Two-Down Approaches To Prepare Triterpenoids For Immune Regulation And Cancer Therapy

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1 版权 2005 美国科学出版社 版权所有 美国印刷 Journal of Nanoscience and Nanotechnology 2005, Vol.5, 纳米科学与纳米技术杂志 2005, Vol.5, 中文译文 由大到小 (Top-Down) 法处理的灵芝孢子的 药理学和抗癌活性 刘昕王江海袁建平 中山大学生命科学学院国家教育部食品工程研究中心, 中国广州 灵芝在中国古代被认为是最珍贵的药物, 而且在当今仍被普遍尊为具有预防和治疗各种慢性疾病的颇具价值的健康补充剂和中草药 然而, 长期以来灵芝功效成分和药理机制的不确定性阻碍了其治疗功效的发挥 近年来发现灵芝孢子是灵芝最有效的药用部位 但是, 由于微米级灵芝孢子具有坚韧的外壁而难于被消化和吸收, 因此, 灵芝孢子功效的发挥尚需在加工技术上做进一步的改进 本文阐述了用于加工灵芝孢子以释放有效药理成分如三萜类化合物的由大到小法, 并讨论了灵芝孢子原料的生产 萌动激活全破壁灵芝孢子的生产工艺 灵芝显著的药理活性 基于现代药理学研究确立的灵芝抗癌机制 灵芝临床试验结果, 以及对具有免疫调节和癌症治疗作用的富含三萜的灵芝孢子和灵芝三萜类化合物的未来制剂形式进行了展望 关键词 : 灵芝 ; 孢子 ; 三萜 / 三萜类化合物 ; 多糖 ; 免疫调节 ; 癌症治疗 目录 1. 前言 灵芝孢子的生产与加工技术 灵芝孢子原料的生产 由大到小法加工灵芝孢子的技术 灵芝子实体和灵芝孢子中主要活性成分三萜类化合物的萃取 灵芝的药理活性和临床试验 灵芝的药理活性 灵芝的临床试验 灵芝的抗肿瘤机制 宿主免疫功能的提高 直接细胞毒 其它机制 展望...14 致谢...15 参考文献与注释 前言有关灵芝的记载可追溯到公元前 300 年的古书如 礼记 和 吕氏春秋 1 而关于灵芝功效更详尽的描述则出现在公元前 100 年的 神农本草经 ( 被普遍认为是关于东方草药和传统中药基础最早的著作 ) 和明代的药典 本草纲目 ( 李时珍于 1578 年编撰 ) 赤芝 (G. lucidum) 是含有多种生物活性物质的一种药用真菌 在中国和其它东方国家, 它被认为是具有促进健康和延年益寿功效的最佳民 1

2 间药物之一而被长期使用并备受推崇 2 赤芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌, 其亚属赤芝 (Leyss. ex Fr.) 是芬兰生物学家 Karsten 于 1881 年分类确定的 3 ; 在中国它被称为灵芝, 在日本则被称为 Reishi 有报道的灵芝品种已超过 120 种, 除赤芝外, 其它有药用或营养价值的灵芝包括紫芝 树舌 松杉灵芝和薄树芝 4, 赤芝和紫芝均被收入 中华人民共和国药典 (2000 和 2005 年版 ) 本文论述了灵芝孢子原料的生产 灵芝孢子的加工技术及灵芝的现代药理学研究和临床试验结果, 最后对具有免疫调节和治疗癌症功效的富含三萜的灵芝孢子和灵芝三萜类化合物的制剂进行了展望 2. 灵芝孢子的生产和加工技术 2.1 灵芝孢子原料的生产灵芝子实体入药在中国虽已有几千年的应用史, 但直至 20 世纪灵芝孢子才被人们所认识和利用 有关灵芝孢子的研究还很少 4 14, 这可能与灵芝孢子难于收集有关 野生灵芝生长于高山上的老龄树或树桩上, 且很难被发现 灵芝孢子较短的喷射期及某些环境因素如刮风和下雨等都会影响孢子的收集 因此, 长期稳定地获取大量高品质的灵芝孢子实际上很难做到 直至 20 世纪, 特别是近十年来, 随着人工栽培灵芝技术的发展和成熟 4,15, 研究人员已经能够获得足量的用于研究和医用的灵芝孢子 刘昕,1957 年出生于中国广东省 获中山大学生物学理学硕士学位 中山大学生命科学学院教授, 教育部食品工程研究中心主任 中国食品学报 等多家杂志编委 以第一获奖者获国家发明奖等 10 多项奖励 ; 长期从事生物技术产业化 微生物药物工程 先进制造技术领域的研究和管理工作, 完成 萌动激活 等多项原创性发明与 30 多项无毒副作用的功能性活性物质及天然药物等重大成果 以第一发明人申请专利 65 项 ; 发表论文 110 篇 Lsfeec1@zsu.edu.cn 王江海,1965 年生于中国江西省 于 1990 年在中国地质大学获博士学位后, 到中国科学院地球化学研究所做博士后, 并于 年期间在中国科学院广州地球化学研究所同位素实验室任研究员 自 2002 年 5 月起在中山大学生命科学学院任教授 共发表 120 多篇论文和出版 3 部专著 研究兴趣为天然生物活性物质, 特别是木脂素和灵芝孢子 lsfeec2@zsu.edu.cn 袁建平,1962 年出生于中国青海省 1986 年在华南理工大学食品工程系学习并获得硕士学位, 之后进入华南理工大学食品工程系工作 先后获华南理工大学食品工程系工学博士学位 (1997 年 ) 和香港大学植物学系生物技术哲学博士学位 (1999 年 ) 2001 年进入中山大学生命科学学院工作,2002 年起任副教授 已发表论文 50 余篇 主要研究兴趣包括食品化学 天然生物活性物质化学和 HPLC 分析技术 lsfeec5@zsu.edu.cn 2

