 2SO4), 羧甲基纤维素钠 (MG 葡萄糖 + 羧甲基纤 维素钠 ), 山新杨 (Ppddn P.b. pmd) 根粉 (MM+1% 山新杨根磨粉 ), 山新杨 茎粉 (MM+1% 山新杨茎磨粉 ), 山新杨叶粉 (MM+ 1% 山新杨叶磨粉 ), 病原菌细胞壁 (MM+1% 杨树烂 皮病细胞壁 ) 和病原菌发酵液 (MM+5% 杨树烂皮病 发酵液 ) [17] 共 9 种诱导培养基中, 分别在诱导 0 12 24 48 和 72 收取菌丝, 提取总 RNA, 反转录后进行 qrtgpcr, 每组重复 3 次.qRTGPCR 反应体系 :10 μl 的 2 SYBR Gn RGmPCR M mx, 0.5μL 引物,2μL 的 DNA,ddH2O 定量至总体积 20 μl.qrtgpcr 反应条件为 :95 预变性 30;95 变性 5,59 退火 15,72 延伸 10;82, 读板 1 ;45 个循环 ;55~95, 每间隔 0.5 读板 1. 并采 用 2 -ΔΔCT 方法计算基因表达量 [17].G1 基因及内参 基因 (An ἀgbn 和 βgbn) 引物如表 1 所列. 1.4 葡聚糖酶基因 G1 原核表达载体构建 根据 G1 基因序列和原核表达载体序列设计带 有酶切位点的引物,G1:5 GATCGGGATCCATG GACGATCCGCATCCTCGTCG3 ( 下划线为 BmHI 酶切位点 )G2:5 GCGATGCGGCCGCGGTGGAGG GATGTTTCTATATCG3 ( 下划线为 NI 酶切位 p:kx.z.d.n
第 7 期刁桂萍等 : 棘孢木霉葡聚糖酶基因 G1 的克隆及原核表达 1687 表 1 qrtgpcr 引物 Tb1 qrtgpcrpm 基因 引物 序列 (5 G3 ) 产物大小 Gn Pm Sqn(5 G3 ) Szpd/bp G1 G1 GATCTTACTGCCGACAATCT 309 G2 GAACACGCTGTTGATGAGTG αgbn αg1 CTGGTCACGGCTGGACTACAAG 245 αg2 GCATCAAGTCGTCGTCGTCGT βgbn βg1 GTTACCTGACGTGCTCCACCAT 232 βg2 CGGAACATGGCGGTGAACTGT An AG1 AAGGAGTCCGTCGTCGAGGTT 247 AG2 AGTTGAGGGCGGAGCGGATA 点 ). 以棘孢木霉 ACCC30536 的 DNA 为模板,G1 和 G2 为引物进行 PCR 扩增. 用 BmHI 和 NI 限制性内切酶对 PCR 的回收产物及 pgexg4tg2 质粒分别进行双酶切, 用 T4DNA Lg 进行连接后, 转入大肠杆菌 TOP10 感受态中, 在含终浓度为 50 mg L -1 羧苄青霉素的 LB 固体培养基中筛选, 并对 [18] 获得的转化子进行 PCR 和双酶切检测. 1.5 葡聚糖酶基因 G1 的原核表达将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株 BL21 中. 将获得的阳性转化子接种于 3 ml 含 50 mg L -1 羧苄青霉素的 LB 液体培养基中,37 过夜培养 12. 次日用新鲜培养基稀释过夜的菌液, 待菌液 OD600 为 0.4~0.6 时, 加入终浓度为 1.0 mm L -1 IPTG, 于 30 200 mn -1 培养 6, 进行重组蛋白诱导表达, 以 IPTG 诱导的含 pgexg4tg2 空载的大肠肝菌 BL21 及未诱导的含重组质粒的大肠杆菌 BL21 作为 [15] 对照, 并通过电转化进行蛋白纯化. 