附 件 1: 抗 氧 化 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 脂 質 氧 化 產 物 : 丙 二 醛 或

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1 關 於 印 發 抗 氧 化 功 能 評 價 方 法 等 9 個 保 健 功 能 評 價 方 法 的 通 知 國 食 藥 監 保 化 [2012]107 號 2012 年 04 月 23 日 發 佈 各 省 自 治 區 直 轄 市 食 品 藥 品 監 督 管 理 局 ( 藥 品 監 督 管 理 局 ), 有 關 單 位 : 為 貫 徹 落 實 食 品 安 全 法 及 其 實 施 條 例 對 保 健 食 品 實 行 嚴 格 監 管 的 要 求, 加 強 保 健 食 品 准 入 管 理, 切 實 提 高 准 入 門 檻, 國 家 食 品 藥 品 監 督 管 理 局 組 織 修 訂 了 抗 氧 化 等 9 個 功 能 的 評 價 方 法, 已 經 保 健 食 品 安 全 專 家 委 員 會 審 議 通 過, 現 予 印 發 自 2012 年 5 月 1 日 起, 對 受 理 的 申 報 註 冊 保 健 食 品 的 相 關 產 品 檢 驗 申 請, 保 健 食 品 註 冊 檢 驗 機 構 應 當 按 照 新 發 佈 的 9 個 功 能 評 價 方 法 開 展 產 品 功 能 評 價 試 驗 等 各 項 工 作 附 件 :1. 抗 氧 化 功 能 評 價 方 法 2. 對 胃 粘 膜 損 傷 有 輔 助 保 護 功 能 評 價 方 法 3. 輔 助 降 血 糖 功 能 評 價 方 法 4. 緩 解 視 疲 勞 功 能 評 價 方 法 5. 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 評 價 方 法 6. 輔 助 降 血 脂 功 能 評 價 方 法 7. 促 進 排 鉛 功 能 評 價 方 法 8. 減 肥 功 能 評 價 方 法 9. 清 咽 功 能 評 價 方 法 國 家 食 品 藥 品 監 督 管 理 局 二 一 二 年 四 月 二 十 三 日 1

2 附 件 1: 抗 氧 化 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 脂 質 氧 化 產 物 : 丙 二 醛 或 血 清 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 蛋 白 質 氧 化 產 物 : 蛋 白 質 羰 基 抗 氧 化 酶 : 超 氧 化 物 歧 化 酶 或 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 抗 氧 化 物 質 : 還 原 性 谷 胱 甘 肽 1.2 人 體 試 食 試 驗 脂 質 氧 化 產 物 : 丙 二 醛 或 血 清 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 超 氧 化 物 歧 化 酶 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 的 指 標 均 為 必 測 專 案 2.2 脂 質 氧 化 產 物 指 標 中 丙 二 醛 和 血 清 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 任 選 其 一 進 行 指 標 測 定, 動 物 實 驗 抗 氧 化 酶 指 標 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 和 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 任 選 其 一 進 行 指 標 測 定 2.3 氧 化 損 傷 模 型 動 物 和 老 齡 動 物 任 選 其 一 進 行 生 化 指 標 測 定 2.4 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 脂 質 氧 化 產 物 蛋 白 質 氧 化 產 物 抗 氧 化 酶 抗 氧 化 物 質 四 項 指 標 中 三 項 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 抗 氧 化 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 脂 質 氧 化 產 物 超 氧 化 物 歧 化 酶 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 三 項 指 標 中 二 項 陽 性, 且 對 機 體 健 康 無 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 抗 氧 化 功 能 的 作 用 2

3 抗 氧 化 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Antioxidative Function 1 動 物 實 驗 1.1 實 驗 動 物 選 用 10 月 齡 以 上 老 齡 大 鼠 或 8 月 齡 以 上 老 齡 小 鼠, 也 可 用 氧 化 損 傷 模 型 鼠 單 一 性 別, 小 鼠 每 組 只, 大 鼠 8-12 只 1.2 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 和 一 個 溶 劑 對 照 組, 以 人 體 推 薦 量 的 10 倍 ( 小 鼠 ) 或 5 倍 ( 大 鼠 ) 為 其 中 的 一 個 劑 量 組, 另 設 兩 個 劑 量 組, 高 劑 量 一 般 不 超 過 30 倍, 必 要 時 設 陽 性 對 照 組 空 白 對 照 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 1.3 實 驗 方 法 老 齡 動 物 選 用 10 月 齡 以 上 大 鼠 或 8 月 齡 以 上 小 鼠, 按 血 中 MDA 水 準 分 組, 隨 機 分 為 1 個 溶 劑 對 照 組 和 3 個 受 試 樣 品 劑 量 組 3 個 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 實 驗 結 束 時 處 死 動 物 測 脂 質 氧 化 產 物 含 量 蛋 白 質 羰 基 含 量 還 原 性 谷 胱 甘 肽 含 量 抗 氧 化 酶 活 力 D- 半 乳 糖 氧 化 損 傷 模 型 原 理 D- 半 乳 糖 供 給 過 量, 超 常 產 生 活 性 氧, 打 破 了 受 控 於 遺 傳 模 式 的 活 性 氧 產 生 與 消 除 的 平 衡 狀 態, 引 起 過 氧 化 效 應 造 模 方 法 選 25-30g 健 康 成 年 小 鼠, 除 空 白 對 照 組 外, 其 餘 動 物 用 D- 半 乳 糖 40mg-1.2g/kg BW 頸 背 部 皮 下 注 射 或 腹 腔 注 射 造 模, 注 射 量 為 0.1mL/10g, 每 日 1 次, 連 續 造 模 6 周, 取 血 測 MDA, 按 MDA 水 準 分 組 隨 機 分 為 1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 受 試 樣 品 劑 量 組,3 個 劑 量 組 經 口 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 在 給 受 試 樣 品 的 同 時, 模 型 對 照 組 和 各 劑 量 組 繼 續 給 予 相 同 劑 量 D- 半 乳 糖 頸 背 部 皮 下 或 腹 腔 注 射, 實 驗 結 束 處 死 動 物 測 脂 質 氧 化 產 物 含 量 蛋 白 質 羰 基 含 量 還 原 性 谷 胱 甘 肽 含 量 抗 氧 化 酶 活 力 乙 醇 氧 化 損 傷 模 型 原 理 3

4 乙 醇 大 量 攝 入, 啟 動 氧 分 子 產 生 自 由 基, 導 致 組 織 細 胞 過 氧 化 效 應 及 體 內 還 原 性 谷 胱 甘 肽 的 耗 竭 造 模 方 法 選 25-30g 健 康 成 年 小 鼠 ( g 大 鼠 ), 隨 機 分 為 4 個 組,1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 受 試 樣 品 劑 量 組, 必 要 時 可 增 設 1 個 空 白 對 照 組 3 個 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 連 續 灌 胃 30 天, 末 次 灌 胃 後, 模 型 組 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 禁 食 16 小 時 ( 過 夜 ), 然 後 1 次 性 灌 胃 給 予 50% 乙 醇 12ml/kgBW,6 小 時 後 取 材 ( 空 白 對 照 組 不 作 處 理, 不 禁 食 取 材 ), 測 血 清 或 肝 組 織 脂 質 氧 化 產 物 含 量 蛋 白 質 羰 基 含 量 還 原 性 谷 胱 甘 肽 含 量 抗 氧 化 酶 活 力 脂 質 氧 化 產 物 測 定 血 中 過 氧 化 脂 質 降 解 產 物 丙 二 醛 (MDA) 含 量 測 定 血 中 過 氧 化 脂 質 降 解 產 物 丙 二 醛 (MDA) 含 量 可 採 用 螢 光 法 和 比 色 法 測 定, 方 法 任 選 其 一 螢 光 法 螢 光 法 原 理 MDA(malondiadehycle) 是 細 胞 膜 脂 質 過 氧 化 的 終 產 物 之 一, 測 其 含 量 可 間 接 估 計 脂 質 過 氧 化 的 程 度 1 個 丙 二 醛 (MDA) 分 子 與 2 個 硫 代 巴 比 妥 酸 (TBA) 分 子 在 酸 性 條 件 下 共 熱, 形 成 粉 紅 色 複 合 物 以 波 長 536nm 為 激 發 光, 在 550nm 有 最 強 螢 光 強 度 可 用 螢 光 法 進 行 微 量 測 定 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 螢 光 分 光 光 度 計 微 量 加 樣 器 恒 溫 水 浴 鍋 普 通 離 心 機 混 旋 器 具 塞 離 心 管 試 劑 : 10mmol/L 四 乙 氧 基 丙 烷 ( 貯 備 液, 棕 色 瓶 4 保 存 12 個 月 ), 臨 用 前 用 純 水 稀 釋 成 1nmol/mL 29mmol/L 硫 代 巴 比 妥 酸 工 作 液 硫 代 巴 比 妥 酸 0.209g EDTA.2H20 25mg 谷 胱 甘 肽 ( 還 原 型 ) 1mg 用 0.02mol/L NaOH 50 ml 溶 解 ( 微 溫 助 溶, 棕 色 瓶 4 保 存 2 周 ) 酸 水 解 液 0.1mol/L H2SO4 125mL 0.1mol/L Na2SO4 125mL 加 水 150mL 用 H2SO4 調 ph 1.5, 加 水 稀 釋 至 500mL 正 丁 醇 以 上 所 用 玻 璃 器 皿 均 需 經 50% 硝 酸 浸 泡 24h 後, 再 經 蒸 餾 水 雙 蒸 水 淋 洗 乾 燥, 試 劑 4

5 ( 選 AR 級 ) 最 好 用 雙 蒸 水 配 製 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 全 血 上 清 液 : 取 血 50μl 加 入 0.5mL 生 理 鹽 水,2000r/min 離 心 10min, 取 上 清 液 待 測 血 清 樣 品 : 取 血 0.5mL 室 溫 靜 置 10min,2000r/min 離 心 10min, 取 上 清 液 待 測 標 準 曲 線 製 作 將 10nmol/mL 四 乙 氧 基 丙 烷, 用 雙 蒸 水 稀 釋 成 nmol/mL 分 別 取 0.1mL 加 入 酸 水 解 液 2mL TBA 工 作 液 0.5mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min 流 水 冷 卻 至 室 溫 3mL 正 丁 醇 振 盪 抽 提 1min 3000r/min 離 心 5min 取 上 清 液 ( 正 丁 醇 層 ) 測 螢 光 強 度 ( 入 射 狹 縫 1.5nm, 出 射 狹 縫 5nm, 激 發 波 長 536nm, 發 射 波 長 550nm) 以 四 乙 氧 基 丙 烷 濃 度 為 橫 坐 標, 螢 光 強 度 為 縱 坐 標 作 圖 樣 品 測 定 試 劑 空 白 管 樣 本 管 標 準 管 10mL 具 塞 離 心 管 0.1mL 蒸 餾 水 0.1mL 血 清 * 0.1mL 標 準 # 酸 水 解 液 2mL 2mL 2mL TBA 工 作 液 0.5mL 0.5mL 0.5mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min, 流 水 冷 卻 正 丁 醇 3mL 3mL 3mL 振 盪 抽 提 1min,3000r/min 離 心 5min * 全 血 上 清 液 0.5mL( 空 白 管 加 蒸 餾 水 0.5mL, 標 準 管 加 標 準 0.1mL 蒸 餾 水 0.4mL) #1nmol/mL 四 乙 氧 基 丙 烷 ( 標 準 ) 血 清 0.1mL( 或 全 血 上 清 液 0.5mL) 加 入 酸 水 解 液 2mL TBA 工 作 液 0.5mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min 流 水 冷 卻 至 室 溫 3mL 正 丁 醇 振 盪 抽 提 1min 3000r/min 離 心 5min 取 上 清 液 ( 正 丁 醇 層 ) 測 螢 光 強 度 ( 入 射 狹 縫 1.5nm, 出 射 狹 縫 5nm, 激 發 波 長 536nm, 發 射 波 長 550nm) 計 算 公 式 : B-A B-A 過 氧 化 脂 質 含 量 (nmol/ml 血 清 )= C K = 1 1 F-A F-A B-A B-A 1 過 氧 化 脂 質 含 量 (nmol/ml 血 液 )= C K = 1 F-A F-A 0.05 A: 空 白 管 螢 光 度 B: 樣 品 螢 光 度 F: 四 乙 氧 基 丙 烷 螢 光 度 C: 四 乙 氧 基 丙 烷 濃 度 (1nmol/mL) K: 稀 釋 倍 數 5

6 比 色 法 比 色 法 原 理 MDA(malondiadehycle) 是 細 胞 膜 脂 質 過 氧 化 的 終 產 物 之 一, 測 其 含 量 可 間 接 估 計 脂 質 過 氧 化 的 程 度 1 個 丙 二 醛 (MDA) 分 子 與 2 個 硫 代 巴 比 妥 酸 (TBA) 分 子 在 酸 性 條 件 下 共 熱, 形 成 粉 紅 色 複 合 物 該 物 質 在 波 長 532nm 有 極 大 吸 收 峰 可 用 分 光 光 法 進 行 測 定 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 微 量 加 樣 器 恒 溫 水 浴 鍋 普 通 離 心 機 混 旋 器 具 塞 離 心 管 試 劑 :0.2M 乙 酸 鹽 緩 衝 液 ph M 乙 酸 溶 液 185mL 0.2M 乙 酸 鈉 溶 液 15mL 1mmol/L 四 乙 氧 基 丙 烷 ( 貯 備 液,4 保 存 3 個 月 ), 臨 用 前 用 水 稀 釋 成 40nmol/mL 8.1% 十 二 烷 基 硫 酸 鈉 SDS 0.8% 硫 代 巴 比 妥 酸 TBA 0.2M 磷 酸 鹽 緩 衝 液 ph M 磷 酸 氫 二 鈉 1920mL 0.2M 磷 酸 二 氫 鉀 480mL 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 溶 血 液 樣 品 : 取 血 20μL 加 入 0.98mL 蒸 餾 水 製 成 2% 溶 血 液 樣 品 測 定 試 劑 空 白 管 樣 品 管 標 準 管 2% 溶 血 液 * 0.2mL 40nmol/mL 四 乙 氧 基 丙 烷 0.2mL 8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2M 乙 酸 鹽 緩 衝 液 1.5mL 1.5mL 1.5mL 0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mL H2O 0.8mL 0.6mL 0.6mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min, 流 水 冷 卻, 於 532nm 比 色 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 * 若 用 血 清, 樣 品 管 0.15mL, 標 準 管 0.15mL 計 算 B A B A 過 氧 化 脂 質 含 量 (nmol/ml2% 溶 血 液 )= C K = 40 1 F A F A B A B A 過 氧 化 脂 質 含 量 (nmol/ml 血 清 )= C K = 40 1 F A F A 6

7 A: 空 白 管 吸 光 度 B: 樣 品 吸 光 度 F: 四 乙 氧 基 丙 烷 吸 光 度 C: 四 乙 氧 基 丙 烷 濃 度 (40nmol/mL) K: 稀 釋 倍 數 組 織 中 過 氧 化 脂 質 降 解 產 物 丙 二 醛 (MDA) 含 量 測 定 原 理 見 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 微 量 加 樣 器 恒 溫 水 浴 鍋 普 通 離 心 機 混 旋 器 具 塞 離 心 管 組 織 勻 漿 器 試 劑 : 見 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 組 織 勻 漿 樣 品 : 取 一 定 量 的 所 需 臟 器, 生 理 鹽 水 沖 洗 拭 幹 稱 重 剪 碎, 置 勻 漿 器 中, 加 入 0.2M 磷 酸 鹽 緩 衝 液, 以 20000r/min 勻 漿 10s, 間 歇 30s, 反 復 進 行 3 次, 製 成 10% 組 織 勻 漿 (W/V), 3000r/min 離 心 5-10min, 取 上 清 液 待 測 樣 品 測 定 試 劑 空 白 管 樣 品 管 標 準 管 10% 組 織 勻 漿 0.2mL 40nmol/mL 四 乙 氧 基 丙 烷 0.2mL 8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2M 乙 酸 鹽 緩 衝 液 1.5mL 1.5mL 1.5mL 0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mL H2O 0.8mL 0.7mL 0.7mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min, 流 水 冷 卻, 於 532nm 比 色 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 計 算 B - A B- A 1 過 氧 化 脂 質 含 量 = C K = 40 (nmol/mg 組 織 ) F - A F - A % 1000 A: 空 白 管 吸 光 度 B: 樣 品 管 吸 光 度 F: 四 乙 氧 基 丙 烷 吸 光 度 C: 四 乙 氧 基 丙 烷 濃 度 (40nmol/mL) K: 稀 釋 倍 數 血 清 中 8- 表 氫 氧 - 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 測 定 原 理 7

8 8- 表 氫 氧 - 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 是 體 內 脂 質 氧 化 應 激 反 應 穩 定 而 具 有 特 異 性 的 標 誌 物, 其 含 量 能 間 接 反 應 因 機 體 內 自 由 基 的 產 生 而 導 致 組 織 細 胞 的 脂 質 過 氧 化 程 度 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 酶 標 儀 生 化 培 養 箱 微 量 振 盪 器 微 量 加 樣 器 洗 板 機 試 劑 :8-Isoprostane KIA Kit ( 酶 聯 免 疫 試 劑 盒 ) 8-Isoprostane EIA 抗 體 血 清 8-Isoprostane AChE 示 蹤 物 8-Isoprostane EIA 標 準 品 EIA 緩 衝 液 洗 滌 緩 衝 液 吐 溫 20 鼠 抗 - 兔 IgG 抗 體 EIA 示 蹤 染 色 劑 EIA 抗 體 血 清 染 色 劑 Ellman s 試 劑 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 小 鼠 眼 內 眥 靜 脈 叢 取 血,3000r/min 離 心 10min 取 上 清 液, 用 EIA 緩 衝 液 稀 釋 15 倍 備 用 樣 品 測 定 按 試 劑 盒 說 明 操 作 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 標 準 孔 濃 度 分 別 為 :500 pg/ml 200 pg/ml 80 pg/ml 32 pg/ml 12.8 pg/ml 5.1 pg/ml 2.0 pg/ml 0.8pg/mL 步 驟 試 劑 空 白 TA NSB B0 標 準 / 樣 品 1. 加 試 劑 EIA 緩 衝 液 μL 50μL - 標 準 / 樣 品 μL AChE 示 蹤 物 μL 50μL 50μL 抗 體 血 清 μL 50μL 2. 培 養 用 封 板 膜 蓋 好 酶 標 板, 並 在 4 避 光 條 件 下 培 養 18 小 時 3. 清 洗 清 洗 所 有 反 應 孔 五 次 4. 加 試 劑 AChE 示 蹤 物 - 5μL Ellman s 200μL 200μL 200μL 200μL 200μL 5. 培 養 用 封 板 膜 蓋 好 酶 標 板, 並 在 常 溫 避 光 條 件 下 培 養 分 鐘 6. 讀 數 在 波 長 412nm 處 測 量 各 孔 吸 光 度 (B0 在 A.U 範 圍 ) 標 準 或 樣 品 孔 吸 光 度 NSB 孔 吸 光 度 %B/B0= 100 B0 孔 吸 光 度 NSB 孔 吸 光 度 以 標 準 物 的 濃 度 的 對 數 (log) 為 橫 坐 標,%B/B0 為 縱 坐 標 繪 製 標 準 曲 線, 亦 可 將 資 料 轉 換 成 logit(b/b0) 或 ln[b/b0/(1-b/b0)] 做 為 縱 坐 標 繪 製 標 準 曲 線, 計 算 回 歸 方 程 將 樣 品 的 %B/B0 值, 代 入 方 程 式, 計 算 出 樣 品 的 濃 度, 再 乘 以 稀 釋 倍 數, 即 為 樣 品 中 的 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 濃 度 蛋 白 質 氧 化 產 物 測 定 H2O2 或 O2 ˉ 自 由 基 對 蛋 白 質 氨 基 酸 側 鏈 的 氧 化 可 導 致 羰 基 產 物 的 積 累 羥 自 由 基 也 可 直 接 作 用 於 肽 鏈, 使 肽 鏈 斷 裂, 引 起 蛋 白 質 一 級 結 構 的 破 壞, 在 斷 裂 處 產 生 羰 基 羰 基 化 蛋 8

9 白 極 易 相 互 交 聯 聚 集 為 大 分 子 從 而 降 低 或 失 去 原 有 蛋 白 質 的 功 能, 蛋 白 質 羰 基 含 量 可 直 接 反 映 蛋 白 質 損 傷 的 程 度 蛋 白 質 羰 基 形 成 是 多 種 氨 基 酸 在 蛋 白 質 的 氧 化 修 飾 過 程 中 的 早 期 標 誌, 它 隨 著 年 齡 的 增 長 而 增 加 血 清 中 蛋 白 質 羰 基 測 定 原 理 被 氧 化 後 的 蛋 白 質 羰 基 含 量 增 多, 羰 基 可 與 2,4- 二 硝 基 苯 肼 反 應 生 成 2,4- 二 硝 基 苯 腙,2,4. 二 硝 基 苯 腙 為 紅 棕 色 的 沉 澱, 將 沉 澱 用 鹽 酸 胍 溶 解 後 即 可 在 分 光 光 度 計 上 讀 取 370 nm 下 的 吸 光 度 值, 從 而 測 定 蛋 白 質 的 羰 基 含 量 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 紫 外 分 光 光 度 計 酶 標 儀 微 量 加 樣 器 生 化 培 養 箱 恒 溫 水 浴 鍋 低 溫 高 速 離 心 機 混 旋 器 2ml 離 心 管 試 劑 :10 mmol/l 2,4- 二 硝 基 苯 肼 (DNPH) 99 毫 克 2,4- 二 硝 基 苯 肼 用 50ml 2 mol/l HCL 溶 解,4 避 光 保 存 2 mol/l HCL 200 g/l 三 氯 乙 酸 (TCA) 6 mol/l 鹽 酸 胍 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 將 無 水 乙 醇 和 乙 酸 乙 酯 按 照 體 積 比 1:1 的 比 例 配 置 成 混 合 溶 液, 現 用 現 配 操 作 步 驟 試 劑 測 定 管 對 照 管 血 清 ( 血 漿 ) 0.1ml 0.1ml 10 mmol/l 2,4- 二 硝 基 苯 肼 0.4ml 2 mol/l HCL 0.4ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘,37 準 確 避 光 反 應 30 分 鐘 200 g/l 三 氯 乙 酸 0.5ml 0.5ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 6 mol/l 鹽 酸 胍 1.25ml 1.25ml 混 勻 後,37 準 確 水 浴 15 分 鐘 渦 旋 混 勻, 將 全 部 沉 澱 溶 解, 以 12000r/min 離 心 15min, 取 上 清 液 在 370nm 處 比 色,6 mol/l 鹽 酸 胍 試 劑 調 零, 測 定 OD 值 用 雙 縮 脲 法 測 定 血 清 ( 或 血 漿 ) 蛋 白 質 含 量 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 9

10 計 算 公 式 測 定 管 OD- 對 照 管 OD 蛋 白 質 羰 基 含 量 = (nmol/mgprot) 22 比 色 光 徑 (cm) 樣 本 蛋 白 濃 度 (mg/l) 組 織 中 蛋 白 質 羰 基 測 定 原 理 見 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 紫 外 分 光 光 度 計 酶 標 儀 微 量 加 樣 器 生 化 培 養 箱 恒 溫 水 浴 鍋 天 平 勻 漿 器 低 溫 高 速 離 心 機 混 旋 器 2ml 離 心 管 試 劑 : 10 mmol/l HEPES 緩 衝 液 ph 克 N-2- 羥 乙 基 呱 嗪 -2 - 乙 磺 酸 (HEPES) 溶 入 1000ml 雙 蒸 餾 水, 用 ln NaOH 調 ph 至 7.4,4 保 存 100 g/l 硫 酸 鏈 黴 素 1g 硫 酸 鏈 黴 素, 溶 入 10ml 雙 蒸 餾 水,4 避 光 保 存 10 mmol/l 2,4- 二 硝 基 苯 肼 (DNPH) 99 毫 克 2,4- 二 硝 基 苯 肼 用 50ml 2 mol/l HCL 溶 解,4 避 光 保 存 2 mol/l HCL 200 g/l 三 氯 乙 酸 (TCA) 6 mol/l 鹽 酸 胍 實 驗 步 驟 樣 品 處 理 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 將 無 水 乙 醇 和 乙 酸 乙 酯 按 照 體 積 比 1:1 的 比 例 配 置 成 混 合 溶 液, 現 用 現 配 取 0.1g 組 織, 在 冰 的 生 理 鹽 水 中 漂 洗, 以 去 掉 表 面 的 血 跡 加 人 0.9ml 的 冰 的 10 mmol/l HEPES 緩 衝 液 (ph7.4), 製 成 10% 的 勻 漿 將 勻 漿 液 以 3000r/min 的 轉 速, 離 心 10 min, 保 留 上 清 取 100g/L 的 硫 酸 鏈 黴 素 溶 液 50µl, 加 入 上 清 液 450µl(v/v,1:9), 室 溫 放 置 10 min 後, 以 11000r/min 的 轉 速, 離 心 10 min, 取 上 清 液 待 測 操 作 步 驟 試 劑 測 定 管 對 照 管 組 織 勻 漿 上 清 液 0.1ml 0.1ml 10 mmol/l 2,4- 二 硝 基 苯 肼 0.4ml 2 mol/l HCL 0.4ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘,37 準 確 避 光 反 應 30 分 鐘 200 g/l 三 氯 乙 酸 0.5ml 0.5ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 10

11 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 6 mol/l 鹽 酸 胍 1.25ml 1.25ml 混 勻 後,37 準 確 水 浴 15 分 鐘 渦 旋 混 勻, 將 全 部 沉 澱 溶 解, 以 12000r/min 離 心 15min, 取 上 清 液 在 370nm 處 比 色,6 mol/l 鹽 酸 胍 試 劑 調 零, 測 定 OD 值 用 雙 縮 脲 法 測 定 勻 漿 上 清 液 蛋 白 質 含 量 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 計 算 公 式 測 定 管 OD- 對 照 管 OD 蛋 白 質 羰 基 含 量 = (nmol/mgprot) 22 比 色 光 徑 (cm) 樣 本 蛋 白 濃 度 (mg/l) 注 意 事 項 加 入 硫 酸 鏈 黴 素 : 在 勻 漿 上 清 液 中 加 人 硫 酸 鏈 黴 素 溶 液 的 作 用 是 沉 澱 核 酸 核 酸 中 的 一 些 堿 基 如 鳥 嘌 呤 胞 嘧 啶 尿 嘧 啶 和 胸 腺 嘧 啶 等 也 含 有 羰 基, 如 不 去 除 核 酸, 這 些 堿 基 就 會 與 DNPH 結 合, 並 反 應 生 成 有 色 物 質, 這 些 物 質 會 增 加 最 後 溶 液 的 吸 光 度, 使 結 果 偏 大 DHPH 的 溶 解 :DNPH 不 溶 于 水, 只 能 溶 於 稀 酸 和 稀 堿 等 溶 液, 因 此, 用 2 mol/l HC1 來 溶 解 DNPH 設 對 照 管 是 為 了 避 免 HC1 與 反 應 液 中 一 些 物 質 反 應 生 成 對 比 色 有 影 響 的 物 質 反 應 體 系 應 避 光 : 當 蛋 白 質 溶 液 中 加 人 DNPH 進 行 反 應 時, 反 應 體 系 需 置 於 黑 暗 中, 因 為 DNPH 不 穩 定, 見 光 會 分 解 如 果 反 應 體 系 遇 到 光,DNPH 分 解, 體 系 中 會 有 剩 餘 的 沒 有 變 成 蛋 白 質 腙 衍 生 物, 對 反 應 比 色 有 影 響 去 除 未 與 蛋 白 質 結 合 的 DNPH: 由 於 DNPH 在 370nm 左 右 有 強 烈 的 光 吸 收, 因 而 用 乙 醇 和 乙 酸 乙 脂 混 合 物 反 復 洗 滌 沉 澱, 去 掉 未 與 蛋 白 質 結 合 的 DNPH, 否 則, 會 增 加 吸 光 值 抗 氧 化 酶 活 力 測 定 SOD 催 化 超 氧 陰 離 子 自 由 基 (O2 ˉ) 生 成 H2O2, 再 由 其 它 抗 氧 化 酶 如 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-PX) 和 過 氧 化 氫 酶 作 用 生 成 水, 這 樣 可 以 清 除 O2 ˉ 對 細 胞 的 毒 害 作 用 SOD GSH-Px 在 動 物 某 些 器 官 和 人 體 血 紅 細 胞 中 的 含 量 均 有 明 顯 的 增 齡 變 化, 酶 活 性 與 生 物 年 齡 的 增 長 成 反 比 消 除 自 由 基 的 能 力 與 酶 活 性 成 正 比 血 或 組 織 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 活 力 測 定 原 理 O2 ˉ 氧 化 羥 胺 的 最 終 產 物 為 亞 硝 酸 鹽, 後 者 在 對 氨 基 苯 磺 酸 及 甲 萘 胺 作 用 下 呈 現 紫 紅 色, 在 波 長 530nm 處 有 極 大 吸 收 峰, 可 用 分 光 光 度 法 進 行 測 定, 當 SOD 消 除 O2 ˉ 後 形 成 的 亞 硝 酸 鹽 減 少 儀 器 與 試 劑 儀 器 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 離 心 機 恒 溫 水 浴 勻 漿 器 試 劑 65mM 磷 酸 鹽 緩 衝 液 (PBS) ph7.8 11