3 图 1. 电子显微镜照片, 示赤芝孢子和紫芝孢子的结构 (A): 卵形赤芝孢子图 ;(B): 赤芝孢子局部放大图 ;(C): 扁卵形紫芝孢子图 ;(D): 紫芝孢子局部放大图, 外形似南瓜子 ;(E): 赤芝孢子截面图 ;(F): 截面图, 示一个赤芝孢子的双层孢壁 灵芝孢子是从成熟的灵芝菌盖底部喷射出的 大小为 5-12 μm 极其微小的呈烟雾状灵芝种子 ( 图 1A 1B 1C 和 1D) 灵芝孢子因拥有十分坚韧的双层孢壁 ( 图 1E 和 1F) 而难以破壁 储藏于内 外孢壁夹层的生物活性物质因孢壁的韧性而难以被萃取 人工培植灵芝通常所用的低成本培养料包括木屑 稻草 棉籽壳 甘蔗渣或其它类似物料 然而用上述培养料培植的灵芝所喷射出的灵芝孢子通常小而干瘪 4, 仅含少量的生物活性物质, 且萌发率低 由国家教育部食品工程研究中心和广州绿色盈康生物工程有限公司建立的灵芝培植基地与常规培植基地明显不同, 并拥有与众不同的三个特点 : (1) 该基地位于中国福建省 1000 米的高山林区, 在野生或仿野生环境如新鲜的空气 洁 净的水 显著的日夜温差 ( 超过 25 C) 和合适 的湿度下培植灵芝 (2) 培植灵芝的培养料为阔叶树段木 为了确保 灵芝孢子无重金属和杀虫剂污染, 段木须经 系统的检测并严格满足培养料的标准 (3) 当灵芝在成熟期开始喷射孢子时, 采用牛皮 纸护套收集法即时收集灵芝孢子, 确保所获 得的高品质新鲜孢子可用于随后进行的萌 动激活处理 然而, 市售的普通灵芝孢子通 常经历了发酵和变质, 因此, 完全不可能将 其萌动, 因为从灵芝菌盖底部喷射出的并沉 积于灵芝菌盖表面的灵芝孢子在收集前已 经历长期的湿热环境 为了获得富含三萜的灵芝孢子原料, 刘昕 16,17 建立了一种在灵芝生长期间通过调节环境因 子, 如 CO 2 浓度 湿度 温差 光的类型和光照 时间等, 诱导灵芝在极端环境下过度产生并累积 次生代谢产物如灵芝三萜的独特工艺 Lingzhi Master 和 Guru ( 学者 ) 灵芝孢子产品是用上述 富含三萜的灵芝孢子原料制成的 该产品具有较 高的药理活性 6 9,11, 由大到小法加工灵芝孢子的技术 最新药理学研究表明, 灵芝孢子具有显著的 11,12,18 抗肿瘤和抗 HIV-1 蛋白酶的活性 19 ; 然而, 上述活性与灵芝孢子的存在状态密切相关 破壁 能明显促进灵芝孢子生物活性的释放 未破壁灵 芝孢子在体外对肿瘤细胞不产生作用 18 我们已 发表的研究结果显示, 未破壁灵芝孢子对肿瘤的 抑制作用远低于全破壁灵芝孢子, 表明未破壁灵 芝孢子中的绝大部分生物活性物质不能被人体 吸收和利用 11,12 而且, 当服用未破壁灵芝孢子 进行治疗时, 在试验对象的粪便中发现大量完整 的灵芝孢子, 表明孢壁在体内是很难被破坏的 显然, 灵芝孢子与大小为 μm 的普通花粉 不同, 未破壁花粉仍可被动物和人体吸收 3

4 表 I. 灵芝孢子破壁的主要专利技术对比 专利号说明 JP Pat 采用有效机械力打破细胞膜的方法达到完全萃取 什塔克菇 菌丝体和孢 20 子中的有效成分 JP Pat 采用溶剂萃取 分离 冷冻并将滤渣研磨成粉的方法以获得灵芝孢子精 21 华 22 CN Pat A 采用以盐水浸泡 冷冻 超声处理和脱水的方法生产破壁灵芝孢子 23 CN Pat A 采用水浸 风干和微波热处理的方法生产破壁灵芝孢子 CN Pat A 采用煮沸 冷却至 60ºC 加酶 再冷却 接种酵母进行发酵 重复进行 24 煮沸 冷却并置于室温的方法, 获取灵芝孢子中的有效成分 CN Pat C 采用以溶菌酶 解螺旋酶 纤维素酶和 / 或半纤维素酶于 20-50ºC 溶解灵芝孢子孢壁, 再经冷冻和熔化处理 2-5 次, 并在 20-50ºC 进行超声处理的方 25 法, 生产破壁灵芝孢子, 重复上述过程可提高破壁率 CN Pat 公开了一种采用多种孢壁溶解酶如溶菌酶 解螺旋酶 纤维素酶和半纤维素酶对灵芝孢子孢壁进行处理, 然后通过冷冻 酶解和超声处理将灵 26 芝孢子破壁 CN Pat C 采用清水冲洗和净化 在 60-80ºC 烘箱中干燥 用高压碰撞装置撞击和用 27 紫外线杀菌的方法生产破壁灵芝孢子 CN Pat C 采用室温下溶剂混合 超声处理和高压处理的方法获取灵芝孢子中的生 28 物活性物质 29 CN Pat A 采用反复液氮冷冻和融化的方法生产破壁灵芝孢子 CN Pat C 采用流速为 m/s 的超声气流法生产破壁灵芝孢子 30 CN Pat A 采用等离子方法生产破壁灵芝孢子 然而, 由于灵芝孢子拥有具预应力的卵形结 