assay,elisa 或化学发光方法 (chemiluminescence immunoassay,clia) 检测血清或体液标本中的标志物为 Her2 CA15-3 CA125 CEA 等 由于在乳腺癌诊治过程中, 乳腺癌患者的 Her2 状态是重要的预后指标和靶向 Her2 药物治疗的预测指标

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1 乳腺癌患者 Her2/neu 检测与临床评价意义 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一, 发病率占全身各种恶性肿瘤的 7-10% 它的发病常与家族遗传有关,40-60 岁之间及绝经期前后的妇女发病率较高, 通常发生在乳腺上皮组织, 严重影响妇女身心健康甚至危及生命 全世界每年约有 140 万妇女罹患乳腺癌, 约 5 万妇女死于乳腺癌 [1] 20 世纪以来, 乳腺癌的发病率在世界各地均呈上升趋势, 且发病人群低龄化 在欧洲 北美占女性恶性肿瘤发病的第一 二位 卫生部 2008 年发布的 第三次全国死因调查主要情况 显示, 在我国, 乳腺癌已居女性恶性肿瘤死亡率之首, 患者数量在过去 30 年间上升了 96% 常见乳腺癌影像图 乳腺癌患者临床常规检测的肿瘤标志物有 Her2( 表皮生长因子受体 2,Her/neu) ER( 雌激素受体 ) PR( 孕激素受体 ) CA15-3( 癌糖类抗原 15-3) CA125( 癌糖类抗原 125) CEA( 癌胚抗原 ) 和 Ki-67( 增殖细胞核抗原是一种与细胞周期相关的蛋白质 ) 其中以免疫组化方法(IHC) 检测组织标本中的标志物为 Her2 ER PR Ki-67; 或以荧光原位杂交法 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 和显色原位杂交法 (chromogenic in situ hybridization,cish) 检测组织标本中的 Her2 标志物 ; 以酶免疫学方法 (enzyme-linked immunosorbent

2 assay,elisa 或化学发光方法 (chemiluminescence immunoassay,clia) 检测血清或体液标本中的标志物为 Her2 CA15-3 CA125 CEA 等 由于在乳腺癌诊治过程中, 乳腺癌患者的 Her2 状态是重要的预后指标和靶向 Her2 药物治疗的预测指标, 约有 20-30% 左右原发乳腺癌患者会出现 Her2 过表达, 而约有 60% 左右乳腺癌转移和复发的患者会出现血清 Her2 水平的不同程度地增高, 准确分析 Her2 状态是乳腺癌患者预后判断以及制定有效治疗方案的先决条件, 对乳腺癌的诊疗具有重要的指导作用 本文首先对 Her2 基因 蛋白分子作简要介绍并将结合 Her2 标志物检测方法, 来阐述 Her2 状态判断相关的技术标准及其指导临床诊治应用的意义 乳腺癌 Her2 阳性影像图 Her2 基因 蛋白的分子基础 在 20 世纪 80 年代研究发现人 Her2 原癌基因 (cerbb2), 首先 Shih C. 於 1981 年在大鼠胚胎神经母细胞瘤中发现 neu 原癌基因, 随后由 Semba K. 和 Coussens L. 两个研究组人员於 1985 年研究发现了一个人类基因和反转录病毒基因 verbb 有很高的同源性, 因而发现了人原癌基因 Her2 人 Her2 原癌基因 (cerbb2) 定位于染色体 17q21, 编码一个跨膜受体酪氨酸激酶的糖蛋白 该跨

3 膜糖蛋白分子量为 185kD( 简称 p185), 属于表皮生长因子受体 (EGFR) 家族成员之一, 被称为表皮生长因子受体 2(Her2/neu), 该家族其它成员分别是 EGFR (Her1/cerbB1) Her3(cerbB3) 和 Her4(cerbB4) 这些受体蛋白结构相似, 都是由一个胞外与配体结合的结构域 一个跨膜结构域和一个胞内的酪氨酸激酶催化的结构域及一个富含酪氨酸起调节作用的 C 末端区域组成 该家族调节正常乳腺的生长和发育, 而 Her2/neu 的过度表达与肿瘤形成密切相关 Her2 蛋白分子模型图 Her2 基因活化过表达与增加细胞分化 迁移 肿瘤侵袭 局部及远处转移 加快血管发生和减少细胞凋亡密切相关 目前研究较为清楚的 Her2 胞内信号传递途径主要有二条, 分别为丝裂原活化蛋白激酶 (RAS/RAF/MEK/MAPK) 和磷酸肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶 B(PI3K/AKT) Her2 蛋白的细胞内段具有受体酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinase,rtk) 活性, 其胞外段 (ECD) 为配体结合域 到目前为止, 激活 Her2 的配体还不清楚, 但其它 Her 家族有已知配体, 如 Her1