1.6 重组葡聚糖酶的酶活特性分析 [19] 采用还原糖测定法, 测定不同 ph(3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 和 7.0) 及不同反应温度 (30 35 40 45 50 55 60 65 和 70 ) 对重组葡聚糖酶酶活的影响. 然后在最适温度和 ph 条件下测定不同诱导时间 (1 2 3 4 5 和 6) 对重组葡聚糖酶活性的影响. 以沸水浴中失活的粗酶液作对照, 每组重复 3 次. 2 结果 2.1 棘孢木霉葡聚糖酶基因 G1 的克隆与序列分析棘孢木霉 G1 基因的 DNA 序列全长为 984 bp, 编码 327 个氨基酸 ( 图 1).PPm 软件分析表明, 该葡聚糖酶的分子由 4956 个原子构成, 分子式为 C1592H2456N406Q494S8, 相对分子量为 35443.92, 等电点为 4.76, 含有 20 种氨基酸 ( 表 2). 通过 BP 预测该蛋白属于 GGdG12 家族 ( 图 2A). 葡聚糖酶 G1 具有多个磷酸化位点, 其中有 18 个苏氨酸磷酸化作用位点 (T:18) 13 个丝氨酸磷酸化作用位点 (S:13) 和 5 个酪氨酸磷酸化作用位点 (T:5), 说明该葡聚糖酶磷酸化以苏氨酸和丝氨酸磷酸化为主, 兼有酪氨酸磷酸化 ( 图 2B). 在葡聚糖酶 G1 第 22 和 23 个氨基酸中间有一个信号肽酶剪切位点 LGI LF 存在, 第 35 和 36 个氨基酸中间有一个信号肽酶剪切位点 TGO PP 存在 ( 图 2C). 棘孢木霉 ACCC30536 葡聚糖酶的三级结构与模板 βg1,4g 葡聚糖酶 (47m.1) 的结构有 36% 的相似性 ( 大于 30% 可以期望得到较好的预测结果 ), 由此推测, 棘孢木霉 ACCC30536 葡聚糖酶属于 βg1,4g 葡聚糖酶 ( 图 2D). 2.2 棘孢木霉葡聚糖酶 G1 多序列比对及进化树分析通过 Bp 获得 G1 相似的氨基酸序列, 从中选取相似性较高的 13 个序列进行分析 ( 图 3), 其中深绿木霉 IMI206040(XP_013940397.1, 相似度 91%) 贵州木霉 (OPB37643.1, 相似度 82%) 绿色木霉 G29G8(XP_013954335.1, 相似度 81%) 和里氏木霉 QM6(XP_006964596.1, 相似度 79%) 的 GG dg12 家族葡聚糖酶相似度最高. 将 G1 和 13 个相似序列进行进化树分析 ( 图 4), 结果表明 G1 和 13 个相似序列被分成 5 组, 其中 G1 和所有木霉属 p:kx.z.d.n
1688 草业科学第 35 卷 表 2 G1 基因的氨基酸组成 Tb2 AmndmpnG1 氨基酸 Amn d 比例 Ppn/ % 氨基酸 Amn d 比例 Ppn/ % 氨基酸 Amn d 比例 Ppn/ % 氨基酸 Amn d 比例 Ppn/ % 氨基酸 Amn d 比例 Ppn/ % A(A) 7.6 Gn (Q) 4.9 L (L) 6.7 S(S) 7.0 P(O) 0.0 Ag (R) 1.5 G (E) 1.8 L(K) 4.0 T(T) 12.2 S(U) 0.0 An (N) 7.6 G(G) 6.1 M(M) 1.8 Tp (W) 1.8 Ax (B) 0.0 Ap (D) 5.8 H(H) 0.6 P(F) 4.0 T(Y) 3.7 Gx (Z) 0.0 C(C) 0.6 I(I) 7.0 P(P) 8.6 V(V) 6.4 X(X) 0.0 1 ATG ACG ATC CGC ATC CTC GTC AAC GCT GCG CTG CTG GCC ATC CCC ATC GCC GTG ACG CTG M T I R I L V N A A L L A I P I A V T L 61 GGC ATC TTG TTC GGC CTC CAA TCG CAC CGA GAT GCC ACG GGC