12 10mmol/L 鹽 酸 羥 胺 鹽 酸 羥 胺 6.95mg, 加 PBS 至 10mL 7.5mmol/L 黃 嘌 呤 黃 嘌 呤 11.41mg, 加 0.1M NaOH 2.5mL 溶 解, 加 PBS 至 10mL 0.2g/L 黃 嘌 呤 氧 化 酶 取 10g/L 黃 嘌 呤 氧 化 酶 0.2mL 加 冰 冷 PBS 9.8mL 至 10mL 0.1% 甲 萘 胺 取 0.2gα- 甲 萘 胺 溶 於 40mL 沸 蒸 餾 水, 涼 至 室 溫 加 50mL 冰 醋 酸, 再 加 110mL 涼 蒸 餾 水 至 200mL 0.33% 對 氨 基 苯 磺 酸 取 0.66g 對 氨 基 苯 磺 酸 溶 于 150mL 溫 蒸 餾 水, 加 50mL 冰 醋 酸 至 200mL SOD 標 準 品 三 氯 甲 烷 95% 乙 醇 (v/v) 0.9% 生 理 鹽 水 實 驗 步 驟 紅 細 胞 抽 提 液 製 備 :10μl 全 血 沖 入 0.5mL 生 理 鹽 水,2000r/min 離 心 3min, 棄 上 清, 加 冰 冷 的 雙 蒸 水 0.2mL 混 勻, 加 入 95% 乙 醇 0.1mL, 振 盪 30s, 加 入 三 氯 甲 烷 0.1mL, 置 快 速 混 合 器 抽 提 1min,4000r/min 離 心 3min, 分 層, 上 層 為 SOD 抽 提 液, 中 層 為 血 紅 蛋 白 沉 澱 物, 下 層 為 三 氯 甲 烷, 記 錄 上 清 液 體 積 待 測 組 織 勻 漿 的 製 備 : 剪 取 一 定 量 的 所 需 臟 器, 生 理 鹽 水 沖 洗 拭 幹 稱 重 剪 碎, 至 玻 璃 勻 漿 器 中 加 入 冷 生 理 鹽 水 20000r/min 勻 漿 10s, 間 歇 30s, 反 復 進 行 三 次, 製 成 1% 組 織 勻 漿,( 最 好 用 超 聲 波 發 生 器 處 理 30s), 使 線 粒 體 振 破, 以 中 性 紅 - 詹 鈉 氏 綠 B 染 色 證 明 線 粒 體 已 振 碎 以 4000r/min 離 心 5min, 取 上 清 液 20μl 待 測 SOD 標 準 抑 制 曲 線 將 SOD 標 準 品 用 磷 酸 鹽 緩 衝 液 配 製 成 750U/mL 的 溶 液, 再 稀 釋 到 50 倍, 即 SOD 量 為 15U/mL(1.5μg/mL), 用 本 法 測 定 不 同 量 的 SOD 標 準 液 的 百 分 抑 制 率, 以 百 分 抑 制 率 為 縱 坐 標, 以 SOD 活 力 單 位 U/mL 為 橫 坐 標 繪 製 標 準 曲 線 對 照 管 OD- 測 定 管 OD SOD 百 分 抑 制 率 = 100% 對 照 管 OD 計 算 每 ml 反 應 液 中 SOD 抑 制 率 達 50% 時 所 對 應 的 SOD 量 為 一 個 單 位 ( 對 照 管 OD- 測 定 管 OD) 100% 對 照 管 OD 反 應 液 總 量 (6mL) SOD 活 力 (U/mL)= 樣 品 稀 釋 倍 數 50% 取 液 量 也 可 用 酶 比 活 法 即 以 每 管 樣 品 的 百 分 抑 制 率 從 SOD 標 準 曲 線 查 出 相 應 的 SOD U/mL, 乘 以 稀 釋 倍 數 (1mL/ 取 樣 量 ) 若 樣 品 為 組 織 勻 漿 液, 根 據 勻 漿 濃 度 或 組 織 蛋 白 質 含 量, 將 單 位 換 算 為 U/g 組 織 或 U/mg 蛋 白 若 樣 品 為 紅 細 胞 抽 提 液, 根 據 血 紅 蛋 白 含 量, 可 換 算 為 U/g Hb 12

13 樣 品 測 定 步 驟 : 試 劑 測 定 管 對 照 管 1/15mol/L 磷 酸 鹽 緩 衝 液 ph7.8(ml) 樣 品 A * 10mmol/L 鹽 酸 羥 胺 (ml) mmol/L 黃 嘌 呤 (ml) mg/mL 黃 嘌 呤 氧 化 酶 (ml) 雙 蒸 水 (ml) 混 勻,37 恒 溫 水 浴 30min 0.33% 對 氨 基 苯 磺 酸 (ml) % 甲 萘 胺 (ml) 混 勻 15min 後, 倒 入 1cm 光 徑 比 色 杯, 以 蒸 餾 水 調 零,530nm 處 比 色 測 定 OD 值 * A 所 用 樣 品 的 量 紅 細 胞 抽 提 液 10 μl 血 清 ( 或 血 漿 ) μl( 溶 血 樣 品 剔 除 ) 1% 組 織 勻 漿 μl 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 血 或 組 織 中 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-Px) 活 力 測 定 原 理 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-Px) 是 體 內 存 在 的 一 種 含 硒 清 除 自 由 基 和 抑 制 自 由 基 反 應 的 系 統 對 防 止 體 內 自 由 基 引 起 膜 脂 質 過 氧 化 特 別 重 要, 其 活 力 以 催 化 GSH 氧 化 的 反 應 速 度, 及 單 位 時 間 內 GSH 減 少 的 量 來 表 示,GSH 和 5,5 - 二 硫 對 硝 基 苯 甲 酸 (DTNB) 反 應 在 GSH-Px 催 化 下 可 生 成 黃 色 的 5- 硫 代 2- 硝 基 苯 甲 酸 陰 離 子, 於 423nm 波 長 有 最 大 吸 收 峰, 測 定 該 離 子 濃 度, 即 可 計 算 出 GSH 減 少 的 量, 由 於 GSH 能 進 行 非 酶 反 應 氧 化, 所 以 最 後 計 算 酶 活 力 時, 必 須 扣 除 非 酶 反 應 所 引 起 的 GSH 減 少 試 劑 和 儀 器 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 低 溫 高 速 離 心 機 勻 漿 器 恒 溫 水 浴 鍋 微 量 加 樣 器 試 劑 : 疊 氮 鈉 磷 酸 緩 衝 液 ph7.0 NaN mg 終 濃 度 2.5mmol/L EDTA-Na2 7.44mg 終 濃 度 0.2mmol/L Na2HPO g 終 濃 度 0.2mol/L NaH2PO g 終 濃 度 0.2mol/L 加 蒸 餾 水 至 100mL, 用 少 量 HCL NaOH 調 ph7.0,4 保 存 1mmol/L 谷 胱 甘 肽 ( 還 原 型 GSH) 溶 液 GSH 30.7mg 加 疊 氮 鈉 磷 酸 緩 衝 液 至 100mL, 臨 用 前 配 製, 冰 凍 保 存 1-2 日 mmol/LH2O2 溶 液 取 30%H2O mL, 用 雙 蒸 水 稀 釋 至 100mL, 作 為 貯 備 液,4 避 光 保 存, 臨 用 13

14 前 將 貯 備 液 用 雙 蒸 水 稀 釋 10 倍 即 可 偏 磷 酸 沉 澱 液 HPO3 16.7g( 先 用 蒸 餾 水 溶 解 ) EDTA 0.5g NaCl 280g 加 蒸 餾 水 至 1000mL, 用 普 通 濾 紙 過 濾, 室 溫 保 存 0.32mol/LNa2HPO4 溶 液 : Na2HPO4 22.7g 加 蒸 餾 水 至 500mL, 室 溫 保 存 DTNB 顯 色 液 DTNB 40mg 檸 檬 酸 三 鈉 1.0g 加 蒸 餾 水 至 100mL,4 避 光 保 存 1 個 月 0.2M 磷 酸 緩 衝 液 ph % 生 理 鹽 水 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 溶 血 液 : 取 鼠 血 10μl 加 入 到 1mL 雙 蒸 水 中, 充 分 振 搖, 使 之 全 部 溶 血 1:100 待 測,4h 內 測 定 酶 活 力 若 當 天 來 不 及 測 定, 將 肝 素 抗 凝 全 血 置 -20 凍 存,3d 內 測 定, 若 4 存 放, 28h 內 必 須 測 完 測 前 取 出 樣 品 室 溫 自 然 解 凍 組 織 上 清 液 : 動 物 禁 食 過 夜, 處 死 後, 立 即 取 出 所 需 臟 器, 放 入 冷 生 理 鹽 水 中 洗 去 浮 血, 剔 除 脂 肪 及 結 締 組 織, 濾 紙 吸 幹 後, 在 冰 浴 上 剪 成 碎 塊, 稱 取 適 量 組 織, 加 冷 0.2M 磷 酸 緩 衝 液, 以 20000r/min 勻 漿 10s, 間 歇 30s, 反 復 3 次 製 成 5% 組 織 勻 漿, 操 作 在 冰 浴 中 進 行, 勻 漿 以 g 離 心 10min( 低 溫 高 速 離 心 機 ), 以 沉 澱 為 破 碎 的 細 胞 細 胞 碎 片 核 及 線 粒 體, 上 清 液 用 以 測 胞 液 中 的 酶 活 力, 最 好 當 天 測, 否 則 加 20%(v/v) 甘 油 分 裝 於 塑 膠 管, 放 置 , 可 保 存 數 周, 而 酶 活 力 不 減 GSH 標 準 曲 線 的 製 作 : 取 1.0mmol/LGSH 溶 液 mL, 分 別 置 於 10mL 小 容 器 瓶 中, 各 加 入 偏 磷 酸 沉 澱 劑 8mL, 用 雙 蒸 水 稀 釋 至 10mL 刻 度, 即 得 到 濃 度 為 μmol/L 的 GSH 標 準 液 取 上 述 不 同 濃 度 標 準 液 各 2mL, 放 入 試 管 中, 加 入 0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL, 比 色 前 加 入 DTNB 顯 色 液 0.5mL 用 光 徑 1cm 杯,5min 內 在 可 見 光 423nm 波 長 測 OD 值, 以 雙 蒸 水 調 零 點 以 GSH 含 量 (μmol/l) 為 橫 坐 標,OD423 值 為 縱 坐 標, 繪 製 標 準 曲 線 測 定 步 驟 : 試 劑 樣 品 管 (ml) 非 酶 管 (ml) 空 白 管 (ml) 1.0mmol/LGSH 樣 品 ** 0.4 雙 蒸 水 *

15 37 水 浴 預 溫 5min H2O2(37 預 熱 ) 水 浴 準 確 反 應 3min ( 嚴 格 控 制 時 間 ) 偏 磷 酸 沉 澱 液 r/min 離 心 10min 離 心 上 清 液 2 2 雙 蒸 水 0.4 偏 磷 酸 沉 澱 液 mol/LNa2HPO DTNB 顯 色 液 顯 色 反 應 1min 後 於 423nm 波 長 (1cm 光 徑 ), 讀 OD 值,5min 之 內 讀 數 準 確 * 樣 品 為 組 織 上 清 液 時, 非 酶 管 改 為 加 熱 使 酶 失 活 的 組 織 上 清 液 ** 溶 血 液 mL 組 織 上 清 液 1:20 稀 釋, 取 稀 釋 液 0.4mL 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 計 算 鼠 全 血 GSH-Px 活 力 單 位 規 定 每 1mL 全 血, 每 分 鐘, 扣 除 非 酶 反 應 的 log[gsh] 降 低 後, 使 log[gsh] 降 低 1 為 一 個 酶 活 力 單 位 非 酶 管 log[gsh]- 樣 品 管 log[gsh] 鼠 全 血 GSH-Px 活 力 單 位 (U/mL 全 血 )= 3min 0.004mL log[ 非 酶 管 OD- 空 白 管 OD]-log[ 樣 品 管 OD- 空 白 管 OD] = 3min 0.004mL 組 織 GSH-Px 比 活 力 單 位 規 定 每 毫 克 蛋 白 質, 每 分 鐘, 扣 除 非 酶 反 應, 使 GSH 濃 度 降 低 1μmol/L 為 一 個 酶 活 力 單 位 ( 非 酶 管 OD- 樣 品 管 OD) A ** 5 組 織 GSH-Px 比 活 力 單 位 (U/mg 蛋 白 ) = 3min 樣 品 蛋 白 質 的 mg 數 * * Folin 法 或 雙 縮 脲 法 測 樣 品 蛋 白 質 含 量 標 準 GSH 濃 度 (μmol/l) ** A= 即 標 準 曲 線 斜 率 標 準 GSH 光 密 度 (OD) 注 意 事 項 由 於 H2O2 易 分 解 導 致 濃 度 改 變, 臨 用 時 取 貯 備 液 用 分 光 光 度 計 測 其 濃 度, 取 貯 備 液 3mL, 測 定 1cm 光 徑 的 240nm 處 OD 值 OD 濃 度 (mmol/l)= 0.036( 消 光 係 數 ) 若 OD 值 為 0.45, 則 表 明 H2O2 濃 度 為 12.5mmol/L 硫 代 2- 硝 基 苯 甲 酸 陰 離 子 的 顯 色 不 僅 與 整 個 反 應 體 系 中 氫 離 子 濃 度 有 15

16 關, 還 受 反 應 時 間 限 制 加 入 顯 色 劑 後, 反 應 體 系 ph 為 6.5 時,11min 開 始 顯 色, 此 時 比 色 5min 內 讀 數 準 確 抗 氧 化 物 質 還 原 型 谷 胱 甘 肽 (GSH) 測 定 谷 胱 甘 肽 是 一 種 低 分 子 清 除 劑, 它 可 清 除 O2 - H2O2 LOOH 谷 胱 甘 肽 是 谷 氨 酸 甘 氨 酸 和 半 胱 氨 酸 組 成 的 一 種 三 肽, 是 組 織 中 主 要 的 非 蛋 白 質 的 巰 基 化 合 物, 是 GSH-PX 和 GST 兩 種 酶 類 的 底 物, 為 這 兩 種 酶 分 解 氫 過 氧 化 物 所 必 需, 它 能 穩 定 含 巰 基 的 酶, 和 防 止 血 紅 蛋 白 及 其 它 輔 助 因 數 受 氧 化 損 傷, 缺 乏 或 耗 竭 GSH 會 促 使 許 多 化 學 物 質 或 環 境 因 素 產 生 中 毒 作 用,GSH 量 的 多 少 是 衡 量 機 體 抗 氧 化 能 力 大 小 的 重 要 因 素 血 或 組 織 中 還 原 型 谷 胱 甘 肽 (GSH) 測 定 方 法 原 理 GSH - 和 5,5'- 二 硫 對 硝 基 甲 酸 (DTNB) 反 應 在 GSH-Px 催 化 下 可 生 成 黃 色 的 5- 硫 代 2- 硝 基 甲 酸 陰 離 子, 於 420nm 波 長 有 最 吸 收 峰, 測 定 該 離 子 濃 度, 即 可 計 算 GSH 的 含 量 儀 器 和 試 劑 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 低 溫 高 速 離 心 機 勻 漿 器 恒 溫 水 浴 鍋 微 量 加 樣 器 試 劑 :0.9% 生 理 鹽 水 4% 磺 基 水 楊 酸 溶 液 0.1mol/L PBS 溶 液 (ph=8.0): 稱 取 Na2HPO g,KH2PO g, 加 蒸 餾 水 至 1000mL 0.004%DTNB 溶 液 : 稱 取 DTNB 40mg 溶 於 1000mL 的 0.1mol/L PBS 溶 液 (ph=8.0) 中 疊 氮 納 緩 衝 液 : NaN mg EDTA-Na mg Na2HPO g NaH2PO g 加 蒸 餾 水 至 1000mL, 用 少 量 HCl NaOH 調 ph7.0,4 保 存 標 準 溶 液 : 稱 取 還 原 型 GSH 15.4mg, 加 疊 氮 納 緩 衝 液 至 50mL, 終 濃 度 為 1mmol/L, 臨 用 前 配 製 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 : 溶 血 液 上 清 液 : 取 0.1mL 抗 凝 全 血 加 雙 蒸 水 0.9mL(1:9 溶 血 液 ), 充 分 混 勻, 直 至 透 亮 為 止 取 溶 血 液 0.5mL 加 4% 磺 基 水 楊 酸 0.5mL 混 勻, 室 溫 下 3500rpm 離 心 10 分 鐘, 取 上 清 液 備 用 血 清 上 清 液 : 取 0.1mL 血 清 加 4% 磺 基 水 楊 酸 0.1mL 混 勻, 室 溫 下 3500rpm 離 心 10 分 鐘, 取 上 清 液 備 用 組 織 上 清 液 : 取 組 織 0.5g 加 生 理 鹽 水 4.5mL 充 分 研 磨 成 細 漿 (10% 肝 勻 漿 ), 混 勻 後 取 16

17 漿 液 0.5mL 加 4% 磺 基 水 楊 酸 0.5mL 混 勻, 室 溫 下 3500rpm 離 心 10 分 鐘, 取 上 清 液 備 用 樣 品 測 定 : 溶 血 液 或 組 織 樣 品 測 定 : 測 定 管 空 白 管 上 清 液 0.5mL - 4% 磺 基 水 楊 酸 - 0.5mL DTNB 4.5mL 4.5mL 混 勻, 室 溫 放 置 10 分 鐘 後,420nm 處 測 定 吸 光 度 血 清 樣 品 測 定 : 測 定 管 空 白 管 上 清 液 0.1mL - 4% 磺 基 水 楊 酸 - 0.1mL DTNB 0.9mL 0.9mL 混 勻, 室 溫 放 置 10 分 鐘 後,420nm 處 測 定 吸 光 度 注 : 該 指 標 檢 測, 需 新 鮮 樣 品 取 材 後 當 天 完 成 用 雙 縮 脲 法 測 定 血 清 ( 或 溶 血 液 ) 組 織 勻 漿 蛋 白 質 含 量 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 標 準 曲 線 取 1mmol/L GSH 標 準 溶 液 µL, 分 別 加 入 生 理 鹽 水 至 0.5mL, 即 得 到 µmol/L 的 GSH 標 準 液 系 列, 各 管 加 入 DTNB4.5mL, 混 勻, 室 溫 放 置 10 分 鐘 後, 空 白 管 調 零,420nm 處 測 定 吸 光 度 以 濃 度 為 橫 坐 標, 吸 光 度 為 縱 坐 標, 做 標 準 曲 線 mmol/L GSH(mL) 生 理 鹽 水 (ml) DTNB(mL) GSH 量 ( mol/l) 計 算 樣 品 GSH 含 量 = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 溶 血 液 稀 釋 倍 數 上 清 液 稀 釋 倍 數 ( mol /L 全 血 ) = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 10 2 樣 品 GSH 含 量 = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 上 清 液 稀 釋 倍 數 ( mol /L 血 清 ) = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 2 樣 品 GSH 含 量 = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 上 清 液 稀 釋 倍 數 上 清 液 組 織 含 量 ( mol /g 組 織 ) = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 2 100g 組 織 /L 樣 品 GSH 含 量 ( mol /gprot) = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 上 清 液 稀 釋 倍 數 上 清 液 蛋 白 含 量 = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 2 勻 漿 gprot/l 17

18 1.4 資 料 處 理 與 結 果 判 定 資 料 處 理 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值, F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 指 標 判 定 脂 質 氧 化 產 物 受 試 樣 品 組 與 模 型 ( 或 老 齡 ) 對 照 組 比 較, 過 氧 化 脂 質 ( 丙 二 醛 或 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 ) 含 量 降 低 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 有 降 低 脂 質 過 氧 化 作 用, 該 項 指 標 結 果 陽 性 蛋 白 質 氧 化 產 物 受 試 樣 品 組 與 模 型 ( 或 老 齡 ) 對 照 組 比 較, 蛋 白 質 羰 基 含 量 降 低 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 有 降 低 蛋 白 質 過 氧 化 作 用, 該 項 指 標 結 果 陽 性 抗 氧 化 酶 活 力 受 試 樣 品 組 與 模 型 ( 或 老 齡 ) 對 照 組 比 較, 抗 氧 化 酶 (SOD 或 GSH-PX) 活 力 升 高 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 有 升 高 抗 氧 化 酶 活 力 作 用, 該 項 指 標 結 果 陽 性 抗 氧 化 物 質 GSH 受 試 樣 品 組 與 模 型 ( 或 老 齡 ) 對 照 組 比 較,GSH 含 量 升 高 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 有 升 高 抗 氧 化 物 質 GSH 作 用, 該 項 指 標 結 果 陽 性 結 果 判 定 過 氧 化 脂 質 含 量 蛋 白 質 羰 基 抗 氧 化 酶 活 性 還 原 性 谷 胱 甘 肽 四 項 指 標 中 三 項 指 標 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 抗 氧 化 動 物 實 驗 結 果 陽 性 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 受 試 者 納 入 標 準 選 年 齡 在 歲, 身 體 健 康 狀 況 良 好, 無 明 顯 腦 心 肝 肺 腎 血 液 疾 患, 無 長 期 服 藥 史, 志 願 受 試 保 證 配 合 的 人 群 2.2 排 除 受 試 者 標 準 妊 娠 或 哺 乳 期 婦 女, 對 保 健 食 品 過 敏 者 合 併 有 心 肝 腎 和 造 血 系 統 等 嚴 重 疾 病 患 者 短 期 內 服 用 與 受 試 功 能 有 關 的 物 品, 影 響 到 對 結 果 的 判 斷 者 不 符 合 納 入 標 準, 未 按 規 定 食 用 受 試 樣 品, 無 法 判 定 功 效 或 資 料 不 全 影 響 功 效 或 安 全 18

19 性 判 斷 者 2.3 受 試 者 分 組 對 受 試 者 按 MDA SOD GSH-Px 水 準 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 年 齡 性 別 生 活 飲 食 習 慣 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 2.4 試 驗 方 法 採 用 自 身 和 組 間 兩 種 對 照 設 計 試 驗 組 按 推 薦 服 用 方 法 服 用 量 每 日 服 用 受 試 產 品, 對 照 組 可 服 用 安 慰 劑 或 採 用 陰 性 對 照 受 試 樣 品 給 予 時 間 3 個 月, 必 要 時 可 延 長 至 6 個 月 試 驗 期 間 對 照 組 和 試 食 組 原 生 活 飲 食 不 變 2.5 觀 察 指 標 各 項 指 標 在 試 驗 開 始 及 結 束 時 各 檢 測 1 次 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 功 效 指 標 過 氧 化 脂 質 含 量 觀 察 試 驗 前 後 MDA 的 變 化 及 MDA 下 降 百 分 率 ( 測 定 方 法 見 ) 試 驗 前 MDA 試 驗 後 MDA MDA 下 降 百 分 率 = 100% 試 驗 前 MDA 觀 察 試 驗 前 後 8-Isoprostane 的 變 化 及 8-Isoprostane 下 降 百 分 率 ( 測 定 方 法 見 2.8) 試 驗 前 8-Isoprostane 試 驗 後 8-Isoprostane 8-Isoprostane 下 降 百 分 率 = 100% 試 驗 前 8-Isoprostane 超 氧 化 物 歧 化 酶 觀 察 試 驗 前 後 SOD 的 變 化 及 SOD 升 高 百 分 率 ( 測 定 方 法 見 ) 試 驗 前 SOD 試 驗 後 SOD SOD 升 高 百 分 率 = 100% 試 驗 前 SOD 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 觀 察 試 驗 前 後 GSH-PX 的 變 化 及 GSH-PX 升 高 百 分 率 ( 測 定 方 法 見 2.7) 19

20 試 驗 前 GSH-PX 試 驗 後 GSH-PX GSH-PX 升 高 百 分 率 = 100% 試 驗 前 GSH-PX 2.6 資 料 處 理 和 結 果 判 定 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 ; 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 在 試 驗 前 組 間 比 較 差 異 無 顯 著 性 的 前 提 下, 可 進 行 試 驗 後 組 間 比 較 各 功 效 觀 察 指 標 試 驗 前 後 自 身 比 較 和 試 食 後 組 間 比 較 均 有 統 計 學 意 義, 方 可 判 定 該 指 標 陽 性 過 氧 化 脂 質 含 量 超 氧 化 物 歧 化 酶 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 三 項 實 驗 中 任 二 項 實 驗 結 果 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 抗 氧 化 功 能 作 用 2.7 血 中 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-Px) 活 力 測 定 原 理 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-Px) 是 體 內 存 在 的 一 種 含 硒 清 除 自 由 基 和 抑 制 自 由 基 反 應 的 系 統 對 防 止 體 內 自 由 基 引 起 膜 脂 質 過 氧 化 特 別 重 要, 其 活 力 以 催 化 GSH 氧 化 的 反 應 速 度, 及 單 位 時 間 內 GSH 減 少 的 量 來 表 示,GSH 和 5,5 - 二 硫 對 硝 基 苯 甲 酸 (DTNB) 反 應 在 GSH-Px 催 化 下 可 生 成 黃 色 的 5- 硫 代 2- 硝 基 苯 甲 酸 陰 離 子, 於 423nm 波 長 有 最 大 吸 收 峰, 測 定 該 離 子 濃 度, 即 可 計 算 出 GSH 減 少 的 量, 由 於 GSH 能 進 行 非 酶 反 應 氧 化, 所 以 最 後 計 算 酶 活 力 時, 必 須 扣 除 非 酶 反 應 所 引 起 的 GSH 減 少 試 劑 和 儀 器 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 恒 溫 水 浴 鍋 微 量 加 樣 器 離 心 機 試 劑 : 疊 氮 鈉 磷 酸 緩 衝 液 ph7.0 NaN mg 終 濃 度 2.5mmol/L EDTA-Na2 7.44mg 終 濃 度 0.2mmol/L Na2HPO g 終 濃 度 0.2mol/L NaH2PO g 終 濃 度 0.2mol/L 加 蒸 餾 水 至 100mL, 用 少 量 HCL NaOH 調 ph7.0,4 保 存 1mmol/L 谷 胱 甘 肽 ( 還 原 型 GSH) 溶 液 GSH 30.7mg 加 疊 氮 鈉 磷 酸 緩 衝 液 至 100mL, 臨 用 前 配 製, 冰 凍 保 存 1-2 日 mmol/L H2O2 溶 液 取 30%H2O mL, 用 雙 蒸 水 稀 釋 至 100mL, 作 為 貯 備 液,4 避 光 保 存, 臨 用 前 將 貯 備 液 用 雙 蒸 水 稀 釋 10 倍 即 可 偏 磷 酸 沉 澱 液 20