4 (EGFR) 已知知有 6 种配配体 : 表皮生生长因子 (EGF), 转化因子 α(tgfα) ), 双向向调节蛋白, 肝素结合 EGF 样生生长因子, 细胞调节素, 和免疫疫调节素 基因活活化通路图 : 当配配体与 Her2 的 ECD 结合后, 引发 Her2 变构, 导致其形形成同型二聚聚体或与 Her1 Her3 及 Her4 形成异二聚聚体, 随后被被内吞, 使受体自身磷磷酸化并激激活其酪氨酸酸激酶活活性 (PTK), 使细胞膜膜内侧的 PTK 活性显显著增加, 受体分子酪酪氨酸残基互互相催化化自身磷酸酸化, 进而引引发级联反应, 信号传传导经细胞膜膜和细胞质质到细胞核, 激活基基因, 使细胞核内的原原癌基因如 FOS 和 JUN 等转录水水平增加, 促进有丝分分裂等, 因而能够够促进肿瘤形形成 如上上所述,Her2 还没有已已知的配体, 但它能与与其它 Her 蛋白形形成异二聚体, 这使得 Her2 在缺缺乏特异性配配体时, 通过形成的异异二聚体体也能参与与一系列的信信号传导通通路的信号传递, 这种种作用, 可是肿瘤细胞胞的 Her2 过表达, 导致细胞胞分发增殖能能力增强, 死亡减少, 而运动能能力增强 Her2 过表表达通过调节细胞周期 ( 特别是 G1/S 转换 ), 使 G1 期变短, 进入 S 期的时时间提前, 导致细细胞的过度增增生和肿瘤瘤的形成 Her2 过表达达激活其胞胞内 PI3K/AKT 途径, 促进细胞胞生存和生生长, 使细胞胞抗凋亡作作用增强, 还可提高肿肿瘤细胞对 TNF 诱导导的凋亡的抗性和对能能破坏 DNA 的治疗药药物产生抗性 肿瘤中中的 Her2 过表达通通常与血管管生成增强和和血管内皮皮细胞生长因子 (VEGF) 表达增增加有正相相关, 研究究发现 Her1/Her2 和 Her2/Her4 的异二聚体有有很强诱导 VEGF 的 mrna 合成成能力, 使肿瘤的血血管生成和和生长能力增增强, 对肿肿瘤实体瘤的的发展和肿肿瘤的转移非非常

5 重要 Her2 家族信号传导及其通路促进肿瘤细胞增殖 存活和侵润性如下图 Her2 的过表达主要是基因扩增的结果,Her2 基因扩增导致 Her2 的 mrna 水平和蛋白水平增高 在乳腺癌中有大约 92% 的 Her2 蛋白过表达是由于 Her2 基因扩增所引起的, 仅少部分可能是由于 Her2 基因在转录水平上发生变化而 Her2 蛋白过表达 过去 20 年的研究报道表明, 乳腺癌的发生与其肿瘤细胞 Her2 基因扩增和 Her2 蛋白过表达密切相关 大约有 10-34% 的乳腺癌患者的 Her2 受体过表达, 被判断为 Her2 阳性 尽管还没有决定性地证据, 表明 Her2 蛋白过表达与 Her2 基因扩增相关联, 但 Her2 蛋白过表达不可能是单基因拷贝能产生的 肿瘤细胞中 Her2 基因扩增与不扩增, 两者之间 Her2 蛋白表达有显著性差别 有 Her2 基因扩增的肿瘤每个细胞有 50 万 -200 万个 Her2 受体分子, 而无 Her2 基因扩增者, 仅有 2.5 万 万个 Her2 阳性的乳腺癌疾病进展速度快 恶性程度更高, 对化疗耐药 化疗缓解期缩短, 更容易复发和转移, 预后也差 对 Her2 基因扩增和 / 或 Her2 蛋白过表达的检测判断乳腺癌疾病的临床诊治指导具有重要的意义, 乳腺癌患者 Her2 状态, 即 Her2 基因的扩增和 Her2 蛋白过表达适用于转化医学中, 据此判断是否对患者进行 Her2 的靶向性治疗 同时对于该疾病也具有重要的预后意义和预测意义 乳腺癌患者组织标本中 Her2 的检测及其在临床诊治应用的意义