构及主要由几丁质 (~49%) 钙和硅组成的坚韧的 双层孢壁 ( 图 1E 和 F), 故将灵芝孢子完全破壁非 常困难 最近已有一些灵芝孢子的破壁方法或技 术公开, 正如表 I 所示 虽然许多破壁技术 已有明显改进, 但这些公开的大多数技术并未完 全克服破壁率低和来自不锈钢设备的铬镍等重 金属严重污染两大缺陷 13,32 低破壁率会降低灵 芝孢子中活性成分的有效吸收, 而重金属污染又 会增加服用灵芝孢子产品的安全风险 即使少数 方法能达到既可完全破壁又不造成重金属污染 的要求, 但因其生产成本过高而无法进行工业化 生产 值得庆幸的是, 刘昕等发明了一种用于 灵芝孢子破壁的独特装备, 该装备的碰撞和研磨 部件均用高强度纳米或非纳米陶瓷材料制成 36,37, 材料中氧化锆和添加氧化钇组分以增强装 备的坚韧性 该装备不仅能在很短的时间 (1-3 分 钟 ) 内生产出全破壁灵芝孢子 ( 图 2), 而且还能够 完全克服重金属污染 检测结果显示, 由该装备 生产的全破壁灵芝孢子产品, 其铬和镍的含量分 别为 0.7 ppm 和 0.5 ppm 13, 而在香港市场上出售 的某种采用常规不锈钢设备生产的声称全破壁 灵芝孢子产品, 其铬和镍的含量分别高达 ppm 和 77.3 ppm 13 此外, 前人方法完全没有考虑灵芝孢子的萌 动, 而萌动能使活性物质的含量增加并提升其药 理活性 11, 中山大学刘昕等提供了唯一一 种能将灵芝孢子完全打破的方法 该方法不仅能 生产全破壁灵芝孢子, 而且能确保灵芝孢子的高 萌动率和所产生的生物活性物质的高药理活性 该方法包括三个阶段 : 4

5 产破壁灵芝孢子 当灵芝孢子因萌发而使其孢壁失去韧性而变脆时, 再采用超微粉碎装置的机械力将灵芝孢子破碎成纳米级超微粉末, 破壁率达 99.8%, 同时有效地确保生理活性物质的稳定, 防止富含三萜的脂质活性物质被氧化 然后对处理过的灵芝孢子进行冷冻干燥或真空干燥 最后阶段是采用超临界 CO 2 流体萃取技术从破壁灵芝孢子中萃取富含三萜的脂质活性物质, 并对灵芝三萜类化合物进行纯化 灵芝子实体和灵芝孢子中主要活性成分三萜 类化合物的萃取 随着现代分析技术特别是色谱分离技术的 图 2. 电子显微镜照片, 示破壁过程中赤芝孢子和紫芝孢子的状态 (A): 部分破壁的赤芝孢子图 ;(B): 部分破壁的赤芝孢子局部放大图 ;(C): 全破壁的赤芝孢子图 ;(D): 几乎全破壁的紫芝孢子图 ;(E): 压缩前的全破壁赤芝孢子图 ;(F): 压缩后的全破壁赤芝孢子图 第一阶段为诱导萌发, 通过选择成熟饱满的 灵芝孢子, 在控温条件下将其浸泡在溶液中, 然 后在通风良好的培养箱内在适当的温度和湿度 条件下诱导灵芝孢子萌发, 萌发率可达 95% 以 上 当休眠的灵芝孢子通过萌动而激活后, 可生 成的生物活性物质至少包括但不限于活性酶 甾 醇 三萜类化合物 多糖 糖蛋白和生物碱 这 些活性物质具有显著的药理活性 药理学研究表 明, 萌动激活灵芝孢子的药理活性显著高于休眠 的灵芝孢子 6 9,11,12 当灵芝孢子萌动激活后, 采用低温酶处理或 超微粒子粉碎技术将灵芝孢子破碎成超微粉末, 同时在激活状态下有效保持生理活性物质的稳 定, 防止富含三萜的脂质活性物质氧化 当灵芝 孢子外壁失去韧性而变脆时, 该阶段就结束了 第二个阶段是通过打破灵芝孢子的孢壁生 发展, 发现灵芝含有一系列生物活性成分, 包括 三萜 多醣 核苷 甾醇 脂肪酸 生物碱 蛋 白质 肽 氨基酸和无机元素 43 从灵芝子实体 灵芝孢子和灵芝菌丝体中萃取出的三萜因其多 种潜在的显著药理活性而倍受关注 11,12,19,44-46 灵芝三萜是灵芝子实体 灵芝菌丝体和灵芝 孢子中的苦味成分 前人研究表明, 灵芝孢子与 灵芝子实体类似, 均包含大量的活性物质, 但灵 芝孢子内活性物质的生物活性比灵芝子实体内 活性物质的生物活性更高 自 Kubota 等首先 从干燥的赤芝表皮中分离出两种新的三萜即灵 芝酸 A 和 B 后, 已先后有超过 130 种氧化的三萜 ( 主要为羊毛甾烷类三萜 ) 从灵芝子实体 灵芝孢 子和灵芝菌丝体中被分离出来 43-46,48 值得注意 的是, 灵芝是灵芝酸这类生物活性物质的唯一已 知来源 目前的研究主要集中于利用色谱和其它 分离技术对灵芝子实体 灵芝孢子和灵芝菌丝体 中的生物活性成分进行分离 纯化 鉴别和定性 以及对灵芝产品的质量保证和质量控制 目前有两种溶剂萃取方法可用于从灵芝孢 子 灵芝子实体和灵芝菌丝体中分离三萜类化合 物 第一种方法涉及用有机溶剂和 / 或水萃取总 5