CAG CCG CCT TTG TTT GCG G I L F G L Q S H R D A T G Q P P L F A 121 CCT CAA CCG CCG CCG ATT CCA ACT CCT GCA CCG CCG AAA CCC CCA AAG AAT GGC GTC ACC P Q P P P I P T P A P P K P P K N G V T 181 AAG ACG AGA TAT TGC CAA AAG TCG TAT GGA ATT ACA CCA GAT ACC ACT GGG CAG CAG TAT K T R Y C Q K S Y G I T P D T T G Q Q Y 241 ATA TTA AAT CCT AAT CAA TGG AAC TGG AAC GTC GGC GAT CCT GGA CGC CTG TGT ATG AAT I L N P N Q W N W N V G D P G R L C M N 301 GTC ACC ACG TTT AAC AAC GGC ACA TAT GCC ACA AGC ACT ACC GCT CCT CAG TTT ATG GTT V T T F N N G T Y A T S T T A P Q F M V 361 TCA TGG CAA TAT CCC CGT GGC CCA GAG GAC AAC CCT GTA CAC GCT TTC CCC AAC ATC CAG S W Q Y P R G P E D N P V H A F P N I Q 421 ATT GAT ACC GAC GTC ATT CCC GCC ACT GTG AAC AGC ATT TCC AAA GTC GAC ATC GAC ATC I D T D V I P A T V N S I S K V D I D I 481 GAA TGG TCC TAC GGC GTC GGC AAT GAG ACC ACA ACG TCT TCT ACC CTC GCG GAT CTT ACT E W S Y G V G N E T T T S S T L A D L T 541 GCC GAC AAT CTC AAC ACC AAC GTT GCT GTC GAT ATG TTT ATT GAC AGC GAT AAG ACG GCC A D N L N T N V A V D M F I D S D K T A 601 GCT CAG AAC CCT GCC AAG GCC AAG TTC GAA CTC ATG GTT TGG TTT GCG GCC TAT GGT AGT A Q N P A K A K F E L M V W F A A Y G S 661 TCC ACT CAG CCC ATC GGT TTT AGC AAC GGT GCT GTG TCC ACC CAA ACG CTT AAT GGC AAC S T Q P I G F S N G A V S T Q T L N G N 721 ACA TTC AAT CTT TAT GCT GGC ATT AAC ACA GCG ACC AAG CAA AAC GTC ATG ACC TGG TAC T F N L Y A G I N T A T K Q N V M T W Y 781 ACC GAC ACG CCT ATA CAA AAG TTC AAT GGA GAC ATA TCT CCA CTC ATC AAC AGC GTG TTC T D T P I Q K F N G D I S P L I N S V F 841 AAG CTC ACC ACT GTT ACC GAT ATT CCC AAG TCT AGC GAC TAC TTG GGA TAC CTG GCT CTG K L T