6 检测方法和判断标准指南目前临床常规的 Her2 检测手段包括免疫组化 (IHC) 和荧光原位杂交 (FISH) 免疫组织化学, 其可以检测全长 Her2/neu 癌蛋白 (p185) 过表达 荧光原位杂交技术, 其可以检测 Her2/neu 基因的拷贝数目 第三种组织检测方法 ( 尚未被 FDA 批准 ), 其已经被越来越广泛使用, 称之为显色原位杂交 (CISH) 与 FISH 法比较,CISH 还有一些技术优势 上述这三种组织检测方法都可以对乳腺癌组织进行检测, 组织先用福尔马林固定和石蜡包埋, 然后经资深病理学家检测从而确定 Her2/neu 的状态 IHC 方法检测的是细胞膜上的 Her2 癌蛋白的表达情况, 而 FISH 是则是以 17 号染色体着丝粒探针作为内参, 通过计算 Her2 的基因探针于 17 号染色体着色丝粒探针杂交信号的比率来判断 Her2 基因是否有扩增 按照美国临床肿瘤学会 (ASCO) 和美国病理医师学会 (CAP) 发布 HER2 检测临床实践指南 以及 中国抗癌协会 Her2 阳性乳腺癌临床诊疗专家共识,IHC 方法, Her2 阳性的界定为 3+, 即 30% 以上的浸润性癌细胞的胞膜呈全周的强着色, 而 FISH 方法 Her2 阳性的界定为 Her2 与 17 号染色体的信号比 (Her2/CEP17) 大于 2.2 IHC 方法 0 或 1+ 以及 FISH 方法 Her2/CEP17 比值小于 1.8 则界定为 Her2 阴性 IHC 方法 2+ 以及 FISH 方法 Her2/CEP17 比值在 之间的被界定为不确定结果, 需要结合 IHC 方法和 FISH 方法的结果进行综合的判断 然而 2013 年 ASCO 和 CAP 又发布新的 Her2 检测临床实践指南, 并对结果判断稍稍做了修改, 见下图 : 用认证过的 IHC 试剂做 HER2 检测 ( 侵润性组织 ) 设批对照和玻片上对照并显示合适的染色着色 完全的, 高强度 不完全和 / 弱 / 中度 不完全膜着色 观察不到着色 * 膜圆周着色, 达到 膜圆周着色, 达到 并微弱 / 勉强可见 或 >10% 肿瘤细胞 * >10% 肿瘤细胞 * >10% 肿瘤细胞 * 膜着色不完全 或 微弱 / 勉强可见 完全的 高强度 10% 肿瘤细胞 膜圆周着色, 在 10% 肿瘤细胞范围内 * IHC 3+ IHC 2+ IHC 1+ IHC 0 阳性 不确定结果 阴性 阴性 必须指令重复检测 (ISH 法检相同标本 ) 或指令做新检测 (IHC 或 ISH 法检, 如果可能用新标本 )

7 * 同性质的或相近的肿瘤侵润细胞群 组织化学结果判断如下图 : IHC 0 IHC 1+ IHC 2+ IHC 3+ 注释 :IHC 0 1+ HER2 阴性 原位杂交法检测判断标准图 IHC 2+ HER2 结果待定 IHC 3+ HER2 阳性 2013 年 ASCO 和 CAP 又发布新的 Her2 检测临床实践指南 原位杂交结果判断见下图 : 用认证过的单探针 ISH 试剂做 HER2 检测 ( 侵润性组织 ) 设批对照和玻片上对照并显示合适的杂交结果 平均 HER2 基因拷贝数 平均 HER2 基因拷贝数 平均 HER2 基因拷贝数察 6.0 信号 / 细胞 * 4.0~<6.0 信号 / 细胞 * <4.0 信号 / 细胞 * ISH ISH ISH 阳性 不确定结果 阴性 必须指令重复检测 ( 用双探针 ISH 法或 IHC 检相同标本 ) 或指令做新检测 ( 用 ISH 或 IHC 法检如果可能用新标本 ) * 同性质的或相近的肿瘤侵润细胞群从指南的 FISH 结果显示, 每个细胞核有超过 6 个 Her2/neu 基因拷贝, 或者