6 三萜 19,49-57 例如, 在分离具有抗 HIV 活性的三 19,55,58 萜类化合物时,Min 等采用甲醇回流法从灵 芝孢子中萃取三萜类化合物 类似地, 最近采用 硅胶色谱法从灵芝子实体的 CH 2 Cl 2 溶性组分中 鉴别出一种新的被命名灵芝内酯的三萜以及其 它三种三萜 (ganoderiol A B 和 ganodermatriol) 52,53 超临界 CO 2 流体萃取法是一种从灵芝孢子 中获取富含三萜 ( 约含 13% 的总三萜 ) 的脂质活 性物质的重要技术 14,59 一项采用超临界 CO 2 流 体萃取技术从灵芝子实体中萃取三萜类化合物 的实验结果表明, 超临界 CO 2 的浓度是影响三萜 萃取效率的最重要因素 60 采用一项原创的超临 界 CO 2 流体萃取技术 42, 从 100 克萌动激活全破 壁灵芝孢子中可萃取出 克的富含三萜类 化合物的脂质 ( 溶解于甘油三酸酯中的生物活性 物质的混合物 ), 并已实现大规模的工业化生产 我们新建立的超临界 CO 2 流体萃取技术及低温 高压逆流萃取技术萃取出含 10-13% 三萜的灵芝 孢子脂质活性物质 第二种方法涉及从总三萜中选择性分离酸 性三萜类化合物 Ma 等的研究显示 67, 可用 95% 的乙醇水溶液回流萃取灵芝子实体 将乙醇 萃取液先减压蒸发, 再将残留物加水后保留并用 三氯甲烷萃取 最后在浓缩的三氯甲烷萃取液中 加入饱和 NaHCO 3 水溶液, 水层在加入 6 N HCl 经酸化后 (ph 3-4) 再用三氯甲烷萃取 两种新的 化合物灵芝内酯和灵芝酸 DM 就可从灵芝子实 体的二氯甲烷可溶部分中分出 52,53 经溶剂萃取 后分离出的三萜部分可用硅胶色谱法进行重复 纯化 前人采用的流动相有多种, 主要包括己烷 - 丙酮 二氯甲烷 - 甲醇 石油醚 - 乙酸乙酯 乙酸 乙酯 - 氯仿 甲醇 - 氯仿 乙酸乙酯 - 二氯甲烷 苯 - 甲醇 - 水和氯仿 - 甲醇 - 水 此外, 少数研究者报 道了将萃取出的酸性三萜用乙醚重氮甲烷进行 甲基化, 再将其衍生物用硅胶柱色谱法和制备型 HPLC 法进行分离 灵芝的药理学活性和临床试验 4.1. 灵芝的药理学活性 现代药理学研究业已表明, 灵芝具有抗肿瘤 6-9,11,12,68-72 抗衰老 73 4,74 清除自由基 抗肝毒性 和抗菌 / 抗病毒等活性 灵芝的药用特性且无 细胞毒性使其能有效防止氧化损伤及由此引起 的疾病 79 灵芝潜在的药用价值和广泛的适应性 已引起人们探寻其药理活性成分的广泛兴趣 44,80 口服灵芝萃取物无任何毒性, 表明灵芝是 非常安全的 灵芝多糖或灵芝水提物 免疫学研究已经表明, 灵芝水提物和 / 或灵 芝多糖具有免疫调节的活性 4,82,83 它们具有双向 的免疫调节活性, 不仅能够刺激免疫细胞和免疫 因子抵御各种疾病, 而且能抑制过敏性免疫反应 并使其保持稳定 1,4 然而, 前人的大多数研究仅 限于灵芝子实体和菌丝体, 而近年来仅有几篇有 关灵芝孢子的研究报道 例如, 从破壁灵芝孢子 中分离出一种具有免疫活性的复杂葡聚糖 84 Gu 85 等研究了灵芝孢子水溶物制剂对老鼠骨骼肌 匀浆自发性和 Fe 2+ 诱导的脂质过氧化的抑制作 用, 结果表明灵芝孢子水溶物制剂通过清除活性 氧自由基可保持肌肉隔膜的稳定 动物试验结果 表明, 破壁灵芝孢子具有免疫调节的活性 86, 灵芝三萜或灵芝醇提物 最新药理学研究显示, 灵芝三萜或灵芝醇提 88 物具有显著的生物活性 例如,Lin 等报道, 一 种灵芝菌丝体的三萜组分通过抑制蛋白激酶 C 和激活有丝分裂原活化蛋白激酶及 G2 期细胞周 89 期阻断, 能抑制人肝癌细胞的生长 Hong 等发 现灵芝子实体醇提物具有促进细胞凋亡和抗炎 功能, 以及对结肠癌细胞早期炎症中细胞因子表 6

7 19 达具有抑制作用, 并呈量效关系 Min 等从灵 芝孢子中分离出多个能显著抑制 HIV 蛋白酶的 三萜, 如灵芝酸 β luciumol B ganodermanodiol 90 ganodermanontriol 和赤芝酸 A Mothana 等首次 从欧洲担子菌类弗氏灵芝子实体中分离出三种 三萜, 如 ganodermadiol lucidadiol 和氧化树舌酸 G, 它们具有抗 A 型流感病毒和 1 型 HSV 病毒的活 91 性 Zhu 等发现灵芝萃取物中的一种三萜组分 对焦酚诱导的红血球膜氧化和铁 (II) 抗坏血酸 诱导的肝线粒体脂质过氧化具有抑制作用, 其主 要三萜成分包括灵芝酸 A B C D 赤芝酸 B 86 和 ganodermanotriol Giner-Larza 等报道, 富含 羊毛甾烷的萃取物具有抗炎和抗磷酯酶 A2 的活 93 性 Smania 等从长管树舌子实体中分离出五种 三萜并发现氧化的树舌酸 A C 和 F 具有抗真菌的 活性 萌动激活破壁灵芝孢子 我们研究了休眠的灵芝孢子 萌动期灵芝孢 子 萌动激活破壁的灵芝孢子和从灵芝孢子中萃 取的富含三萜的脂质对小鼠肝癌 恶性毒瘤 S-180 和网状细胞肉瘤 L-II 的抑制作用, 结果表 明休眠的灵芝孢子的生物活性低于萌动激活的 灵芝孢子 由于灵芝孢子中的生物活性成分蕴藏 于孢壁内, 而孢壁很难被消化, 故破壁灵芝孢子 的生物活性远高于未破壁的灵芝孢子 而富三萜 的萌动激活灵芝孢子脂质具有显著的抗肿瘤功 效并呈量效关系, 能显著抑制这三种肿瘤, 抑瘤 率达 80 90% 11,12 我们的研究结果也显示, 在 实验结束时未见任何毒性或副作用 