534 围 内 广 泛 分 布 目 前 认 为 NAFLD 是 与 胰 岛 素 抵 抗 (insulinresistance,ir) 和 遗 传 易 感 密 切 相 关 的 代 谢 应 激 性 肝 脏 损 伤 [1] NAFLD 的 发 生 发 展 涉 及 到 遗 传 环 境 和 生 活 方 式 等

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1 中 国 病 理 生 理 杂 志 ChineseJournalofPathophysiology 2014,30(3): [ 文 章 编 号 ] (2014) 利 拉 鲁 肽 对 非 酒 精 性 脂 肪 肝 大 鼠 脂 联 素 及 胰 岛 素 抵 抗 的 影 响 曾 志 刚, 徐 丽 姝, 关 丽 嫦, 高 慧 亭 ( 广 东 省 医 学 科 学 院, 广 东 省 人 民 医 院 消 化 科, 广 东 省 老 年 医 学 研 究 所, 广 东 广 州 ) [ 摘 要 ] 目 的 : 观 察 利 拉 鲁 肽 (Lira) 对 非 酒 精 性 脂 肪 肝 (NAFLD) 大 鼠 血 清 和 肝 组 织 脂 联 素 (ADP) 及 胰 岛 素 抵 抗 的 影 响 方 法 : 雄 性 SD 大 鼠 30 只, 随 机 分 为 3 组, 分 别 予 普 通 饮 食 (ND 组 )10 只 高 脂 饮 食 (HFD 组 )10 只 和 高 脂 饮 食 加 利 拉 鲁 肽 腹 腔 注 射 (Lira 组 )10 只 高 脂 饮 食 12 周 建 立 大 鼠 NAFLD 模 型, 建 模 成 功 后 Lira 组 予 利 拉 鲁 肽 腹 腔 注 射 治 疗 4 周 16 周 末 处 死 各 组 大 鼠, 生 物 化 学 法 检 测 丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶 (ALT) 空 腹 血 糖 (FBG) 甘 油 三 酯 (TG) 及 总 胆 固 醇 (TC), 分 光 光 度 计 测 定 游 离 脂 肪 酸 (FFAs), 酶 联 免 疫 吸 附 法 测 定 胰 岛 素 和 ADP 结 果 : 与 HFD 组 比 较,Lira 组 大 鼠 体 质 量 肝 指 数 胰 岛 素 抵 抗 指 数 血 清 TG TC ALT FBG 及 肝 匀 浆 TG TC FFAs 显 著 下 降 ( 均 P<0.05), 血 清 及 肝 组 织 ADP 明 显 升 高 (P<0.05), 肝 脏 脂 肪 变 性 程 度 明 显 减 少 至 恢 复 正 常 (P<0.05), 肝 组 织 ADP 含 量 与 肝 脏 FFAs 含 量 呈 负 相 关 结 论 : 利 拉 鲁 肽 改 善 胰 岛 素 抵 抗 和 肝 脏 脂 肪 变 的 可 能 机 制 之 一 与 其 升 高 血 清 及 肝 组 织 脂 联 素 水 平 有 关 [ 关 键 词 ] 利 拉 鲁 肽 ; 胰 高 血 糖 素 样 肽 1; 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 ; 脂 联 素 ; 胰 岛 素 抵 抗 [ 中 图 分 类 号 ] R575.5 [ 文 献 标 志 码 ] A doi: /j.isn Efectsofliraglutideonadiponectinandinsulinresistanceinratswith non alcoholicfatyliverdisease ZENGZhi gang,xuli shu,guanli chang,gaohui ting (DepartmentofGastroenterology,GuangdongInstituteofGeriatrics,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangdong GeneralHospital,Guangzhou510080,China.E mail:xulishu70@163.com) [ABSTRACT] AIM:Toinvestigatetheefectsofglucagon likepeptide1analog,liraglutide,onadiponectinand insulinresistanceintheratswithdiet inducednon alcoholicfatyliverdisease(nafld).methods:maleratswere randomlydividedinto3groups:normaldiet(nd)group(n=10),high fatdiet(hfd)group(n=10),andhfdwith intraperitonealinjectionofliraglutidegroup(n=10,first12weekswithhfd,later4weekswithliraglutide).altreat mentscontinuedfor16weeks,andthentheratswerekiledethicalyandthebloodsamplesandlivertisueswerecolect