T V T D I P K S S D Y L G Y L A L 901 GGC TCC GAG GCC TTT TCC GTT GAC AAG ACC GTC ACG CTT TAC GTA CCC CAA CTC TCG ATA G S E A F S V D K T V T L Y V P Q L S I 961 GAT ATA GAA ACA TCC TCC ACCTAG D I E T S S T 图 1 G1 基因的 DNA 序列及推导的氨基酸序列 Fg.1 DNAqnG1gnndpddmndqnG1pn 粗体表示 DNA 序列 ; 斜体表示 DNA 编码的氨基酸序列. BdxndDNAqn;xndmndqnnddbDNA. p:kx.z.d.n
第７期 刁桂萍 等:棘孢木霉葡聚糖酶基因 G １ 的克隆及原核表达 １６８９ 图 ２ 葡聚糖酶 G １ 的保守区 磷酸化位点 信号肽及三级结构预测图 F ２ Im n d n,p n, p p d,nd p d dg １ q n g g g p gn A: G １ 的保守区; B: G １ 的磷酸化位点; C: G １ 的信号肽; D: G １ 的三级结构. A: n d g n G １;B:p p n G １;C: pp d G １;D: G １ gn 的 G d １２ 家族葡聚糖酶分成一组( G p１),其 ５ I)培养条件下, G １ 基 因 均 呈 上 调 表 达,分 别 在 １２ G d １２ 家族葡聚糖酶同源性最高,亲缘关系最 ６ ８ ５ ４ ) ) ) ) 的 １２ １３( ２３ １３ ９３( ２３ ４５ ２５( ２５ １０ ５６( ２３ 中 G １ 和 深 绿 木 霉 IMI２０６０４０( XP_０１３９４０３９７ １)的 近,而其他属的 G d １２ 家族葡聚糖酶被分为 ４ 组( G p２ G p３ G p４ 和 G p５). ２ ３ 棘孢木霉葡聚糖酶基因 G １ 在 ９ 种诱导条件下 的表达分析 运用 qrtpcr 技术检测 ９ 种 诱 导 条 件 下 棘 孢 木 霉 G １ 基 因 的 调 控 表 达 水 平 (图 ５). 在 MM (图 ５A) N 饥饿(图５C) １ 山新杨根粉(图５E) １ 山新 杨茎粉(图 ５F) １ 山新杨叶粉(图 ５G) １ 杨树烂皮 病菌细胞壁 (图 ５H)和 ５ 杨 树 烂 皮 病 菌 发 酵 液 (图 ２４ ２４ １２ １２ ２４ 和 ４８ 达 到 峰 值,分 别 为 未 诱 导 时 １ ６ １ ) )和８ )倍.但 是,在 C 饥 饿 ８ ５７( ２３ ６ ０６( ２２ ５７( ２３ (图 ５B)和 羧 甲 基 纤 维 素 钠(图 ５D)培 养 条 件 下, G １ 基 因 呈 下 调 表 达,分 别 在 ２４ 和 １２ 下 调 至 最 低 点, ８ )和 ２１ 分 别 低 于 未 诱 导 时 的 ６ ９６( ２２ １１( ２４ ４ )倍. 说 明 G １ 基 因 在 棘 孢 木 霉 响 应 环 境 压 力 中 起 到 重 要 作 用,并 且 能 够 参 与 棘 孢 木 霉 对 杨 树 ( Pp )或 杨树病原菌的识别. ２ ４ 棘孢木霉葡聚糖酶 G １ 的 SDS PAGE 分析 SDS PAGE检 测 结 果 (图６)显 示,重 组 转 化 子 经 kx z d n p:
