免疫沉澱法 撰文:謝馨慧 尋找蛋白質與基因的親密關係 Epigenetics在蛋白質體學相關領域裡 主要是針對基因修飾進行研究 然而其基因也會跟蛋白 質結合進而調控誘發下游之反應 我們可以藉由純化其蛋白質去探討彼此間交互作用 免疫沉澱 Immunoprecipitation,IP 為純化蛋白或研究蛋白質間交互作用的生物技術 利用抗體與抗原結 合特異性 將蛋白質視為抗原 並利用抗體去偵測 為分離蛋白質複合體實驗中常用方法之一 也因為應用性廣 所以更受各實驗室的愛戴 最常用來探討: 抗原定性 抗原相對分子量 抗原合成或降解量 蛋白質活性比例 後轉譯修飾蛋白的表現 蛋白質與核酸 蛋白質或其他配體交互作用 IP種類 Traditional IP:將特定抗體固定在一載體 並辨認複雜樣品中之抗原 CoIP:為IP的延伸方法 主要探討蛋白質與蛋白質間交互作用 先利用一個專一性抗體找尋與 抗原有交互作用之蛋白(Cat:# 786 638) Chromatin immunoprecipitation assay(chip assay):探討基因表現調控中dna與蛋白的結合性 確認其調控蛋白與嵌合之DNA序列 RNA Immunoprecipitation(RIP):與ChIP assay相似 探討RNA與蛋白的相關性 Tagged ProteinIP:其技術為利用帶有標示物(tag)的標的蛋白質抗原 純化蛋白複合體 其重組 蛋白的tag常見的有GST Flag myc等融合蛋白質去純化複合體 傳統的IP方法 免疫沉澱主要目的是小規模的抗體抗原特異性的親和純化 主要可以分成下列步驟(圖一): 1.樣品製備 帶有其有興趣之抗原 找到適合的抗體 2.形成抗體抗原複合物 3.辨認並純化有興趣之蛋白 18
傳統上會直接先將抗體固定在Protein A 或Protein G 樹脂上進行實驗 辨認有興趣之抗原 並 去除非專一性之結合 洗滌出有興趣之蛋白 但如果樣品中其蛋白濃度過低或是抗體專一性不佳 時 則可先將抗體與樣品反應後 再與Protein A 或Protein G 樹脂上結合 最後 抗體抗原複合 體在洗滌出的液體裡時 可以跑SDSPAGE 利用分子量分辨其抗體與有興趣之抗原 若標的蛋 白與抗體分子量相近時 則不適用此方式辨認 其基本原理除了抗體抗原專一性外 其固定Protein A或G的基底也有所不同 除了傳統利用 樹脂外 現在也有磁珠的方式進行純化 樹脂的方式主要是利用重力滴定或是離心的方式 磁珠 系統則是藉由磁力方式 收集懸浮樣品中之與抗原結合之抗體磁珠 成功關鍵 1.樣品中抗原之種類 免疫沉澱最常使用於純化可溶性的蛋白 不可溶蛋白或是過度黏稠之樣品則不適合此種方式去 做純化 通常約105或是106個細胞即可利用免疫沉澱法純化出可溶性蛋白 2.抗體抗原專一性 免疫沉澱法是依靠抗體抗原結合而達到純化結果 然而當樣品中抗原濃度過低或是抗體親和 力不足時 則會影響後續純化之效益 抗體親和力建議在108 mole1或更高 其純化效果最佳 雖 說107 mole1也可偵測到抗原存在 但其後續定量效果較差 圖一. 免疫沉澱基本原理 19
樣品前製備 裂解試劑(lysis buffer)為很重要的關鍵 決定後續實驗是否可以順利進行 其試劑必須穩定 原本蛋白質(native protein)結構 抑制蛋白酶活性 最少的抗體結合位點變性 並可以大量從細胞 或組織釋放出蛋白質 通常會建議 lysis buffer 需因標的蛋白在細胞內位置不同 例如:細胞膜 細 胞質 細胞核 去選擇 才能達到最大的裂解效果 常見的 IP lysis buffer 有以下三種: 1.