21 HPO3 16.7g( 先 用 蒸 餾 水 溶 解 ) EDTA 0.5g NaCl 280g 加 蒸 餾 水 至 1000mL, 用 普 通 濾 紙 過 濾, 室 溫 保 存 0.32mol/L Na2HPO4 溶 液 : Na2HPO4 22.7g 加 蒸 餾 水 至 500mL, 室 溫 保 存 DTNB 顯 色 液 DTNB 40mg 檸 檬 酸 三 鈉 1.0g 加 蒸 餾 水 至 100mL,4 避 光 保 存 1 個 月 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 溶 血 液 : 取 血 20μl 加 入 到 1mL 雙 蒸 水 中, 充 分 振 搖, 使 之 全 部 溶 血 1:100 待 測,4 小 時 內 測 定 酶 活 力 若 當 天 來 不 及 測 定, 將 肝 素 抗 凝 全 血 置 -20 凍 存,3 天 內 測 定, 若 4 存 放,28 小 時 內 必 須 測 完 測 前 取 出 樣 品 室 溫 自 然 解 凍, GSH 標 準 曲 線 的 製 作 : 取 1.0mmol/L GSH 溶 液 mL, 分 別 置 於 10mL 小 容 器 瓶 中, 各 加 入 偏 磷 酸 沉 澱 劑 8mL, 用 雙 蒸 水 稀 釋 至 10mL 刻 度, 即 得 到 濃 度 為 μmol/L 的 GSH 標 準 液 取 上 述 不 同 濃 度 標 準 液 各 2mL, 放 入 試 管 中, 加 入 0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL, 比 色 前 加 入 DTNB 顯 色 液 0.5mL 用 光 徑 1cm 杯,5min 內 在 可 見 光 423nm 波 長 測 OD 值, 以 雙 蒸 水 調 零 點 以 GSH 含 量 (μmol/l) 為 橫 坐 標,OD423 值 為 縱 坐 標, 繪 製 標 準 曲 線 測 定 步 驟 : 試 劑 樣 品 管 (ml) 非 酶 管 (ml) 1.0mmol/L GSH 血 樣 稀 釋 液 0.4 雙 蒸 水 * 水 浴 預 溫 5min H2O2(37 預 熱 ) 水 浴 準 確 反 應 5min( 嚴 格 控 制 時 間 ) 偏 磷 酸 沉 澱 液 r/min 離 心 10min 離 心 上 清 液 2 2 雙 蒸 水 偏 磷 酸 沉 澱 液 21

22 計 算 0.32mol/L Na2HPO DTNB 顯 色 液 顯 色 反 應 1min 後 於 423nm 波 長 (1cm 光 徑 ), 讀 OD 值,5min 之 內 讀 數 準 確 全 血 GSH-Px 活 力 單 位 規 定 每 8μl 全 血, 在 37 反 應 5min, 扣 除 非 酶 反 應 後, 使 GSH 濃 度 降 低 1μmol/L 濃 度 為 一 個 酶 活 力 單 位 全 血 GSH-Px 活 力 U/mL 血 =( 非 酶 管 OD- 樣 品 管 OD) A * 5 ** 標 準 GSH 濃 度 (μmol/l) * A= 即 標 準 曲 線 的 斜 率 標 準 GSH 光 密 度 (OD) ** 5 換 算 成 1mL 反 應 液 中 GSH 濃 度 時, 需 乘 以 稀 釋 倍 數 注 意 事 項 由 於 H2O2 易 分 解 導 致 濃 度 改 變, 臨 用 時 取 貯 備 液 用 分 光 光 度 計 測 其 濃 度, 取 貯 備 液 3mL, 測 定 1cm 光 徑 的 240nm 處 OD 值 OD 濃 度 (mmol/l)= 0.036( 消 光 係 數 ) 若 OD 值 為 0.45, 則 表 明 H2O2 濃 度 為 12.5mmol/L 硫 代 2- 硝 基 苯 甲 酸 陰 離 子 的 顯 色 不 僅 與 整 個 反 應 體 系 中 氫 離 子 濃 度 有 關, 還 受 反 應 時 間 限 制 加 入 顯 色 劑 後, 反 應 體 系 ph 為 6.5 時,11min 開 始 顯 色, 此 時 比 色 5min 內 讀 數 準 確 2.8 血 清 中 8- 表 氫 氧 - 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 測 定 原 理 8- 表 氫 氧 - 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 是 體 內 脂 質 氧 化 應 激 反 應 穩 定 而 具 有 特 異 性 的 標 誌 物, 其 含 量 能 間 接 反 應 因 機 體 內 自 由 基 的 產 生 而 導 致 組 織 細 胞 的 脂 質 過 氧 化 程 度 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 酶 標 儀 生 化 培 養 箱 微 量 振 盪 器 微 量 加 樣 器 洗 板 機 試 劑 :8-Isoprostane KIA Kit ( 酶 聯 免 疫 試 劑 盒 ) 8-Isoprostane EIA 抗 體 血 清 8-Isoprostane AChE 示 蹤 物 8-Isoprostane EIA 標 準 品 EIA 緩 衝 液 洗 滌 緩 衝 液 吐 溫 20 鼠 抗 - 兔 IgG 抗 體 EIA 示 蹤 染 色 劑 EIA 抗 體 血 清 染 色 劑 Ellman s 試 劑 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 靜 脈 取 血,3000r/min 離 心 10min 取 上 清 液, 用 EIA 緩 衝 液 稀 釋 15 倍 備 用 22

23 樣 品 測 定 按 試 劑 盒 說 明 操 作 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 標 準 孔 濃 度 分 別 為 :500 pg/ml 200 pg/ml 80 pg/ml 32 pg/ml 12.8 pg/ml 5.1 pg/ml 2.0 pg/ml 0.8pg/mL 步 驟 試 劑 空 白 TA NSB B0 標 準 / 樣 品 1. 加 試 劑 EIA 緩 衝 液 μL 50μL - 標 準 / 樣 品 μL AChE 示 蹤 物 μL 50μL 50μL 抗 體 血 清 μL 50μL 2. 培 養 用 封 板 膜 蓋 好 酶 標 板, 並 在 4 避 光 條 件 下 培 養 18 小 時 3. 清 洗 清 洗 所 有 反 應 孔 五 次 4. 加 試 劑 AChE 示 蹤 物 - 5μL Ellman s 200μL 200μL 200μL 200μL 200μL 5. 培 養 用 封 板 膜 蓋 好 酶 標 板, 並 在 常 溫 避 光 條 件 下 培 養 分 鐘 6. 讀 數 在 波 長 412nm 處 測 量 各 孔 吸 光 度 (B0 在 A.U 範 圍 ) 標 準 或 樣 品 孔 吸 光 度 NSB 孔 吸 光 度 %B/B0= 100 B0 孔 吸 光 度 NSB 孔 吸 光 度 以 標 準 物 的 濃 度 的 對 數 (log) 為 橫 坐 標,%B/B0 為 縱 坐 標 繪 製 標 準 曲 線, 亦 可 將 資 料 轉 換 成 logit(b/b0) 或 ln[b/b0/(1-b/b0)] 做 為 縱 坐 標 繪 製 標 準 曲 線, 計 算 回 歸 方 程 將 樣 品 的 %B/B0 值, 代 入 方 程 式, 計 算 出 樣 品 的 濃 度, 再 乘 以 稀 釋 倍 數, 即 為 樣 品 中 的 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 濃 度 23

24 附 件 2: 對 胃 粘 膜 損 傷 有 輔 助 保 護 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 胃 粘 膜 大 體 損 傷 狀 況 胃 粘 膜 病 理 損 傷 積 分 1.2 人 體 試 食 試 驗 臨 床 症 狀 體 征 胃 鏡 觀 察 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.2 無 水 乙 醇 消 炎 痛 致 急 性 胃 粘 膜 損 傷 模 型 或 冰 醋 酸 致 慢 性 胃 粘 膜 損 傷 模 型 任 選 其 一 進 行 動 物 實 驗 2.3 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 實 驗 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 大 體 觀 察 評 分 與 病 理 組 織 學 檢 查 評 分 結 果 均 表 明 胃 粘 膜 損 傷 明 顯 改 善, 可 判 定 該 受 試 樣 品 動 物 實 驗 結 果 為 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 試 食 組 與 對 照 組 比 較, 臨 床 症 狀 體 征 積 分 明 顯 減 少, 胃 鏡 複 查 結 果 有 改 善, 可 判 定 該 受 試 樣 品 對 胃 粘 膜 有 輔 助 保 護 功 能 24

25 對 胃 粘 膜 損 傷 有 輔 助 保 護 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Protection of Gastric Mucosa Function 1 動 物 實 驗 1.1 原 理 在 一 定 時 間 內 給 予 一 定 量 的 受 試 樣 品, 用 對 胃 粘 膜 有 損 傷 作 用 的 物 質 造 成 急 性 胃 粘 膜 損 傷 模 型, 觀 察 各 劑 量 組 胃 粘 膜 的 損 傷 程 度 ; 或 用 對 胃 粘 膜 有 損 傷 作 用 的 物 質 造 成 慢 性 胃 潰 瘍 模 型, 在 一 定 時 間 內 給 予 一 定 量 的 受 試 樣 品, 觀 察 各 劑 量 組 胃 潰 瘍 的 面 積 和 體 積, 反 映 受 試 樣 品 對 胃 粘 膜 的 保 護 作 用 1.2 實 驗 動 物 選 用 SD 或 Wistar 健 康 大 鼠, 單 一 性 別, 克, 每 組 8-12 只 1.3 實 驗 設 計 及 劑 量 分 組 受 試 物 設 三 個 劑 量 組, 其 中 一 個 應 為 人 體 推 薦 量 的 5 倍 劑 量 組, 並 同 時 設 置 正 常 對 照 組 不 同 的 損 傷 模 型, 還 應 設 置 相 應 的 模 型 對 照 組 慢 性 潰 瘍 模 型 應 先 造 模, 手 術 次 日 再 分 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 一 般 為 天, 必 要 時 可 以 延 長 至 45 天 1.4 胃 粘 膜 損 傷 模 型 急 性 胃 粘 膜 損 傷 酒 精 模 型 實 驗 動 物 : 選 用 Wistar 或 SD 健 康 大 鼠, 單 一 性 別 實 驗 器 材 及 試 劑 : 解 剖 器 械, 遊 標 卡 尺, 酒 精 或 醋 酸, 病 理 製 片 系 統, 生 物 顯 微 鏡 等 實 驗 方 法 : 動 物 隨 機 分 正 常 對 照 組 模 型 組 和 受 試 樣 品 三 個 劑 量 組 各 劑 量 組 灌 胃 樣 品 30 天 后, 全 部 動 物 嚴 格 禁 食 24 小 時 ( 不 禁 水 ), 此 期 間 亦 禁 止 給 予 受 試 物 除 空 白 對 照 外, 所 有 試 驗 組 動 物 給 予 無 水 乙 醇 1.0ml/ 只,1 小 時 後 處 死 動 物, 暴 露 完 整 胃, 結 紮 幽 門, 灌 注 適 量 10% 甲 醛 溶 液, 固 定 20min, 然 後 沿 胃 大 彎 剪 開, 洗 淨 胃 內 容 物, 展 開 胃 粘 膜, 在 體 視 解 剖 顯 微 鏡 下 或 肉 眼 下 用 遊 標 卡 尺 測 量 出 血 點 或 出 血 帶 的 長 度 和 寬 度 因 寬 度 所 代 表 損 傷 的 嚴 重 性 遠 較 長 度 大, 故 雙 倍 積 分 其 評 分 標 準 見 表 1 表 1 急 性 酒 精 損 傷 肉 眼 觀 查 評 分 標 準 損 傷 程 度 1 分 2 分 3 分 4 分 出 血 點 1 個 出 血 帶 長 度 1-5mm 6-10mm 10-15mm >15mm 出 血 帶 寬 度 1-2mm >2mm 總 積 分 = 出 血 點 分 值 + 長 度 分 值 +( 寬 度 分 值 2) 25

26 觀 察 指 標 : 各 實 驗 組 胃 粘 膜 損 傷 程 度 以 損 傷 發 生 率 (%) 損 傷 積 分 指 數 和 損 傷 抑 制 率 表 示 損 傷 發 生 率 (%)= 某 組 出 現 出 血 或 潰 瘍 的 大 鼠 數 量 / 該 組 大 鼠 數 量 100%; 損 傷 積 分 指 數 = 組 損 傷 評 分 總 和 / 組 動 物 數 量 ; 損 傷 抑 制 率 (%)= (A-B) /A 100%(A B 分 別 為 模 型 組 與 試 驗 組 的 損 傷 積 分 ) 病 理 組 織 學 觀 察 及 評 分 : 大 體 檢 查 完 畢, 將 每 只 動 物 胃 粘 膜 損 傷 最 嚴 重 的 部 位 切 下, 固 定 於 10% 甲 醛 溶 液, 常 規 製 片,HE 染 色, 鏡 下 觀 察 注 意 選 擇 胃 粘 膜 正 橫 切 面, 包 括 粘 膜 全 層 的 區 域 觀 察 評 分 方 法 : 以 充 血 出 血 粘 膜 細 胞 變 性 壞 死 在 整 個 粘 膜 上 皮 層 的 累 及 程 度 分 為 5 級 充 血 權 重 為 1, 出 血 權 重 為 2, 上 皮 細 胞 變 性 壞 死 權 重 為 3, 評 分 標 準 及 病 變 總 積 分 公 式 見 表 2 表 2 急 性 胃 粘 膜 損 傷 鏡 下 評 分 標 準 病 變 1 分 2 分 3 分 4 分 5 分 充 血 < 1/5 1/5-2/5 2/5-3/5 3/5-4/5 上 皮 全 層 出 血 < 1/5 1/5-2/5 2/5-3/5 3/5-4/5 上 皮 全 層 上 皮 細 胞 變 性 壞 死 < 1/5 1/5-2/5 2/5-3/5 3/5-4/5 上 皮 全 層 病 變 總 積 分 = 充 血 積 分 + 出 血 積 分 2+ 上 皮 細 胞 變 性 壞 死 積 分 急 性 胃 粘 膜 損 傷 消 炎 痛 模 型 實 驗 動 物 : 選 用 Wistar 或 SD 健 康 大 鼠, 單 一 性 別 實 驗 器 材 及 試 劑 : 解 剖 器 械 或 遊 標 卡 尺, 病 理 製 片 系 統 ; 消 炎 痛, 甲 醛 等 實 驗 方 法 : 動 物 隨 機 分 正 常 對 照 組 模 型 組 和 受 試 樣 品 三 個 劑 量 組, 灌 胃 給 予 動 物 受 試 物 30 天 后, 禁 食 不 禁 水 24 小 時, 模 型 組 和 劑 量 組 給 予 消 炎 痛 40mg/kg 一 次 性 腹 腔 注 射 5 小 時 後 處 死 動 物, 剖 腹 將 胃 取 出, 結 紮 幽 門 和 賁 門, 從 十 二 指 腸 與 幽 門 部 結 合 處 注 入 10% 甲 醛 溶 液 5 ml, 固 定 20 分 鐘 後, 沿 胃 大 彎 剪 開, 洗 淨 胃 內 容 物, 展 開 胃 粘 膜, 用 紙 吸 幹, 觀 察 胃 粘 膜 損 傷 程 度 用 遊 標 卡 尺 測 量 胃 出 血 或 潰 瘍 的 最 大 長 度 及 寬 度, 以 出 血 或 潰 瘍 的 最 大 長 寬 徑 作 為 損 傷 指 標 評 分 消 炎 痛 所 致 胃 粘 膜 損 傷 的 潰 瘍 一 般 較 小, 肉 眼 觀 查 以 點 狀 多 見, 其 評 分 標 準 見 表 3 表 3 急 性 胃 粘 膜 損 傷 消 炎 痛 模 型 評 分 標 準 損 傷 形 態 1 分 2 分 3 分 4 分 出 血 點 1 個 - - 出 血 帶 長 度 1-2mm 2-4mm 4-6mm >6mm 出 血 帶 寬 度 1-2mm >2mm 總 積 分 = 出 血 點 分 值 + 長 度 分 值 +( 寬 度 分 值 2) 注 : 長 度 和 寬 度 均 以 最 大 徑 計 觀 察 指 標 : 各 實 驗 組 胃 粘 膜 損 傷 程 度 以 損 傷 發 生 率 (%) 損 傷 指 數 和 損 傷 抑 制 率 表 示 損 傷 發 生 率 (%)= 某 組 出 現 出 血 或 潰 瘍 的 大 鼠 數 量 / 該 組 大 鼠 數 量 100%; 損 傷 指 數 = 組 損 傷 評 分 總 和 / 組 動 物 數 量 ; 損 傷 抑 制 率 (%)=(A-B)/A 100%(A B 分 別 為 模 型 組 與 試 驗 組 的 損 傷 積 分 ) 病 理 組 織 學 觀 察 及 評 分 : 同 急 性 胃 粘 膜 損 傷 酒 精 模 型 慢 性 胃 潰 瘍 模 型 動 物 : 選 用 Wistar 或 SD 健 康 大 鼠, 單 一 性 別 26

27 實 驗 器 材 及 試 劑 : 帶 尺 規 的 解 剖 鏡 微 量 注 射 器, 醋 酸 半 胱 氨 酸 等 實 驗 方 法 : 醋 酸 注 射 法 : 將 動 物 禁 食 不 禁 水 24 小 時, 乙 醚 或 1% 巴 比 妥 鈉 麻 醉 後 實 施 剖 腹 手 術, 消 毒 腹 部, 於 劍 突 下 切 開 腹 腔, 將 胃 輕 拉 出 腹 腔 外, 用 微 量 注 射 器 於 胃 幽 門 處 漿 膜 下 注 射 l 的 30% 冰 醋 酸, 縫 合 切 口, 術 後 正 常 餵 食 和 水 第 二 天 將 手 術 後 狀 態 良 好 的 動 物 按 體 重 隨 機 分 為 模 型 組 和 受 試 樣 品 三 個 劑 量 組 各 劑 量 組 按 相 應 劑 量 灌 胃, 連 續 14 天 模 型 組 灌 胃 蒸 餾 水 或 溶 劑 禁 食 24 小 時 後 處 死, 取 出 整 個 胃 浸 泡 於 10% 的 甲 醛 內, 浸 泡 20 分 鐘 後 沿 胃 大 彎 剪 開, 洗 淨 內 容 物, 取 腺 胃 區 展 開 平 鋪 於 玻 璃 板 上, 用 紙 吸 幹 潰 瘍 內 的 水 分, 測 量 其 面 積 和 體 積 潰 瘍 面 積 和 體 積 測 量 法 : 於 帶 尺 規 的 解 剖 顯 微 鏡 下 計 數 潰 瘍 所 占 的 方 格 數, 換 算 成 面 積 然 後 用 微 量 注 射 器 將 有 色 墨 水 注 入 潰 瘍 內, 將 潰 瘍 填 滿 與 周 邊 平 齊, 讀 取 微 量 注 射 器 上 刻 度 即 為 潰 瘍 的 體 積 冰 醋 酸 浸 漬 法 : 將 動 物 禁 食 不 禁 水 24 小 時, 乙 醚 或 1% 巴 比 妥 鈉 麻 醉 後 實 施 剖 腹 手 術, 消 毒 腹 部, 於 劍 突 下 切 開 腹 腔, 將 內 徑 5mm 長 30mm 的 玻 璃 管 垂 直 放 置 胃 體 部 粘 膜 上, 向 管 腔 加 入 冰 醋 酸 0.2ml,1.5 分 鐘 後 用 棉 簽 蘸 出 冰 醋 酸, 縫 合 手 術 切 口, 術 後 正 常 餵 食 和 水, 第 二 天 將 手 術 後 狀 態 良 好 的 動 物 按 體 重 隨 機 分 組 給 藥, 動 物 處 置 和 測 量 等 操 作 同 上 1.5 資 料 處 理 和 結 果 判 定 資 料 可 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值,F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 F 值 F0.05, 即 P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 受 試 物 一 個 或 一 個 以 上 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 進 行 比 較, 大 體 觀 察 評 分 與 病 理 組 織 學 檢 查 評 分 結 果 均 表 明 胃 粘 膜 損 傷 明 顯 改 善, 可 判 定 該 受 試 樣 品 動 物 實 驗 結 果 為 陽 性 1.6 注 意 事 項 動 物 禁 食 應 完 全, 應 嚴 格 控 制 動 物 禁 食 期 間 食 糞 便 皮 毛 墊 料 等 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 受 試 者 的 選 擇 標 準 納 入 受 試 者 標 準 : 符 合 慢 性 淺 表 性 胃 炎 診 斷 標 準 且 經 胃 鏡 篩 選 確 診 為 胃 粘 膜 損 傷 的 自 願 受 試 者 慢 性 淺 表 性 胃 炎 診 斷 標 準 : 病 程 遷 延, 有 不 同 程 度 的 消 化 不 良 上 腹 痛 燒 心 噯 氣 反 酸 腹 脹 等 臨 床 症 狀, 可 有 上 腹 部 輕 度 壓 痛 符 合 慢 性 淺 表 性 胃 炎 纖 維 胃 鏡 診 斷 標 準 及 活 體 組 織 檢 查 診 斷 標 準 排 除 胃 潰 瘍 患 者 排 除 受 試 者 標 準 : 年 齡 在 18 歲 以 下 或 65 歲 以 上, 妊 娠 或 哺 乳 期 婦 女, 過 敏 體 質 及 對 本 樣 品 過 敏 者 繼 發 性 慢 性 胃 炎 合 併 有 心 血 管 腦 血 管 肝 腎 和 造 血 系 統 嚴 重 疾 病, 精 神 病 患 者 27

28 經 常 用 藥 嗜 酒 吸 煙,4 周 內 參 加 過 其 它 實 驗 個 月 內 用 過 已 知 對 胃 腸 功 能 有 損 害 的 藥 物 症 狀 體 征 分 級 為 重 症 者 有 嚴 重 消 化 系 統 潰 瘍 的 病 人 正 在 服 用 其 它 治 療 藥 物 或 接 受 其 它 治 療 者 未 按 規 定 服 用 樣 品, 無 法 判 斷 功 效, 或 資 料 不 全 等 影 響 功 效 或 安 全 性 判 斷 者 2.2 試 驗 設 計 及 服 樣 期 限 採 用 組 間 和 自 身 兩 種 對 照 設 計 按 受 試 者 的 症 狀 輕 重 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 年 齡 性 別 病 程 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 2.3 受 試 樣 品 的 劑 量 和 使 用 方 法 試 食 組 按 推 薦 服 用 方 法 服 用 量 服 用 受 試 產 品, 在 試 驗 期 間 停 用 其 它 用 於 慢 性 胃 病 的 物 品, 對 照 組 服 有 相 同 作 用 的 陽 性 物 按 雙 盲 法 進 行 試 食 試 驗 觀 察 時 間 不 少 於 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 試 驗 期 間 不 改 變 原 來 的 飲 食 習 慣, 正 常 飲 食 2.4 觀 察 指 標 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 : 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 ( 僅 在 試 驗 開 始 前 檢 查 一 次 ) 功 效 指 標 症 狀 觀 察 胃 痛 噯 氣 反 酸 腹 脹 食 欲 不 振 少 食 等 臨 床 症 狀 體 征 觀 察 劍 突 下 壓 痛 程 度 按 症 狀 輕 重 統 計 積 分 ( 重 症 3 分, 中 度 2 分, 輕 度 1 分 ), 見 表 4 胃 痛 表 4 人 體 試 食 試 驗 症 狀 輕 重 分 級 表 症 狀 輕 (1 分 ) 中 (2 分 ) 重 (3 分 ) 輕 微, 持 續 時 間 短, 不 影 響 工 作 及 休 息 疼 痛 時 間 較 長, 每 日 超 4 小 時, 尚 能 忍 受, 但 對 工 作 及 休 息 有 一 定 影 響 疼 痛 較 重, 持 續 難 忍, 需 服 藥 才 能 減 輕 噯 氣 偶 有 發 作 經 常 發 作, 引 及 兩 脅 不 適 頻 繁 發 作, 引 及 兩 脅 疼 痛 反 酸 偶 有 吐 酸 飲 食 不 適 即 吐 酸 頻 繁 吐 酸 腹 脹 腹 脹 輕 微, 時 作 時 止, 在 短 時 間 內 可 較 甚 腹 脹 較 甚 或 發 作 頻 繁, 在 較 長 時 間 內 不 緩 解, 影 響 工 作 及 休 息 腹 脹 難 忍, 持 續 時 間 長, 需 服 藥 才 能 減 輕 28

29 少 食 食 欲 較 差, 飯 量 減 少 1/2 以 內 胃 鏡 檢 查 與 體 征 觀 察 飯 量 減 少 1/2-2/3 無 食 欲, 飯 量 減 少 2/3 以 上 劍 突 下 壓 痛 程 度 檢 查, 根 據 疼 痛 程 度 分 為 輕 (1 分 ) 中 (2 分 ) 重 (3 分 ) 輕 度 : 用 力 時 才 出 現 疼 痛, 壓 痛 輕 微 1 分 中 度 : 用 力 即 出 現 疼 痛, 但 疼 痛 尚 能 忍 受, 壓 痛 明 顯 2 分 重 症 : 稍 微 用 力 即 出 現 疼 痛, 疼 痛 不 能 忍 受, 壓 痛 劇 烈 3 分 隨 機 選 擇 試 食 組 和 對 照 組 各 15 例 受 試 者 進 行 胃 鏡 檢 查, 比 較 試 食 試 驗 前 後 的 改 變 2.5 資 料 處 理 和 結 果 判 定 統 計 症 狀 和 體 征 積 分 值 試 驗 資 料 為 計 量 資 料, 可 用 t 檢 驗 進 行 分 析 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗, 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 結 果 判 定 : 試 食 前 後 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 後 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 臨 床 症 狀 體 征 積 分 明 顯 減 少, 胃 鏡 複 查 結 果 有 改 善 或 不 加 重, 可 判 定 該 受 試 樣 品 對 胃 粘 膜 損 傷 有 輔 助 保 護 功 能 29

30 附 件 3: 輔 助 降 血 糖 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 分 為 方 案 一 ( 胰 島 損 傷 高 血 糖 模 型 ) 和 方 案 二 ( 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 ) 兩 種 方 案 一 ( 胰 島 損 傷 高 血 糖 模 型 ) 體 重 空 腹 血 糖 糖 耐 量 方 案 二 ( 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 ) 體 重 空 腹 血 糖 糖 耐 量 胰 島 素 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 1.2 人 體 試 食 試 驗 空 腹 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 糖 化 血 紅 蛋 白 (HbA1c) 或 糖 化 血 清 蛋 白 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.2 根 據 受 試 樣 品 作 用 原 理 不 同, 方 案 一 和 方 案 二 動 物 模 型 任 選 其 一 進 行 動 物 實 驗 2.3 除 對 高 血 糖 模 型 動 物 進 行 所 列 指 標 的 檢 測 外, 應 進 行 受 試 樣 品 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 影 響 的 觀 察 2.4 人 體 試 食 試 驗 應 在 臨 床 治 療 的 基 礎 上 進 行 2.5 應 對 臨 床 症 狀 和 體 征 進 行 觀 察 2.6 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 30

31 3.1 動 物 實 驗 : 方 案 一 : 空 腹 血 糖 和 糖 耐 量 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 且 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 無 影 響, 即 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 血 糖 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 方 案 二 : 空 腹 血 糖 和 糖 耐 量 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 血 脂 ( 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 ) 無 明 顯 升 高, 且 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 無 影 響, 即 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 血 糖 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 空 腹 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 糖 化 血 紅 蛋 白 ( 或 糖 化 血 清 蛋 白 ) 血 脂 四 項 指 標 均 無 明 顯 升 高, 且 空 腹 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 兩 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 對 機 體 健 康 無 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 輔 助 降 血 糖 功 能 的 作 用 31

32 輔 助 降 血 糖 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Assisting Blood Sugar Reduction Function 1. 動 物 實 驗 1.1 實 驗 動 物 選 用 成 年 動 物, 選 用 小 鼠 (26 2g) 或 大 鼠 (180 20g), 單 一 性 別, 大 鼠 每 組 8-12 只 小 鼠 每 組 只 1.2 材 料 試 劑 四 氧 嘧 啶 (C4H2N2O4 H2O, 分 子 量 ) 或 鏈 脲 佐 菌 素 地 塞 米 松 磷 酸 鈉 注 射 液 葡 萄 糖 或 醫 用 澱 粉 血 糖 測 定 試 紙 或 試 劑 盒, 胰 島 素 甘 油 三 酯 總 膽 固 醇 測 定 試 劑 盒 高 熱 能 飼 料 豬 油 10% 蔗 糖 15% 蛋 黃 粉 15% 酪 蛋 白 5% 膽 固 醇 1.2% 膽 酸 鈉 0.2% 碳 酸 氫 鈣 0.6% 石 粉 0.4% 鼠 維 持 料 52.6% 儀 器 血 糖 儀 全 自 動 生 化 儀 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 天 平 1.3 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 和 一 個 模 型 對 照 組, 以 人 體 推 薦 量 的 10 倍 ( 小 鼠 ) 或 5 倍 ( 大 鼠 ) 為 其 中 的 一 個 劑 量 組, 另 設 二 個 劑 量 組, 高 劑 量 一 般 不 超 過 30 倍, 必 要 時 設 空 白 對 照 組 同 時 設 給 予 受 試 樣 品 高 劑 量 的 正 常 動 物 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 1.4 實 驗 方 法 正 常 動 物 降 糖 實 驗 選 健 康 成 年 動 物 按 禁 食 3-5 小 時 的 血 糖 水 準 分 組, 隨 機 選 1 個 對 照 組 和 1 個 劑 量 組 對 照 組 給 予 溶 劑, 劑 量 組 給 予 高 劑 量 濃 度 受 試 樣 品, 連 續 30 天, 測 空 腹 血 糖 值 ( 禁 食 同 實 驗 前 ), 比 較 兩 組 動 物 血 糖 值 高 血 糖 模 型 降 糖 實 驗 方 案 一 32