8 Her2/neu 基因信号与 17 染色体的比值超过 2.2 则预示 Her2/neu 为阳性 阴性的结果是 IHC 染色为 0 或 1+, 或者 FISH 结果显示每个细胞核中 Her2/neu 拷贝数少于 4 个, 或者 FISH 比值少于 1.8 对于模糊的结果, 在做出最终判定前需要获得一些其他的补充试验结果 指导原则建议, 在进行 Her2/neu 检测时, 这些实验室得到的数据与另外所测得的具有法律效率的阳性和阴性检测值相比, 应该证明能达到 95% 的一致性 这个专家小组强烈建议, 实验室的检测方法或方法修改的确认, 要采用标准化的操作程序, 并符合新的测试标准, 用严格的实验室认可标准, 能力测试和能力评估进行监控 该专家小组建议, 在 CAP 认可的实验室或在符合指导原则文件认可和能力测试要求的实验室进行 Her2/neu 检测 组织中 Her2 状态与临床治疗意义虽然, 在检测 Her2/neu 状态时候, 有大约 80%-85% 的准确度, 但是通过组织分析, 从收集多年的研究结果看, 原发性乳腺癌的 Her2/neu 状态并不总是能准确无误地反应出转移性乳腺癌的 Her2/neu 状态 这里重点介绍一些因素, 这些因素有助于评估通过组织测试 Her2/neu 状态的不准确性, 希望这将改进对 Her2/neu 状态的评估 因素之一,IHC 试剂所用的抗 Her2/neu 抗体不同, 例如有两个经过 FDA 批准的 IHC 检测 Her2/neu 状态的检测试剂和方法 :Herceptest (DAKO, Carpeteria, CA, 美国 ) 是一种多克隆抗体, 和 CB11 (Pathway, 香榭居医药中心, Tucson, AZ, 美国 ) 是单克隆抗体 大多数实验室采用免疫组织化学的实验方法, 用 Herceptest 或 CB11 试剂来检测 p185 在乳腺癌细胞上的表达水平 Fornier 和同事报告, 用两种试剂检测相同的样本, 却得出了 95% 的样本是 2+ 或 3+ 阳性 (CB11 单克隆抗体试剂 ) 和 84% 的样本是 2+ 或 3+ 阳性 ( 多克隆抗体 Herceptest 试剂 ) 有明显差别的结果, 如此变异性的组织检测结果, 提示在制定 Her2 靶向治疗方案时, 对于组织结果不明确的要慎重, 并结合临床其它检测手段和指标进行综合考虑 不同厂家生产的 FISH 检测试剂, 也存在结果判定上的区别 因素之二, 组织检测方法和判断患者组织的 Her2 状态, 需要资深地有经验的病例学家, 检测实验室的设备和检测程序要标准化, 并应有权威部门和同行专家进行评审, 否则组织检测的结果就会有较大的变异性, 可比性就小 因素之三, 假阳性和假阴性可能由于试验都需要固定肿瘤组织, 也有潜在的错误可能 例如, 组织通过福尔马林固定和多年的存放,Her2/neu 的表位可能会被破坏 大多数时候, 原发性肿瘤组织被切除, 福尔马林固定, 石蜡包埋, 并且存储到肿瘤复发的时候 因此,20% Her2/neu 阳性样品的抗原可能会发生损失 还有一些其他的因素, 可以导致假阳性和假阴性的 IHC 结果, 包括组织处理, 试剂变质, 抗原修复方法, 记分的方式, 肿瘤的异质性, 和测试的半定量方法等 还有调查者发现, 通过 IHC 检测, 原发性肿瘤和转移性肿瘤有 14% 的不一致

9 性 有 12%(7/58) 的转移性肿瘤患者的 Her2/neu 为阳性, 而相应的原发性肿瘤为阴性 有趣的是, 经 IHC 检测, 约七分之三的患者原发性肿瘤中 Her2/neu 是阴性, 但在转移性肿瘤中是阳性, 用曲妥珠单抗治疗有效 Her2 受体过表达与乳腺癌患者的肿瘤侵润性恶性增殖和转移及其不良的预后有密切关系 Her2 阳性也与肿瘤恶性程度的分级 淋巴结阳性转移和有丝分裂计数增加有密切联系 Her2 的状态与对多种治疗药物疗效反应性密切相关, Her2 阳性对内分泌治疗药物的耐药性增加, 使得非蒽环类抗生素 不含紫杉烷类化疗药物的疗效大大降低 反过来,Her2 阳性对蒽环类抗生素和紫杉醇就展示出较好的疗效 Her2 基因扩增水平越高, 该类型患者以阿霉素为基础作为辅助联合治疗的疗效就越差 以乳腺癌 Her2 基因扩增和蛋白过表达为靶标, 而开发出了 Her2 特异性靶向药物, 使得对该类患者的治疗效果大大提高 1998 年 FDA 批准第一个针对 Her2 的人源化抗体 曲妥珠单抗药用于转移性乳腺癌的治疗, 在 2006 年被批准用于淋巴结转移阳性患者的辅助治疗,2008 年又被批准用于淋巴结转移阴性的乳腺癌患者的辅助治疗 拉帕替尼是一个选择性抑制 Her2 和 EGFR 活性的抑制剂 拉帕替尼是一种 Her2 和 EGFR 的受体酪氨酸激酶的可逆性抑制剂, 临床用于转移性乳腺癌的治疗, 它的作用机理与曲妥珠单抗不同, 它适用于那些 Her2 过表达并且对化疗和曲妥珠单抗无效的转移性乳腺癌患者 这些靶向药物都显示出对 Her2 阳性肿瘤患者的良好治疗效果 曲妥珠单抗治疗转移性乳腺癌的临床试验是通过 FISH 方法来评价和选择患者的 Her2 状态, 临床试验治疗效果显示 FISH 法 Her2 阳性患者有效率为 34%, 而 FISH 法阴性的患者有效率仅 7% 随后曲妥珠单抗与一系列的化疗药物联合用于治疗转移性乳腺癌患者, 与单独用化疗药物治疗组相比, 其疗效大大提高 乳腺癌患者 Her2/neu 状态的检测和结果判断, 对于临床药物治疗方案的制定 治疗效果的观察 预后的预测都极为重要, 但目前 ASCO 和 CAP 专家认为, 通过 IHC 和 FISH 检测乳腺癌患者肿瘤组织 Her2 状态, 仍然可能有大约 20% 的不准确, 这当然与多种因素所影响而造成的 随着乳腺癌临床治疗理念的不断发展,IHC 和 FISH 自身固有的一些不足, 使得它们无法更进一步满足患者最新的诊疗需求, 这已经成为乳腺癌临床诊疗过程中的一个突出问题 IHC 和 FISH 不足主要表现在以下几个方面 :(1) 存在一些病例,IHC 和 FISH 得出的均为不确定结果, 无法对 HER2 状态做出明确判断 ;(2) 经 IHC 或 FISH 判断为 Her2 阳性的患者未必能从靶向治疗中获益, 导致这种现象的原因可能是检测体系本身所造成的假阳性, 也可能是 Her2 的信号通路中还存在其他异常的位点 ;(3) 肿瘤异质性的存在导致 IHC 和 FISH 均无法避免假阴性结果 ;(4) 部分患者无法提供检测所需的组织标本或者组织标本无法满足进行检测的基本要求 ;(5) 既往的临床研究表明,