ed.thelevelsofalanineaminotransferase(alt),fastingbloodglucose(fbg),totalcholesterol(tc)andtriglyceride (TG)weredetectedbyabiochemicalautomaticanalyzer.Thelevelsoffreefatyacids(FFAs),fastinginsulin(FINS) andadiponectinweremeasuredbyriaandelisa.results:comparedwithhfdgroup,thebodyweight,liverindex, homeostasisasesment insulinresistance(homa IR),theserumlevelsofTG,TC,ALTandFBG,andtheliverlevels oftg,tcandffasintheratsinliraglutidegroupwereapparentlylower,thedegreeofhepaticsteatosisandinflammatory activitysignificantlydecreased(p<0.05),andthelevelofadiponectinintheserumandliverhomogenateincreasedob viously(p<0.05).thelevelofadiponectinintheliverhomogenatewasnegativelycorelatedwiththelevelsofffasin theliverhomogenate.conclusion:liraglutideisbeneficialfornafldratstoimproveinsulinresistanceandreduce hepaticsteatosisbyincreasingthelevelofadiponectinintheserumandlivertisues. [KEYWORDS] Liraglutide;Glucagon likepeptide1;non alcoholicfatyliverdisease;adiponectin;insulinre sistance 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 (non alcoholicfatyliver disease,nafld) 是 一 种 常 见 的 慢 性 肝 病, 在 世 界 范 [ 收 稿 日 期 ] [ 修 回 日 期 ] [ 基 金 项 目 ] 广 东 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (No ;No.S ) 通 讯 作 者 Tel: ;E mail:xulishu70@163.com

2 534 围 内 广 泛 分 布 目 前 认 为 NAFLD 是 与 胰 岛 素 抵 抗 (insulinresistance,ir) 和 遗 传 易 感 密 切 相 关 的 代 谢 应 激 性 肝 脏 损 伤 [1] NAFLD 的 发 生 发 展 涉 及 到 遗 传 环 境 和 生 活 方 式 等 多 种 因 素, 与 肥 胖 高 脂 血 症 胰 岛 素 抵 抗 糖 尿 病 等 有 关, 被 认 为 是 代 谢 综 合 征 的 肝 脏 表 现 [2 4] 脂 联 素 (adiponectin,adp) 是 脂 肪 细 胞 分 泌 的 一 种 特 异 性 蛋 白, 有 研 究 认 为 ADP 具 有 改 善 糖 脂 代 谢 及 抗 炎 等 作 用, 在 NAFLD 的 发 生 发 展 中 起 着 重 要 作 用 [5] 胰 高 血 糖 素 样 肽 1(glucagon like peptide1,glp 1) 类 似 物 利 拉 鲁 肽 (liraglutide,lira) 具 有 降 低 体 重 及 改 善 脂 质 代 谢 紊 乱 等 作 用, 已 经 越 来 越 多 地 被 应 用 于 NAFLD 的 治 疗 研 究 中 [6 7] Lira 的 上 述 作 用 是 否 与 ADP 的 影 响 有 关, 目 前 报 道 较 少, 本 研 究 通 过 高 脂 饮 食 (high fatdiet,hfd) 建 立 NAFLD 大 鼠 模 型, 探 讨 Lira 对 NAFLD 大 鼠 胰 岛 素 抵 抗 血 清 和 肝 组 织 ADP 含 量 及 肝 脏 脂 质 和 游 离 脂 肪 酸 (freefaty acids,ffas) 含 量 的 影 响, 并 探 讨 ADP 与 血 清 甘 油 三 酯 (triglyceride,tg) 及 肝 脏 FFAs 的 关 系 材 料 和 方 法 1 材 料 1.1 动 物 清 洁 级 雄 性 SD 大 鼠 30 只, 体 重 (140± 10)g, 购 自 中 山 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 1.2 主 要 试 剂 GLP 1 类 似 物 Lira 购 自 丹 麦 诺 和 诺 德 公 司 ; 血 清 胰 岛 素 和 ADP 试 剂 盒 为 国 产 ELISA 试 剂 盒 ;FFAs 甘 油 三 酯 及 胆 固 醇 试 剂 盒 均 购 自 南 京 建 