非變性(nondenaturing)lysis buffer 為了要讓抗體可以辨認native protein結構 這一類的試劑 大都包含非離子洗液(nonionic detergents) 例如:NP40 Tween 20或是Triton X100 2.Denaturing lysis buffer 常見的為Radioimmunoprecipitation Assay(RIPA)buffer(Gbiosciences, #786490) 這種試劑是利用SDS或是sodium deoxycholate等ionic detergents去釋放蛋白 針對 不易釋出之蛋白 例如:核蛋白 此種試劑也是個不錯的選擇 但是無法維持住蛋白原本之結 構 以上兩種試劑大都包含NaCl and TrisHCl 且pH值穩定於7.4 8之間 3.Detergentfree buffers 最常用於利用物理性的方式來裂解細胞 例如加熱或是均質時搭配的lysis buffer 無論是哪一種的lysis buffer 都可以順利進行IP的實驗 然而當蛋白質釋放出來時 為了保護 蛋白不受蛋白酶(proteases)和磷酸酶(phosphatases)降解 實驗過程除了放在4度C之外 也會 另外添加蛋白酶抑制劑 例如 PMSF, aprotinin and leupeptin 而常見的sodium orthovanadate 或是sodium fluoride則為磷酸酶抑制劑 這些抑制劑都可以單獨使用 不過現在市面上也有許多商 品化抑制劑 例如 GBioscinces的proteases cocktail(#786108) phosphatases cocktail(#786450) 其效果更佳且更省成本喔 另外 讓lysis buffer在最適合的條件下反應也很重要 常見的限制如下: Component Range Nonionic detergents (NP40, Triton X100) 0.1 to 2% Ionic detergents (SDS, sodium deoxycholate) 0.01 to 0.5% Salt concentrations 0 to 1M Divalent cations 0 to 10mM ph 6 to 9 EDTA 0 to 5mM 清除樣品雜質為做IP實驗前的步驟 樣品中殘留的脂質 碳水化合物 DNA或是RNA可能會去 跟Protein A 或 G 產生非專一性的結合 為了避免這樣的狀況發生 建議先利用非專一性抗體與 樣品反應 做一次IP檢查 如果沒有非專一性結合發生 則可不需要清除雜質 此外也可做為IP 的negative control喔 20
IP載台 IP的操作方法與邏輯相當簡單 雖然影響實驗成功的關鍵在於抗體與抗原親和力與專一性 儘 管如此 實驗內件的品項也會跟實驗流程與結果相關 樹脂 (agarose beads) 為目前最廣泛使用 於IP的非水溶性載台 也就是常聽到的resin 名字乍聽下為球狀物體 其實為類似海綿結構的多 孔體 其孔隙空間都可與配體結合 大小約50 to 150μm 這種高度多孔材料中具有最高的抗體結 合能力 且耐久使用又堅固 在無損壞的狀況下 可以承受5,000g的離心 100磅的壓力和120度 的高溫 且可耐大多數detergents 鹽類 有機溶劑和極端的pH值(311) 也因如此才會如此廣 泛性的被使用 磁珠(Magnetic Beads)resin不同的地方在於為球狀固體 抗體只能接在磁珠表面 所以與抗 體結合力不像resin多孔體佳 且磁珠大小也只有1 to 4μm 但是若給予足夠的磁珠量 其表面會 與抗體有最佳結合 此系統是利用磁力的方式去收集磁珠 通常都需要磁盤的幫忙 此種方式不 能離心 避免破壞抗體抗原的結合 導致標地蛋白的流失 抗體固定 常見的方法有兩種固定抗體在載台上 一種是將利用樹脂連接蛋白質 並與抗體結合後去做純 化 另一種則是抗體直接利用共價鍵連接在樹脂上 Antibodybinding Proteins Protein A Protein G和 Protein A/G可以與抗體 IgG 恆定區域(Constant Domain)做結合 也 因為如此才可以固定抗體的方向位置 確認抗原可以順利接上 圖二 Light chains Heavy chains F(ab )2 Protein A Protein G Protein A/G Fc Protein L 圖二. Protein A Protein