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宴松
7 years ago
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1 动物组织石蜡切片制作

2 实验目的制作实验动物的组织切片并染色, 掌握动物组织制片技术

3 1. 动物的组织实验用品 2. 器材和仪器 : 切片机展片仪毛笔载玻片盖玻片烤箱显微镜 3. 试剂 :60% 乙醇 70% 乙醇 80% 乙醇 90% 乙醇 95% 乙醇无水乙醇二甲苯石蜡中性树胶

4 方案一 : 病理石蜡切片的制作 ( 一 ) 石蜡组织块制作 1. 取材 2. 固定 3. 脱水透明及浸蜡 ( 具体步骤见表 ) 4. 包埋

5 步骤操作项目小鼠大鼠家兔 (1) 60% 乙醇 15min 20min 30min (2) 70% 乙醇 15min 20min 30min (3) 80% 乙醇 20min 30min 40min (4) 90% 乙醇 20min 30min 40min (5) 95% 乙醇 Ⅰ 20min 30min 40min (6) 95% 乙醇 Ⅱ 20min 20min 30min (7) 无水乙醇 Ⅰ 20min 30min 40min (8) 无水乙醇 Ⅱ 20min 30min 40min (9) 二甲苯 Ⅰ 5min 8min 10min (10) 二甲苯 Ⅱ 3min 5min 5min (11) 石蜡 Ⅰ 10min 15min 20min (12) 石蜡 Ⅱ 20min 25min 30min (13) 石蜡 Ⅲ 30min 30min 40min

6 注意事项一般实质性脏器的组织及肿瘤组织应把最大切面朝下包埋 ; 食管胃肠等组织须将管壁横断面朝下包埋, 若在同一蜡块中包埋数块管壁组织时, 应平行横埋且黏膜面 ( 内膜 ) 的方向应一致, 以便切片及观察同一蜡块包埋多个组织块时, 组织的性质应相同, 方向要一致, 不能把大小厚薄差别悬殊的组织包埋在一起, 组织块间的距离不能太大皮肤骨等难切组织及需要连续切片的组织都应单独包埋神经脊髓及需要定向包埋的组织应注意组织块的相互关系包埋 ( 尤其在室温较低的情况下 ) 操作应迅速, 防止组织块变凉蜡液凝结及出现气泡, 组织块与蜡液不能很好凝固定在一起, 导致组织与蜡分离遇有管腔或空洞标本与小标本同埋一个蜡块时, 不能将小标本放入其他标本的管腔或空洞内

7 ( 二 ) 石蜡切片制作用切片机将石蜡包埋的组织块 ( 蜡块 ) 制成适宜厚度的切片, 是目前在病理学科中最常用的一种制片方法切片厚度为一般 4~6μm 切片前的准备 1 修切蜡块切片前应先修块, 即切去组织周围过多的石蜡, 一般留下约 2mm 宽度的蜡边为宜注意蜡块不能留得太窄, 在切片时易损坏组织 ; 蜡边不能留得太多, 否则影响展片室温过高时, 可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间 2 切片用品准备 (1) 切片刀 : 预先磨好切片刀备用或切片前更换新的一次性切片 (2) 载物片 : 载物片经清洁液 95% 乙醇处理后备用 (3) 展片仪 : 加入温水, 接通电源, 调整温度 (4) 其他用品 : 准备好毛笔记号笔镊子冰块等

8 切片制作过程以使用旋转式切片机石蜡切片为例 : 1. 将切片刀装在刀架上, 后将蜡块装在切片机固定装置上调整蜡块与刀至合适位置 ( 刀刃与蜡块切面呈 5 夹角 ) 旋转式切片机切取组织, 是由下向上切, 为得到完整的切片, 防止组织出现刀纹裂缝, 应将组织硬脆难切的部分放在上端 ( 如皮肤组织, 应将表皮部分向上而胃肠等组织, 应将浆膜面朝上 ) 2. 左手执手笔, 右手旋转切片机旋转轮先粗切标本, 直到暴露出组织最大切面 ( 但对小标本不要修切得太多, 以免将整个组织块修切掉 ) 再连续旋转切出蜡带, 左手持毛笔将蜡片带下端轻轻托起, 右手用镊子夹起蜡带上端, 正面向上放入展片仪水盒内, 展片温度根据使用的石蜡熔点进行调整, 一般水温为 45 左右, 待蜡片带中的组织展平后, 即可进行分片和捞片对于展片困难的切片经 30% 的乙醇初展后, 再用载玻片捞起蜡带放人展片仪水盒内可使切片更易展平在夏季切片时可用冰块冷却切片刀和组织块, 减少切片刀与组织块在切片过程中产生的热时, 使石蜡保持合适的硬度以利于切片 3. 捞起切片后, 写上编号捞片时注意切片的位置, 一般切片的中心位于载物片右侧 1/3 与 2/3 交界处为佳, 并注意整齐美观 4. 烤箱 60 左右烘烤切片 30min, 对血凝块和皮肤组织应及时烤片, 烤片温度应稍低 ; 脑组织切片捞出后直立晾干, 再烤片, 否则产生气泡