10 患者病情发展及治疗过程中会发生 Her2 状态的变化, 而 IHC 和 FISH 均无法对患者的 Her2 状态进行动态 实时的监测 鉴于 IHC 和 FISH 的上述不足, 为保证更好地指导乳腺癌患者的个体化治疗, 亟需在上述两种方法之外寻找新的检测手段, 以便对 IHC 和 FISH 的检测结果提供补充和参考, 对患者的 Her2 状态做全面 动态 准确的判断 专家建议, 对所有浸润性乳腺癌患者 Her2/neu 状态的确定, 一个精确计算结果依赖于精确的 可重复性的检测程序, 包括新的适合的检测方法 由于创伤小, 方便操作, 通过采集患者外周血进行 Her2 状态的判断一直以来广受关注, 目前技术手段相对成熟的包括 Her2 ECD 检测 ( 此处 5 点总结引述解放军 307 医院江泽飞教授等在第五届 CSCO 乳腺癌高峰论坛会大会报告的文章 ) 乳腺癌患者血清 Her2 定量测定及其在临床诊治应用的意义 许多研究已经证实,Her2/neu 蛋白 p185 的胞外域是一个分子量为 p kd 的蛋白片段, 可以从正常或者癌细胞中释放, 并且可以通过血清免疫学方法可重复的 精确的检测, 作为血清 Her2/neu 水平的参考 Her2 蛋白 p185 在金属蛋白酶的作用下其胞外端 (ECD) 分子量为 kDa 的区域将会断裂并释放到血液循环系统中, 这使的外周血 Her2 的检测成为可能 根据不同的文献报道, 早期乳腺癌患者 Her2 ECD 的阳性率在 10.1% 34% 之间, 均值 15.4%, 而在转移性乳腺癌患者中,Her2 ECD 的阳性率在 23% 62% 之间, 均值为 36.5%, 远远高于组织学 Her2 的阳性率 但是以往报道所采用的研究体系各不相同, 判断为阳性的标准也不一致, 这在某种程度上影响了各个研究报导之间的可比性 所以建议在对乳腺癌患者的血清 Her2 水平进行监测时, 建议采用通过 FDA 认证的 Her2 检测试剂盒和方法, 对乳腺癌患者的血清 Her2 ECD 进行定量检测 那些转移性乳腺癌患者基线血清 Her2 的浓度大于 15ng/ml 时, 其血清 Her2 水平的监测可以作为其病情发展的跟进观察 血清 Her2 水平监测的应用价值是联合临床上的病情和其它诊断程序的有用信息, 用于转移性乳腺癌患者的疾病管理中 Her2 作为一个早期复发患者的预后指标和患者免疫治疗管理的指标, 其血清测定的临床应用还没有完全建立起来 如果一个患者血清中 Her2 含量超过 15ng/ml 的时候, 其为血清 Her2/neu 水平升高 正常的上限定义为正常健康的绝经前和绝经后妇女中超过 95% 的最低浓度值, 作为检测的一部分数据提交给 FDA 样本人群包括 121