实验小鼠在 实验剂量范围内其皮肤和毛发及行为特征均未 显毒性反应, 且实验小鼠的平均体重也无显著的 差异 11, 灵芝的临床试验 灵芝在中国和其它东亚国家作为一种草药 而被广泛用于治疗各种小病和慢性疾病, 如厌食 症 关节炎 哮喘 心血管疾病 慢性支气管炎 便秘 糖尿病 痛经 红斑狼疮 胃炎 痔疮 肝炎 高血压 白血球减少 偏头痛 肾炎 神 经衰弱和带状疱疹的神经痛 2,4,49,75, 然而, 灵芝的现代临床研究始于上世纪 70 年代, 并已 有很多关于灵芝的临床报道, 但前人研究主要限 于灵芝子实体或菌丝体, 而对灵芝孢子的研究极 其鲜见 临床观察已证实, 灵芝能提高对硬皮病 皮肌炎 红斑狼疮和牛皮癣治疗的预后效果 4 在临床试验中很少有关于灵芝副作用的报道 当前, 许多研究者开始专注用灵芝治疗各种 癌症的研究 中国医生已将灵芝用于常规手术 化疗和 / 或放疗的癌症病人的辅治疗, 以构筑免 疫系统的抗耐性和减少毒性 4 前人的研究表明, 灵芝产品与手术 化疗和放疗相结合对辅助治疗 各种癌症具有重要作用 具体的功效包括 :(1) 提高癌症病人对化疗或放疗的耐受性 ;(2) 减轻 化疗或放疗的副作用, 如厌食和白血球减少 ;(3) 刺激免疫系统抵御癌症 ;(4) 提高癌症病人的生 存质量 灵芝子实体 102 Kanmatsuse 等对一种冻干灵芝提取物进 行了抗高血压的临床评估 给 53 位具有原发性 高血压 轻微高血压和正常血压的病人服用灵芝 提取物片剂, 每个病人每天服用 6 片, 含 0.24 克灵芝提取物并持续 6 个月 结果显示, 灵芝提 取物对原发性高血压病人具有降血压作用, 在 6 个月的服食期间, 没有对原发性或临界高血压病 人产生任何副作用 另一项对 33 例有高脂血症 和脑血栓症的高血压病人所进行的临床试验, 每 天 4 次, 剂量为 0.11 克, 服食两周 结果显示, 灵芝水提物是改善血液流动性 增加血液供给和 防止血痊形成的有效药物 1 为了评价五色灵芝 ( 从五种灵芝中萃取的一 种多糖萃取物 ) 减轻放疗副作用和改善免疫功 7

8 能, 对 72 例鼻咽癌病人进行了随机的安慰剂对 照临床试验 103 病人在接受放疗期间口服五色灵 芝, 服用剂量为 0.76 克, 每天三次 结果显示, 五色灵芝能帮助放疗的鼻咽癌病人提高免疫功 能, 但不能减轻放疗所产生的副作用 103 对 143 例晚期癌症病人进行随机的安慰剂对照临床试 验, 口服 Ganopoly ( 一种灵芝多糖水提物 ), 剂量 为 1.8 克, 每天三次, 服用 12 个星期 104,105 结 果显示, 用 Ganopoly 治疗 12 个星期后, 血浆中 某些细胞因子包括 IFN-γ 的平均浓度显著增加 104, 灵芝孢子 在一项临床研究中, 给 10 例萎缩性肌强直 病人 (8 位男性 2 位女性 ) 肌肉注射灵芝孢子水提 物 106, 注射剂量为每天 克, 持续注射剂 量为 克, 对病人随访 8 个月至 6.8 年, 未发现有短期或长期的副作用 一项临床试验表 明, 灵芝孢子对自身免疫性疾病如皮肌炎和硬皮 病有良好的治疗效果 Ni 等使用灵芝孢子对 100 例脾虚的癌症病人进行临床试验, 在放疗期 间口服灵芝孢子, 剂量为 0.4 克, 每日三次, 服 用 30 天, 结果表明, 灵芝孢子能提高病人的生 存质量 另一项用灵芝孢子对 200 例消化系统癌 症的化疗病人进行辅助治疗的临床试验中, 病人 口服灵芝孢子剂量为 0.5 克, 每日三次, 服用 8 个星期, 结果显示, 灵芝孢子能减轻化疗的副作 用 刺激骨髓的造血功能和增强免疫系统 109 Yu 110 提供了用灵芝孢子治疗 94 例癌症病人的临 床试验, 病人口服灵芝孢子剂量为 克, 每日三次, 服用 天, 结果表明, 灵芝孢子 可提高免疫功能 减少化疗和放疗的副作用并能 提高病人的生存质量 萌动激活全破壁灵芝孢子 Wang 等和刘昕等进行了一项随机的安 慰剂对照临床试验, 用萌动激活全破壁灵芝孢子 (CSGGS) 治疗 88 例 (46 例男性,42 例女性 ) 乙型肝炎病毒 (HBV) 感染者 病人服用 CSGGS 胶囊 ( 治疗期三至六个月 ), 剂量为 1.2 克, 每日三次, 服用三个月, 结果显示, 治疗后的病人其 HBeAg HBsAg 和 HBV DNA 转阴率分别为 34.1% 9% 和 29.5% 用 CSGGS 治疗无症状 HBV 携带者的有效率与慢性肝炎病人的有效率相近, 与目前可利用的其它抗病毒制剂具有类似的效果 同时, 治疗后病人血清中的白介素 2 (IL 2) 含量明显高于 CSGGS 治疗前的水平, 特别是对 HBV DNA 转阴的病人, 表明 CSGGS 可促进 IL 2 的产生并能抑制 HBV DNA 的复制 一项持续 6 个月至 4 年的临床试验评估了 CSGGS 对 52 例肿瘤病人的治疗效果 治疗分为三个阶段 :(1) 手术 放疗或化疗期间的特殊护理阶段 : 每天服用剂量为 9 克 CSGGS;(2) 手术 