9 方案二石蜡切片的制作 1 6 微米制作大批的或是连续的切片长期保存一切片前的准备 : 1 恒温水浴锅首先预热至蜡块整修, 暴露组织并修平, 减少刀的磨 3. 载玻片应事先洗涤干净, 无油腻和不透明现象涂粘片剂 4 将锋利的刀片, 调整角度和位置, 以为佳 5 备用小型毛笔小型无钩镊子铅笔

10 方案二石蜡切片的制作二切片的步骤 : 1 将蜡块固定于切片机头上的夹座内, 2 调整蜡块组织切面恰好与刀口接触, 旋紧刀架 3 根据需要调整切片厚度 4 修整切片, 直到切出完整的最大组织切面后, 再行切制 5 切下的切片带, 用毛笔从刀口向上挑起, 拉下切片带

11 方案二石蜡切片的制作三切片的注意事项 1 切片质量的好坏, 与技术熟练程度和切片机切片刀的好坏有关外 2 切片机的各个零件和螺丝应旋紧, 否则将会产生震动 3 在摇动切片机时, 用力要求均匀一致, 不宜过重过猛, 否则造成切片厚薄不均或空洞现象 4 在夏秋季节进行切片时, 应使用冰块加强冷却, 可保持石蜡的硬度, 减少切片的褶皱

12 方案二石蜡切片的制作四贴片 : 1 将单张切片, 用镊子夹住蜡片的一边并提起, 铺于恒温水中 ( 光亮的一面朝下 ) 立即用毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好 2 待切片在恒温水内充分摊开展平后, 将载玻片垂直插入水中轻靠切片, 随即将玻片直立提起, 拨正切片位置 3 用铅笔在玻片的毛玻璃上写上标本编号, 字要写得小而清楚端正 4 贴好的切片置于 60 恒温箱内干燥 2 小时, 蛋白质凝固后即可染色

13 实验 1 石蜡切片的制做技术试剂与器材 : 甲醛, 酒精, 二甲苯, 苏木精, 伊红, 中性树胶, 双面刀片, 蜡板, 镊子, 滤纸, 200ml 容量瓶 ( 广口 ) 玻璃标本缸, 载玻片, 盖玻片, 染色缸, 毛笔, 新鲜鸡蛋, 甘油空闲时间 : 参观冰冻切片的制做石蜡切片的制做程序 ( 详细过程请查看讲义 ) 组织取材 2 毫米厚度, 固定于福尔马林 2 小时组织流水冲洗 1-2 小时

14 实验 1 石蜡切片的制做技术 70% 酒精 2-4 小时 85% 酒精 2-4 小时 95% 酒精 (Ⅰ)2-3 小时 95% 酒精 (Ⅱ)1-2 小时 100% 酒精 (Ⅰ)1-2 小时 100% 酒精 (Ⅱ)0.5-1 小时 100% 酒精 : 二甲苯 (1:1)0.5-1 小时二甲苯 (Ⅰ)20 30 分钟二甲苯 (Ⅱ)10 20 分钟浸蜡 (Ⅰ)40 分钟浸蜡 (Ⅱ)40 分钟组织包埋蜡块整修切片贴好的切片置于 60 恒温箱内干燥 2 小时

15 实验 2 HE 染色技术二甲苯 Ⅰ 脱蜡 10 分钟二甲苯 Ⅱ 脱蜡 10 分钟 100% 酒精 Ⅰ2-5 分钟 100% 酒精 Ⅱ2-5 分钟 95% 酒精 1-2 分钟 90% 酒精 1-2 分钟 85% 酒精 1-2 分钟自来水洗片刻蒸馏水片刻苏木素分钟自来水洗 1 2 分钟 1% 盐酸酒精分化分钟流水冲洗蓝化 10 分钟至数小时

16 实验 2 HE 染色技术蒸馏水冲洗 1-2 分钟 70% 酒精 1-2 分钟 85% 酒精 1-2 分钟 90% 酒精 1-2 分钟伊红 ( 醇溶 )5-20 秒 95% 酒精 (Ⅰ)1 秒 95% 酒精 (Ⅱ)1 秒 100% 酒精 (Ⅱ)1-2 分钟 100% 酒精 (Ⅱ)3-5 分钟二甲苯 (Ⅰ)5-10 分钟二甲苯 (Ⅱ)5-10 分钟中性树胶封片