成 生 物 技 术 研 究 所 2 方 法 2.1 动 物 模 型 的 建 立 6 周 龄 雄 性 SD 大 鼠 30 只, 普 通 饲 料 喂 养 1 周 后 随 机 抽 取 10 只 为 正 常 饮 食 (normaldiet,nd) 组, 继 续 普 通 饲 料 喂 养, 余 20 只 为 制 模 组 给 予 高 脂 饲 料 ( 其 中 普 通 饲 料 88% 猪 油 10% 胆 固 醇 2%) 至 第 14 周 末, 随 机 处 死 正 常 饲 养 组 1 只 和 制 模 组 1 只, 经 检 测 制 模 组 肝 指 数 血 脂 肝 转 氨 酶 等 显 著 增 高, 进 行 肝 组 织 切 片 HE 染 色 肝 细 胞 明 显 脂 肪 变 性 确 认 制 备 模 型 成 功 制 模 组 剩 余 19 只 随 机 分 为 2 组 :HFD 组 9 只, 继 续 以 高 脂 饲 料 喂 养 ;Lira 组 10 只 继 续 予 高 脂 饮 食 同 时 Lira0.6mg kg -1 d -1 腹 腔 注 射 18 周 末 予 水 合 氯 醛 溶 液 腹 腔 麻 醉 处 死 所 有 大 鼠, 下 腔 静 脉 采 血 分 离 血 清, 取 部 分 肝 组 织 于 液 氮 速 冻 后 低 温 保 存, 另 取 部 分 肝 组 织 行 病 理 检 查 2.2 肝 指 数 实 验 结 束 时 称 体 重 和 肝 湿 质 量, 肝 湿 重 / 体 重 100% 即 为 计 算 肝 指 数 2.3 血 清 中 指 标 的 测 定 将 下 腔 静 脉 留 取 的 血 液 3000r/min 离 心 10min, 取 上 层 血 清, 通 过 全 自 动 生 化 分 析 仪 测 定 丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶 (alanineaminotrans ferase,alt) 空 腹 血 糖 (fas tingbloodglucose,fbg) 总 胆 固 醇 (totalcholesterol,tc) 和 TG, 空 腹 胰 岛 素 (fastinginsulin,fins) 和 ADP 采 用 酶 联 免 疫 吸 附 法 测 定, 计 算 胰 岛 素 抵 抗 指 数 (homeostasisasesmentofin sulinresistance,homa IR)=FBG FINS/ 肝 匀 浆 指 标 的 测 定 精 确 称 取 相 同 部 位 的 肝 组 织 200mg, 置 于 1.8mL 匀 浆 介 质, 冰 浴 条 件 下 2000 r/min 匀 浆 3min, 制 备 成 10% 的 肝 组 织 匀 浆 肝 组 织 ADP 通 过 酶 联 免 疫 吸 附 法 测 定, 肝 组 织 TG 和 TC 使 用 生 物 化 学 法 检 测, 分 光 光 度 计 测 定 肝 匀 浆 FFAs 2.5 病 理 学 检 查 部 分 肝 组 织 以 40% 中 性 甲 醛 溶 液 固 定, 制 备 石 蜡 切 片, 采 用 HE 染 色 ; 同 时 取 部 分 冰 冻 肝 组 织 制 备 冰 冻 切 片, 采 用 油 红 O 染 色 3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 分 析, 计 量 资 料 以 均 数 ± 标 准 差 (mean±sd) 表 示 多 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 采 用 Pearson 相 关 系 数 分 析 测 量 指 标 的 相 关 性 以 P<0.05 为 差 异 有 统 计 学 意 义 结 果 1 大 鼠 一 般 情 况 体 质 量 及 肝 指 数 的 变 化 与 ND 组 比 较,HFD 组 大 鼠 性 情 温 顺, 不 喜 动, 毛 色 黄 腻,Lira 组 与 ND 组 相 似 HFD 组 与 ND 组 相 比, 体 重 和 肝 指 数 均 显 著 增 高 (P<0.05); 与 HFD 组 相 比,Lira 组 体 重 和 肝 指 数 均 显 著 下 降 (P<0.05); Lira 组 与 ND 组 相 比, 体 重 无 显 著 差 异 (P>0.05), 肝 指 数 增 高 (P<0.05), 见 表 1 表 1 大 鼠 体 重 肝 指 数 及 血 清 各 项 指 标 的 检 测 结 果 Table1.Resultsofbodyweight,liverindex,andserumindicatorsinrats(Mean±SD) Group n Bodyweight(g) Liverindex(%) ALT(U/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) FBG(mmol/L) ND ± ± ± ± ± ±0.78 HFD ± ± ± ± ± ±1.50 Lira ± ± ± ± ± ±1.03 TG:triglyceride;TC:totalcholesterol;ALT:alanineaminotransferase;FBG:fastingbloodglucose. P<0.05vsNDgroup; P< 0 05vsHFDgroup.