33 胰 島 損 傷 高 血 糖 模 型 原 理 四 氧 嘧 啶 ( 或 鏈 脲 佐 菌 素 ) 是 一 種 細 胞 毒 劑, 可 選 擇 性 地 損 傷 多 種 動 物 的 胰 島 細 胞, 造 成 胰 島 素 分 泌 低 下, 引 起 實 驗 性 糖 尿 病 造 模 方 法 購 入 成 年 動 物, 適 應 1 天 后, 隨 機 取 15 只 動 物 禁 食 3-5 小 時, 測 空 腹 血 糖, 作 為 該 批 次 動 物 基 礎 血 糖 值 隨 後 動 物 禁 食 24 小 時 ( 自 由 飲 水 ), 注 射 四 氧 嘧 啶 ( 用 前 新 鮮 配 製 ) 造 模, 小 鼠 45-50mg/kg BW.iv 或 mg/kg BW.ip, 大 鼠 50-80mg/kg BW.iv 或 mg/kg BW.ip 5-7 天 后 動 物 禁 食 3-5 小 時, 測 血 糖, 血 糖 值 10-25mmol/L 為 高 血 糖 模 型 成 功 動 物 高 血 糖 模 型 動 物 降 糖 實 驗 選 高 血 糖 模 型 動 物 按 禁 食 3-5 小 時 的 血 糖 水 準 分 組, 隨 機 選 1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 ( 組 間 差 不 大 於 1.1mmol/L) 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 溶 劑, 連 續 30 天, 測 空 腹 血 糖 值 ( 禁 食 同 實 驗 前 ), 比 較 各 組 動 物 血 糖 值 及 血 糖 下 降 百 分 率 ( 實 驗 前 血 糖 值 - 實 驗 後 血 糖 值 ) 血 糖 下 降 率 %= % 實 驗 前 血 糖 值 高 血 糖 模 型 動 物 糖 耐 量 實 驗 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 同 各 組 動 物 禁 食 3-5 小 時, 測 定 給 葡 萄 糖 或 醫 用 澱 粉 前 ( 即 0 小 時 ) 血 糖 值, 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑,15-20 分 鐘 後 各 組 經 口 給 予 葡 萄 糖 2.0g/kg BW 或 醫 用 澱 粉 3-5g/kg BW, 測 定 給 葡 萄 糖 後 各 組 小 時 的 血 糖 值 或 給 醫 用 澱 粉 後 1 2 小 時 的 血 糖 值, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 給 葡 萄 糖 或 醫 用 澱 粉 後 各 時 間 點 ( 小 時 ) 血 糖 值 及 血 糖 曲 線 下 面 積 的 變 化 (0 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 0.5 (2 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 1.5 血 糖 曲 線 下 面 積 = 方 案 二 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 ( 任 選 其 一 ) 地 塞 米 松 誘 導 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 原 理 糖 皮 質 激 素 具 有 拮 抗 胰 島 素 生 物 效 應 的 作 用, 可 抑 制 靶 組 織 對 葡 萄 糖 的 攝 取 和 利 用, 促 進 蛋 白 質 和 脂 肪 的 分 解 及 糖 異 生 作 用, 導 致 糖 脂 代 謝 紊 亂, 胰 島 素 抵 抗, 誘 發 實 驗 性 糖 尿 病 試 驗 方 法 購 入 健 康 雄 性 大 鼠 (150 20g), 普 通 維 持 料 適 應 飼 養 3-5 天, 禁 食 3-4 小 時, 取 尾 血, 測 定 空 腹 即 給 葡 萄 糖 前 (0 小 時 ) 血 糖 值, 給 2.5g/kgBW 葡 萄 糖 後 測 定 小 時 血 糖 值, 作 為 該 批 次 動 物 基 礎 值 以 小 時 血 糖 水 準 分 5 個 組, 即 1 個 空 白 對 照 組 1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組, 每 組 15 只 空 白 對 照 組 不 做 處 理,3 個 劑 量 組 灌 胃 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 連 續 35 天 各 組 給 予 維 持 料 飼 養,1 周 後 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 更 換 高 熱 能 飼 料, 喂 飼 2 周 後, 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 在 高 熱 能 飼 料 基 礎 上 分 別 給 予 地 塞 米 松 0.8mg/kgBW 腹 腔 注 射 (0.008% 地 塞 米 松 注 射 量 1ml/100g 體 重 ), 每 日 1 次, 連 續 天 33

34 試 驗 結 束, 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 空 腹 血 糖 糖 耐 量 血 清 胰 島 素 及 膽 固 醇 甘 油 三 脂 水 準 觀 察 指 標 空 腹 血 糖 糖 耐 量 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 測 定 空 腹 血 糖 即 給 葡 萄 糖 前 (0 小 時 ) 血 糖 值, 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 空 白 對 照 組 不 做 處 理,15-20 分 鐘 後 各 組 經 口 給 予 葡 萄 糖 2.5g/kg BW, 測 定 給 葡 萄 糖 後 各 組 小 時 的 血 糖 值, 若 模 型 對 照 組 0.5 小 時 血 糖 值 10mmol/L, 或 模 型 對 照 組 0.5 小 時 2 小 時 任 一 時 間 點 血 糖 升 高 或 血 糖 曲 線 下 面 積 升 高, 與 空 白 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性, 判 定 模 型 糖 代 謝 紊 亂 成 立, 在 此 基 礎 上, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 空 腹 血 糖 給 葡 萄 糖 後 (0.5 2 小 時 ) 血 糖 及 小 時 血 糖 曲 線 下 面 積 的 變 化 ( 實 驗 前 血 糖 值 - 實 驗 後 血 糖 值 ) 血 糖 下 降 率 %= % 實 驗 前 血 糖 值 (0 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 0.5 (2 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 1.5 血 糖 曲 線 下 面 積 = 膽 固 醇 甘 油 三 脂 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 血 清 膽 固 醇 甘 油 三 脂, 若 模 型 對 照 組 血 清 膽 固 醇 或 甘 油 三 酯 明 顯 升 高, 與 空 白 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性, 判 定 模 型 脂 代 謝 紊 亂 成 立, 在 此 基 礎 上, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 血 脂 變 化 胰 島 素 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 血 清 胰 島 素, 模 型 對 照 組 與 空 白 對 照 組 比 較 胰 島 素 抵 抗 指 數 無 明 顯 下 降, 且 動 物 糖 / 脂 代 謝 紊 亂 成 立, 判 定 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 成 功 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 胰 島 素 抵 抗 情 況 血 糖 胰 島 素 胰 島 素 抵 抗 指 數 = 胰 島 素 /22.5e -ln 血 糖 四 氧 嘧 啶 誘 導 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 原 理 高 熱 能 飼 料 喂 飼 基 礎 上, 輔 以 小 劑 量 四 氧 嘧 啶 (C4H2N2O4 H2O, 分 子 量 ), 造 成 糖 / 脂 代 謝 紊 亂, 胰 島 素 抵 抗, 誘 發 實 驗 性 糖 尿 病 造 模 方 法 購 入 健 康 雄 性 大 鼠 (150 20g), 普 通 維 持 料 適 應 飼 養 3-5 天, 禁 食 3-4 小 時, 取 尾 血, 測 定 給 葡 萄 糖 前 ( 即 0 小 時 ) 血 糖 值, 給 2.5g/kgBW 葡 萄 糖 後 小 時 血 糖 值, 作 為 該 批 次 動 物 基 礎 值 以 小 時 血 糖 水 準 分 5 個 組, 即 1 個 空 白 對 照 組 1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組, 每 組 15 只 空 白 對 照 組 不 做 處 理,3 個 劑 量 組 灌 胃 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 連 續 33 天 各 組 給 予 維 持 料 飼 養,1 周 後 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 更 換 高 熱 能 飼 料, 喂 飼 3 周 後, 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 禁 食 24 小 時 ( 不 禁 水 ), 給 予 四 氧 嘧 啶

35 105mg/kgBW 腹 腔 注 射, 注 射 量 1ml/100g 體 重 注 射 後 繼 續 給 予 高 熱 能 飼 料 喂 飼 3-5 天 試 驗 結 束, 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 空 腹 血 糖 糖 耐 量 血 清 胰 島 素 及 膽 固 醇 甘 油 三 脂 水 準 觀 察 指 標 空 腹 血 糖 糖 耐 量 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 測 定 空 腹 血 糖 即 給 葡 萄 糖 前 (0 小 時 ) 血 糖 值, 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 空 白 對 照 組 不 做 處 理,15-20 分 鐘 後 各 組 經 口 給 予 葡 萄 糖 2.5g/kg BW, 測 定 給 葡 萄 糖 後 各 組 小 時 的 血 糖 值, 若 模 型 對 照 組 0.5 小 時 血 糖 值 10mmol/L, 或 模 型 對 照 組 0.5 小 時 2 小 時 任 一 時 間 點 血 糖 升 高 或 血 糖 曲 線 下 面 積 升 高, 與 空 白 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性, 判 定 模 型 糖 代 謝 紊 亂 成 立, 在 此 基 礎 上, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 空 腹 血 糖 給 葡 萄 糖 後 (0.5 2 小 時 ) 血 糖 及 小 時 血 糖 曲 線 下 面 積 的 變 化 ( 實 驗 前 血 糖 值 - 實 驗 後 血 糖 值 ) 血 糖 下 降 率 %= % 實 驗 前 血 糖 值 (0 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 0.5 (2 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 1.5 血 糖 曲 線 下 面 積 = 膽 固 醇 甘 油 三 脂 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 血 清 膽 固 醇 甘 油 三 脂, 若 模 型 對 照 組 血 清 膽 固 醇 或 甘 油 三 酯 明 顯 升 高, 與 空 白 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性, 判 定 模 型 脂 代 謝 紊 亂 成 立, 在 此 基 礎 上, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 血 脂 變 化 胰 島 素 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 血 清 胰 島 素, 模 型 對 照 組 與 空 白 對 照 組 比 較 胰 島 素 抵 抗 指 數 無 明 顯 下 降, 且 動 物 糖 / 脂 代 謝 紊 亂 成 立, 判 定 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 成 功 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 胰 島 素 抵 抗 情 況 血 糖 胰 島 素 胰 島 素 抵 抗 指 數 = 胰 島 素 /22.5e -ln 血 糖 資 料 處 理 及 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值,F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 指 標 判 定 正 常 動 物 降 糖 試 驗 血 糖 指 標 : 空 腹 血 糖 受 試 樣 品 劑 量 組 與 對 照 組 比 較 無 統 計 學 意 義, 判 定 對 正 常 動 物 血 糖 無 35

36 影 響 高 血 糖 模 型 降 糖 試 驗 空 腹 血 糖 指 標 : 模 型 成 立 的 前 提 下, 受 試 樣 品 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 空 腹 血 糖 下 降 或 血 糖 下 降 百 分 率 升 高 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 空 腹 血 糖 指 標 結 果 陽 性 糖 耐 量 指 標 : 模 型 成 立 的 前 提 下, 受 試 樣 品 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 在 給 葡 萄 糖 或 醫 用 澱 粉 後 小 時 任 一 時 間 點 血 糖 下 降 ( 或 血 糖 下 降 百 分 率 升 高 ) 有 統 計 學 意 義, 或 小 時 血 糖 曲 線 下 面 積 降 低 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 糖 耐 量 指 標 結 果 陽 性 血 脂 指 標 : 模 型 成 立 的 前 提 下, 受 試 樣 品 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 血 清 膽 固 醇 或 甘 油 三 酯 下 降 有 統 計 學 意 義, 可 判 定 該 受 試 樣 品 降 血 脂 指 標 陽 性 結 果 判 定 方 案 一 : 空 腹 血 糖 和 糖 耐 量 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 且 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 無 影 響, 即 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 血 糖 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 方 案 二 : 空 腹 血 糖 和 糖 耐 量 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 且 血 脂 ( 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 ) 無 明 顯 升 高, 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 無 影 響, 即 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 血 糖 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 1.6 注 意 事 項 為 了 使 實 驗 動 物 糖 代 謝 功 能 狀 態 儘 量 保 持 一 致, 也 為 了 準 確 地 按 體 重 計 算 受 試 樣 品 的 用 量, 實 驗 前 動 物 應 嚴 格 禁 食 ( 不 禁 水 ), 實 驗 前 後 禁 食 條 件 應 一 致, 鼠 類 在 禁 食 的 同 時 應 更 換 襯 墊 物 如 用 血 清 樣 品 進 行 測 定, 應 於 取 血 後 30 分 鐘 內 分 離 血 清, 分 離 後 血 清 的 含 糖 量 在 6 小 時 內 不 變 用 血 清 製 備 的 無 蛋 白 血 濾 液 可 保 存 48 小 時 以 上 高 濃 度 的 還 原 性 物 質 如 Vit C 亦 能 與 色 素 原 競 爭 游 離 氧, 干 擾 反 應, 使 結 果 偏 低 血 紅 蛋 白 能 使 過 氧 化 氫 過 早 分 解, 亦 干 擾 反 應, 致 使 測 得 血 糖 值 偏 低 故 對 已 溶 血 的 全 血 或 血 清 必 須 製 備 無 蛋 白 濾 液 後, 再 進 行 測 定 1.7 血 糖 測 定 方 法 用 試 紙 或 試 劑 盒, 按 說 明 書 操 作 ; 若 自 行 配 製 試 劑, 按 下 列 方 法 操 作 : 原 理 葡 萄 糖 氧 化 酶 是 一 種 需 氧 脫 氫 酶, 能 催 化 葡 萄 糖 生 成 葡 萄 糖 酸 和 過 氧 化 氫, 後 者 在 過 氧 化 物 酶 作 用 下 放 出 氧, 使 4- 氨 基 安 替 比 林 與 酚 氧 化 縮 合, 生 成 紅 色 醌 類 化 合 物, 可 在 波 長 505nm 比 色 測 定 葡 萄 糖 氧 化 酶 葡 萄 糖 葡 萄 糖 酸 + 過 氧 化 氫 過 氧 化 物 酶 過 氧 化 氫 + 酚 +4- 氨 基 安 替 比 林 紅 色 醌 類 化 合 物 36

37 1.7.2 試 劑 配 製 磷 酸 鹽 緩 衝 液 (0.2mol/L,pH7.0) 0.2mol/L Na2HPO461mL,0.2mol/L KH2PO439mL 混 合 即 可 酶 試 劑 葡 萄 糖 氧 化 酶 400u, 過 氧 化 物 酶 0.6mg,4- 氨 基 安 替 比 林 10mg, 疊 氮 鈉 100mg, 加 磷 酸 鹽 緩 衝 液 至 100mL,PH 調 至 7 冰 箱 存 放 至 少 可 穩 定 2 個 月 酚 試 劑 酚 100mg 溶 於 100mL 蒸 餾 水 中 酶 混 合 試 劑 取 等 量 酶 試 劑 和 酚 試 劑 混 合 在 冰 箱 中 可 存 放 1 個 月 葡 萄 糖 標 準 液 儲 存 液 : 無 水 D- 葡 萄 糖 (A.R.) 在 烤 箱 中 80 烤 4 小 時, 冷 卻 後, 存 放 於 乾 燥 器 中 至 恒 重 精 確 稱 取 2g 以 0.25% 苯 甲 酸 溶 液 溶 解 並 移 入 100mL 容 量 瓶 中, 再 用 苯 甲 酸 溶 液 稀 釋 至 100mL 應 用 液 : 在 100mL 容 量 瓶 中 準 確 加 入 儲 存 液 5mL, 再 用 0.25% 苯 甲 酸 溶 液 稀 釋 至 100mL, 即 1mg/mL 應 用 液 蛋 白 沉 澱 劑 溶 解 磷 酸 氫 二 鈉 10g 鎢 酸 鈉 10g 氯 化 鈉 9g 於 800mL 蒸 餾 水 中, 加 入 1mol/L 鹽 酸 125mL, 並 用 蒸 餾 水 稀 釋 至 1000mL 操 作 步 驟 取 蛋 白 沉 澱 劑 1mL 加 入 血 漿 ( 血 清 )50μL 混 勻 室 溫 放 置 7 分 鐘 後, 離 心, 取 上 清 液 ( 無 蛋 白 血 濾 液 ) 測 定 葡 萄 糖 標 準 應 用 液 亦 進 行 同 樣 處 理 測 定 管 標 準 管 空 白 管 無 蛋 白 血 濾 液 ml 處 理 後 的 葡 萄 糖 標 準 液 ml 蛋 白 沉 澱 液 ml 0.5 酶 混 合 試 劑 ml 混 勻 後,37 水 浴 保 溫 15 分 鐘, 用 空 白 管 調 零 點, 在 波 長 505nm 處 比 色 結 果 計 算 測 定 管 OD 血 糖 含 量 (mmol/l)= 100/18 標 準 管 OD 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 試 驗 設 計 試 驗 採 用 隨 機 分 組, 組 間 和 自 身 兩 種 對 照 設 計 2.2 受 試 產 品 37

38 受 試 產 品 必 須 是 具 有 定 型 包 裝 標 明 服 用 方 法 和 服 用 量 的 定 型 產 品 ; 安 慰 劑 除 功 效 成 分 外, 在 劑 型 口 感 外 觀 和 包 裝 上 與 受 試 產 品 保 持 一 致 2.3 受 試 者 選 擇 納 入 標 準 選 擇 經 飲 食 控 制 或 口 服 降 糖 藥 治 療 後 病 情 較 穩 定, 不 需 要 更 換 藥 物 品 種 及 劑 量, 僅 服 用 維 持 量 的 成 年 II 型 糖 尿 病 患 者 (DM), 即 空 腹 血 糖 7mmol/L(126mg/dl) 或 餐 後 2 小 時 血 糖 11.1mmol/L (200mg/dl); 也 可 選 擇 空 腹 血 糖 5.6-7mmol/L( mg/dl) 或 餐 後 2 小 時 血 糖 mmol/L( mg/dl) 的 糖 調 節 受 損 (IGR) 人 群 排 除 標 準 Ⅰ 型 糖 尿 病 病 人 年 齡 在 18 歲 以 下 或 65 歲 以 上, 妊 娠 或 哺 乳 期 婦 女, 對 受 試 樣 品 過 敏 者 有 心 肝 腎 等 主 要 臟 器 併 發 症, 或 合 併 有 其 它 嚴 重 疾 病, 精 神 病 患 者, 服 用 糖 皮 質 激 素 或 其 它 影 響 血 糖 藥 物 者 不 能 配 合 飲 食 控 制 而 影 響 觀 察 結 果 者 近 3 個 月 內 有 糖 尿 病 酮 症 酸 中 毒 以 及 感 染 者 短 期 內 服 用 與 受 試 功 能 有 關 的 物 品, 影 響 到 對 結 果 的 判 斷 者 凡 不 符 合 納 入 標 準, 未 按 規 定 服 用 受 試 樣 品, 或 資 料 不 全 影 響 觀 察 結 果 者 2.4 受 試 者 分 組 採 用 自 身 和 組 間 兩 種 對 照 設 計 根 據 隨 機 盲 法 的 要 求 進 行 分 組 按 受 試 者 的 糖 化 血 紅 蛋 白 或 糖 化 血 清 蛋 白 及 血 糖 水 準 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 病 程 服 藥 種 類 ( 磺 脲 類 雙 胍 類 ) 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 2.5 試 驗 方 法 試 驗 前 對 每 一 位 受 試 者 按 性 別 年 齡 不 同 勞 動 強 度 理 想 體 重 參 照 原 來 生 活 習 慣 規 定 相 應 的 飲 食, 試 食 期 間 堅 持 飲 食 控 制, 治 療 糖 尿 病 的 藥 物 種 類 和 劑 量 不 變 試 食 組 在 服 藥 的 基 礎 上, 按 推 薦 服 用 方 法 服 用 量 每 日 服 用 受 試 樣 品, 對 照 組 在 服 藥 的 基 礎 上 可 服 用 安 慰 劑 或 採 用 空 白 對 照 受 試 樣 品 給 予 時 間 2 個 月, 必 要 時 可 延 長 至 4 個 月 2.6 觀 察 指 標 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 體 征 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 38

39 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 ( 僅 試 驗 前 檢 查 一 次 ) 功 效 指 標 症 狀 觀 察 詳 細 詢 問 病 史, 瞭 解 患 者 飲 食 情 況, 用 藥 情 況, 活 動 量, 觀 察 口 渴 多 飲 多 食 易 饑 倦 怠 乏 力 多 尿 等 主 要 臨 床 症 狀, 按 症 狀 輕 重 積 分, 於 試 食 前 後 統 計 積 分 值, 並 就 其 主 要 症 狀 改 善 ( 改 善 1 分 為 有 效 ), 觀 察 臨 床 症 狀 改 善 率 臨 床 症 狀 積 分 表 無 症 狀 輕 症 中 症 重 症 ( 積 0 分 ) ( 積 1 分 ) ( 積 2 分 ) ( 積 3 分 ) 口 渴 多 飲 無 有 口 渴 感, 飲 水 量 口 渴 感 明 顯, 飲 水 量 口 渴 顯 著, 飲 水 量 <1 L/ 日 1-2 L/ 日 >2L/ 日 多 食 易 饑 無 餐 前 有 輕 度 饑 餓 感 餐 前 有 明 顯 饑 餓 感 晝 夜 均 有 饑 餓 感 多 尿 尿 量 <1.8L/ 日 尿 量 L/ 日 尿 量 L/ 日 尿 量 >3 L/ 日 倦 怠 乏 力 無 精 神 不 振, 不 耐 勞 力 精 神 疲 乏, 可 堅 持 輕 體 力 勞 動 精 神 極 度 疲 乏, 勉 強 堅 持 日 常 活 動 空 腹 血 糖 觀 察 試 食 前 後 空 腹 血 糖 值 空 腹 血 糖 下 降 百 分 率 空 腹 血 糖 有 效 率 餐 後 2 小 時 血 糖 觀 察 試 食 前 後 食 用 100g 精 粉 饅 頭 後 2 小 時 血 糖 值 餐 後 2 小 時 血 糖 下 降 百 分 率 餐 後 2 小 時 血 糖 有 效 率 糖 化 血 紅 蛋 白 或 糖 化 血 清 蛋 白 觀 察 試 食 前 後 糖 化 血 紅 蛋 白 或 糖 化 血 清 蛋 白 變 化 血 脂 觀 察 試 食 前 後 血 清 總 膽 固 醇 血 清 甘 油 三 酯 水 準 2.7 注 意 血 清 ( 漿 ) 中 的 葡 萄 糖 能 與 白 蛋 白 及 其 他 血 清 蛋 白 分 子 末 端 的 氨 基 上 發 生 非 酶 促 糖 化 反 應 而 形 成 高 分 子 酮 胺 結 構 此 酮 胺 結 構 能 在 鹼 性 環 境 中 與 硝 基 四 氮 唑 蘭 (NBT) 發 生 還 原 反 應 生 成 藍 紫 色 物 質, 以 1- 去 氧 -1- 嗎 啡 啉 果 糖 (DMF) 作 標 準 參 照 物 在 540 nm 波 長 處 (530 nm-550 nm) 進 行 比 色 測 定, 求 得 樣 本 中 果 糖 胺 的 濃 度 參 考 值 為 1.7 mmol/l-2.5 mmol/l 由 於 血 清 中 白 蛋 白 的 半 衰 期 約 21 d, 所 以 糖 化 血 清 蛋 白 測 定 可 反 映 患 者 過 去 2-3 周 平 均 血 糖 水 準 糖 尿 病 患 者 的 糖 化 血 清 蛋 白 的 增 加 比 糖 化 血 紅 蛋 白 迅 速, 當 血 糖 得 到 較 好 控 制 時, 糖 化 血 清 蛋 白 的 下 降 也 比 糖 化 血 紅 蛋 白 迅 速, 因 此 能 較 早 地 提 供 血 糖 控 制 信 息 糖 化 血 清 蛋 白 更 能 靈 敏 地 反 映 近 期 糖 尿 病 患 者 血 糖 的 波 動 情 況 它 的 敏 感 度 高, 特 異 強 並 不 受 年 齡, 飲 食, 藥 物, 妊 娠 等 因 素 的 影 響, 對 血 糖 濃 度 的 臨 時 波 動 反 應 不 敏 感, 是 診 斷 糖 尿 病 和 較 長 時 間 血 糖 控 制 水 準 研 究 的 良 好 指 標 標 本 溶 血 對 糖 化 血 清 蛋 白 的 測 定 結 果 有 較 大 影 響, 血 清 中 1 g/l 的 血 紅 蛋 白 可 導 致 GSP 測 定 結 果 增 高 0.6 mmol/l 左 右 39

40 2.7.2 糖 化 血 紅 蛋 白 是 經 過 緩 慢 的, 不 可 逆 的, 非 酶 促 反 應 而 結 合 形 成 的 產 物, 其 濃 度 與 紅 細 胞 壽 命 ( 平 均 120 天 ) 和 該 時 期 內 血 糖 平 均 濃 度 有 關, 不 受 每 天 葡 萄 糖 波 動 的 影 響, 也 不 受 運 動 或 食 物 的 影 響, 可 反 映 患 者 抽 血 前 2 個 月 -3 個 月 的 平 均 血 糖 水 準, 是 判 斷 糖 尿 病 長 期 控 制 的 良 好 指 標 糖 化 血 紅 蛋 白 在 健 康 人 體 內 的 波 動 範 圍 很 小 (0.1%-0.2%), 正 常 值 為 4%-6% 2.8 資 料 處 理 和 結 果 判 定 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 ; 方 差 齊 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 血 糖 下 降 幅 度 試 驗 前 空 腹 血 糖 試 驗 後 空 腹 血 糖 空 腹 血 糖 下 降 百 分 率 = 100% 試 驗 前 空 腹 血 糖 試 驗 前 餐 後 2 小 時 血 糖 試 驗 後 餐 後 2 小 時 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 下 降 百 分 率 = 100% 試 驗 前 餐 後 2 小 時 血 糖 糖 化 血 紅 蛋 白 或 糖 化 血 清 蛋 白 下 降 幅 度 試 驗 前 糖 化 血 紅 蛋 白 試 驗 後 糖 化 血 紅 蛋 白 糖 化 血 紅 蛋 白 下 降 百 分 率 = 100% 試 驗 前 糖 化 血 紅 蛋 白 試 驗 前 糖 化 請 紅 蛋 白 試 驗 後 糖 化 血 清 蛋 白 糖 化 血 清 蛋 白 下 降 百 分 率 = 100% 試 驗 前 糖 化 血 清 蛋 白 功 效 判 定 標 準 : 有 效 :⑴ 試 驗 後 空 腹 血 糖 恢 復 正 常 ( 5.6 mmol/l), 或 空 腹 血 糖 下 降 幅 度 10% ⑵ 試 驗 後 餐 後 2 小 時 血 糖 恢 復 正 常 ( 7.8 mmol/l), 或 餐 後 2 小 時 血 糖 下 降 幅 度 10% 無 效 : 未 達 到 有 效 標 準 空 腹 血 糖 有 效 例 數 空 腹 血 糖 下 降 有 效 率 = 100% 空 腹 血 糖 觀 察 例 數 餐 後 2 小 時 血 糖 有 效 例 數 餐 後 2 小 時 血 糖 下 降 有 效 率 = 100% 餐 後 2 小 時 血 糖 觀 察 例 數 指 標 判 定 40