G和Protein A/G與抗體連接位置 Protein A Protein G和Protein A/G對於不同物種及抗體種類的親和性都有所不同 可參閱 表一 Protein A有4個IgG結合位 Protein G有2個IgG結合位 而Protein A/G則有6個結合位 但 是Protein A Protein G和Protein A/G並不適用各種IP實驗 需依抗體種類的特性不同而選用適當 的結合蛋白 然而 在傳統IP中 抗體的花費成本是最令人擔憂的 因為每次沖提 都會造成目 標抗體的損失 且也不能重複使用其抗體 因此這是個需要考量的花費 此外也要考慮抗體與抗 原分子量的因素 因為抗體的重鏈分子量為55kDa 而輕鏈為25kDa 若抗體與抗原的分子量過於 接近 會導致後續實驗中 在SDSPAGE上無法利用分子量辦認為抗體還是抗原 21
Species Mouse Antibody Class Protein A Protein G Protein A/G IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2a IgG2b IgG2c Hamster Guinea Pig Rabbit Horse Cow Pig Sheep Goat Chicken Human Rat 表一. Protein A Protein G和Protein A/G與抗體結合力比較圖 越多結合力越佳 為無法結合 Crosslinking IP 交聯劑(crosslinker)可利用來增加抗體與 Protein A Protein G Protein A/G 共價連結 DSS and BS3等短碳鏈主要是有NHydroxysuccinimidyl(NHS)結構 利用NHS與一級胺結合形成 共價鍵達到固定蛋白之目的 如果是先將抗體接在 Protein A Protein G Protein A/G 瓊脂樹脂 上 再與交聯劑溶液混合 交聯劑可幫助抗體Fc端和重組蛋白相鄰胺基產生共價鍵而相連接 加 強抗體與重組蛋白之鍵結 並可進行後續IP實驗 這樣的方式與傳統的IP不同 可增加抗體與重組蛋白連結 讓抗體能完全固定在管柱中 避免 抗體在沖提時釋出 也可以增加管柱重複使用的次數 然而 抗體有許多位點都有胺基存在 並 非只有Fc端才有胺基 若使用過多或過少的交聯劑都會影響最後的結果 過多可能會與抗原決定 位結合導致正確抗原無法接上 過少又會增加抗體的使用量 因此交聯劑的使用量要特別注意 22
圖三. 交聯免疫沉澱法示意圖 Direct Covalent IP 此種方式為抗體直接利用共價鍵樹脂結合 沒有Protein A/G的參與 因此抗體沒有指向性 可 用於抗體對 Protein A/G 親和力微弱 或是抗體無Fc端時的IP選擇 抗體與抗原間聯結力相當微 弱因此沖提出來的只會有抗原 因此抗體與管柱是可以重複使用的 但需注意此種方式是利用抗 體胺基羥基(OH)的結合 故利用此種方式的所有試劑都不可以有胺基存在 避免干擾抗體連接 圖四. 直接免疫沉澱法示意圖 23
圖五. 常見的免疫沉澱法比較圖 如何找出適合自己的IP? 前述了許多不同的IP方法(圖五) 目前還是以傳統的IP為最多人使用 然而隨著實驗經費短缺 越來越多人選擇使用Crosslink IP的方式 除了增加抗體與重組蛋白結合效率外 也可減少抗體被 沖提出來的量 進而減少抗體的使用 節省實驗經費 也能達到純化之效果 此外Direct IP管柱與 抗體也可重複使用 但因為有胺基存在的限制 普及率較沒前面兩者高 在岑祥天地裡 可以找 到最適合自己的工具 找到最想要看的蛋白 就讓岑祥小天使滿足你的願望吧 Order information 1.Classical Immunoprecipitation Kit (Cat. # 786637) 2.Crosslink Immunoprecipitation Kit (Cat. # 786639) 3.Direct Immunoprecipitation Kit (Cat. # 786636) 24