11 个健康的绝经前的妇女血清样本和 120 个健康的绝经后的妇女血清样本 在这 241 个健康的妇女中,95% 的 Her2 的浓度在 13.37ng/ml 以下 在 121 绝经前和 120 绝经后的妇女的血清中 Her2 值没有显著差异 根据此相同的人群, 正常值的上限被定义为平均值加上两个标准差即为 14.78ng/ml, 因此 15ng/ml 定义为正常值的阳性阈值 任何血清 Her2 的值等于或者大于 15ng/ml, 被视为升高 北京胜发兴生物技术有限公司与天津胜发生物技术有限公司联手研发 生产并经三家 3 甲以上的医院临床试验验证 产品质量检验合格和国家食品药品监督管理局质量体系考核通过, 已获得国家食品药品监督管理局批准 ( 批准文号 : 国食药监械 ( 准 ) 字 2014 第 号 ) 的 人表皮生长因子受体 2(Her2/neu) 检测试剂盒 ( 酶联免疫吸附法 )(Human Her2/neu Detection Kit (ELISA) ) 是目前国内唯一的生物技术公司首家获得此种检测试剂盒产品批准证书 北京胜发兴生物技术有限公司, 引进国外先进技术, 历经数年研究, 生产的人表皮生长因子受体 2(Her2/neu) 检测试剂盒, 其基本原理是 : 采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法 包被液中含有一株抗 Her2 ECD 的单克隆抗体, 包被微孔板制成固相抗体, 当加入的待测血清样品中含有 Her2 或 Her2 校准品时, 可与微孔板中吸附的抗 Her2 抗体结合, 再加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的另一抗 Her2 单克隆抗体 ( 此抗体与包被板中的单克隆抗体结合 Her2 ECD 的抗原表位不同 ) 时, 即可与微孔板中第一抗体捕获的 Her2 结合, 经充分洗涤后, 加入酶联免疫反应 TMB 底物, 产生的颜色反应与血清样品中存在的 Her2 或 Her2 校准品的含量在一定范围内呈正比 当颜色反应一定时间后, 加入酸性终止液以终止颜色反应 在酶标检测仪上, 测定 450 nm( 参考波长 630 nm) 的光吸收值, 就可获得校准曲线和待测人血清样品中 Her2 的浓度 试剂盒检测原理图

12 该试剂盒在临床试验中, 是与西门子公司生产的检测相同标志物 Her2/neu 的化学发光试剂盒 ( 已获 SFDA 批准 ) 进行了对比试验 选择了三家有乳腺癌治疗专科的 3 甲医院, 将三家医院数据综合, 本次验证的样本病例总数三家医院选定为血清 1050 例 对所有收集的样品, 用 2 种试剂盒, 进行平行检测, 得出两组数据, 进行统计学计算处理, 相关系数显著性分析结果 : 经计算,N=1045 次,r=0.9727,P=0.000(P<0.001), 根据统计学原理, 两组数据高度相关 一元线性回归方程为 :Y=0.9129X y = 0.912x R² = 系列 1 线性 ( 系列 1) R 2 = 从以上临床对比试验结果可以看出, 北京胜发兴生物技术有限公司生产的 人表皮生长因子受体 2 检测试剂盒 ( 酶免疫吸附试验 ), 与西门子公司的化学发光试剂盒检测相同血清样品 Her2 含量的总符合率达 98.19%, 其质量可靠, 完全可用于临床乳腺癌患者血清 Her2 水平的定量检测, 填补了国内生物技术公司在该领域研发技术产品的空白, 为临床乳腺癌患者的 Her2 状态辅助判断 治疗方案的制定 疾病的复发和肿瘤的转移, 预后的预测提供了新的监测手段 临床对 Her2 ECD 的关注主要集中在 Her2 状态辅助判断 患者预后判断 靶向治疗的疗效预测和评价等几个方面 关于 Her2 状态的辅助判断, 衡量其准确性的一条关键指标就是与其组织学检测结果的相关性 但是由于所采取的 Her2 ECD 以及组织学检测方法和检测的样品各不相同, 既往研究显示, 不管是早期乳腺癌还是晚期乳腺癌患者,Her2 ECD 检测与组织学检测的相关性并不好, 敏感性也不理想 因此目前并没有推荐血清 Her2 ECD 水平用于患者病情所处状态的常