41 空 腹 血 糖 : 1 試 驗 前 後 自 身 比 較, 空 腹 血 糖 下 降 差 異 有 顯 著 性, 且 試 驗 後 平 均 血 糖 下 降 幅 度 10%;2 試 驗 後 試 食 組 空 腹 血 糖 值 下 降 或 空 腹 血 糖 下 降 幅 度 升 高 與 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性 ; 3 試 驗 後 試 食 組 空 腹 血 糖 下 降 有 效 率 升 高 與 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性 滿 足 上 述 3 個 條 件, 可 判 定 該 受 試 樣 品 空 腹 血 糖 指 標 結 果 陽 性 餐 後 2 小 時 血 糖 : 1 試 驗 前 後 自 身 比 較, 餐 後 2 小 時 血 糖 下 降 差 異 有 顯 著 性, 且 試 驗 後 平 均 血 糖 下 降 幅 度 10 %;2 試 驗 後 試 食 組 餐 後 2 小 時 血 糖 值 下 降 或 餐 後 2 小 時 血 糖 下 降 幅 度 升 高 與 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性 ;3 試 驗 後 試 食 組 餐 後 2 小 時 血 糖 下 降 有 效 率 升 高 與 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性 滿 足 上 述 3 個 條 件, 可 判 定 該 受 試 樣 品 餐 後 2 小 時 血 糖 指 標 結 果 陽 性 糖 化 血 紅 蛋 白 ( 或 糖 化 血 清 蛋 白 ): 1 試 驗 前 後 自 身 比 較, 糖 化 血 紅 蛋 白 ( 或 糖 化 血 清 蛋 白 ) 下 降 差 異 有 顯 著 性 ;2 試 驗 後 試 食 組 糖 化 血 紅 蛋 白 ( 或 糖 化 血 清 蛋 白 ) 值 下 降 或 糖 化 血 紅 蛋 白 ( 或 糖 化 血 清 蛋 白 ) 下 降 幅 度 升 高 與 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性 滿 足 上 述 2 個 條 件, 可 判 定 該 受 試 樣 品 糖 化 血 紅 蛋 白 ( 或 糖 化 血 清 蛋 白 ) 指 標 結 果 陽 性 血 清 膽 固 醇 : 1 試 驗 前 後 自 身 比 較, 血 清 膽 固 醇 下 降 差 異 有 顯 著 性 ;2 試 驗 後 試 食 組 血 清 膽 固 醇 下 降 與 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性 滿 足 上 述 2 個 條 件, 可 判 定 該 受 試 樣 品 血 清 膽 固 醇 指 標 結 果 陽 性 血 清 甘 油 三 酯 : 1 試 驗 前 後 自 身 比 較, 血 清 甘 油 三 酯 下 降 差 異 有 顯 著 性 ;2 試 驗 後 試 食 組 血 清 甘 油 三 酯 下 降 與 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性 滿 足 上 述 2 個 條 件, 可 判 定 該 受 試 樣 品 血 清 甘 油 三 酯 指 標 結 果 陽 性 結 果 判 定 空 腹 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 糖 化 血 紅 蛋 白 ( 或 糖 化 血 清 蛋 白 ) 血 脂 四 項 指 標 均 無 明 顯 升 高, 且 空 腹 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 兩 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 對 機 體 健 康 無 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 輔 助 降 血 糖 功 能 的 作 用 41

42 附 件 4: 緩 解 視 疲 勞 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 人 體 試 食 試 驗 項 目 1.1 分 別 於 試 食 前 後 進 行 眼 部 症 狀 及 眼 底 檢 查, 血 尿 常 規 檢 查, 肝 腎 功 能 檢 查, 症 狀 詢 問 用 眼 情 況 調 查 ; 於 試 驗 前 進 行 一 次 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 1.2 明 視 持 久 度 1.3 視 力 2 試 驗 原 則 2.1 受 試 樣 品 試 食 時 間 為 60 天 2.2 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.3 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 試 驗 組 自 身 比 較 或 試 驗 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 症 狀 改 善 且 症 狀 總 積 分 差 異 有 顯 著 性 (p<0.05) 3.2 試 驗 組 自 身 比 較 或 試 驗 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 明 視 持 久 度 差 異 有 顯 著 性 (p<0.05), 且 平 均 明 視 持 久 度 提 高 大 於 等 於 10% 具 備 3.1 及 3.2 可 判 定 該 受 試 物 具 有 緩 解 視 疲 勞 功 能 42

43 緩 解 視 疲 勞 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Alleviating Eye Fatigue Function 1 受 試 者 納 入 標 準 歲 -65 歲 的 成 人 1.2 長 期 用 眼, 視 力 易 疲 勞 者 2 受 試 者 排 除 標 準 2.1 患 有 感 染 性 外 傷 性 眼 部 疾 患 者 進 行 眼 部 手 術 不 足 3 個 月 者 2.2 患 有 角 膜 晶 體 玻 璃 體 眼 底 病 變 等 內 外 眼 疾 患 者 2.3 患 有 心 血 管 腦 血 管 肝 腎 造 血 系 統 等 疾 病 者 2.4 妊 娠 或 哺 乳 期 婦 女 過 敏 體 質 患 者 2.5 短 期 內 服 用 與 受 試 功 能 有 關 的 物 品, 影 響 到 對 結 果 的 判 定 者 2.6 長 期 服 用 有 關 治 療 視 力 的 藥 物, 保 健 品 或 使 用 其 他 治 療 方 法 未 能 終 止 者 2.7 不 符 合 納 入 標 準, 未 按 規 定 食 用 受 試 物 者, 或 資 料 不 全 等 影 響 功 效 或 安 全 性 判 斷 者 3 試 驗 設 計 及 分 組 要 求 採 用 自 身 和 組 間 兩 種 對 照 設 計 根 據 隨 機 雙 盲 的 要 求 進 行 分 組, 分 組 時 根 據 症 狀 及 視 力 檢 查 情 況, 使 試 食 組 和 對 照 組 的 症 狀 及 視 力 水 準 均 衡 同 時 要 考 慮 年 齡 性 別 等 因 素, 使 兩 組 具 有 可 比 性 試 食 試 驗 結 束 時 每 組 受 試 者 人 數 不 少 於 50 例 4 受 試 物 的 劑 量 和 使 用 方 法 60 天 試 食 組 按 推 薦 方 法 和 推 薦 量 服 用 受 試 物, 對 照 組 服 用 安 慰 劑 受 試 物 服 用 時 間 為 連 續 5 觀 察 指 標 5.1 安 全 性 指 標 : 血 尿 常 規 檢 查, 體 格 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 或 X 光 片 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 ( 於 試 食 前 檢 查 一 次 ) 5.2 功 效 性 指 標 : 于 試 食 開 始 及 結 束 時 檢 查 問 卷 調 查 : 症 狀 詢 問 用 眼 情 況 43

44 5.2.2 眼 科 檢 查 : 包 括 眼 底 檢 查 視 力 檢 查 ( 近 視 遠 視 散 光 等 ) 明 視 持 久 度 ( 測 定 方 法 見 附 錄 ) 6 功 效 判 定 標 準 6.1 症 狀 改 善 有 效 率 眼 酸 痛 眼 脹 畏 光 視 物 模 糊 眼 乾 澀 異 物 感 流 淚, 全 身 不 適 8 種 症 狀 中 有 3 種 改 善, 且 其 他 症 狀 無 惡 化 即 判 定 症 狀 改 善 計 算 兩 組 症 狀 改 善 例 數 和 兩 組 症 狀 改 善 有 效 率 症 狀 改 善 有 效 率 (%) 計 算 方 法 為 症 狀 改 善 例 數 / 試 食 例 數 100 將 兩 組 症 狀 改 善 有 效 率 進 行 統 計 學 檢 驗 6.2 症 狀 平 均 積 分 計 算 每 位 試 食 者 試 食 前 後 的 症 狀 積 分, 分 別 計 算 兩 組 的 平 均 積 分 值, 並 進 行 統 計 學 檢 驗 表 1 視 疲 勞 症 狀 判 定 方 法 ( 半 定 量 積 分 法 ) 症 狀 / 積 分 0 1 分 2 分 3 分 眼 脹 無 偶 感 眼 脹 時 有 眼 脹, 休 息 後 好 轉 經 常 眼 脹, 休 息 後 改 善 眼 酸 痛 無 偶 感 隱 痛 時 有 眼 痛 經 常 眼 痛 畏 光 無 偶 有 畏 光 時 有 畏 光 經 常 畏 光 視 物 模 糊 無 偶 有 模 糊 時 有 模 糊, 休 息 後 緩 解 經 常 模 糊, 休 息 後 改 善 眼 乾 澀 無 偶 有 乾 澀 時 有 乾 澀 經 常 乾 澀 異 物 感 無 偶 有 異 物 感 時 有 異 物 感 經 常 異 物 感 流 淚 無 偶 有 流 淚 時 有 流 淚 經 常 流 淚 與 視 疲 勞 相 關 的 全 身 不 適 無 偶 有 全 身 不 適 時 有 全 身 不 適 經 常 全 身 不 適 注 : 偶 感 是 指 1-2 次 /2 天 ; 時 有 是 指 1-3 次 / 天 ; 經 常 是 指 >3 次 / 天 6.3 視 力 改 善 率 為 參 考 指 標 以 試 食 後 較 試 食 前 提 高 兩 行 為 改 善, 統 計 兩 組 服 用 受 試 物 後 的 視 力 改 善 率 作 為 參 考 指 標 參 考 指 標 不 作 為 對 緩 解 視 疲 勞 功 能 是 否 有 效 的 判 定 標 準 6.4 明 視 持 久 度 試 食 組 自 身 比 較 或 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 明 視 持 久 度 差 異 有 顯 著 性 (p<0.05), 且 平 均 明 視 持 久 度 提 高 大 於 等 於 10% 為 有 效 7 資 料 處 理 和 統 計 分 析 計 量 資 料 可 用 t 檢 驗 進 行 分 析 自 身 對 照 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 44

45 檢 驗 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 在 試 食 前 組 間 比 較 差 異 無 顯 著 性 的 前 提 下, 可 進 行 試 驗 後 組 間 比 較 計 數 資 料 可 用 X2 檢 驗 四 格 表 總 例 數 小 於 40, 或 總 例 數 等 於 或 大 於 40 但 出 現 理 論 頻 數 等 於 或 小 於 1 時, 應 改 用 確 切 概 率 法 8 結 果 判 定 8.1 試 食 組 自 身 比 較 或 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 症 狀 改 善 有 效 率 或 症 狀 總 積 分 差 異 有 顯 著 性 (p<0.05) 8.2 試 食 組 自 身 比 較 或 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 明 視 持 久 度 差 異 有 顯 著 性 (p<0.05), 且 平 均 明 視 持 久 度 提 高 大 於 等 於 10% 具 備 8.1 及 8.2 且 視 力 改 善 率 不 明 顯 降 低, 可 判 定 該 受 試 物 具 有 有 助 於 緩 解 視 疲 勞 功 能 的 作 用 45

46 附 錄 : 明 視 持 久 度 測 定 方 法 明 視 持 久 度 測 定 此 法 是 用 於 評 價 視 疲 勞 的 一 種 方 法 當 人 大 腦 皮 質 興 奮 性 降 低 時, 視 覺 分 析 功 能 下 降, 眼 睛 注 視 物 件 物 的 過 程 中, 不 能 明 視 的 時 間 增 加, 能 明 視 的 時 間 減 少 這 種 明 視 時 間 對 注 視 時 間 的 百 分 比 稱 為 明 視 持 久 度, 它 是 綜 合 反 映 視 功 能 和 心 理 功 能 的 一 種 指 標 明 視 持 久 度 的 測 定 方 法 如 下 : 在 檢 查 表 上 繪 製 品 字 形 立 體 方 塊 圖, 方 塊 每 邊 長 1cm, 局 部 照 明 100 LX-150 LX ( 可 使 用 專 門 製 作 的 燈 箱 ) 測 定 時, 檢 查 表 與 眼 睛 的 距 離 應 按 照 受 試 者 視 物 習 慣 保 持 在 適 當 距 離 不 動, 規 定 受 試 者 看 到 品 字 圖 像 視 為 明 視, 倒 品 字 時 為 不 明 視 測 定 時 間 為 3min 檢 查 時 讓 受 試 者 手 持 能 斷 續 計 時 的 碼 錶, 檢 查 者 發 出 開 始 的 口 令 後, 受 試 者 立 即 注 視 方 塊 中 的 圖 案 ( 或 打 開 燈 箱 開 關 ), 同 時 開 動 手 中 的 碼 錶 計 時 在 注 視 過 程 中 看 到 倒 品 字 時 立 即 按 下 碼 錶 的 暫 停 開 關 ; 看 到 又 呈 品 字 圖 像 時 再 開 動 碼 錶, 如 此 反 復 進 行 測 定 到 規 定 時 間 3min 結 束 時 受 試 者 聽 到 檢 查 者 的 口 令 立 即 停 止 碼 錶, 這 段 時 間 內 碼 錶 走 過 的 讀 數 就 是 受 試 者 看 成 品 字 圖 像 的 總 時 間, 即 明 視 時 間 明 視 持 久 度 =( 明 視 時 間 / 注 視 總 時 間 ) 100% 測 定 時 應 注 意 場 地 和 照 明, 還 與 受 試 者 受 試 前 的 用 眼 程 度 有 關, 實 驗 前 應 注 意 明 視 持 久 度 測 定 用 品 字 圖 46

47 附 件 5: 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 血 紅 蛋 白 紅 細 胞 比 積 / 紅 細 胞 游 離 原 卟 啉 1.2 人 體 試 食 試 驗 血 紅 蛋 白 血 清 鐵 蛋 白 紅 細 胞 游 離 原 卟 啉 / 紅 細 胞 運 鐵 蛋 白 飽 和 度 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.2 針 對 兒 童 的 人 體 試 食 試 驗, 只 測 血 紅 蛋 白 和 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 2.3 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 血 紅 蛋 白 指 標 陽 性, 紅 細 胞 游 離 原 卟 啉 / 紅 細 胞 壓 積 二 項 指 標 一 項 指 標 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 動 物 實 驗 結 果 為 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 針 對 改 善 兒 童 缺 鐵 性 貧 血 功 能 的, 血 紅 蛋 白 和 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 二 項 指 標 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 作 用 針 對 改 善 成 人 缺 鐵 性 貧 血 功 能 的, 血 紅 蛋 白 指 標 陽 性, 血 清 鐵 蛋 白 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 / 血 清 運 鐵 蛋 白 飽 和 度 二 項 指 標 一 項 指 標 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 作 用 47

48 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Improving Nutritional Anaemia Function 1. 動 物 實 驗 1.1 原 理 用 低 鐵 飼 料 喂 飼 動 物 可 形 成 實 驗 性 缺 鐵 性 貧 血 模 型, 再 給 予 受 試 樣 品, 觀 察 其 對 血 液 細 胞 學 血 液 生 化 學 等 指 標 的 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 對 改 善 動 物 缺 鐵 性 貧 血 的 作 用 1.2 實 驗 動 物 健 康 初 斷 乳 大 鼠, 單 一 性 別, 每 組 大 鼠 8-12 只 1.3 低 鐵 飼 料 配 方 : 成 分 添 加 量 g/kg 玉 米 澱 粉 蛋 清 蛋 白 * 蔗 糖 玉 米 油 ( 無 添 加 劑 ) 70.0 纖 維 素 50.0 混 合 礦 物 鹽 (AIN-93G-MX) 35.0 混 合 維 生 素 (AIN-93G-VX) 10.0 L- 胱 氨 酸 氯 化 膽 鹼 * 亦 可 使 用 EDTA 處 理 的 酪 蛋 白 AIN-93G 混 合 礦 物 鹽 配 方 礦 物 質 添 加 量 g or mg/kg mix Calcium carbonate anhydrous Potassium phosphate monobasic Potassium citrate, tripotassium monohydrate Sodium chloride Potassium sulfate Magnesium oxide Zinc carbonate 1.65 Sodium meta-silicater9h2o

49 Manganous carbonate 0.63 Cupric carbonate 0.30 Chromium potassium sulfater12h2o Boric acid (17.5% B), mg Sodium fluoride (45.24% F), mg Nickel carbonate (45% Ni), mg Lithium chloride (16.38% Li), mg Sodium selenate anhydrous(41.79% Se), mg AIN -93G 混 合 維 生 素 配 方 維 生 素 添 加 量 g/kg mix Nicotinic acid Ca pantothenate Pyridoxine-HCl Thiamin-HCl Riboflavin Folic acid Biotin Vitamin B-12 (cyanocobalamin) (0.1% in mannitol) Vitamin E (all-rac-a-tocopheryl acetate)2 ( IU/g) Vitamin A (all-trans-retinyl palmitate) (500,000 IU/g) Vitamin D-3 (cholecalciferol) (400,000 IU/g) Vitamin K-1 (phylloquinone) Powdered sucrose 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 和 一 個 低 鐵 對 照 組, 以 人 體 推 薦 量 的 5 倍 為 其 中 的 一 個 劑 量 組, 另 設 二 個 劑 量 組, 必 要 時 設 陽 性 對 照 組 ( 硫 酸 亞 鐵 或 乳 酸 亞 鐵, 劑 量 為 2 ppm 或 2 mg/(kgbw), 以 Fe 元 素 計 ) 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 1.5 實 驗 步 驟 建 立 缺 鐵 性 貧 血 大 鼠 模 型 選 用 健 康 斷 乳 大 鼠 在 實 驗 環 境 下 適 應 3-5 天 后 飼 予 低 鐵 飼 料 及 去 離 子 水 ( 或 雙 蒸 水 ), 採 用 不 銹 鋼 籠 及 食 罐, 同 時, 採 用 剪 尾 取 血 法 放 血,5 天 一 次, 每 次 ml 實 驗 過 程 中 避 免 鐵 污 染 自 第 3 周 開 始 每 週 選 取 部 分 大 鼠 采 尾 血 測 Hb, 如 多 數 動 物 Hb 低 於 100g/L 時, 測 定 全 部 大 鼠 的 體 重 及 Hb 49

50 1.5.2 恢 復 實 驗 選 取 Hb<100g/L 的 大 鼠 作 為 實 驗 動 物, 根 據 貧 血 大 鼠 Hb 水 準 和 體 重 將 其 隨 機 分 為 低 鐵 對 照 組 和 三 個 實 驗 組, 各 組 均 繼 續 飼 予 低 鐵 飼 料, 低 鐵 對 照 組 給 予 相 應 溶 劑, 實 驗 組 分 別 給 予 不 同 劑 量 的 受 試 樣 品, 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天, 測 定 體 重 及 各 項 血 液 學 指 標 1.6 觀 察 指 標 體 重 血 紅 蛋 白 紅 細 胞 比 積 / 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 血 紅 蛋 白 測 定 ( 氰 化 高 鐵 法 ) 消 光 係 數 法 和 標 準 曲 線 法 任 選 其 一 測 定 血 紅 蛋 白 吸 光 係 數 法 原 理 血 紅 蛋 白 (haemoglobin,hb) 被 鐵 氰 化 鉀 氧 化 後 生 成 高 鐵 血 紅 蛋 白, 再 與 氰 離 子 結 合 形 成 氰 化 高 鐵 血 紅 蛋 白 ( 紅 色 ), 氰 化 高 鐵 血 紅 蛋 白 ( 紅 色 ) 極 為 穩 定, 在 540nm 波 長 下, 摩 爾 吸 光 係 數 為 44000, 據 此, 用 分 光 光 度 法 測 其 光 密 度, 運 用 吸 光 係 數 作 血 紅 蛋 白 的 定 量 測 定 儀 器 分 光 光 度 計 10 微 升 微 量 吸 管 試 劑 稱 取 碳 酸 氫 鈉 (NaHCO3,AR)140 毫 克 鐵 氰 化 鉀 200 毫 克 氰 化 鉀 50 毫 克, 用 水 溶 解 並 稀 釋 到 1000 毫 升 貯 存 於 棕 色 試 劑 瓶 內, 在 暗 處 或 冰 箱 (4 ) 保 存, 至 少 可 穩 定 數 月 到 1 年 實 驗 步 驟 取 試 劑 2.5 毫 升 於 5 毫 升 帶 蓋 試 管 中, 加 入 10 微 升 血 液, 混 勻 後, 放 置 15 分 鐘 選 用 0.5 釐 米 光 徑 比 色 杯, 於 540nm 波 長 下, 以 試 劑 調 零 點, 將 所 得 樣 品 管 之 光 密 度 乘 以 736, 即 為 血 紅 蛋 白 濃 度 (g/l) 計 算 公 式 如 下 : DHiCN 540 Ct = 64458= D HiCN Ct= 待 測 的 血 紅 蛋 白 (g/l) 濃 度 D 540 HiCN = 氰 化 高 鐵 血 紅 蛋 白 在 540nm 波 長 下 測 出 的 光 密 度 251 = 測 定 時 血 液 的 稀 釋 倍 數 ( 血 10μL 加 入 試 劑 2.5mL 中 ) = 氰 化 高 鐵 血 紅 蛋 白 的 摩 爾 吸 光 係 數 0.5 = 比 色 杯 的 光 徑 = 血 紅 蛋 白 的 分 子 量 50

51 注 意 事 項 試 劑 不 要 放 在 聚 乙 烯 瓶 內, 以 免 因 氰 離 子 與 其 反 應 而 使 試 劑 作 用 降 低 儀 器 因 摩 爾 吸 光 係 數 法 完 全 依 靠 儀 器 的 吸 光 度 來 計 算, 故 此 法 要 求 所 用 的 儀 器 性 能 要 符 合 要 求 ( 如 儀 器 的 波 長 準 確 與 否, 以 及 靈 敏 度 及 線 性 等 ), 否 則 將 直 接 影 響 測 定 的 結 果 儀 器 在 使 用 前 最 好 應 以 WHO 規 定 的 氰 化 高 鐵 血 紅 蛋 白 參 考 液 校 正 後 再 使 用 參 考 液 最 好 選 用 ICSH( 國 際 血 液 學 標 準 化 委 員 會 ) 確 定 的 由 RIV( 荷 蘭 國 立 公 共 衛 生 研 究 院 ) 製 作 的 氰 化 高 鐵 血 紅 蛋 白 參 考 液 或 上 海 醫 學 化 驗 所 製 備 的 氰 化 高 鐵 血 紅 蛋 白 標 準 液 標 準 曲 線 法 原 理 血 紅 蛋 白 (hemoglobin,hb) 在 鐵 氰 化 鉀 和 氰 化 鉀 的 作 用 下 生 成 極 為 穩 定 的 氰 化 高 鐵 血 紅 蛋 白 ( 紅 色 ), 其 顏 色 深 淺 與 血 紅 蛋 白 的 含 量 成 正 比 用 分 光 光 度 計 在 540nm 波 長 下, 測 定 血 紅 蛋 白 標 準 品 和 參 考 標 準 物 質 的 吸 光 度, 製 成 標 準 曲 線, 測 得 待 測 樣 品 的 吸 光 度 後 查 標 準 曲 線 即 可 得 Hb 的 濃 度 儀 器 10μL 血 色 素 吸 管 ( 或 定 量 毛 細 管 ) 5mL 或 10mL 帶 蓋 試 管 分 光 光 度 計 試 劑 稱 取 碳 酸 氫 鈉 (NaHCO3,AR)140mg 鐵 氰 化 鉀 200mg 氰 化 鉀 50mg, 用 蒸 餾 水 溶 解 並 稀 釋 到 1000mL, 貯 存 於 棕 色 試 劑 瓶 內, 保 存 於 4 冰 箱 可 穩 定 至 1 年 實 驗 步 驟 吸 取 2.5mL 試 劑 於 5mL 帶 蓋 試 管 中, 用 10μL 血 色 素 吸 管 ( 或 定 量 毛 細 管 ) 取 大 鼠 尾 血 或 靜 脈 血 10μL 放 置 於 已 放 入 試 劑 的 試 管 中 ; 混 勻 放 置 15min 選 用 0.5cm 光 徑 比 色 杯, 於 540nm 波 長 下, 以 試 劑 調 節 儀 器 零 點, 測 定 各 樣 品 管 的 吸 光 度, 同 時 測 定 血 紅 蛋 白 標 準 和 參 考 標 準 物 質 的 吸 光 度, 繪 製 血 紅 蛋 白 的 標 準 曲 線 查 標 準 曲 線 可 求 得 待 測 樣 品 和 參 考 標 準 物 質 的 血 紅 蛋 白 含 量 (g/l), 計 算 參 考 物 質 的 回 收 率 注 意 事 項 不 要 將 試 劑 放 在 聚 乙 烯 瓶 內, 以 免 因 氰 離 子 與 其 反 應 而 使 試 劑 作 用 降 低 不 宜 直 接 使 用 消 光 係 數 方 法 計 算 血 紅 蛋 白 的 含 量, 因 為 儀 器 的 波 長 準 確 與 否 儀 器 的 靈 敏 度 和 線 性 等 因 素 均 直 接 影 響 測 定 結 果 每 次 測 定 時, 在 不 同 間 隔 反 復 測 定 血 紅 蛋 白 標 準 液 和 參 考 標 準 物 質 ( 低 中 高 3 個 濃 度 ) 資 料 處 理 及 結 果 判 定 實 驗 資 料 可 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值,F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 51

52 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 結 果 判 定 受 試 樣 品 組 與 對 照 組 比 較, 血 紅 蛋 白 濃 度 升 高 經 統 計 處 理 差 異 有 顯 著 性, 且 受 試 樣 品 組 前 後 升 高 幅 度 平 均 達 到 10g/L 以 上, 判 定 該 實 驗 結 果 陽 性 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 測 定 原 理 血 紅 蛋 白 的 合 成 過 程 中, 幼 紅 細 胞 中 的 原 卟 啉 在 血 紅 素 合 成 酶 的 作 用 下 與 鐵 結 合, 當 鐵 供 應 不 足 時, 紅 細 胞 內 的 原 卟 啉 乃 以 游 離 形 式 累 積 起 來 超 過 正 常 水 準 因 此, 檢 測 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 (Free erythrocyte proloporphyrin, FEP) 的 含 量 是 檢 查 缺 鐵 性 紅 細 胞 生 成 的 有 效 方 法 血 液 樣 品 經 生 理 鹽 水 稀 釋 後, 分 別 以 乙 酸 乙 酯 : 乙 酸 混 合 液 (4:1) 和 0.5N 鹽 酸 提 取 分 離 血 中 游 離 原 卟 啉, 在 一 定 波 長 下 測 定 其 原 卟 啉 的 螢 光 強 度 而 定 量 儀 器 螢 光 分 光 光 度 計 或 930 型 螢 光 光 度 計 離 心 機 混 旋 器 試 劑 肝 素 抗 凝 劑 一 支 單 位 的 肝 素 以 0.9% 生 理 鹽 水 稀 釋 至 25mL(1mL=500 單 位 ) %(W/V) 矽 藻 土 生 理 鹽 水 懸 濁 液 稱 取 5g 矽 藻 土 加 0.9% 生 理 鹽 水 至 100mL :1 乙 酸 乙 酯 和 乙 酸 混 合 液 N HCl 原 卟 啉 標 準 液 原 卟 啉 標 準 貯 備 液 (50mg/L): 稱 取 5mg 原 卟 啉, 加 4mL 無 水 乙 醇 使 之 溶 解, 以 1.5N HCl 稀 釋 至 100mL 原 卟 啉 標 準 中 間 液 (1.0mg/L): 取 2mL 原 卟 啉 貯 備 液, 以 乙 酸 乙 酯 與 乙 酸 (4:1) 混 合 液 稀 釋 到 100mL 原 卟 啉 標 準 應 用 液 (0.1mg/L): 取 1mL 原 卟 啉 中 間 液, 以 乙 酸 乙 酯 與 乙 酸 (4:1) 混 合 液 稀 釋 到 10mL 實 驗 步 驟 試 劑 樣 品 管 空 白 管 標 準 管 肝 素 (ml) 全 血 (ml) 0.02 水 (ml) % 矽 藻 土 懸 濁 液 (ml) 原 卟 啉 標 準 應 用 液 (ml)