17 上皮组织单层扁平上皮实验二动物的组织蛙肠系膜整装片,AgNO3 法,40X 单层扁平上皮单层立方上皮血管内皮,H.E,40X 矢状断面 ( 即侧面 ) 观察时, 大致呈正方形, 但从表面观察时呈六边形细胞核大致呈圆球形, 位于细胞的中央分布于甲状腺的滤泡及肾脏集合管等兔肾脏集合管,H.E,20X 单层柱状上皮矢状断面观察时, 细胞呈长方形, 细胞核呈椭圆形, 位于细胞近基底部, 整齐地排列在同一水平上分布于胃肠的粘膜及腺体导管中, 多具有分泌吸收的功能蛔虫消化道,H.E,40X 复层扁平上皮细胞层数不定浅层细胞较扁平, 中间细胞呈多角形, 基底层的细胞为矮柱状, 可不断分裂并向表层推移某些部位的复层扁平上皮最表层细胞变态形成强韧的无生命的角度层角质层和下面的活的上皮细胞紧密相联角化的上皮分布在表皮等 ; 未角化的上皮分布在口腔食道和阴道等蝾螈小肠绒毛, 三色染色,40X 人掌皮, H.E, 10X 1

18 单细胞腺多细胞腺小肠绒毛内的杯状细胞, 三色,40X 蛙皮肤单管泡状腺,H.E,10X 结缔组织疏松结缔组织中的主要细胞类型巨噬细胞 (macrophage) 组织培养的成纤维细胞, 苏木精染色, 40X 大白鼠皮下组织铺片, 台盘蓝活体注射,40X 肥大细胞 (mast cell) 致密结缔组织大白鼠皮下组织铺片, 硫堇染色,40X 兔肌腱,H.E,40X 人皮肤,H.E,10X 2

19 血液各种白细胞红细胞嗜中性 2 嗜酸性 3 嗜碱性 4 中淋巴 5 小淋巴 6 单核鸡血涂片,Wrights, 10X 蛙血涂片, Wrights,40X 软骨和骨透明软骨骨长骨磨片,20X 骨磨片结构模式图狗气管,H.E,20X 肌肉组织三种肌肉的比较骨骼肌主要附着在骨骼上, 故称为骨骼肌, 肌纤维长圆柱状, 具有明暗相间的横纹, 它们收缩快而有力, 一般是随意的心肌分布在心脏, 故称为心肌, 肌纤维短柱状或分枝状, 也有横纹, 心肌收缩是不随意的, 但强有力并有节奏平滑肌主要分布于内脏器官, 肌纤维呈梭形, 在光镜下没有横纹, 故称为平滑肌, 它们的收缩过程是缓慢和不随意的骨骼肌骨骼肌肌原纤维结构, 铁矾苏木精染色,40X 肌纤维由肌原纤维构成肌原纤维由粗细两种肌丝构成肌原纤维具有横纹 ( 条带 ) 3

20 心肌平滑肌心肌纤维较细, 呈短柱状, 并具有分枝相连, 形成网状心肌一般只有一个细胞核, 位于纤维中心, 细胞核的两端肌浆丰富心肌纤维也具明暗相间的横纹, 属横纹肌闰盘是心肌纤维之间的特殊连接方式纤维呈梭形, 细胞的大小随所在器官而异, 一般长为 nm, 直径 5-10nm 纤维存在的形式随所在部位的功能而异, 有的单个存在, 也有的排列成束平滑肌的收缩以波浪式进行多数平滑肌纤维表面没有神经末梢, 而是通过缝隙连接来传递信息兔心肌,H.E,40X 分离的平滑肌纤维猫肠壁平滑肌,H.E,40X 神经组织多极神经元有髓神经纤维轴突和轴丘树突尼氏体神经原纤维有髓鞘神经纤维纵切面兔坐骨神经 H.E 10X 多极运动神经元牛脊髓涂片, 美蓝,40X 有髓鞘神经纤维横切面感觉神经末梢感觉神经末梢是感觉神经元感觉神经纤维 ( 传入纤维 ) 的末梢, 其结构又称感受器外感受器本体感受器内感受器游离神经末梢和被囊神经末梢常见被末梢 : 环层小体触觉小体克氏终球环层小体猫 ( 上 ) 肠系膜整装片 20X ( 下 ) 皮下组织切片 H.E 20X 运动神经末梢从中枢向外周发出的神经纤维的末梢终止于骨骼肌平滑肌和腺体, 将神经冲动功能传导到肌肉和腺体, 引起运动和腺体的分泌神经与肌肉或腺体等效应器形成的连接称运动神经末梢运动终板支配内脏和腺的末梢运动终板整装片, 蛇肋间肌,H.E,20X 4

组织切片制作

组织切片制作组织石蜡切片制作 ( 一 ) 组织固定包埋切片 1 用途 2 主要设备 3 药品及溶液配制 4 具体步骤及注意事项 5 出现问题及解决 1 用途 (1) 用于各种组织结构分析 ( 化学染料 ) H.E. 染色 ; PAS 染色 ; 苯胺蓝染色 ; 油红 O 染色 ; 茜素红染色 ; 等等 (2) 用于组织中特定蛋白质的定位表达分析免疫组化 ; 免疫荧光 (3) 用于组织中特定基因 mrna 的定位表达分析原位杂交