13 规判断, 但是其可以作为组织学检测的有益补充 组织学 Her2( 基因扩增或 p185 过表达 ) 的检测结果与血清 Her2 ECD(ECD 含量 ng/ml) 检测结果不一致的情况可以分为两种, 一种是组织学阳性 (3+ 或 6.0 信号 / 细胞 ) 而 Her2 ECD 阴性 ( 小于 15ng/ml), 另外一种是组织学阴性但是 Her2 ECD( 大于 15ng/ml) 为阳性 对于前者, 可能是肿瘤本身特性或 ECD 释放相关的酶类活性不足所导致, 以组织学结果作为常规诊疗即可, 血清 Her2 可以作为一种辅助手段进行动态观察, 而对于后者则提示, 可能由于肿瘤异质性或检测体系本身的原因, 组织学的检测结果有可能是假阴性所造成的, 可能需重新综合判定 通过血清 Her2 ECD 的这种校正和提示功能, 患者 Her2 状态的判断可能会更为准确, 但是在这方面还缺乏足够的循证医学证据, 还有待进一步的临床研究来证实 从 Her2/neu 的产生机理上分析,Her2 的过度表达是血清 Her2 ECD 升高的必要前提, 而肿瘤细胞膜 Her2 ECD 的断裂和释放又导致 Her2 胞外端酪氨酸激酶区域的持续活化, 进而引发肿瘤细胞的各种恶性行为 因此 Her2 ECD 的升高应该与患者的不良预后相关 的确, 不管是前瞻性的还是回顾性的临床研究也均证实, 无论是早期的还是晚期的乳腺癌患者, 对血清 Her2 ECD 的动态监测均具有较好的预后监测价值 自 2000 年以来, 有许多研究报道, 通过 IHC/FISH 对那些原发性乳腺癌的组织 Her2/neu 呈阳性与其后来转移性乳腺癌患者的血清中 Her2 ECD 水平的相比较, 结果显示那些原发性乳腺癌组织 Her2/neu 呈阳性的患者与其自身发展为转移性乳腺癌后的血清 Her2 ECD 水平的升高之间有很强的一致性 还有许多报道, 在组织中 Her2/neu 阳性的与转移性乳腺癌发生时患者血清 Her2 ECD 水平升高大约有 80-90% 的相关性 然而, 并非所有的报道都是一致的 也有报道在组织中 Her2/neu 阳性的 (IHC/FISH) 患者在发生转移性乳腺癌时, 其血清 Her2 ECD 水平升高仅有 40-55% 根据以前发表的数据和由 007 BCIRG 控制的研究指出, 原发性肿瘤组织 Her2/neu 阳性的患者, 可能成为最好的候选者, 通过监测其血清 Her2 ECD 水平的增高, 并作为外科手术之后乳腺癌复发早期的一种检测手段 然而, 这种标示的地位还没有得到 FDA 确认 关于 Her2 ECD 对靶向治疗的疗效评价方面, 有用曲妥珠单抗治疗 ( 曲妥珠单抗联合化疗的各种组合 ) 转移性乳腺癌病人, 分析发现这些病人血清中 Her2

14 ECD 水平连续地变化与疾病的临床表象相关, 在某些病例中, 血清中 Her2 ECD 水平的变化, 先于临床病程的变化 对于这些经激素治疗 化疗或曲妥珠单抗治疗 ( 曲妥珠单抗联合化疗 ) 病例研究总体结果显示, 血清 Her2 ECD 的连续变化与疾病的临床过程变化平行相关 血清中 Her2 ECD 从曲妥珠单抗预处理时的基线水平到治疗后 30 天会显著减少, 可作为曲妥珠单抗治疗结果的一个早期预测指标 目前相对一致的观点认为,Her2 ECD 的降低比例超过 20% 则提示患者治疗有效 但是, 在 Her2 ECD 对靶向治疗的疗效预测方面目前还存在很大的争议, 有研究者认为,Her2 ECD 越高说明 Her2 的过度表达程度越高, 因此患者 Her2 ECD 的基线值越高则从把向治疗中获益的可能性越大 ; 而有的研究者则认为, 曲妥珠单抗的作用靶点在 Her2 ECD 上,Her2 ECD 释放的越多, 曲妥珠单抗作用的靶点就会越少, 因此患者 Her2 ECD 的基线值越高则从靶向治疗中获益的可能性越小 此外, 还有的研究表明,Her2 ECD 的表达水平与患者靶向治疗的获益并无关联 总之, 到底患者是否能从靶向治疗中获益, 需要分析释放和留在细胞表面的 Her2 ECD 比例, 必须结合患者组织学状态进行综合分析 血清 Her2 ECD 水平的高低与患者临床的预期有一定关系 研究发现, 那些乳腺癌复发患者血清 Her2 ECD 水平持续升高大于 15ng/ml 与血清 Her2 ECD 水平持续低于 15ng/ml 的乳腺癌复发患者相比, 前者的生存率显著低下 在病程中或治疗过程中, 患者血清 Her2 ECD 水平持续降低并低于 15ng/ml 以下, 其病情缓解, 生存期会延长 在复发的乳腺癌患者中, 血清 Her2 ECD 水平的升高, 可以早期检测潜在的转移性乳腺癌的风险, 并且可以验证病人生存期缩短的高可能性 乳腺癌转移之前, 血清 Her2 ECD 水平的升高, 可能是侵润性疾病进展的象征 在乳腺癌复发被临床实际诊断出来的 2-9 个月之前, 可以检测血清 Her2 ECD 水平的升高而预警 在所有的组织 Her2 ECD 阳性的患者中, 监测血清 Her2 ECD 水平可能是早期检测乳腺癌复发的很好的途径 Her2/neu 不仅仅是一种肿瘤标志物, 血清中 Her2 ECD 水平与肿瘤的负荷 Her2/neu 过表达和受体激活有密切联系 Her2/neu 裂解的胞外区导致细胞内酪氨酸激酶的磷酸化增加 血液循环的 Her2/neu 水平不仅是一个肿瘤过表达的标志物还可以预测受体的激活程度 在激素受体阳性的转移性乳腺癌患者中, 血清 Her2 ECD 是一个重要的独立的预测和预后因子, 作为一个独立的肿瘤攻击性发展的标志物, 能够反应肿瘤的生物学行为