53 乙 酸 乙 酯 與 乙 酸 (4:1) 混 合 液 (ml) 注 : 按 上 表 依 次 加 入 各 種 試 劑, 在 加 入 乙 酸 乙 酯 與 乙 酸 混 合 液 前, 用 混 旋 器 混 合 已 加 入 的 混 合 液, 然 後 邊 混 合 邊 加 入 乙 酸 乙 酯 與 乙 酸 混 合 液 離 心 15 分 鐘, 將 各 管 上 清 液 分 別 倒 入 10mL 比 色 管 中, 每 管 加 4mL 0.5N 鹽 酸, 振 搖 5 分 鐘 靜 止 使 之 分 層, 將 上 層 溶 劑 抽 出 棄 去, 測 定 鹽 酸 液 的 螢 光 強 度 (30 分 鐘 內 比 色 ) 螢 光 測 量 若 使 用 日 立 MPF-4 型 螢 光 分 光 光 度 計 測 定 條 件 為 激 發 波 長 為 403nm, 狹 縫 10nm; 發 射 波 長 為 605nm, 狹 縫 為 5nm, 液 槽 為 1cm 厚 石 英 槽 若 使 用 國 產 930 型 螢 光 光 度 計 測 試, 條 件 為 激 發 濾 光 片 420, 螢 光 濾 片 550, 靈 敏 度 1 500, 滿 度 開 關 開 至 最 大, 液 槽 為 1cm 厚 石 英 槽, 檢 出 靈 敏 度 為 0.01µg/4mL 在 不 同 量 原 卟 啉 (0µg,0.01µg,0.03µg,0.05µg,0.07µg,0.1µg) 呈 線 性 關 係 計 算 樣 品 螢 光 強 度 空 白 螢 光 強 度 100 血 中 原 卟 啉 含 量 (µg/l 全 血 ) = 標 準 管 原 卟 啉 含 量 (µg) 10 標 準 管 螢 光 強 度 空 白 螢 光 強 度 樣 品 取 樣 量 (ml) 資 料 處 理 及 結 果 判 定 實 驗 資 料 可 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值,F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 結 果 判 定 受 試 樣 品 組 與 對 照 組 比 較, 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 降 低 經 統 計 處 理 差 異 有 顯 著 性, 即 可 判 定 該 實 驗 結 果 陽 性 注 意 事 項 螢 光 強 度 隨 時 間 延 長 而 逐 漸 衰 退, 但 30 分 鐘 內 基 本 穩 定 加 乙 酸 乙 酯 - 乙 酸 混 合 液 時, 一 定 要 邊 混 合 邊 加 入, 否 則 影 響 測 定 結 果 濾 紙 法 測 定 : 將 滴 有 20 微 升 血 點 全 部 剪 下 放 入 試 管 中, 同 時 取 同 樣 大 小 空 白 濾 紙 放 入 標 準 管 和 空 白 管 中, 各 管 均 加 入 5% 矽 藻 土 懸 濁 液 0.2 亳 升, 振 盪 後 放 置 過 夜, 以 下 步 驟 同 直 接 法 計 算 : FEP( 微 克 /100 毫 升 全 血 )=C/B A/D 100 A= 標 準 管 原 卟 啉 含 量 (0.02 毫 克 ) B= 標 準 管 螢 光 強 度 - 空 白 管 螢 光 強 度 C= 血 樣 螢 光 強 度 - 空 白 管 螢 光 強 度 D= 取 樣 量 紅 細 胞 壓 積 測 定 : 使 用 全 自 動 血 細 胞 分 析 儀 進 行 資 料 處 理 及 結 果 判 定 同

54 1.7 資 料 處 理 和 結 果 判 定 實 驗 資 料 可 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值,F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 結 果 判 定 受 試 樣 品 組 與 低 鐵 對 照 組 相 比, 若 血 紅 蛋 白 差 異 有 顯 著 性, 且 其 前 後 平 均 升 高 幅 度 達 到 10g/L 以 上, 同 時, 受 試 樣 品 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 或 紅 細 胞 壓 積 與 低 鐵 對 照 組 相 比 差 異 有 顯 著 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 1.8 注 意 事 項 本 項 實 驗 關 鍵 在 於 貧 血 模 型 的 建 立 低 鐵 飼 料 含 鐵 量 最 好 控 制 在 9mg/Kg 以 下, 所 用 試 劑 應 為 分 析 純, 動 物 飲 用 水 應 為 去 離 子 水 或 雙 蒸 水, 採 用 不 銹 鋼 籠 具, 所 用 器 皿 應 用 10% 硝 酸 溶 液 處 理 實 驗 過 程 中 嚴 防 外 來 鐵 的 污 染 及 彼 此 交 叉 污 染 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 受 試 者 納 入 標 準 受 試 者 為 小 細 胞 低 色 素 貧 血, 且 有 明 確 的 缺 鐵 原 因 和 臨 床 表 現 的 成 人 和 兒 童 成 人 納 入 標 準 : 男 性 Hb 80g/L-130g/L, 女 性 Hb 80g/L-120g/L 兒 童 納 入 標 準 : 6 歲 兒 童 Hb 70g/L-110g/L;7-18 歲 青 少 年 80g/L-120g/L 2.2 受 試 者 排 除 標 準 合 併 有 心 腦 血 管 肝 腎 消 化 道 等 嚴 重 疾 病 及 精 神 病 患 者 過 敏 體 質 或 對 該 受 試 樣 品 過 敏 者 嚴 重 貧 血 患 者 短 期 內 服 用 與 受 試 功 能 有 關 的 物 品, 影 響 到 對 結 果 的 判 斷 者 未 按 標 準 服 用 受 試 樣 品 資 料 不 全 影 響 功 效 或 安 全 性 判 斷 者 2.3 試 驗 設 計 及 分 組 要 求 採 用 自 身 和 組 間 兩 種 對 照 設 計 按 受 試 者 的 血 紅 蛋 白 水 準 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 性 別 年 齡 經 濟 狀 況 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 2.4 受 試 樣 品 的 劑 量 和 使 用 方 法 54

55 試 食 組 按 推 薦 服 用 方 法 服 用 量 服 用 受 試 產 品, 對 照 組 可 服 用 安 慰 劑 或 採 用 空 白 對 照, 也 可 服 用 具 有 同 樣 作 用 的 陽 性 物 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 120 天 試 驗 期 間 不 改 變 原 來 的 飲 食 習 慣, 正 常 飲 食 2.5 觀 察 指 標 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 ( 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 ) 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 ( 兒 童 受 試 者 不 測 定 此 項 ) 腹 部 B 超 胸 透 心 電 圖 檢 查 ( 各 項 指 標 在 試 驗 前 檢 查 一 次, 兒 童 受 試 者 不 測 此 項 ) 膳 食 調 查 於 試 驗 開 始 前 結 束 前 進 行 三 天 的 詢 問 法 膳 食 調 查, 觀 察 飲 食 因 素 對 試 驗 結 果 的 影 響 症 狀 觀 察 食 欲 不 振 乏 力 煩 燥 頭 暈 眼 花 精 神 不 集 中 心 慌 氣 短 等 功 效 性 指 標 兒 童 觀 察 指 標 : 血 紅 蛋 白 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 成 人 觀 察 指 標 : 血 紅 蛋 白 血 清 鐵 蛋 白 血 清 運 鐵 蛋 白 飽 和 度 / 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 血 紅 蛋 白 : 見 血 清 鐵 蛋 白 測 定 ( 放 射 免 疫 法 ): 原 理 人 血 清 中 的 鐵 蛋 白 (SF) 與 加 入 的 125 I 標 記 的 SF 競 爭 性 地 與 抗 鐵 蛋 白 抗 體 結 合 用 第 二 抗 體 分 離 結 合 部 分, 分 別 測 定 總 放 射 性 與 沉 澱 物 放 射 性 計 數 依 據 標 準 SF 試 劑 作 出 標 準 曲 線, 從 而 可 在 曲 線 上 查 出 相 應 樣 品 血 清 的 SF 濃 度 *SF+Ab *SF-Ab+*SF + SF SF-Ab + SF *SF: 標 記 的 鐵 蛋 白 SF: 未 標 記 的 鐵 蛋 白 Ab: 抗 鐵 蛋 白 抗 體 儀 器 離 心 機 - 射 線 計 數 儀 試 劑 55

56 125 I- 血 清 鐵 蛋 白 放 射 免 疫 分 析 試 劑 盒 操 作 步 驟 操 作 步 驟 : 鐵 蛋 白 測 定 操 作 程 式 和 試 劑 用 量 (ml) ( 見 下 表 ) 繪 製 標 準 曲 線 以 各 標 準 管 的 B/ B0 % 作 縱 座 標, 標 準 鐵 蛋 白 濃 度 為 橫 座 標 ( 對 數 邊 ) 作 標 準 曲 線 樣 品 或 質 控 由 B/ B0 % 值 從 曲 線 上 查 到 相 應 的 含 量 組 別 名 稱 (T) (NBS) 總 計 數 值 非 特 異 管 標 準 曲 線 組 待 (B0) (B) 測 零 標 準 管 標 準 管 管 溫 育 液 鐵 蛋 白 標 準 0.1 待 測 血 樣 或 質 控 0.1 鐵 蛋 白 抗 體 I- 鐵 蛋 白 充 分 搖 勻,37, 溫 育 1.0 小 時 分 離 試 劑 充 分 搖 勻, 室 溫 15 分 鐘 3500 轉 / 分, 離 心 15 分 鐘, 棄 上 清 液, 測 沉 澱 計 數 結 果 計 算 非 特 異 結 合 率 : NBS ( cpm) 本 底 ( cpm) NBS(%) = T(cpm) - 本 底 ( cpm) 100% 零 管 結 合 率 : B0( cpm) NBS( cpm) B0 / T(%) = T(cpm) - 本 底 ( cpm) 100% 標 準 管 ( 樣 品 質 控 ) 結 合 率 : B( cpm) NBS( cpm) B/B0 (%) = B0(cpm) -NBS( cpm) 100% 注 意 事 項 本 實 驗 為 抗 原 抗 體 結 合 反 應, 操 作 時 要 注 意 防 止 可 引 起 抗 原 抗 體 失 活 的 因 素 ( 如 高 溫 冰 凍 等 ) 測 定 時, 要 防 止 液 體 濺 出, 以 免 造 成 同 位 素 污 染, 使 本 底 值 增 高 離 心 後, 抽 去 上 清 液 時 勿 將 平 鋪 在 管 底 的 免 疫 複 合 物 吸 起, 否 則 測 定 結 果 不 準 確 非 特 異 管 零 管 是 為 鑒 定 試 劑 是 否 符 合 規 定 而 設 立 的 血 清 鐵 蛋 白 濃 度 也 可 用 酶 聯 免 疫 吸 附 法 測 定 具 體 測 定 方 法 按 相 應 試 劑 盒 說 明 書 進 行 血 清 運 鐵 蛋 白 飽 和 度 測 定 原 理 56

57 血 清 中 加 入 過 量 的 鐵, 使 血 清 中 的 運 鐵 蛋 白 全 部 與 鐵 結 合, 達 到 飽 和, 過 剩 的 鐵 用 碳 酸 鎂 吸 附 除 去, 然 後 按 測 血 清 鐵 的 方 法, 測 定 總 結 合 的 鐵 量, 即 為 總 鐵 結 和 力 從 中 可 計 算 出 未 飽 和 鐵 量 及 血 清 運 鐵 蛋 白 飽 和 度 血 清 鐵 測 定 血 清 鐵 (S1) 是 指 存 在 於 血 清 中 與 血 清 運 鐵 蛋 白 結 合 的 鐵, 它 以 高 鐵 的 形 式 附 著 在 血 清 pl 球 蛋 白 的 轉 遞 蛋 白 上, 成 人 正 常 值 為 µg/100mL 缺 鐵 性 貧 血 時 常 低 於 50µg/100mL, 當 血 紅 蛋 白 濃 度 降 低 不 明 顯 時, 血 清 鐵 已 減 少, 被 認 為 是 早 期 缺 鐵 性 貧 血 診 斷 依 據 之 一 鉻 天 青 B 銨 鹽 比 色 法 鉻 天 青 B 銨 鹽 作 為 顯 色 劑 測 血 清 鐵, 比 過 去 多 採 用 的 聯 吡 啶 等 作 為 顯 色 劑 有 較 高 的 靈 敏 度, 其 克 分 子 吸 光 係 數 在 630nm 波 長 下 為 L mol -1 cm -1 可 大 大 減 少 樣 品 血 清 量, 方 法 簡 便, 準 確 原 理 Fe 3 /Fe 2 與 鉻 天 青 B(CAB) 和 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 銨 (CTMA) 反 應, 形 成 三 元 膠 囊 狀 絡 合 物 使 試 劑 顏 色 加 深, 其 顏 色 加 深 程 度 與 血 清 鐵 含 量 成 正 比, 在 ph 為 , 波 長 為 630nm 時, 有 最 大 吸 收 峰, 利 用 檸 檬 酸 船 為 鐵 的 掩 蔽 劑, 樣 品 為 自 身 空 白, 不 需 除 蛋 白, 即 可 測 出 血 清 鐵 的 含 量 試 劑 緩 衝 溶 液 ph4.75, 取 25g 無 水 醋 酸 鈉,110g 氯 化 鈉,8mL 冰 醋 酸, 用 蒸 餾 水 定 容 1000mL 用 酸 度 計 測 ph 應 為 顯 色 劑 % 鉻 天 青 B 銨 鹽 溶 液 (A 液 ): 取 0.1g 鉻 天 青 B 銨 鹽, 定 容 於 l00ml 蒸 餾 水 中, 放 在 棕 色 瓶 中 可 在 室 溫 下 保 存 1 個 月 % 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 銨 (B 液 ): 取 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 銨 0.3g, 用 蒸 餾 水 定 容 至 100mL 顯 色 劑 應 用 液 : 取 90mL B 液,60mL A 液, 小 心 混 勻, 用 緩 衝 溶 液 定 容 至 1000mL, 放 在 棕 色 瓶 內 可 保 存 1 個 月 掩 蔽 劑 : 稱 17.0g 檸 檬 酸 (C6H8O7 H2O), 35.0g 檸 檬 酸 鈉 (Na3C6H5O7 H2O), 約 加 50mL 蒸 餾 水 加 熱 助 溶, 冷 卻 後 定 容 至 l00ml 鐵 標 準 液 貯 備 液 :3mmol/L, 取 1.176g 硫 酸 亞 鐵 銨 (6 分 子 結 晶 水 ) 至 少 量 蒸 餾 水 中, 加 50mL 濃 硝 酸 混 勻 反 應 10 分 鐘, 用 蒸 餾 水 定 容 至 1000mL 工 作 液 :30µmol/L, 取 10mL 貯 備 液, 用 蒸 餾 水 定 容 至 1000mL 方 法 按 下 表 加 入 各 種 試 劑 樣 品 管 標 準 管 空 白 1 空 白 2 空 白 3 血 清 (ml ) Fe 標 (30µmol/L) 0.1 蒸 餾 水 (ml ) 顯 色 劑 應 用 液 (ml)

58 度 隱 蔽 劑 (ml ) 混 勻, 放 置 20 分 鐘, 在 721 型 分 光 光 度 計 上, 波 長 630nm, 以 空 白 管 調 零 點 記 錄 光 密 注 :1 樣 品 管 和 標 準 管 以 空 白 1 調 0 點 ; 2 空 白 管 2 以 空 白 3 調 0 點 計 算 樣 品 管 光 密 度 空 白 2 管 光 密 度 血 清 鐵 濃 度 (µmol/l) = 30 標 準 管 光 密 度 樣 品 管 光 密 度 空 白 2 管 光 密 度 或 血 清 鐵 濃 度 (µg/100ml)= 標 準 管 光 密 度 注 意 事 項 要 求 所 用 器 皿 用 2N 鹽 酸 浸 泡 過 夜, 試 劑 純 度 為 分 析 純 以 上, 所 用 蒸 餾 水 為 雙 蒸 水 或 去 離 子 水 緩 衝 液 ph 對 結 果 影 響 較 大, 測 定 時 ph 應 保 證 在 之 間 嚴 格 限 制 波 長 的 選 擇 ( 需 經 校 下 ), 血 清 樣 品 在 nm 之 間 有 一 個 雜 質 吸 收 峰 原 子 吸 收 光 譜 法 用 原 子 吸 收 光 譜 法 測 定 生 物 樣 品 中 微 量 元 素 的 含 量 具 有 操 作 簡 便 快 速 靈 敏 度 較 高 的 優 點, 故 被 廣 泛 應 用 試 劑 混 合 酸 消 化 液 : 4 份 硝 酸,1 份 高 氯 酸 混 合 即 成 鐵 標 準 溶 液 鐵 標 貯 備 液 : 取 g 純 金 屬 鐵, 用 鹽 酸 或 硝 酸 溶 解 後, 用 0.1N 鹽 酸 稀 釋 到 1000mL, 移 入 聚 乙 烯 塑 膠 瓶 內, 存 放 在 4 冰 箱,1mL 含 1mg 鐵 鐵 標 工 作 液 : 取 10mL 貯 備 液, 用 0.1N 鹽 酸 定 容 至 l00ml,lml=l00µg 鐵 操 作 樣 品 收 集 及 處 理 取 靜 脈 血 2mL 于 盛 有 l0mg 草 酸 鉀 的 5mL 試 管 中 ( 於 每 試 管 中 加 入 0.2mL5% 草 酸 鉀, 置 烘 箱 中 烤 幹 即 成 ), 離 心 (3000 轉 / 分 )15 分 鐘 將 分 離 出 的 血 漿 吸 入 另 一 帶 蓋 小 試 管 中, 備 用 消 化 取 1.0mL 血 漿, 于 100mL 高 型 燒 杯 中, 約 加 3mL 混 合 酸 消 化 液, 上 蓋 表 皿, 放 置 數 小 時 或 過 夜, 在 沙 浴 電 熱 板 上 徐 徐 加 熱 煮 沸, 在 冒 白 色 濃 煙 激 烈 作 用 後 溶 液 呈 無 色 或 淡 黃 色 反 應 終 了, 取 下 燒 杯 ( 若 酸 用 量 不 夠, 最 後 可 出 現 溶 液 變 黑 現 象, 此 時 可 再 加 2 ml 混 合 酸 消 化 液 繼 續 消 化 直 至 五 色 ) 冷 卻 後 用 10-20mL 去 離 子 水 沖 洗 表 皿 和 杯 壁, 除 去 表 皿 繼 續 加 熱, 直 到 再 度 冒 白 色 濃 煙, 待 溶 液 體 積 接 近 蒸 幹, 殘 留 酸 量 不 超 過 l ml, 取 下 冷 卻, 用 蒸 58

59 餾 水 稀 釋 至 3mL 測 定 吸 取 0.0mL,0.5mL,1.0mL,2.0mL,3.0mL,5.0mL 鐵 標 準 應 用 液, 用 0.1N 鹽 酸 定 容 至 100mL, 混 合, 各 容 量 瓶 中 每 ml 分 別 相 當 於 0µg,0.5µg,1µg,2µg,3µg,5µg 鐵 將 處 理 後 的 樣 液, 試 劑 空 白, 鐵 標 系 列 溶 液 分 別 導 入 火 焰 進 行 測 定, 測 定 條 件 (Pekin-Elener403 型 原 子 吸 收 分 光 光 度 計 ): 波 長 248.3nm; 空 心 陰 極 燈 電 流 :30mA, 狹 縫 寬 0.2mm, 空 氣 流 量 13.51/min, 乙 炔 流 量 :5.21/ 分 以 鐵 含 量 對 應 濃 度 吸 光 度 繪 製 標 準 曲 線, 根 據 標 準 曲 線 求 得 樣 品 鐵 含 量 計 算 (A1-A2) V X= 100 m 式 中 :X 血 漿 中 鐵 的 含 量 (µg/100ml 血 清 ) A1 測 定 用 樣 品 液 中 鐵 的 含 量 (mg/l) A2 測 定 空 白 液 中 鐵 的 含 量 (mg/l) V 樣 品 處 理 液 定 容 總 體 積 (ml) m 血 漿 取 樣 量 (ml) 總 鐵 結 合 量 測 定 試 劑 鐵 標 準 液 鉻 天 青 B 銨 鹽 法 貯 備 液 :(3mmol/L) 取 1.176g 硫 酸 亞 鐵 銨 (6 分 子 結 晶 水 ) 置 蒸 餾 水 中, 加 50mL 濃 硝 酸 混 勻 反 應 10 分 鐘, 用 蒸 餾 水 定 容 至 1000mL 工 作 液 :(30µmol/L) 取 10mL 貯 備 液, 用 蒸 餾 水 定 容 至 1000mL 原 子 吸 收 分 光 光 度 法 貯 備 液 : 取 g 純 金 屬 鐵, 用 鹽 酸 或 硝 酸 溶 解 後, 用 0.1N 鹽 酸 稀 釋 到 1000mL, 移 入 聚 乙 烯 塑 膠 瓶 內, 存 放 4 o C 冰 箱,1mL 含 1mg 鐵 工 作 液 : 取 10mL 貯 備 液, 用 0.1N 鹽 酸 定 容 至 100mL,1mL=100µg 鐵 輕 質 碳 酸 鎂 (AR)( 或 堿 式 碳 酸 鎂 ) 其 品 質 應 符 合 要 求 實 驗 步 驟 應 用 鉻 天 青 B 銨 鹽 方 法 測 總 鐵 結 合 量 取 0.1mL 血 清 放 入 尖 底 離 心 管, 加 60µmol/l 鐵 標 準 液 0.1mL 充 分 混 合, 室 溫 放 置 15 分 鐘 再 加 4-5mg 輕 質 碳 酸 鎂, 放 置 15 分 鐘, 混 合 3-4 次 然 後 以 3000 轉 / 分 離 心 5-8 分 鐘, 取 上 清 液 0.1mL 按 鉻 天 青 B 銨 鹽 比 色 法 測 血 清 鐵 的 步 驟 進 行 操 作, 計 算 原 子 吸 收 分 光 光 度 法 測 總 鐵 結 合 量 取 1.0mL 血 清, 加 鐵 標 準 液 (20µg/mL) 0.5mL, 充 分 混 合, 放 置 15 分 鐘 加 150mg 輕 質 碳 酸 鎂, 充 分 混 勻 1 分 鐘 以 上, 放 置 30 分 鐘, 混 合 3-4 次 離 心 10 分 鐘, 取 上 清 液 1mL 按 原 子 吸 收 分 光 光 度 法 測 血 清 鐵 的 操 作 步 驟 進 行 消 化, 測 定, 計 算 計 算 59

60 血 清 總 鐵 結 合 量 可 用 (mg/100l) 表 示 未 飽 和 鐵 量 = 血 清 總 鐵 結 合 量 - 血 清 鐵 血 清 鐵 血 清 蛋 白 運 鐵 蛋 白 飽 和 度 (%)= 100 血 清 總 鐵 結 合 量 資 料 處 理 及 結 果 判 定 實 驗 資 料 可 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值,F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 : 見 結 果 判 定 受 試 樣 品 組 與 對 照 組 比 較, 血 紅 蛋 白 升 高 且 平 均 升 高 幅 度 10g/L, 血 清 鐵 蛋 白 增 加, 血 清 運 鐵 蛋 白 飽 和 度 升 高, 紅 細 胞 游 離 原 卟 啉 降 低, 經 統 計 處 理 差 異 有 顯 著 性, 即 可 分 別 判 定 該 指 標 結 果 陽 性 2.6 資 料 處 理 及 結 果 判 定 : 試 驗 資 料 為 計 量 資 料, 可 用 t 檢 驗 進 行 分 析 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t' 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 ; 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 結 果 判 定 : 改 善 兒 童 缺 鐵 性 貧 血 : 試 驗 前 後 自 身 比 較 和 試 驗 後 組 間 比 較, 血 紅 蛋 白 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 二 項 指 標 差 異 有 顯 著 性 ; 同 時, 試 食 組 自 身 前 後 比 較, 血 紅 蛋 白 平 均 升 高 幅 度 10g/L, 可 判 定 受 試 樣 品 具 有 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 的 作 用 改 善 成 人 缺 鐵 性 貧 血 : 試 驗 前 後 自 身 比 較 和 試 驗 後 組 間 比 較, 血 紅 蛋 白 指 標 差 異 有 顯 著 性 ; 同 時, 試 食 組 自 身 前 後 比 較, 血 紅 蛋 白 平 均 升 高 幅 度 10g/L, 血 清 鐵 蛋 白 紅 細 胞 內 游 離 原 卟 啉 / 血 清 運 鐵 蛋 白 飽 和 度 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 60

61 附 件 6: 輔 助 降 血 脂 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 根 據 血 脂 異 常 的 類 型, 輔 助 降 血 脂 功 能 按 照 不 同 的 血 脂 類 型 設 立 分 類 的 動 物 試 驗 和 人 體 試 食 實 驗 1 試 驗 項 目 1.1 根 據 受 試 樣 品 的 作 用 機 制, 分 成 三 種 情 況 輔 助 降 低 血 脂 功 能 : 降 低 血 清 總 膽 固 醇 和 血 清 甘 油 三 酯 輔 助 降 低 血 清 膽 固 醇 功 能 : 單 純 降 低 血 清 膽 固 醇 輔 助 降 低 血 清 甘 油 三 酯 功 能 : 單 純 降 低 血 清 甘 油 三 酯 1.2 觀 察 指 標 體 重 血 清 總 膽 固 醇 血 清 甘 油 三 酯 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 血 清 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 1.3 人 體 試 食 試 驗 血 清 總 膽 固 醇 血 清 甘 油 三 酯 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 血 清 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 測 專 案 2.2 根 據 受 試 樣 品 的 作 用 機 制, 可 在 動 物 實 驗 的 兩 個 動 物 模 型 中 任 選 一 項 2.3 根 據 受 試 樣 品 的 作 用 機 制, 可 在 人 體 試 食 試 驗 的 三 個 方 案 中 任 選 一 項 2.4 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 混 合 型 高 脂 血 症 動 物 模 型 輔 助 降 低 血 脂 功 能 結 果 判 定 : 模 型 對 照 組 和 空 白 對 照 組 比 較, 血 清 甘 油 三 酯 升 高, 血 清 61

62 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 升 高, 差 異 均 有 顯 著 性, 判 定 模 型 成 立 (1) 各 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 任 一 劑 量 組 血 清 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 且 任 一 劑 量 組 血 清 甘 油 三 酯 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 各 劑 量 組 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 脂 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 (2) 各 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 任 一 劑 量 組 血 清 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 各 劑 量 組 血 清 甘 油 三 酯 不 顯 著 高 於 模 型 對 照 組, 各 劑 量 組 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 清 膽 固 醇 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 (3) 各 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 任 一 劑 量 組 血 清 甘 油 三 酯 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 各 劑 量 組 血 清 總 膽 固 醇 及 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 高 於 模 型 對 照 組, 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 清 甘 油 三 酯 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 高 膽 固 醇 血 症 動 物 模 型 模 型 對 照 組 和 空 白 對 照 組 比 較, 血 清 總 膽 固 醇 (TC) 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (LDL-C) 升 高, 血 清 甘 油 三 酯 (TG) 差 異 無 顯 著 性, 判 定 模 型 成 立 各 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 任 一 劑 量 組 血 清 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 差 異 有 顯 著 性, 並 且 各 劑 量 組 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (HDL-C) 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 血 清 甘 油 三 酯 不 顯 著 高 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 清 膽 固 醇 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 指 標 判 定 標 準 : 有 效 :TC 降 低 >10%;TG 降 低 >15%;HDL-C 上 升 >0.104mmol/L 無 效 : 未 達 到 有 效 標 準 者 輔 助 降 低 血 脂 功 能 結 果 判 定 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 受 試 者 血 清 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 對 照 組, 試 驗 組 總 有 效 率 顯 著 高 於 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 脂 功 能 人 體 試 食 試 驗 結 果 陽 性 輔 助 降 低 血 清 膽 固 醇 功 能 結 果 判 定 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 受 試 者 血 清 總 膽 固 醇 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 血 清 甘 油 三 酯 不 顯 著 高 於 對 照 組, 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 對 照 組, 試 驗 組 血 清 總 膽 固 醇 有 效 率 顯 著 高 於 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 脂 功 能 人 體 試 食 試 驗 結 果 陽 性 輔 助 降 低 甘 油 三 酯 功 能 結 果 判 定 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 受 試 者 血 清 甘 油 三 酯 降 低, 差 異 有 顯 著 性, 同 時 血 清 總 膽 固 醇 和 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 高 於 對 照 組, 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 對 照 組, 試 驗 組 血 清 甘 油 三 酯 有 效 率 顯 著 高 於 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 甘 油 三 酯 功 能 人 體 試 食 試 驗 結 果 陽 性 62