放疗或化疗后三个月的调整阶段 : 每天服用剂量为 6.3 克 CSGGS;(3) 康复阶段 : 每天服用剂量为 4.2 克 CSGGS 观察结果表明, 一例白血病患者和一例肺癌患者完全康复,38 例病人的肿瘤显著缩小 特别是 CSGGS 可改善大多数癌症病人的症状, 如减轻痛苦 增进食欲 改善睡眠和提高对放疗或化疗的耐受性 中国疾病预防控制中心艾滋病性病预防控制中心采用以下两套方案评价了 CSGGS 对 30 例 HIV 病人的治疗效果 :(1) 3 个月 HAART ( 高效抗逆转录酶病毒疗法 ) 治疗期 + CSGGS 治疗, 服食剂量为 3 克, 每天三次, 在 HAART 中断期的 3 个月服用 ;(2) 单独 CSGGS 治疗, 服食剂量为 3 克, 每天三次, 服用时间为 6 个月 HAART + CSGGS 方案的临床结果显示,CSGGS 能使 66.7% HIV 病人血清中的病毒载量在中断期不反弹, 并能使 CD4 细胞数量增加 CSGGS 方案的结果表明,CSGGS 能使 14% HIV 病人的 CD4 细胞数量增加, 或保持 72% HIV 病人的 CD4 细 8

9 胞数量稳定, 表明 CSGGS 能改善 HIV 病人的免疫系统状况 因此,CSGGS 是一种潜在的免疫调节剂, 可作为抗 HIV 的辅助药物, 能减轻抗 HIV 药物的副作用, 巩固抗 HIV 药物的治疗效果, 增强 HIV 病人的免疫系统 112 一项随机的临床试验评估了 CSGGS 对 24 例妇女子宫肌瘤的抑制效果 CSGGS 服用剂量为每天 4.5 克, 当服用 6 个月后, 有 21 例妇女的子宫肌瘤完全消失, 另外 3 例的子宫肌瘤变小, 表明 CSGGS 能抑制子宫肌瘤的生长 138 例随机的男性更年期综合症 (MCS) 病人服食 CSGGS 胶囊, 剂量为 0.6 克, 每天三次, 服用三个星期后, 观察患者的症状 血清睾酮 SOD 丙二醛(MDA) 和抑郁量表标准分的变化, 并与 58 例服用安慰剂的对照组进行对比 经 3 个星期治疗后,CSGGS 组症状显著减轻, 抑郁量表标准分改善 74.3%, 表明 CSGGS 对男性更年期综合症的治疗是有效和安全的 64 显然, 上述临床证据支持灵芝及其孢子所声称的药理学活性 5. 灵芝的抗肿瘤机制虽然灵芝及其孢子的药用和治疗活性早已被证明 4,68,69, 但其抗肿瘤机制仍然未被完全确定 目前大量的体内或体外研究数据表明, 灵芝的抗肿瘤功效主要归因于提高宿主免疫功能 直接细胞毒 抗信号转导分子增殖 调变信号转导分子 诱导变异 诱导细胞周期阻断 诱导凋亡和抗血管生成 宿主免疫功能的提高许多体外和体内研究表明, 灵芝水提物或灵芝多糖是一种免疫调节剂, 能刺激免疫效应细胞, 包括 T 淋巴细胞 B 淋巴细胞 巨噬细胞和自然杀伤 (NK) 细胞, 抵御肿瘤细胞 4,82,84, 例如, 灵芝水提物或多糖能抑制荷瘤小鼠中诸如 肝癌 恶性毒瘤 180 网状细胞肉瘤 L-II 成纤维细胞瘤和刘易斯肺癌等肿瘤细胞生长 4, 然而, 无论是将灵芝水提物还是多糖直接加入 S-180 HL-60 或其它肿瘤细胞的培养液中, 均不显抑制细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的活性 , 表明灵芝水提物或多糖的抗癌机制除直接细胞毒外还有其它机制 126 分析结果表明, 用灵芝水提物或多糖处理过的试验动物血清内的细胞因子如 TNF-α ( 肿瘤坏死因子 ) 和 IFN-γ ( 干扰素 ) 的水平高于未经处理的试验动物血清中细胞因子的水平 122,125, 表明灵芝水提物或多糖能刺激体内免疫系统中细胞因子如 TNF-α 和 IFN-γ 的生成, 这对于抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡至关重要 灵芝水提物或多糖对刺激 T 淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子的进一步研究结果表明, 经灵芝水提物或多糖处理过的试验动物血清能显著抑制体外 HL-60 细胞的增殖并诱导其凋亡, 上清液中 TNF-α 或 IFN-γ 水平与抗肿瘤效果之间为正相关关系 122,125 该结果清楚表明, 所有这些细胞因子都可能与灵芝水提物或多糖体的抗肿瘤作用有关 将灵芝水提物或多糖加入巨噬细胞或 T 淋巴细胞的体外培养液中可显著增加 TNF-α 和 IFN-γ 的 mrna 的表达并呈量效关系 122,125 通过强迫灌胃方式喂食灵芝水提物,TNF-α 和 IFN-γ 的 mrna 表达也显著增加 123,124 这些结果表明, 灵芝水提物或多糖能诱导 TNF-α 和 IFN-γ 在体内和体外的 mrna 表达 127 进一步的研究显示, 灵芝多糖能促进体外培养的小鼠骨髓树突状细胞的成熟和作用的发挥 灵芝多糖能提高具有细胞毒的 T 淋巴细胞的细胞毒性, 这是由带有 P815 肿瘤抗原的树突状细胞在主要通过 IFNγ 和颗粒溶酶 B 路径的抗原呈递过程中被诱生 83,128 9