15 总体来讲, 过去由于缺乏一致的研究体系以及一致的阳性判断标准, 在血清 Her2 ECD 领域目前还缺乏高质量的研究以及一致性的结果, 导致其临床应用受到了极大的限制 但是这并不影响我们对该领域的关注, 相信随着检测体系以及阳性判断标准的进一步统一, 很多临床诊疗中面临的问题将会得以解决, 并且最终会影响到临床应用的实践 综上所述,Her2/neu 的基因 蛋白及蛋白胞外区是乳腺癌重要的预后指标和 Her2 靶向药物的预测指标, 准确分析 Her2 状态对乳腺癌的诊疗具有重要的指导作用 现有 Her2 检测存在的不足使得外周血 Her2 ECD 的检测成为了临床关注的焦点, 目前围绕着 Her2 ECD 已经开展了大量的转化性研究工作并取得了阶段性的成果 Her2/neu 状态是一个重要的信息, 是指导乳腺癌 Her2/neu 阳性患者的治疗所需要的 因此, 通过 IHC 和 FISH 的方法准确地确定 Her2/neu 状态, 对于选择最适合的治疗方式非常有必要 许多研究现在已经证实, 原发性肿瘤中 Her2/neu 的状态并不能准确反映病人接受曲妥珠单抗治疗, 也不能对辅助治疗或肿瘤转移的情况进行确定 因此, 血清 Her2ECD 检测的一种潜在的临床用途是, 对于组织 Her2/neu 检测阴性的患者验证其血清 Her2 ECD 的水平是否升高 这可能是一个原因来通过 IHC 和 FISH, 重新评估原发性肿瘤还是转移性肿瘤是 Her2/neu 阳性 血清 Her2 ECD 检测是一种能够与组织学检测互补的检测, 但是它不能取代 IHC 和 FISH 因为多数通过 IHC 和 FISH 研究报告有 20-30% 的 Her2/neu 阳性存在于原发性乳腺癌中, 现在一些研究表明为什么在原发性乳腺癌中有 20% 的假阴性率, 血清 Her2 ECD 升高占转移性乳腺癌病 50% 的比例成为一种可能 然而, 对于一位患者被认 Her2/neu 阴性的大部分原因是该患者的肿瘤只有少于 10% 的 3+ 阳性细胞, 因为要有 10% 及以上的 3+ 阳性细胞才被定义为 Her2/neu 阳性 然而, 这很有可能使得在原发性乳腺癌细胞中有足够的 Her2/neu 阳性细胞 ( 忽略阈值 ) 在转移性乳腺癌中产生 Her2/neu 阳性肿瘤 无论在原发性乳腺癌中,Her2/neu 阳性细胞的百分比是多少, 他们可以成为生物生长优势的肿瘤细胞, 并且可以迁移到比较远的地方然后创造产生转移性肿瘤 过去几年中进行的一些研究显示, 血清 Her2 ECD 升高的频率在原发性肿瘤 Her2/neu 阳性的转移性乳腺癌病人中发生的情况更加明显 通过 FISH 扩增鉴定在原发性肿瘤 Her2/neu 阳性的患者发展成转移性乳腺癌患者中有 89.5% 血清

16 Her2 ECD 水平明显升高 (>15ng/ml) 同样有可能的是, 血清 Her2 ECD 的检测可能对于在处理特殊的 Her2/neu 阳性肿瘤的病人的时候有临床价值 研究表明, 有较好的临床结果的病人 Her2 ECD 水平持续低于 15ng/ml 在曲妥珠单抗治疗的患者中, 同样研究显示, 血清 Her2 ECD 水平从治疗前到治疗后降低不到 20% 与临床治疗效果不理想有密切联系, 这种结果对比那些患者下降超过 20% 的情况而言 那些没有达到 20% 下降比率的病人可能受益于补充的 Her2/neu 抑制剂, 这种抑制剂目前在临床开发阶段 伴随着许多靶向治疗方法的出现, 基于循环中生物标志物的新机理会变得日益重要, 例如 Her2/neu, 表皮生长因子受体和血管内皮生长因子, 可以使用在转移性癌症设定监视靶向治疗的疗效, 并选择对患者有针对性的治疗 新型诊断检测的目标应该是应用基于生物标志物的机理, 例如血清中 Her2/neu, 为了检测早期乳腺癌的复发, 从第一次诊断的时间开始到肿瘤的迁移, 要作为监测病人状况的常规检测项目, 目的是提高治疗早期干预, 并希望提高总体生存率

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