3 3 血清及肝匀浆生物化学指标的检测 HFD组与 ND组相比 大鼠血清 TG TC ALT FBS及肝匀浆 TG TC FFA均明显升高 P 血清和肝组织 ADP明显降低 P 差别均有 统计学意义 L 组与 HFD组相比 血清 TG TC ALT FBS及肝匀浆 TG TC FFA均明显降低 P 血清和肝组织 ADP明显升高 P 差 别均有统计学意义 L 组与 ND组相比 各项指标 均无显著差异 P 见表 3 胰岛素抵抗指数 HFD组的 HOMA R 6 ND组和 L 组的 HOMA R 6 根据 年美国糖尿病协会糖尿 病指南的标准 HOMA R 6为有胰岛素抵抗的 组未产生胰岛素抵抗 胰岛素敏 标准 ND组和 L 感性提高 与 HFD组比较 差别有统计学意义 P 见表 表 大鼠 HOMA R及肝匀浆各项指标的检测结果 T R f m M ±S D G ND HFD L HOMA R 8 ± ± ± TC mm 8± 8 ± 8 ± TG mm ± ± 4 ± 3 3 FFA μm ± ±3 8 ±3 TG y TC FFA f f y P ND P HFD 4 病理学检查结果 光镜下显示 ND组肝细胞排列整齐 肝小叶规 则 细胞中央有大而圆的核 细胞质均匀 HFD组大 鼠肝细胞肿胀 体积较正常 明 显 增 大 出 现 脂 肪 变 性 胞质内可见大小不等的脂滴空泡 以大泡性脂肪 滴为主 汇管区有以单核 淋巴细胞为主的炎症细胞 浸润 部分出现点状坏死和灶状坏死 已进展为非酒 组肝细胞明显较高脂组肝 精性脂肪肝炎阶段 L 细胞体积缩小 未见脂肪变性 肝小叶内未见炎症 见图 L 对血清及肝组织脂联素的影响 HFD组与 ND组相比 大鼠血清及肝匀浆 ADP 明显降低 P L 干预后 血清及肝组织 ADP明显升高 P 见图 3 6 血清 ADP与血清 TG 及肝组织 ADP与肝组织 FFA的关联性 血清 ADP 与 血 清 TG 具 有 负 相 关 性 肝组织 ADP含量与肝组织 FFA 4 P 含量具有负相关性 4 P F H f HE 4 A ND B HFD C L 图 HE染色观察各组大鼠肝组织病理学变化 F H f O O 4 A ND B HFD C L 图 油红 O染色观察各组大鼠肝组织病理学变化

4 536 Figure3.Theefectofliraglutide(Lira)onadiponectin(ADP).A:thelevelofADPinserum;B:thelevelofADPinliverhomoge nates. P<0.05vsNDgroup; P<0.05vsHFDgroup. 图 3 Lira 对 脂 联 素 的 影 响 讨 论 NAFLD 是 一 种 无 过 量 饮 酒 史 以 肝 实 质 细 胞 脂 肪 变 性 和 脂 肪 储 积 为 特 征 的 临 床 病 理 综 合 征 NAFLD 的 发 病 机 制 至 今 尚 未 完 全 阐 明 较 为 成 熟 的 是 二 次 打 击 学 说 第 一 次 打 击 是 引 起 NAFLD 的 首 发 原 因, 包 括 各 种 原 因 导 致 的 脂 质 代 谢 紊 乱, 使 过 多 的 脂 质 在 肝 细 胞 内 沉 积, 而 以 胰 岛 素 抵 抗 和 氧 应 激 脂 质 过 氧 化 为 核 心 的 二 次 打 击 导 致 脂 肪 变 的 肝 脏 发 生 炎 症 坏 死 和 纤 维 化 [1] GLP 1 是 一 种 葡 萄 糖 依 赖 性 肠 促 胰 素, 可 通 过 增 加 脂 肪 酸 氧 化, 改 善 肝 脏 的 脂 肪 病 变 及 氧 应 激, 对 非 酒 精 性 脂 肪 肝 起 到 明 显 的 改 善 作 用 [8] GLP 1 可 改 善 肝 脏 脂 肪 变 性, 并 不 单 纯 依 赖 于 减 轻 体 重 所 致 整 体 代 谢 参 数 的 改 善 [9] GLP 1 可 能 通 过 增 加 肝 脏 载 脂 蛋 白 E(apolipoproteinE,ApoE) 的 表 达 或 上 调 ADP 水 平, 显 著 降 低 TG TC 水 平, 减 少 低 密 度 脂 蛋 白 的 合 成 [10] Lira 是 GLP 1 类 似 物, 与 天 然 GLP 1 有 97% 的 同 源 性, 具 备 GLP 1 全 部 生 理 作 用 [11] 本 研 究 模 型 组 大 鼠 肝 组 织 FFAs 血 清 TG 及 TC 显 著 升 高,ADP 与 FFAs 和 TG 呈 明 显 负 相 关, 提 示 ADP 降 低 导 致 