１６９０ 草 业 科 第 ３５ 卷 学 图 ３ 葡聚糖酶 G １ 及其相似序列的多序列比对 F ３ M q n G １nd m q n g p gnmn 表示同源 dn XP_０１３９４０３９７ １:深绿木霉 T dimi２０６０４０;opb３７６４３ １:贵州木霉 T zn ;XP_０１３９５４３３５ １:绿 色 木 霉 ; g T n G２９ ８;XP_００６９６４５９６ １:里 氏 木 霉 T QM６;XP_００６９６４５９６ １:里 氏 木 霉 T QM６;EQL０１６１８ １:冬 虫 夏 草 Op d p nn CO１８;KIM９９４９５ １:大 孢 树 粉 孢 菌 Od dnd n m Zn;KJK６４２９１ １:寄 生 曲 霉 Ap g p SU １;XP_ ００７８１７１８８ １:罗伯茨绿僵菌 M z m b ARSEF２３;XP_０１４５４３００６ １:罗伯茨绿僵 菌 M z mb nnm ARSEF;XP_０１４５７２９７２ １: 大孢绿僵菌 M z m mj ARSEF２９７;KDB１１７７８ １:稻曲病菌 U g n d n ;KXG４５７９０ １:灰黄霉 P n mg m. IPTG 诱 导 后,泳 道 １ ５ 清 晰 可 见 蛋 白 条 带,大 小 与 ６１ ４４kD的预测蛋白一致,而对照泳道６ 在相应位置 没有条带出现,证 明 G １ 基 因 成 功 整 合 到 大 肠 杆 菌 BL２１ 中;而且诱导 ６ 的重组蛋白明显多于诱导 ２ 和 ４ 的重组蛋白,说 明 IPTG 诱 导 时 间 越 长,转 化 子 分 泌的蛋白越多.对变 性 复 性 后 的 蛋 白 进 行 电 纯 化 后, 获得纯化后的目的蛋白 G １. ２ ５ 重组葡聚糖酶 G １ 酶活特性 首先测定 不 同 浓 度 葡 萄 糖 的 吸 光 度 绘 制 标 准 曲 线,获 得 线 性 回 归 方 程 ０ ０００ ８x ０ ００３ ９, R２ kx z d n p:
第 7 期刁桂萍等 : 棘孢木霉葡聚糖酶基因 G1 的克隆及原核表达 1691 图 4 葡聚糖酶 G1 及其相似序列的进化树 Fg.4 PgnG1ndmqn 所有分支显示了可靠的置信度 ( 超过 50% 的引导值 ); 线段上的数字表示碱基替换率. Abnwgnnpp(>50% bp);nmbnngmnndbpmn. 图 5 9 种诱导条件下 G1 基因差异表达 Fg.5 ExpngnG1ndnndnndnndn p:kx.z.d.n
1692 草业科学第 35 卷 图 6 重组蛋白的 SDSGPAGE 检测 Fg.6 SDSGPAGEdnmbnnpn M:Pnmk;1G5:IPTG 分别诱导 2 3 4 5 和 6, 重组转化子 BL21GG1 蛋白 SDSGPAGE 电泳图 ;6:IPTG 诱导 6, 对照转化子 BL21G BL21GpGEXSDSGPAGE 电泳图 ;7: 纯化后的重组蛋白 G1SDSGPAGE 电泳图. M:Pn Mk;1G5:SDSGPAGEnnmnBL21GG1ndd2,3,4,5,nd6,p;6:SDSGPAGEn nnmnbl21gpgexndd6;7:sdsgpagenpdmbnng1. 图 7 重组葡聚糖酶 G1 酶活特性 Fg.7 EnzmppmbnnG1 0.9732. 根据回归方程, 分析在不同 ph 不同反应温条件下,G1 活性呈先增加后降低的趋势, 当 ph 为度和不同反应时间下 G1 的酶活特性. 在不同 ph 4.5 时,G1 活性最大, 为 1.81U ml -1 ( 图 7A); 在 p:kx.z.d.n
第 7 期 刁桂萍 等 : 棘孢木霉葡聚糖酶基因 G1 的克隆及原核表达 1693 不同反应温度条件下,G1 活性也呈先增加后降低 枯病菌 (Rzn) 的抑制效果较原始木霉 的趋势, 当温度达到 45 时,G1 活性最大, 为 1.86 菌株明显提高, 抑制率提高了 27% [21]. 因此, 本研 U ml -1 ( 图 7B); 在不同反应时间条件下,G1 活 究中的 G1 蛋白可能具有与 βg1,4g 葡聚糖酶一样的 性呈递增的趋势, 在 5 达到峰值, 为 1.80U ml -1, 生防特性. 之后趋于平缓 ( 图 7C). 这些结果表明, 重组葡聚糖酶 在正常环境下葡聚糖酶在生物体中的含量较少, 最适 ph 为 4.5, 偏酸性, 最适温度为 45, 且随着时 活性很低. 