10 灵芝的进一步抗肿瘤机制包括可抑制高侵 袭乳腺癌 MDA-MB-231 细胞和前列腺癌 PC 3 细 胞的转移 因为抑制细胞迁移与抑制乳腺癌和前 列腺癌细胞中具有自发活性的核因子 κb (NF-κB) 的信号传导途径有直接关联 Sliva 等 Jiang 等和 Stanley 等进一步测定了不同灵芝 样品是如何抑制具有自发活性的 NF-κB 的 某些 灵芝样品对癌细胞转移有强的抑制作用, 抑制程 度等同于对具有自发活性的 NF-κB 的抑制 结果 也显示, 灵芝能抑制 MDA-MB -231 细胞和 PC-3 细胞中具有自发活性的转录因子 AP-1 和 NF-κB 对此特别有趣的是因为最近的研究发现,AP-1 和 NF-κB 因子是癌症治疗的潜在靶点 研究 已经表明, 尿激酶型纤溶酶原激活剂 (upa) 和 upa 受体 (upar) 在癌症转移中起重要作用 10 upa 通过其蛋白水解活性激活转化生长因子 β1(tgf-β1) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 能直接 刺激细胞转移 因此, 灵芝通过抑制 upa 和 upa 受体 (upar) 的表达和 upa 的分泌, 从而抑制 MDA-MB-231 和 PC-3 细胞的转移 10 灵芝的免疫调节作用主要包括免疫效应细 胞如 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞 巨噬细胞和自然 杀伤细胞的有丝分裂与激活, 诱导细胞因子如 TNF-α 和 IFNs 的产生 其它作用, 如对肥大细胞 B 淋巴细胞和补体系统的激活或抑制也已经有 报道 Gao 等认为, 灵芝的主要免疫调节物 质包括多糖 ( 特别是 β-d- 葡聚糖 ) 蛋白质 ( 如 LZ-8) 和各种三萜 我们即将发表的研究结果也显示, 赤芝孢子和紫芝孢子中富含三萜的脂质具有显 著的双向免疫调节的活性 然而, 通常认为灵芝 三萜不能调节免疫系统 因此, 灵芝三萜是否具 有免疫调节活性尚无定论, 需做进一步的研究加 以确证 5.2 直接细胞毒 最新研究显示, 灵芝醇提物或三萜类化合物 在体外对肿瘤细胞具有直接的细胞毒, 这不同于 灵芝水提物或多糖的作用机制 18,55-57,133 例如, 从松杉灵芝子实体中得到的两种羊毛甾烷糖苷 对人肝细胞 (Hep 3B) 具有细胞毒, 使亚 G1 期细 胞显著增加和 G2/M 期 Hep 3B 细胞的细胞周期进 程受阻, 表明这两种糖苷能诱导细胞凋亡或细胞 周期进程受阻 73 从灵芝子实体和灵芝孢子中分 离出的几个高度氧化的羊毛甾烷型三萜在体外 对肿瘤细胞株 Meth-A, LLC 和 Hepalcic 7 具有直 接的细胞毒 55,134 从干的灵芝子实体分离出的三 萜类化合物如赤芝酸 N 赤芝酸 A 和灵芝酸 E 对 Hep G2 和 P-388 肿瘤细胞具有明显的细胞毒, 而 赤芝酸 C methyl lucidenate F 和 lucidenolactone 仅有中等细胞毒性 56 研究发现了一种灵芝三萜 能诱导人肝癌 Hep3B 的凋亡和细胞周期进程受 阻 49, Zhu 等报道了两种能强烈抑制人宫颈 癌传代细胞 HeLa 生长的灵芝孢子醇提物 (I 和 III) 而且, 采用硅胶色谱法从醇提物 I 获得的醇 提物 III 能阻断细胞周期从 G1 期向 S 期的转换, 诱 导细胞内钙离子浓度显著减少, 这意味着有效的 萃取物可通过改变钙输运系统而对细胞周期和 细胞信号转导产生影响 研究还表明, 灵芝醇提 物能抑制肿瘤细胞增殖并具有量效和时效关系, 它是通过上调 p21/waf1 和下调细胞周期蛋白 D1 的形式实现的 此外, 灵芝能直接诱导 MCF-7 细胞的凋亡, 它可能是通过上调促凋亡蛋白 Bax 而不是通过免疫系统实现的 135 从灵芝子实体中分离出三种新的羊毛甾烷 型三萜醛类化合物, 并被分别命名为 Lucialdehyde A B 和 C 其中 Lucialdehyde B 和 C 对肿瘤细胞系如 Lewis 肺癌 (LLC) T-47D 恶性 毒瘤 180 和 Meth-A 具有细胞毒, 而 Lucialdehyde C 对受试的肿瘤细胞系的细胞毒最强 57 从灵芝 菌丝体中萃取的富含三萜的组分 WEES-G6 能抑 制人肝癌细胞 Huh-7 的生长 将受试的肿瘤细胞 10