TG 和 FFAs 升 高 可 能 是 NAFLD 形 成 的 机 制 之 一 经 Lira 治 疗 后 能 使 NAFLD 大 鼠 脂 质 代 谢 紊 乱 明 显 改 善 NAFLD 已 被 证 实 与 胰 岛 素 抵 抗 的 发 生 发 展 密 切 相 关 [12 13] 胰 岛 素 抵 抗 引 起 NAFLD 的 主 要 原 因 是 脂 代 谢 紊 乱 和 高 胰 岛 素 血 症, 导 致 FFAs 增 多, 增 多 的 FFAs 又 可 通 过 抑 制 胰 岛 素 的 信 号 转 导 而 加 重 IR [14 15] 同 时 大 量 的 FFAs 在 线 粒 体 内 被 氧 化, 产 生 过 多 的 活 性 氧 簇 (reactiveoxidespecies,ros), 当 肝 细 胞 内 ROS 的 产 生 及 其 作 用 超 过 抗 氧 化 系 统 清 除 能 力 时 便 产 生 氧 化 应 激 [16] Lira 可 改 善 β 细 胞 功 能, 降 低 体 质 量 和 低 血 糖 发 生 率 [11,17] 但 有 关 其 对 胰 岛 素 敏 感 性 及 其 机 制 的 研 究 较 少 本 研 究 高 脂 组 FFAs FBG 和 HOMA IR 明 显 上 升, 肝 组 织 ADP 含 量 与 肝 组 织 FFAs 含 量 呈 显 著 负 相 关 Lira 干 预 后 FFAs FBG 和 HOMA IR 均 显 著 改 善 并 恢 复 至 正 常 饲 养 组 水 平, 说 明 NAFLD 大 鼠 经 Lira 处 理 后, 糖 脂 代 谢 明 显 改 善, 有 效 逆 转 了 IR ADP 是 脂 肪 细 胞 分 泌 的 一 种 特 异 性 蛋 白, 大 量 的 动 物 和 人 体 实 验 发 现 ADP 与 肥 胖 IR 冠 心 病 及 NAFLD 密 切 相 关 [18 19] [20] LI 等 测 量 了 60 例 NAFLD 患 者 及 60 例 正 常 患 者 的 血 清 ADP 含 量 和 HOMA IR, 说 明 低 ADP 与 IR 呈 负 相 关, 是 引 起 IR 的 独 立 影 响 因 素 本 研 究 显 示 模 型 组 大 鼠 血 清 及 肝 组 织 ADP 明 显 低 于 对 照 组,HOMA IR 明 显 上 升, 说 明 低 ADP 可 能 在 NAFLD 的 发 生 中 起 一 定 的 作 用, 模 型 组 大 鼠 经 Lira 处 理 后, 血 清 及 肝 组 织 ADP 明 显 增 高,HOMA IR 明 显 上 升, 提 示 Lira 改 善 IR 可 能 与 升 高 血 清 及 肝 组 织 ADP 有 关 本 研 究 在 前 期 发 现 GLP 1 类 似 物 Lira 具 有 抗 炎 改 善 氧 应 激 及 脂 质 过 氧 化 减 轻 体 重 及 抑 制 摄 食 等 作 用 的 基 础 上, 进 一 步 从 体 内 代 谢 角 度 对 其 在 NAFLD 的 机 制 上 进 行 研 究 结 果 表 明 Lira 处 理 4 周 后, 大 鼠 血 浆 及 肝 组 织 ADP 水 平 升 高 的 同 时, 糖 脂 代 谢 明 显 改 善,IR 明 显 降 低, 因 此, 我 们 推 测 Lira 改 善 NAFLD 胰 岛 素 抵 抗 和 肝 脏 脂 肪 变 的 可 能 机 制 之 一 与 其 升 高 血 清 及 肝 组 织 ADP 水 平 有 关 [ 参 考 文 献 ] [1] TesariP,CoracinaA,CosmaA,etal.Hepaticlipidme tabolism andnon alcoholicfatyliverdisease[j].nutr MetabCardiovascDis,2009,19(4): [2] TarantinoG,FineliC.Whataboutnon alcoholicfatyli verdiseaseasanew criteriontodefinemetabolicsyn drome?[j].worldjgastroenterol,2013,19(22): [3] 林 妙 霞, 李 泽 楷, 罗 敏 琪, 等. 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 与 代 谢 综 合 征 的 关 系 研 究 [J]. 中 国 病 理 生 理 杂 志,

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