当生物体受到外界刺激时, 葡聚糖酶可以 间的增加, 重组酶活性逐渐增加, 并于 5 后趋于平 [9] 被刺激物所诱导和积累. 研究表明, 霍尔斯单轴霉 稳. (Pmpd) 侵染后的向日葵 (Hn 3 讨论与结论 [23] nn), 其葡聚糖酶基因表达量明显升高. 在本研究中, 当棘孢木霉 ACCC30536 与山新杨及杨树病 木霉菌种类繁多, 其分泌的代谢产物也相当丰 原菌互作后,G1 基因的表达也明显上升, 表明 G1 富, 其中抗真菌次生代谢物和细胞壁水解酶协同作 蛋白参与了生防菌棘孢木霉与杨树及杨树病原菌的识 [20] 用可导致植物病原真菌死亡. 细胞壁水解酶中的 别, 从而使杨树 (Pp) 可能通过调节自身防御基 葡聚糖能够水解植物病原真菌细胞壁最外层覆盖的 因表达和生理变化来适应环境或抵御病原真菌. 在此 葡聚糖层, 使细胞壁骨架和细胞受损, 而且抑菌试验 基础上构建了 G1 基因的原核表达载体并获得重组 也表明葡聚糖酶对多种真菌菌丝的生长有抑制作 葡聚糖酶 G1. 酶活特性分析表明, 该重组 G1 [21] 用. 本研究从棘孢木霉 ACCCC30536 菌株基因 活性的最适 ph 为 4.5, 偏酸性, 最适温度为 45 C, 与 组中克隆到一个葡聚糖酶基因 G1,DNA 序列全 玉蜀黍赤霉菌 (Gbbz) 的 βg1,4g 葡聚糖酶重 长 984bp, 由 327 个氨基酸组成, 通过生物信息学分 [23] 组蛋白酶酶活特性报道结果一致. 此外, 重组酶酶 析推测此酶属于 βg1,4g 葡聚糖酶. 一些研究表明, β G 活受时间影响较大, 随着时间的增加, 酶活也逐渐增 1,4G 葡聚糖酶在纤维素的水解过程中起着非常关键 加, 并于 5 后趋于平稳. 以上这些研究结果将为进 的作用, 它能够作用于纤维素链内的 βg1,4 糖苷键, 一步探究葡聚糖酶的生防功能提供理论基础, 也为进 将长链纤维素分子水解成更小分子量的葡萄糖聚合 一步开发和应用葡聚糖酶类生物农药奠定良好的物质 [20,22] 物. 插入 βg1,4g 葡聚糖酶的绿色木霉对小麦纹 基础. 参考文献 Rn: [1] LP,Fng M G,LW F,HCX.CnnndznbnnnnzmBGdβGgG nndxnxpdne.fems MbgL,2006,261(2):224G230. [2] KnM,BmC W.GwTdmdndwppnmb.JnAg FdCm,2001,49:883G887. [3] BbmnnV,VD,CJ,SkN.PnβG1,3Ggn:TbgnnndngnxpG ngnppgnng.bngl,2012,34:1983g1990. [4] LgéJP.Tw:Abdmng.MMbg,2007,66(2):279G290. [5] Lmón M C,Cn M R,MjR,BnízLT.IndnngndnpTdmzG nm CECT2413bddnbndngdmn.Appd MbgBng,2004,64:675G685. [6] RbJF.EkndSH.Smndnmnmndxnnndxnnd mnppd.bgncm,1982,11:115g132. [7] CddJA,RJS,P M E.Impnggwpm.InnnSgJn,1997,99: 78G84. [8] GmV M,OA EA,XGFJ.AnndbG1,3Ggndmdwp(VgnnG g L.Wp)nbgwngndnpd.JnSnFdnd Ag, 1996,72(1):86G90. [9] 左豫虎, 康振生, 杨传平, 芮海英, 娄树宝, 刘惕若.βG1,3G 葡聚糖酶和几丁质酶活性与大豆对疫霉根腐病抗性的关系. 植物病理 p:kx.z.d.n
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