11 系用 WEES-G6 进行处理能使调节细胞生长的蛋白质 PKC 的活性快速降低, 并将 JNK 和 p38 MAP 激酶激活, 其结果是使 G2 期细胞周期延长及明显抑制肝癌细胞的生长 其它机制异常增殖是癌症易感性增加的一个显著特征, 而癌症预防通常与抑制 逆转或延迟细胞过度增殖有关 虽然灵芝水提物或多糖对肿瘤细胞无毒, 但其它成分如三萜已被证明能抑制培养的多种肿瘤细胞系的增殖 18,55-57 此外, 酪氨酸激酶可促进 Balb/3T3 细胞增殖, 而灵芝多糖能抑制其活性 46 由于异常细胞信号与癌症发生 生长和发展阶段紧密相连, 故与细胞信号转导有关的蛋白质自然成为预防和治疗癌症的靶点 细胞信号分子的调制可能是灵芝的一种抗癌及抗肿瘤活性的机制 灵芝多糖抑制 Balb/3T3 细胞中酪氨酸激酶的活性, 导致肿瘤细胞增殖的减少 46 灵芝中分离出的灵芝酸 A 和 methyl ganoderate A 能竞争性抑制法呢基蛋白转移酶 (FPT), 其对应的 IC50 值为 100 和 38 μm 136 两种化合物均为法呢基焦磷酸酶的竞争性抑制剂, 灵芝酸 A 和 methyl ganoderate A 的 K i 值分别为 54 和 20 μm FPT 能促使 Ras 肿瘤蛋白羧基末端四肽的半胱氨酸残基在遗传转译后的法尼基化, 它对于 Ras 膜结合和细胞转换活性不可缺少 FPT 抑制剂被证明能抑制依赖 Ras 的细胞转换, 故它提供了一种治疗人类癌症的潜在策略 137 已有的报道显示, 灵芝多糖 (GP) 能诱导白血病细胞分化 30,72 经 GP 刺激的人血单核细胞培养液能显著抑制 U937 细胞的生长并诱导其分化成具有噬菌作用并产生细胞质超氧化物的成熟单核细胞 / 巨噬细胞 70 同样, 用 GP 刺激过的人单核细胞培养液处理 HL-60 和 U937 白血病细胞, 能使细胞分化为成熟的单核细胞, 并有 40-45% 的白血病细胞能表达 CD14 和 CD68 表面抗原 72 另外, 灵芝提取物能诱导 PC12 细胞的神经元分化, 阻止依赖于神经生长因子的 PC12 神经细胞的凋亡 80 进一步的研究表明, 灵芝的这些作用可能是通过 Ras/ 细胞外信号调节激酶 (Erk) 和 camp ( 环磷酸腺苷 ) 反应元件结合 (CREB) 蛋白信号路径进行调节的, 并已从 Erk1 Erk2 和 CREB 的磷酸化作用得到验证 这些结果表明, 存在具有调节 PC12 细胞包括细胞信号分子 Erk 和 CREB 的神经元分化和神经保护的神经活性化合物 抗血管生成可能是灵芝抗肿瘤机制之一 一些研究显示, 灵芝活性成分特别是三萜类化合物可能是通过调节 MAPK 和 Akt 信号达到抑制由 Matrigel 体内模型诱导的血管生成 131,38, 展望富含三萜的灵芝和灵芝孢子产品在治疗各种疾病时所表现出的独特活性且无毒副作用, 使其具备成为一种用于免疫调节和癌症治疗的安全药物的可能 但尚需开展进一步工作筛选或确证哪种灵芝或哪种成分 / 成分群具有抗肿瘤和 / 或免疫调节的活性 另一领域的研究是将富含三萜的制剂与具有纳米或非纳米结构的给药载体的靶向给药系统相结合, 使富含三萜的制剂能按设想传递到各种肿瘤细胞中 幸运的是, 我们已研发出有效的技术和独特的装备生产富含三萜的灵芝孢子原料 几乎完全萌动激活的灵芝孢子 完全破壁且无重金属污染的灵芝孢子和从全破壁灵芝孢子中完全萃取富含三萜的灵芝孢子脂质 而且, 采用具有较高分离和检测能力的传统和现代色谱 质谱和电泳技术, 对灵芝及其孢子中各种主要成分和次要成分 ( 包括灵芝及其孢子中的 活性 和 非活性 成分 ) 进行提纯 分离 定性和定量 药理学数据显示, 11

12 灵芝或灵芝孢子中的生物活性物质, 特别是三萜类化合物和多糖是通过多种机制而使其呈现显著的抗肿瘤活性的 大多数灵芝抗肿瘤临床试验的证据表明, 由于现有制剂的低吸收率, 故需高剂量和频繁地服药 灵芝和 / 或灵芝孢子, 特别是高纯度三萜非常稀少且昂贵, 因此, 低吸收率 高剂量和昂贵的治疗成本降低了灵芝制剂的治疗效果并阻碍了其推广 该问题的解决可能依靠于现代制剂学最重要的进展之一 靶向给药系统 不同的靶向给药系统对应不同的给药载体 给药载体通常包括脂质体 毫微粒 微球体 微乳液 药质体和分泌颗粒类似物 140,141 最新的研究显示, 新型载体特别是大小为 nm 的脂质体能选择性将药物输送到靶器官, 因而它在癌症治疗上具有很多优势, 如提高药物的利用率 低剂量和很低的药物副作用 值得指出的是, Guo 142 构建了一个大小为 30 nm 可操控的 DNA 组装马达, 它由六个合成的捆绑三磷酸腺苷 (ATP) 的 RNA 单体驱动 基于这种马达的特性, 如马达复合体及其部件形成规则的结构排列 马 达功能的保持及通过 RNA 二聚物 三聚物和六聚物的操作很容易得到所需的形状和大小 142, 这种包含 RNA 的马达有望成为一种新型的很有前景的给药载体 中国中山大学与美国普渡大学之间签署的一项合作计划是研制一种用于癌症治疗的灵芝三萜新型纳米脂质体注射剂, 它可将纳米尺度的药物输送到指定的靶器官, 并因微小的药物能穿过浸润性的肿瘤脉管系统而进入肿瘤组织, 最终被细胞吸收并选择性诱导肿瘤细胞凋亡 致谢 : 日本奈良机械制造株式会社协助拍摄了扫描电子显微照片, 谨此致谢 我们感谢美国普渡大学郭培宣教授的鼓励及对本文初稿提出的富有建设性的意见 我们也感谢五位匿名评审专家提出的富有洞察力的意见, 这些意见帮助我们将原稿修改得更清晰 参考文献与注释略, 见原文 12