63 輔 助 降 低 血 脂 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Assisting Blood Lipids Reduction Function 根 據 血 脂 異 常 的 類 型, 輔 助 降 低 血 脂 功 能 按 照 受 試 物 作 用 機 制 的 不 同, 設 立 分 類 的 動 物 試 驗 動 物 試 驗 : 分 成 二 種 情 況 : 1. 混 合 型 高 酯 血 症 動 物 模 型 2. 高 膽 固 醇 血 症 動 物 模 型 人 體 試 食 試 驗 : 根 據 試 驗 的 結 果, 分 三 種 情 況 分 別 進 行 判 定 : 1. 輔 助 降 低 血 脂 功 能 2. 輔 助 降 低 血 清 膽 固 醇 功 能 3. 輔 助 降 低 甘 油 三 酯 功 能 1 動 物 實 驗 檢 驗 方 法 1.1 混 合 型 高 脂 血 症 動 物 模 型 原 理 用 含 有 膽 固 醇 蔗 糖 豬 油 膽 酸 鈉 的 飼 料 餵 養 動 物 可 形 成 脂 代 謝 紊 亂 動 物 模 型, 再 給 予 動 物 受 試 樣 品, 可 檢 測 受 試 樣 品 對 高 脂 血 症 的 影 響, 並 可 判 定 受 試 樣 品 對 脂 質 的 吸 收 脂 蛋 白 的 形 成 脂 質 的 降 解 或 排 泄 產 生 的 影 響 儀 器 及 試 劑 解 剖 器 械 分 光 光 度 計, 自 動 生 化 分 析 儀, 膽 固 醇 膽 酸 鈉 血 清 總 膽 固 醇 (TC) 甘 油 三 酯 (TG) 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (LDL-C), 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (HDL-C) 測 定 試 劑 盒 動 物 選 擇 及 飼 料 健 康 成 年 雄 性 大 鼠, 適 應 期 結 束 時, 體 重 200±20g, 首 選 SD 大 鼠, 每 組 8-12 只 模 型 飼 料 在 維 持 飼 料 中 添 加 20.0% 蔗 糖 15% 豬 油 1.2% 膽 固 醇 0.2% 膽 酸 鈉, 適 量 的 酪 蛋 白 磷 酸 氫 鈣 石 粉 等 除 了 粗 脂 肪 外, 模 型 飼 料 的 水 分 粗 蛋 白 粗 脂 肪 粗 纖 維 粗 灰 分 鈣 磷 鈣 : 磷 均 要 達 到 維 持 飼 料 的 國 家 標 準 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 63

64 實 驗 設 三 個 劑 量 組 空 白 對 照 組 和 模 型 對 照 組, 以 人 體 推 薦 量 的 5 倍 為 其 中 的 一 個 劑 量 組, 另 設 二 個 劑 量 組, 必 要 時 設 陽 性 對 照 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 為 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 實 驗 步 驟 適 應 期 : 於 屏 障 系 統 下 大 鼠 喂 飼 維 持 飼 料 觀 察 5-7 天 造 模 期 按 體 重 隨 機 分 成 2 組,10 只 大 鼠 給 予 維 持 飼 料 作 為 空 白 對 照 組,40 只 給 予 模 型 飼 料 作 為 模 型 對 照 組 每 週 稱 量 體 重 1 次 模 型 對 照 組 給 予 模 型 飼 料 1-2 周 後, 空 白 對 照 組 和 模 型 對 照 組 大 鼠 不 禁 食 采 血 ( 眼 內 眥 或 尾 部 ), 采 血 後 儘 快 分 離 血 清, 測 定 血 清 TC TG LDL-C HDL-C 水 準 根 據 TC 水 準 將 模 型 對 照 組 隨 機 分 成 4 組, 分 組 後 空 白 對 照 組 和 模 型 對 照 組 比 較 TC TG LDL-C HDL-C 差 異 均 無 顯 著 性 受 試 樣 品 給 予 分 組 後, 三 個 劑 量 組 每 天 經 - 口 給 予 受 試 樣 品, 空 白 對 照 組 和 模 型 對 照 組 同 時 給 予 同 體 積 的 相 應 溶 劑, 空 白 對 照 組 繼 續 給 予 維 持 飼 料, 模 型 對 照 組 及 三 個 劑 量 組 繼 續 給 予 模 型 飼 料, 並 定 期 稱 量 體 重, 于 實 驗 結 束 時 不 禁 食 采 血, 采 血 後 儘 快 分 離 血 清, 測 定 血 清 TC TG LDL-C HDL-C 水 準 觀 察 指 標 :TC TG LDL-C HDL-C 資 料 處 理 和 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值, 36F 值 <F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 動 物 實 驗 結 果 判 定 : 輔 助 降 低 血 脂 功 能 結 果 判 定 : 模 型 對 照 組 和 空 白 對 照 組 比 較, 血 清 甘 油 三 酯 升 高, 血 清 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 升 高, 差 異 均 有 顯 著 性, 判 定 模 型 成 立 (1) 各 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 任 一 劑 量 組 血 清 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 且 任 一 劑 量 組 血 清 甘 油 三 酯 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 各 劑 量 組 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 脂 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 (2) 各 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 任 一 劑 量 組 血 清 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 各 劑 量 組 血 清 甘 油 三 酯 不 顯 著 高 於 模 型 對 照 組, 各 劑 量 組 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 膽 固 醇 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 (3) 各 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 任 一 劑 量 組 血 清 甘 油 三 酯 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 各 劑 量 組 血 清 總 膽 固 醇 及 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 高 於 模 型 對 照 組, 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 模 型 64

65 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 甘 油 三 酯 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 注 意 事 項 在 建 立 動 物 模 型 中, 可 因 動 物 品 系 飼 養 管 理 而 影 響 模 型 的 建 立 保 證 維 持 飼 料 的 各 種 營 養 成 分, 必 要 時 需 進 行 檢 測, 除 了 粗 脂 肪 外, 模 型 飼 料 的 水 分 粗 蛋 白 粗 脂 肪 粗 纖 維 粗 灰 分 鈣 磷 鈣 : 磷 均 要 達 到 維 持 飼 料 的 國 家 標 準 模 型 飼 料 餵 養 期 間, 模 型 組 血 中 膽 固 醇 水 準 比 較 穩 定, 甘 油 三 酯 水 準 會 逐 漸 恢 復 正 常 水 準, 故 模 型 飼 料 給 予 時 間 不 能 超 過 8 周 1.2 高 膽 固 醇 血 症 動 物 模 型 原 理 用 含 有 膽 固 醇 豬 油 膽 酸 鈉 的 飼 料 餵 養 動 物 可 形 成 高 膽 固 醇 脂 代 謝 紊 亂 動 物 模 型, 再 給 予 動 物 受 試 樣 品, 可 檢 測 受 試 樣 品 對 高 膽 固 醇 脂 血 症 的 影 響, 並 可 判 定 受 試 樣 品 對 脂 質 的 吸 收 脂 蛋 白 的 形 成 脂 質 的 降 解 或 排 泄 產 生 的 影 響 儀 器 及 試 劑 解 剖 器 械 分 光 光 度 計, 自 動 生 化 分 析 儀, 膽 固 醇 膽 酸 鈉 血 清 總 膽 固 醇 (TC) 甘 油 三 酯 (TG) 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (LDL-C), 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (HDL-C) 測 定 試 劑 盒 動 物 選 擇 及 飼 料 大 鼠 模 型 : 健 康 成 年 雄 性 大 鼠, 適 應 期 結 束 時, 體 重 200±20g, 首 選 SD 種 大 鼠, 每 組 8-12 只 金 黃 地 鼠 模 型 : 健 康 成 年 雄 性 金 黃 地 鼠, 適 應 期 結 束 時, 體 重 100±10g, 每 組 8-12 只 模 型 飼 料 大 鼠 模 型 : 在 維 持 飼 料 中 添 加 1.2% 膽 固 醇 0.2% 膽 酸 鈉 3-5% 豬 油, 適 量 的 酪 蛋 白 磷 酸 氫 鈣 石 粉 等 除 了 粗 脂 肪 外, 模 型 飼 料 的 其 它 品 質 指 標 均 要 達 到 維 持 飼 料 的 國 家 標 準 金 黃 地 鼠 模 型 : 在 維 持 飼 料 中 添 加 0.2% 膽 固 醇, 其 餘 同 大 鼠 模 型 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 空 白 對 照 組 和 模 型 對 照 組, 以 人 體 推 薦 量 的 5 倍 為 其 中 的 一 個 劑 量 組, 另 設 二 個 劑 量 組, 必 要 時 設 陽 性 對 照 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 為 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 實 驗 步 驟 適 應 期 : 於 屏 障 系 統 下 動 物 喂 飼 維 持 飼 料 觀 察 5-7 天 造 模 期 : 65

66 按 體 重 隨 機 分 成 2 組,10 只 動 物 給 予 維 持 飼 料 作 為 空 白 對 照 組,40 只 給 予 模 型 飼 料 作 為 模 型 對 照 組 每 週 稱 量 體 重 1 次 模 型 對 照 組 給 予 模 型 飼 料 1-2 周 後, 空 白 對 照 組 和 模 型 對 照 組 動 物 不 禁 食 采 血 ( 眼 內 眥 或 尾 部 ), 采 血 後 儘 快 分 離 血 清, 測 定 血 清 TC TG LDL-C HDL-C 水 準 根 據 TC 水 準 將 模 型 對 照 組 隨 機 分 成 4 組, 分 組 後 空 白 對 照 組 和 模 型 對 照 組 比 較 TC TG LDL-C HDL-C 差 異 均 無 顯 著 性 (P>0.05) 受 試 樣 品 給 予 分 組 後, 三 個 劑 量 組 每 天 經 口 給 予 受 試 樣 品, 空 白 對 照 組 和 模 型 對 照 組 同 時 給 予 同 體 積 的 相 應 溶 劑, 空 白 對 照 組 繼 續 給 予 維 持 飼 料, 模 型 對 照 組 及 三 個 劑 量 組 繼 續 給 予 模 型 飼 料, 並 定 期 稱 量 體 重, 于 實 驗 結 束 時 不 禁 食 采 血, 采 血 後 儘 快 分 離 血 清, 測 定 血 清 TC TG LDL-C HDL-C 水 準 觀 察 指 標 :TC TG LDL-C HDL-C 資 料 處 理 和 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值, 36F 值 <F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 動 物 實 驗 結 果 判 定 : 輔 助 降 低 膽 固 醇 功 能 結 果 判 定 : 模 型 對 照 組 和 空 白 對 照 組 比 較, 血 清 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 升 高, 差 異 有 顯 著 性, 血 清 甘 油 三 酯 差 異 無 顯 著 性, 判 定 模 型 成 立 各 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 任 一 劑 量 組 血 清 總 膽 固 醇 或 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 差 異 有 顯 著 性, 並 且 各 劑 量 組 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 血 清 甘 油 三 酯 不 顯 著 高 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 膽 固 醇 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 注 意 事 項 在 建 立 動 物 模 型 中, 可 因 動 物 品 系 飼 養 管 理 而 影 響 模 型 的 建 立 保 證 維 持 飼 料 的 各 種 營 養 成 分, 必 要 時 需 進 行 檢 測 2 人 體 試 食 試 驗 檢 驗 方 法 2.1 受 試 者 納 入 標 準 在 正 常 飲 食 情 況 下, 檢 測 禁 食 小 時 後 的 血 脂 水 準, 半 年 內 至 少 有 兩 次 血 脂 檢 測, 血 清 總 膽 固 醇 在 mmol/L, 並 且 血 清 甘 油 三 酯 在 mmol/L, 可 作 為 輔 助 降 低 血 脂 功 能 備 選 物 件 ; 血 清 甘 油 三 酯 在 mmol/L, 並 且 血 清 總 膽 固 醇 6.21mmol/L, 66

67 可 作 為 輔 助 降 低 甘 油 三 酯 功 能 備 選 物 件 ; 血 清 總 膽 固 醇 在 mmol/L, 並 且 血 清 甘 油 三 酯 2.25mmol/L, 可 作 為 輔 助 降 低 膽 固 醇 功 能 備 選 物 件, 在 參 考 動 物 實 驗 結 果 基 礎 上, 選 擇 相 應 指 標 者 為 受 試 物 件 原 發 性 高 脂 血 症 獲 得 知 情 同 意 書, 自 願 參 加 試 驗 者 2.2 排 除 受 試 者 標 準 年 齡 在 18 歲 以 下 或 65 歲 以 上 者 妊 娠 或 哺 乳 期 婦 女, 過 敏 體 質 或 對 本 受 試 樣 品 過 敏 者 合 併 有 心 肝 腎 和 造 血 系 統 等 嚴 重 疾 病, 精 神 病 患 者 近 兩 周 曾 服 用 調 脂 藥 物, 影 響 到 對 結 果 的 判 斷 者 住 院 的 高 血 脂 症 者 未 按 規 定 食 用 受 試 樣 品, 或 資 料 不 全, 影 響 功 效 或 安 全 性 判 斷 者 2.3 受 試 樣 品 的 劑 量 和 使 用 方 法 根 據 受 試 樣 品 推 薦 量 和 推 薦 方 法 確 定 2.4 試 驗 設 計 及 分 組 要 求 採 用 自 身 和 組 間 兩 種 對 照 設 計 根 據 隨 機 盲 法 的 要 求 進 行 分 組 按 受 試 者 血 脂 水 準 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 年 齡 性 別 飲 食 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 試 食 組 服 用 受 試 樣 品, 對 照 組 可 服 用 安 慰 劑 或 採 用 空 白 對 照 試 驗 週 期 45 天, 不 超 過 6 個 月 2.5 觀 察 指 標 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 ( 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 ) 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 ( 僅 在 試 驗 開 始 前 進 行 ) 功 效 性 指 標 血 清 總 膽 固 醇 (TC) 水 準 及 降 低 百 分 率 甘 油 三 酯 (TG) 水 準 及 降 低 百 分 率 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (HDL-C) 水 準 及 上 升 幅 度 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (LDL-C) 水 準 功 效 判 定 標 準 有 效 :TC 降 低 >10%;TG 降 低 >15%;HDL-C 上 升 >0.104mmol/L 無 效 : 未 達 到 有 效 標 準 者 觀 察 血 清 總 膽 固 醇 (TC) 有 效 率 甘 油 三 酯 (TG) 有 效 率 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 (HDL-C) 67

68 有 效 率 及 總 有 效 率 2.6 資 料 處 理 和 結 果 判 定 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 ; 方 差 齊 方 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 有 效 率 及 總 有 效 率 採 用 X2 檢 驗 進 行 檢 驗 四 格 表 總 例 數 小 於 40, 或 總 例 數 等 於 或 大 於 40 但 出 現 理 論 數 等 於 或 小 於 1 時, 應 改 用 確 切 概 率 法 輔 助 降 低 血 脂 功 能 結 果 判 定 : 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 受 試 者 血 清 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 對 照 組, 試 驗 組 總 有 效 率 顯 著 高 於 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 脂 功 能 人 體 試 食 試 驗 結 果 陽 性 輔 助 降 低 血 清 膽 固 醇 功 能 結 果 判 定 : 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 受 試 者 血 清 總 膽 固 醇 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 降 低, 差 異 均 有 顯 著 性, 同 時 血 清 甘 油 三 酯 不 顯 著 高 於 對 照 組, 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 對 照 組, 試 驗 組 血 清 總 膽 固 醇 有 效 率 顯 著 高 於 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 血 脂 功 能 人 體 試 食 試 驗 結 果 陽 性 輔 助 降 低 甘 油 三 酯 功 能 結 果 判 定 : 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 受 試 者 血 清 甘 油 三 酯 降 低, 差 異 有 顯 著 性, 同 時 血 清 總 膽 固 醇 和 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 高 於 對 照 組, 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 不 顯 著 低 於 對 照 組, 試 驗 組 血 清 甘 油 三 酯 有 效 率 顯 著 高 於 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 低 甘 油 三 酯 功 能 人 體 試 食 試 驗 結 果 陽 性 68

69 附 件 7: 促 進 排 鉛 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 血 鉛 骨 鉛 肝 組 織 鉛 1.2 人 體 試 食 試 驗 血 鉛 尿 鉛 尿 鈣 尿 鋅 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.2 應 對 臨 床 症 狀 體 征 進 行 觀 察 2.3 應 對 尿 鉛 進 行 多 次 測 定, 以 瞭 解 體 內 鉛 的 排 出 情 況 2.4 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 實 驗 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 骨 鉛 含 量 顯 著 降 低, 同 時 血 鉛 或 肝 鉛 顯 著 降 低, 可 判 定 該 受 試 樣 品 動 物 實 驗 結 果 為 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 至 少 兩 個 觀 察 時 點 尿 鉛 排 出 量 增 加 且 顯 著 高 於 試 驗 前, 或 總 尿 鉛 排 出 量 明 顯 增 加 同 時, 對 總 尿 鈣 總 尿 鋅 的 排 出 無 明 顯 影 響, 或 總 尿 鈣 總 尿 鋅 排 出 增 加 的 幅 度 小 於 總 尿 鉛 排 出 增 加 的 幅 度, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 促 進 排 鉛 功 能 69

70 促 進 排 鉛 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Alleviating Lead Excretion Function 1 動 物 實 驗 1.1 實 驗 原 理 實 驗 動 物 經 口 給 予 含 鉛 化 合 物 ( 推 薦 使 用 醋 酸 鉛 ), 可 造 成 組 織 中 鉛 含 量 增 高 造 模 早 期 以 肝 腎 等 組 織 中 增 高 明 顯, 之 後 骨 組 織 中 鉛 含 量 逐 漸 增 高 比 較 給 予 實 驗 動 物 受 試 樣 品 後, 模 型 動 物 組 織 中 鉛 含 量 的 變 化 情 況, 以 確 定 此 受 試 樣 品 是 否 具 有 促 進 機 體 排 鉛 的 作 用 1.2 實 驗 動 物 推 薦 使 用 成 年 大 鼠, 單 一 性 別, 體 重 克, 每 組 8-12 只 小 鼠 則 應 使 用 近 交 系 動 物, 單 一 性 別, 體 重 克, 每 組 只 1.3 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 一 個 空 白 對 照 組 和 一 個 模 型 對 照 組, 三 個 劑 量 組 中 應 包 括 一 個 人 體 推 薦 量 的 10 倍 ( 小 鼠 ) 或 5 倍 ( 大 鼠 ) 劑 量 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 1.4 實 驗 設 計 本 實 驗 使 用 預 防 性 高 鉛 動 物 模 型 實 驗 期 間, 在 模 型 對 照 組 受 試 樣 品 各 劑 量 組 飲 用 醋 酸 鉛 水 溶 液 ( 推 薦 濃 度 為 0.1%- 0.2%) 或 喂 飼 含 鉛 飼 料 造 模 的 同 時, 各 劑 量 組 灌 胃 給 予 受 試 樣 品 或 喂 飼 含 不 同 劑 量 受 試 樣 品 的 飼 料 空 白 對 照 組 給 予 去 離 子 水 或 基 礎 飼 料 1.5 觀 察 指 標 於 末 次 給 予 動 物 受 試 樣 品 24 小 時 後, 稱 量 動 物 體 重 取 血 並 處 死 動 物, 取 適 量 血 肝 股 骨 樣 品 進 行 濕 式 消 化, 使 用 石 墨 爐 原 子 吸 收 分 光 光 度 計 ( 或 ICP-MS 等 方 法 ) 測 定 鉛 含 量 1.6 資 料 處 理 和 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 則 計 算 F 值 若 F 值 < F0.05, 結 論 為 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ; 若 F 值 F0.05( 即 P 0.05), 結 論 為 各 組 均 數 間 差 異 有 顯 著 性, 需 進 一 步 使 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 分 析 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 需 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 分 析 ; 若 經 變 數 轉 換 仍 不 能 達 到 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 目 的, 則 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 分 析 70

71 結 果 判 定 : 在 動 物 模 型 成 立 的 前 提 下, 實 驗 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 骨 鉛 含 量 顯 著 降 低, 同 時 血 鉛 或 肝 鉛 顯 著 降 低, 可 判 定 該 受 試 樣 品 動 物 實 驗 結 果 為 陽 性 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 受 試 者 納 入 標 準 有 密 切 鉛 接 觸 史, 血 鉛 含 量 較 高 的 自 願 受 試 者 推 薦 選 擇 屬 於 血 鉛 負 荷 偏 高 的 人 群, 即 血 鉛 在 200 g/l-400 g/l(1 mol/l-2 mol/l) 範 圍 內, 或 尿 鉛 在 70 g/l-120 g/l (0.34 mol/l mol/l) 範 圍 內 者 2.2 受 試 者 排 除 標 準 血 鉛 或 尿 鉛 過 高, 有 明 顯 鉛 中 毒 症 狀 者 患 有 心 血 管 肝 腎 和 造 血 系 統 等 全 身 性 疾 病 者 妊 娠 和 哺 乳 期 婦 女 試 驗 期 間 服 用 與 受 試 功 能 有 關 的 物 品, 影 響 到 對 結 果 的 判 斷 者 停 服 受 試 樣 品 或 中 途 加 服 其 它 藥 物, 無 法 判 斷 功 效 或 資 料 不 全 者 2.3. 試 驗 設 計 及 分 組 要 求 採 用 自 身 和 組 間 兩 種 對 照 設 計 按 血 鉛 或 尿 鉛 水 準 對 受 試 者 進 行 隨 機 分 組, 在 分 組 時 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 鉛 接 觸 史 年 齡 性 別 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 有 效 例 數 不 少 於 50 例 2.4. 受 試 樣 品 的 劑 量 和 使 用 方 法 試 食 組 按 推 薦 服 用 方 法 和 服 用 量 每 日 服 用 受 試 樣 品, 對 照 組 可 服 用 安 慰 劑 或 採 用 空 白 對 照 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 試 驗 期 間 受 試 者 不 改 變 生 活 工 作 環 境, 不 改 變 原 來 生 活 飲 食 習 慣 2.5. 觀 察 指 標 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 ( 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 ) 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 ( 各 項 指 標 於 試 驗 前 檢 查 一 次 ) 尿 鈣 尿 鋅 的 測 定 : 測 定 時 間 次 數 和 方 法 同 尿 鉛 總 尿 鈣 總 尿 鋅 為 試 驗 開 始 後 3 次 尿 鈣 或 尿 鋅 測 定 值 之 和 功 效 性 指 標 : 臨 床 症 狀 觀 察 : 準 確 記 錄 受 試 者 試 食 前 後 的 主 觀 症 狀, 主 要 觀 察 頭 暈 失 眠 四 肢 71

72 無 力 等 症 狀 血 鉛 尿 鉛 含 量 測 定 : 採 集 試 食 試 驗 前 試 驗 後 血 液, 以 及 試 食 前 及 試 食 第 10 天 ( 如 進 行 45 天 試 驗 則 為 第 15 天 ) 20 天 ( 如 進 行 45 天 試 驗 則 為 第 30 天 ) 和 結 束 時 的 24 小 時 尿 液 樣 本 ( 亦 可 以 晨 尿 代 替 24 小 時 尿, 但 需 用 尿 肌 酐 進 行 校 正 ), 測 定 血 鉛 尿 鉛 含 量 總 尿 鉛 為 試 驗 開 始 後 三 次 尿 鉛 測 定 值 之 和 2.6 資 料 處 理 和 結 果 判 定 血 鉛 尿 鉛 尿 鈣 尿 鋅 等 試 驗 資 料 為 計 量 資 料, 可 用 t 檢 驗 進 行 分 析 自 身 對 照 資 料 可 採 用 配 對 t 檢 驗 ; 試 食 後 不 同 觀 察 時 點 兩 組 血 鉛 尿 鉛 的 測 定 值 均 數 比 較 以 及 試 食 後 兩 組 總 尿 鉛 總 尿 鈣 總 尿 鋅 排 出 量 比 較 採 用 兩 樣 本 均 數 t 檢 驗 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 需 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 要 求 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 經 資 料 轉 換 仍 不 能 滿 足 正 態 分 佈 或 方 差 齊 要 求, 則 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 對 於 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料, 應 使 用 秩 和 檢 驗 結 果 判 定 : 試 食 後, 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 至 少 兩 個 觀 察 時 點 尿 鉛 排 出 量 增 加 且 顯 著 高 於 試 驗 前, 或 總 尿 鉛 排 出 量 明 顯 增 加 同 時, 對 總 尿 鈣 總 尿 鋅 的 排 出 無 明 顯 影 響, 或 總 尿 鈣 總 尿 鋅 排 出 增 加 的 幅 度 小 於 總 尿 鉛 排 出 增 加 的 幅 度, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 促 進 排 鉛 功 能 72

73 附 件 8: 減 肥 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 體 重 增 重 攝 食 量 攝 入 總 熱 量 體 內 脂 肪 重 量 ( 睾 丸 周 圍 脂 肪 墊 腎 周 圍 脂 肪 墊 ) 脂 / 體 比 1.2 人 體 試 食 試 驗 體 重 腰 圍 臀 圍 體 內 脂 肪 含 量 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.2 動 物 實 驗 中 大 鼠 肥 胖 模 型 法 和 預 防 大 鼠 肥 胖 模 型 法 任 選 其 一 2.3 減 少 體 內 多 餘 脂 肪, 不 單 純 以 減 輕 體 重 為 目 標 2.4 引 起 腹 瀉 或 抑 制 食 欲 的 受 試 樣 品 不 能 作 為 減 肥 功 能 食 品 2.5 每 日 營 養 素 攝 入 量 應 基 本 保 證 機 體 正 常 生 命 活 動 的 需 要 2.6 對 機 體 健 康 無 明 顯 損 害 2.7 實 驗 前 應 對 同 批 受 試 樣 品 進 行 違 禁 藥 物 的 檢 測 2.8 以 各 種 營 養 素 為 主 要 成 分 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 受 試 樣 品 可 以 不 進 行 動 物 實 驗, 僅 進 行 人 體 試 食 試 驗 2.9 不 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 試 驗, 應 對 試 食 前 後 的 受 試 者 膳 食 和 運 動 狀 況 進 行 觀 察 2.10 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 試 驗, 除 開 展 不 替 代 主 食 的 設 計 指 標 外, 還 應 設 立 身 體 活 動 情 緒 工 作 能 力 等 測 量 表 格, 排 除 服 用 受 試 樣 品 後 無 相 應 的 負 面 影 響 產 生 結 合 替 代 主 食 的 受 試 樣 品 配 方, 對 每 日 膳 食 進 行 營 養 學 評 估 2.11 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 實 驗 組 的 體 重 或 體 重 增 重 低 於 模 型 對 照 組, 體 內 脂 肪 重 量 或 脂 / 體 比 低 於 模 型 對 照 組, 差 異 有 顯 著 性, 攝 食 量 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 動 物 減 肥 功 能 實 驗 結 果 陽 性 73

74 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 不 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 受 試 樣 品 : 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 體 內 脂 肪 重 量 減 少, 皮 下 脂 肪 四 個 點 中 任 兩 個 點 減 少, 腰 圍 與 臀 圍 之 一 減 少, 且 差 異 有 顯 著 性, 運 動 耐 力 不 下 降, 對 機 體 健 康 無 明 顯 損 害, 並 排 除 膳 食 及 運 動 對 減 肥 功 能 作 用 的 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 減 肥 功 能 的 作 用 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 受 試 樣 品 : 試 食 組 試 驗 前 後 自 身 比 較, 其 體 內 脂 肪 重 量 減 少, 皮 下 脂 肪 四 個 點 中 至 少 有 兩 個 點 減 少, 腰 圍 與 臀 圍 之 一 減 少, 且 差 異 有 顯 著 性 (P<0.05), 微 量 元 素 維 生 素 營 養 學 評 價 無 異 常, 運 動 耐 力 不 下 降, 情 緒 工 作 能 力 不 受 影 響, 並 排 除 運 動 對 減 肥 功 能 作 用 的 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 減 肥 功 能 作 用 74

75 減 肥 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Weight Control Function 1 動 物 試 驗 1.1 原 理 本 方 法 是 以 高 熱 量 食 物 誘 發 動 物 肥 胖, 再 給 予 受 試 樣 品 ( 肥 胖 模 型 ), 或 在 給 予 高 熱 量 食 物 同 時 給 予 受 試 樣 品 ( 預 防 肥 胖 模 型 ), 觀 察 動 物 體 重 體 內 脂 肪 含 量 的 變 化 1.2 儀 器 及 試 劑 動 物 天 平, 解 剖 器 械 等, 戊 巴 比 妥 鈉 1.3 實 驗 方 法 實 驗 動 物 選 用 雄 性 大 鼠, 適 應 期 結 束 時, 體 重 200±20g, 每 組 8-12 只 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 和 一 個 模 型 對 照 組, 以 人 體 推 薦 量 的 5 倍 為 其 中 的 一 個 劑 量 組, 另 設 二 個 劑 量 組, 必 要 時 設 陽 性 對 照 組 空 白 對 照 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 至 少 給 予 6 周, 不 超 過 10 周 高 熱 量 模 型 飼 料 在 維 持 飼 料 中 添 加 15.0% 蔗 糖 15.0% 豬 油, 適 量 的 酪 蛋 白 磷 酸 氫 鈣 石 粉 等 除 了 粗 脂 肪 外, 模 型 飼 料 的 水 分 粗 蛋 白 粗 脂 肪 粗 纖 維 粗 灰 分 鈣 磷 鈣 : 磷 均 要 達 到 維 持 飼 料 的 國 家 標 準 實 驗 步 驟 肥 胖 模 型 法 適 應 期 : 於 屏 障 系 統 下 大 鼠 喂 飼 維 持 飼 料 觀 察 5-7 天 造 模 期 : 適 應 期 結 束 後 按 體 重 隨 機 分 成 2 組,10 只 大 鼠 給 予 維 持 飼 料 作 為 空 白 對 照 組,60 只 大 鼠 給 予 高 熱 量 模 型 飼 料 每 週 記 錄 給 食 量 撒 食 量 剩 食 量, 稱 量 體 重 1 次 餵 養 2 周 後, 給 予 高 熱 量 飼 料 的 60 只 大 鼠 按 體 重 增 重 排 序, 淘 汰 體 重 增 重 較 低 的 1/3 肥 胖 抵 抗 大 鼠 將 篩 選 出 的 40 只 肥 胖 敏 感 大 鼠 再 給 予 高 熱 量 飼 料 6 周, 空 白 對 照 組 同 時 給 予 維 持 飼 料 75

76 受 試 樣 品 給 予 : 造 模 期 結 束 後,40 只 肥 胖 敏 感 大 鼠 按 體 重 隨 機 分 成 4 組, 分 別 為 模 型 對 照 組 和 三 個 劑 量 組 每 週 記 錄 給 食 量 撒 食 量 剩 食 量, 稱 量 體 重 1 次 模 型 對 照 組 和 三 個 劑 量 組 給 予 高 熱 量 模 型 飼 料, 空 白 對 照 組 給 予 維 持 飼 料 各 劑 量 組 灌 胃 給 予 不 同 劑 量 的 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 和 空 白 對 照 組 給 予 等 量 的 相 應 溶 劑, 受 試 樣 品 給 予 時 間 6 周, 不 超 過 10 周 試 驗 結 束 後, 稱 體 重,1% 戊 巴 比 妥 鈉 (0.5ml/100g BW) 麻 醉, 解 剖 取 腎 周 圍 脂 肪 睾 丸 周 圍 脂 肪, 並 稱 重, 計 算 脂 / 體 比 預 防 肥 胖 模 型 法 適 應 期 : 於 屏 障 系 統 下 大 鼠 喂 飼 維 持 飼 料 觀 察 5-7 天 造 模 篩 選 期 : 適 應 期 結 束 後 按 體 重 隨 機 分 成 2 組,10 只 大 鼠 給 予 維 持 飼 料 作 為 空 白 對 照 組,60 只 給 予 高 熱 量 飼 料 作 為 模 型 組 每 週 記 錄 給 食 量 撒 食 量 剩 食 量, 稱 量 體 重 1 次 餵 養 2 周 後, 給 予 高 熱 量 飼 料 的 大 鼠 按 體 重 增 重 排 序, 淘 汰 體 重 增 重 較 低 的 1/3 肥 胖 抵 抗 大 鼠 受 試 樣 品 給 予 : 將 篩 選 出 的 40 只 肥 胖 敏 感 大 鼠 按 體 重 隨 機 分 成 4 組, 分 別 為 模 型 組 和 三 個 劑 量 組 模 型 對 照 組 和 三 個 劑 量 組 給 予 高 熱 量 模 型 飼 料, 空 白 對 照 組 給 予 維 持 飼 料 各 劑 量 組 灌 胃 給 予 不 同 劑 量 的 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 和 空 白 對 照 組 給 予 等 量 的 相 應 溶 劑, 受 試 樣 品 給 予 時 間 6 周, 不 超 過 10 周 每 週 記 錄 給 食 量 撒 食 量 剩 食 量, 稱 量 體 重 1 次 試 驗 結 束 後, 稱 體 重,1% 戊 巴 比 妥 鈉 (0.5ml/100g BW) 麻 醉, 解 剖 取 腎 周 圍 脂 肪 睾 丸 周 圍 脂 肪, 並 稱 重, 計 算 脂 / 體 比 觀 察 指 標 體 重 體 重 增 重 攝 食 量 攝 入 總 熱 量 ( 攝 食 量 每 公 斤 飼 料 熱 量 ) 食 物 利 用 率 體 內 脂 肪 重 量 ( 睾 丸 及 腎 周 圍 脂 肪 墊 ) 脂 肪 / 體 重 1.4 資 料 處 理 和 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值, F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 採 用 方 差 分 析 加 Q 檢 驗 進 行 統 計 實 驗 組 的 體 重 或 體 重 增 重 低 於 模 型 對 照 組, 體 內 脂 肪 重 量 或 脂 / 體 比 低 於 模 型 對 照 組, 差 異 有 顯 著 性, 攝 食 量 不 顯 著 低 於 模 型 對 照 組, 可 判 定 該 受 試 樣 品 動 物 減 肥 功 能 實 驗 結 果 陽 性 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 原 理 76

77 害 單 純 性 肥 胖 受 試 者 食 用 受 試 樣 品, 觀 察 體 重 體 內 脂 肪 含 量 的 變 化 及 對 機 體 健 康 有 無 損 2.2 儀 器 體 成 分 測 定 設 備 功 率 自 行 車 心 率 監 測 器 B 超 皮 卡 鉗 體 重 計 2.3 試 驗 方 法 受 試 者 納 入 標 準 受 試 對 象 為 單 純 性 肥 胖 人 群, 成 人 BMI 30, 或 總 脂 肪 百 分 率 達 到 男 >25%, 女 >30% 的 自 願 受 試 者 受 試 者 排 除 標 準 合 併 有 心 肝 腎 和 造 血 系 統 等 嚴 重 疾 病, 精 神 病 患 者 短 期 內 服 用 與 受 試 功 能 有 關 的 物 品, 影 響 到 對 結 果 的 判 斷 者 未 按 規 定 食 用 受 試 樣 品, 無 法 判 定 功 效 或 資 料 不 全 影 響 功 效 或 安 全 性 判 斷 者 試 驗 設 計 及 分 組 要 求 不 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 試 驗 採 用 自 身 對 照 及 組 間 對 照 試 驗 設 計 按 受 試 者 的 體 重 體 脂 重 量 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 年 齡 性 別 飲 食 運 動 狀 況 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 試 驗 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 試 驗 只 設 單 一 試 食 組, 按 受 試 者 的 體 重 體 脂 重 量 隨 機 分 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 年 齡 性 別 飲 食 運 動 狀 況 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 有 效 例 數 不 少 於 50 人, 不 設 對 照 組 受 試 樣 品 的 劑 量 和 使 用 方 法 不 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 受 試 樣 品 : 試 食 組 按 推 薦 服 用 方 法 服 用 量 服 用 受 試 產 品, 對 照 組 可 服 用 安 慰 劑 或 採 用 空 白 對 照 按 盲 法 進 行 試 食 試 驗 受 試 樣 品 給 予 時 間 至 少 60 天 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 受 試 樣 品 : 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 受 試 樣 品 : 建 議 取 代 每 天 1-2 餐 主 食, 並 能 保 證 消 費 者 同 時 攝 取 充 足 的 營 養 素, 應 鼓 勵 增 加 果 蔬 攝 入 量 受 試 者 按 推 薦 方 法 和 推 薦 劑 量 服 用 受 試 樣 品, 受 試 樣 品 給 予 時 間 至 少 35 天 觀 察 指 標 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 ( 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 ) 血 尿 便 常 規 檢 查 77

78 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 ( 各 項 指 標 於 試 驗 前 檢 查 一 次 ) 血 尿 酸 尿 酮 體 運 動 耐 力 測 試 : 運 動 耐 力 測 試 方 法 為 功 率 自 行 車 試 驗 試 食 前 後 受 試 者 以 相 同 的 運 動 方 案 做 功 率 自 行 車 試 驗, 記 錄 心 率, 並 應 用 Astrand 和 Ryhming 的 列 線 圖 法 間 接 測 定 每 個 受 試 者 的 最 大 攝 氧 量 (L/ 分 ) 其 它 不 良 反 應 觀 察 : 如 厭 食 腹 瀉 等 膳 食 因 素 及 運 動 情 況 觀 察 不 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 試 驗 需 對 受 試 者 試 驗 開 始 前 結 束 前 進 行 三 天 的 詢 問 法 膳 食 調 查, 為 排 除 飲 食 因 素 對 試 驗 結 果 的 影 響, 要 求 盡 可 能 與 日 常 飲 食 相 一 致 對 試 驗 期 間 受 試 者 的 運 動 狀 況 進 行 詢 問 觀 察, 要 求 與 日 常 運 動 情 況 一 致 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 試 驗, 除 開 展 不 替 代 主 食 的 設 計 指 標 外, 還 應 設 立 身 體 活 動 情 緒 工 作 能 力 等 測 量 表 格, 排 除 服 用 受 試 樣 品 後 無 相 應 的 負 面 影 響 產 生 結 合 替 代 主 食 的 受 試 樣 品 配 方, 對 每 日 膳 食 進 行 營 養 學 評 估 每 日 能 量 攝 入 量 達 到 人 體 需 要 量 的 80%( 男 :1920kcal, 女 :1680 kcal), 每 日 主 要 營 養 素 攝 入 量 要 達 到 人 體 膳 食 營 養 素 參 考 攝 入 量 (DRIs), 蛋 白 質 ( 男 :75g, 女 :65g), 鈣 (800mg), 磷 (700mg), 鉀 (2000mg) 鈉 (2200mg), 鎂 (350mg), 鐵 ( 男 :15mg, 女 20mg), 維 生 素 A ( 男 :800µg, 女 :700µg) 維 生 素 D(5µg) 功 效 性 指 標 體 重, 身 高, 腰 圍 ( 臍 周 ) 臀 圍, 並 計 算 體 質 指 數 (BMI), 標 準 體 重 超 重 度 體 重 (kg) 成 年 人 (BMI)= 身 高 2 (m 2 ) 實 測 體 重 - 標 準 體 重 超 重 度 (%) = 100% 標 準 體 重 體 內 脂 肪 含 量 的 測 定 體 內 脂 肪 總 量 和 脂 肪 占 體 重 百 分 率, 用 水 下 稱 重 法 或 電 阻 抗 法 皮 下 脂 肪 厚 度 用 B 超 測 定 法 或 皮 卡 鉗 法,4 個 測 定 位 點 見 下 表 A 點 B 點 C 點 D 點 右 三 角 肌 下 緣 臂 外 側 正 中 點 右 肩 胛 下 角 右 臍 旁 3cm 右 髂 前 上 棘 2.4 資 料 處 理 和 結 果 判 定 試 驗 資 料 為 計 量 資 料, 可 用 t 檢 驗 進 行 分 析 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 78

79 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 ; 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 結 果 判 定 : 不 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 受 試 樣 品 : 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 後 試 食 組 與 對 照 組 比 較, 其 體 內 脂 肪 重 量 減 少, 皮 下 脂 肪 四 個 點 中 至 少 有 兩 個 點 減 少, 腰 圍 與 臀 圍 之 一 減 少, 且 差 異 有 顯 著 性 (P<0.05), 運 動 耐 力 不 下 降, 對 機 體 健 康 無 不 良 影 響, 並 排 除 膳 食 及 運 動 對 減 肥 功 能 作 用 的 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 減 肥 功 能 作 用 替 代 主 食 的 減 肥 功 能 受 試 樣 品 : 試 食 組 試 驗 前 後 自 身 比 較, 其 體 內 脂 肪 重 量 減 少, 皮 下 脂 肪 四 個 點 中 至 少 有 兩 個 點 減 少, 腰 圍 與 臀 圍 之 一 減 少, 且 差 異 有 顯 著 性 (P<0.05), 能 量 和 營 養 學 評 價 無 異 常, 運 動 耐 力 不 下 降, 情 緒 工 作 能 力 不 受 影 響, 並 排 除 運 動 對 減 肥 功 能 作 用 的 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 減 肥 功 能 作 用 79

80 附 件 9: 清 咽 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 大 鼠 棉 球 植 入 實 驗 大 鼠 足 趾 腫 脹 實 驗 小 鼠 耳 腫 脹 實 驗 1.2 人 體 試 食 試 驗 : 咽 部 症 狀 體 征 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.2 應 對 臨 床 症 狀 體 征 進 行 觀 察 2.3 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 大 鼠 棉 球 植 入 實 驗 結 果 陽 性, 同 時 大 鼠 足 趾 腫 脹 實 驗 或 小 鼠 耳 腫 脹 實 驗 結 果 任 意 一 項 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 清 咽 功 能 動 物 實 驗 結 果 為 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 咽 部 症 狀 及 體 征 有 明 顯 改 善, 症 狀 及 體 征 的 改 善 率 明 顯 增 加, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 清 咽 功 能 80

81 清 咽 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Clear the Throat Function 1 動 物 實 驗 1.1 大 鼠 棉 球 植 入 實 驗 實 驗 原 理 採 用 棉 球 作 為 異 物 植 入 動 物 局 部 皮 下, 可 引 起 與 臨 床 某 些 炎 症 後 期 病 理 變 化 相 似 的 肉 芽 組 織 增 生 比 較 給 予 受 試 樣 品 後, 實 驗 組 動 物 與 對 照 組 動 物 肉 芽 腫 重 量 的 差 異, 以 確 定 受 試 樣 品 是 否 具 有 干 預 慢 性 炎 症 ( 肉 芽 腫 形 成 ) 的 作 用 實 驗 動 物 推 薦 使 用 成 年 雄 性 大 鼠, 體 重 克 每 組 8-12 只 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 和 一 個 空 白 對 照 組, 三 個 劑 量 組 中 應 包 括 一 個 人 體 推 薦 量 5 倍 的 劑 量 組, 必 要 時 設 陽 性 對 照 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 儀 器 和 材 料 手 術 器 械 恒 溫 乾 燥 箱 分 析 天 平 注 射 器 乙 醚 碘 伏 脫 脂 棉 脫 毛 器 實 驗 步 驟 棉 球 的 處 理 將 脫 脂 棉 製 成 約 20~25mg 緊 致 的 小 棉 球, 經 高 壓 滅 菌 後, 置 恒 溫 乾 燥 箱 60 C 乾 燥 3h, 取 出 無 菌 條 件 下 稱 重, 乾 燥 保 存, 備 用 肉 芽 腫 的 形 成 和 測 定 實 驗 結 束 前 8 天, 用 脫 毛 器 脫 去 大 鼠 兩 側 腹 股 溝 處 的 毛, 乙 醚 淺 麻 醉 大 鼠, 碘 伏 消 毒, 在 無 菌 條 件 下 切 開 大 鼠 兩 側 腹 股 溝 皮 膚, 植 入 備 用 的 棉 球, 縫 合 切 口, 繼 續 給 予 受 試 物 實 驗 結 束 當 天, 給 受 試 物 1 小 時 後, 斷 頸 處 死 大 鼠, 在 原 縫 合 處 剪 開 皮 膚, 剝 離 並 取 出 棉 球 肉 芽 組 織, 置 於 已 稱 重 潔 淨 平 皿 中, 恒 溫 乾 燥 箱 60 C 開 蓋 乾 燥 1 小 時 後 稱 重, 計 算 肉 芽 腫 淨 量 肉 芽 腫 淨 量 (mg)= 乾 燥 後 棉 球 肉 芽 腫 重 量 - 原 棉 球 重 量 資 料 處 理 和 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 則 計 算 F 值 若 F 值 < F0.05, 結 論 為 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ; 若 F 值 F0.05( 即 P 0.05), 結 論 為 各 組 均 數 間 差 異 有 顯 著 性, 需 進 一 步 使 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 分 析 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 需 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 分 析 ; 若 經 變 數 轉 換 仍 不 能 達 到 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 目 的, 則 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 分 析 結 果 判 定 : 實 驗 組 與 空 白 對 照 組 比 較, 肉 芽 腫 淨 量 明 顯 下 降, 經 統 計 處 理 差 異 有 顯 著 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 大 鼠 棉 球 植 入 實 驗 結 果 陽 性 81

82 1.1.7 注 意 事 項 所 用 棉 球 重 量 及 表 面 積 對 實 驗 結 果 影 響 較 大, 故 在 實 驗 中, 應 盡 可 能 保 證 所 用 棉 球 重 量 和 表 面 積 近 似 儘 量 使 手 術 切 口 的 大 小 一 致, 以 減 少 差 異 植 入 棉 球 後, 將 切 口 縫 合 牢 固, 以 免 在 實 驗 過 程 中 棉 球 脫 落, 影 響 實 驗 結 果 1.2 大 鼠 足 趾 腫 脹 實 驗 實 驗 原 理 一 定 量 致 炎 劑 注 入 大 鼠 後 肢 足 趾 皮 下, 可 造 成 足 趾 腫 脹 測 定 足 趾 容 積, 比 較 致 炎 劑 作 用 前 後 實 驗 組 和 對 照 組 足 趾 容 積 的 變 化, 以 確 定 受 試 樣 品 是 否 具 有 干 預 急 性 炎 症 ( 足 趾 腫 脹 ) 的 作 用 實 驗 動 物 同 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 同 儀 器 和 材 料 : 致 炎 劑 ( 推 薦 使 用 葡 聚 糖 4 萬 ) 足 趾 容 積 測 量 儀 無 菌 蒸 餾 水 0.25ml 注 射 器 實 驗 步 驟 致 炎 劑 的 配 製 用 無 菌 蒸 餾 水 配 製 濃 度 為 1% 的 葡 聚 糖 4 萬, 備 用 足 趾 腫 脹 及 測 定 實 驗 結 束 當 天 再 給 受 試 樣 品 一 次,1 小 時 後, 用 足 趾 容 積 測 量 儀 測 量 各 組 大 鼠 右 後 足 趾 的 容 積, 作 為 0 小 時 足 趾 容 積 然 後 在 大 鼠 右 後 足 趾 皮 下 注 入 1% 葡 聚 糖 4 萬 0.1mL/ 只, 分 別 於 小 時 測 量 大 鼠 足 趾 的 容 積, 同 一 部 位 測 量 3 次, 取 平 均 值 以 不 同 時 間 所 測 足 趾 容 積 與 致 炎 劑 作 用 前 的 足 趾 容 積 之 差 為 腫 脹 值, 計 算 各 個 時 間 段 的 足 趾 腫 脹 率 腫 脹 率 (%)= 腫 脹 值 / 致 炎 前 足 趾 容 積 100% 資 料 處 理 和 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 則 計 算 F 值 若 F 值 < F0.05, 結 論 為 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ; 若 F 值 F0.05( 即 P 0.05), 結 論 為 各 組 均 數 間 差 異 有 顯 著 性, 需 進 一 步 使 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 分 析 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 需 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 分 析 ; 若 經 變 數 轉 換 仍 不 能 達 到 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 目 的, 則 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 分 析 結 果 判 定 : 實 驗 組 與 空 白 對 照 組 比 較, 任 一 時 間 點 刺 激 前 後 足 趾 容 積 腫 脹 率 明 顯 減 少, 差 異 有 顯 著 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 大 鼠 足 趾 腫 脹 實 驗 結 果 陽 性 注 意 事 項 致 炎 劑 注 入 的 品 質 對 實 驗 結 果 影 響 很 大, 注 入 致 炎 劑 時, 應 將 動 物 後 肢 拉 直, 從 右 後 足 掌 82

83 心 向 踝 關 節 方 向 皮 下 注 射 致 炎 劑, 並 應 盡 可 能 使 動 物 不 動 建 議 由 專 人 負 責 致 炎 劑 的 注 射, 以 保 證 實 驗 結 果 的 一 致 性 測 量 足 趾 容 積 時, 嚴 格 按 儀 器 說 明 操 作 注 意 應 在 鼠 足 某 處 用 記 號 筆 劃 線 作 為 測 量 標 線, 將 鼠 足 緩 緩 放 入 測 量 筒 內, 當 水 平 面 與 鼠 足 上 的 測 量 標 線 重 疊 時, 踏 動 腳 踏 開 關, 記 錄 足 趾 容 積, 用 吸 水 紙 擦 乾 鼠 足 上 的 水 後, 分 別 再 進 行 第 2 次 和 第 3 次 測 定 為 避 免 測 量 誤 差, 測 定 人 員 應 事 先 進 行 訓 練, 掌 握 將 鼠 足 放 入 測 量 筒 內 的 最 佳 方 式, 每 個 樣 品 的 測 量 最 好 由 專 人 進 行 每 次 測 定 的 部 位 要 固 定 1.3 小 鼠 耳 腫 脹 實 驗 實 驗 原 理 二 甲 苯 為 無 色 澄 清 液 體, 塗 抹 於 小 鼠 耳 廓 後, 由 於 其 刺 激 作 用, 可 引 起 鼠 耳 局 部 毛 細 血 管 充 血, 通 透 性 增 加, 導 致 急 性 炎 症 比 較 實 驗 組 和 對 照 組 二 甲 苯 作 用 後 耳 腫 脹 率 的 差 異, 以 確 定 受 試 樣 品 是 否 具 有 干 預 急 性 炎 症 ( 小 鼠 耳 腫 脹 ) 的 作 用 儀 器 和 材 料 直 徑 9mm 打 孔 器 致 炎 劑 ( 二 甲 苯 ) 微 量 加 樣 器 分 析 天 平 實 驗 動 物 推 薦 使 用 近 交 系 雄 性 小 鼠, 體 重 克, 每 組 只 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 和 一 個 空 白 對 照 組, 三 個 劑 量 組 中 應 包 括 一 個 人 體 推 薦 量 10 倍 的 劑 量 組, 必 要 時 設 陽 性 對 照 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 實 驗 步 驟 汲 取 二 甲 苯 20μl, 滴 加 在 小 鼠 右 耳 外 側 面 耳 廓 的 中 央, 讓 其 自 由 擴 散,30 分 鐘 後, 將 小 鼠 脫 頸 椎 處 死, 剪 下 雙 耳, 用 9mm 直 徑 打 孔 器 在 兩 耳 相 同 部 位 打 下 耳 片 並 稱 重, 以 兩 耳 重 量 之 差 為 耳 廓 腫 脹 值, 計 算 耳 廓 腫 脹 率 耳 廓 腫 脹 率 (%)= 耳 廓 腫 脹 值 / 對 照 耳 片 重 量 100% 資 料 處 理 和 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 則 計 算 F 值 若 F 值 < F0.05, 結 論 為 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ; 若 F 值 F0.05( 即 P 0.05), 結 論 為 各 組 均 數 間 差 異 有 顯 著 性, 需 進 一 步 使 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 分 析 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 需 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 分 析 ; 若 經 變 數 轉 換 仍 不 能 達 到 正 態 分 佈 或 方 差 齊 的 目 的, 則 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 分 析 結 果 判 定 : 實 驗 組 與 空 白 對 照 組 比 較, 耳 廓 腫 脹 率 明 顯 減 少, 差 異 有 顯 著 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 小 鼠 耳 腫 脹 實 驗 結 果 陽 性 注 意 事 項 83

84 二 甲 苯 具 有 對 眼 及 上 呼 吸 道 有 刺 激 作 用, 操 作 時, 操 作 者 應 注 意 自 身 的 防 護 打 下 的 耳 片 應 及 時 稱 重, 以 避 免 水 分 失 去 而 影 響 實 驗 結 果 的 準 確 性 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 受 試 者 納 入 標 準 體 征 : 慢 性 咽 炎 人 群, 主 觀 症 狀 有 咽 痛 咽 癢 咽 幹 乾 咳 異 物 感 多 言 加 重 等 咽 部 症 狀 : 咽 部 粘 膜 水 腫 粘 膜 充 血 咽 後 壁 淋 巴 濾 泡 增 生 分 泌 物 附 著 具 有 及 中 至 少 一 項 檢 查 所 見 的 自 願 受 試 者, 即 可 納 入 觀 察 2.2 受 試 者 排 除 標 準 慢 性 咽 炎 急 性 發 作 期 或 急 性 咽 炎 聲 帶 結 節 感 冒 或 吸 煙 因 素 所 致 者 鼻 咽 咽 喉 鼻 喉 食 管 頸 部 及 結 核 轉 移 性 肺 癌 病 變 所 致 者 年 齡 在 18 歲 以 下 或 65 歲 以 上 者, 妊 娠 和 哺 乳 期 婦 女 及 對 受 試 產 品 過 敏 者 合 併 有 心 腦 血 管 肝 腎 造 血 系 統 支 氣 管 和 肺 等 嚴 重 疾 病 及 精 神 病 患 者 和 有 睡 眠 疾 病 的 患 者 短 期 內 已 服 用 與 受 試 功 能 有 關 的 物 品, 影 響 到 對 結 果 的 判 斷 者 未 按 規 定 服 用 受 試 樣 品 或 中 途 加 服 其 它 藥 物, 無 法 判 斷 功 效 或 資 料 不 全 者 2.3 試 驗 設 計 及 分 組 要 求 採 用 自 身 和 組 間 兩 種 對 照 設 計 按 受 試 者 的 咽 部 症 狀 體 征 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 分 組 時 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 病 程 年 齡 性 別 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 2.4 受 試 樣 品 的 劑 量 和 使 用 方 法 試 食 組 按 推 薦 服 用 方 法 和 服 用 量 每 日 服 用 受 試 產 品, 對 照 組 可 服 用 安 慰 劑 或 採 用 空 白 對 照, 也 可 使 用 具 有 清 咽 功 能 的 保 健 食 品 作 為 對 照 受 試 樣 品 給 予 時 間 15 天 ~30 天 試 驗 期 間 受 試 者 不 改 變 生 活 工 作 環 境, 不 改 變 原 來 生 活 飲 食 習 慣 2.5 觀 察 指 標 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 ( 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 ) 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 ( 試 驗 前 檢 查 一 次 ) 功 效 性 指 標 症 狀 觀 察 準 確 記 錄 受 試 者 試 食 前 後 的 咽 部 主 觀 症 狀, 主 要 咽 部 症 狀 包 括 : 咽 痛 咽 癢 咽 幹 乾 咳 異 物 感 多 言 加 重 等, 按 症 狀 輕 重 計 算 積 分 (1 度 1 分,2 度 2 分,3 度 3 分 ), 統 計 積 分 變 化 和 症 狀 改 善 率 84

85 體 征 觀 察 咽 部 檢 查 : 咽 部 粘 膜 充 血 粘 膜 水 腫 咽 後 壁 淋 巴 濾 泡 增 生 分 泌 物 等 體 征 按 檢 查 結 果 的 輕 中 重 分 為 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 級, 分 別 記 錄 試 食 前 後 體 征 變 化, 計 算 體 征 積 分 和 改 善 率 觀 察 指 標 功 效 判 定 : 有 效 : 症 狀 減 輕 1 度, 咽 部 體 征 檢 查 結 果 減 輕 I 級 無 效 : 症 狀 體 征 均 無 明 顯 改 變 2.6 資 料 處 理 和 結 果 判 定 : 積 分 變 化 可 用 t 檢 驗 進 行 分 析 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 ; 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 改 善 率 為 計 數 資 料, 可 用 X 2 檢 驗, 四 格 表 總 例 數 小 於 40, 或 總 例 數 等 於 或 大 於 40 但 出 現 理 論 數 等 於 或 小 於 1 時, 應 改 用 確 切 概 率 法 結 果 判 定 : 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 咽 部 臨 床 症 狀 體 征 積 分 明 顯 降 低, 且 症 狀 體 征 改 善 率 較 對 照 組 有 明 顯 增 加, 差 異 有 顯 著 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 清 咽 功 能 2.7 注 意 事 項 因 咽 部 症 狀 檢 查 帶 有 較 大 的 主 觀 性, 建 議 由 專 人 負 責 所 有 受 試 者 試 食 前 後 的 檢 查, 盡 可 能 保 證 判 斷 標 準 的 一 致 性 85