检验医学 年 月第 卷第 期 /2+1/,+1.9$' &"$ -0-!, :+;+ 胰高血糖素样肽 0 -&/0+"$%$%,'$ C 7 是胰高血糖素原基因表达产物 有 C 7 和 C 7 ;6 种生物活性形式 后者占 8 左右 具有生物活性的 C 7 在体内半衰期极短 仅 " 左右 迅速被酶类

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1 检验医学 年 月第 卷第 期 /2+1/,+1.9$' &"$ -0-!, :+;+ 文章编号 中图分类号 文献标志码!" 胰高血糖素样肽 + 定量.90 方法的建立及初步临床应用 孙立山 汪明东 陆 柳 刘颖冰 鹿 麟 郭金虎 范列英 同济大学附属上海市东方医院检验科 上海 ;+3+' /5 公司 美国加利福尼亚州 摘要 目的 建立定量检测血清中胰高血糖素样肽 C 7 酶联免疫吸附试验 并探讨其在 型糖尿病 * 9 患者个体化治疗中的应用 方法 以多克隆抗体作为捕获抗体 另一单克隆抗体作为标记抗体和系列稀释的标准液 建立能够定量检测血清中 C 7 总含量的 并初步确立生物参考区间 将研究对象根据糖代谢情况分为正常糖耐量 ;C* 组 例 糖耐量受损 C* 组 例 和 * 9 组 例 分别测定空腹 服糖后 # 服糖后 # 血清中 C 7 含量的动态变化 结合其它常规生化指标 评价 C 7 检测在 * 9 患者治疗中的临床应用价值 结果 所建立的方法在 " + 范围内具有良好的定量关系 ) 初步建立成人生物参考区间为 " + * 9 组 C 7 浓度明显高于 ;C* 组和 C* 组 ) 动态监测研究对象糖耐量试验中血清 C 7 浓度变化 在 C* 组和 * 9 组出现服糖后 C 7 分泌异常不足的情况 结论 成功建立了定量检测血清 C 7 的 可以动态监测 C* *9 患者体内 C 7 的分泌状况以指导临床个体化治疗 关键词 胰高血糖素样肽 酶联免疫吸附试验 型糖尿病 糖耐量受损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基金项目 上海市科委生物医药领域重点项目? 作者简介 孙立山 男 年生 硕士 主管技师 主要从事糖尿病和冠心病的生物标志物研究 通讯作者 范列英 联系电话

2 检验医学 年 月第 卷第 期 /2+1/,+1.9$' &"$ -0-!, :+;+ 胰高血糖素样肽 0 -&/0+"$%$%,'$ C 7 是胰高血糖素原基因表达产物 有 C 7 和 C 7 ;6 种生物活性形式 后者占 8 左右 具有生物活性的 C 7 在体内半衰期极短 仅 " 左右 迅速被酶类降解 有研究证实 C 7 可以促进胰岛 细胞分泌胰岛素 "!- " ; 减少胰高血糖素的分泌 降低血糖 从而在维持血糖水平中起重要作用 糖耐量受损 %/1$' 0 -&+!$,+ $1/"&$ C* 及 型糖尿病,.%$ ' /2$,$! $,-! * 9 患者进食后 ; 水平升高的同时 胰高血糖素水平也明显升高 C 7 分泌减少导致的胰高血糖素分泌抑制不足起着重要作用 此外 流行病学调查发现 * 9 与阿尔茨海默病 #$ $1!'!$/!$ 及动脉粥样硬化性疾病密切相关 基于 C 7 和其类似物以及二肽酶 ' %$%,'. %$%,'/!$ : 77 : 抑制物等新药物的使用为这些疾病的治疗提供了新的选择 为了进一步研究 C 7 在这些疾病致病机制中的作用 明确此类药物的疗效 本研究建立了测定血清或血浆 C 7 总含量定量酶联免疫吸附试验 $". $ " $' -"+!+12$",/!/. 并进行了初步的临床应用研究 材料和方法一 研究对象选择 年 月至 年 月来上海市东方医院体验的表面健康人群 名 确认空腹血糖正常 肝 肾功能正常 血脂指标均正常 无糖尿病及心血管病史 其中男 名 年龄 岁 女 名 年龄 岁 采集空腹静脉血 用以建立 C 7 生物参考区间 同期在上海市东方医院首次诊断 C* 患者 例和 * 9 患者 例 所有患者均未接受 C 7 或其类似物药物治疗 正常糖耐量 "+1 / 0 -&+!$,+ $1/"&$ ;C* 组 例 上述研究对象进行口服葡萄糖耐量试验 +1/ 0 -&+!$,+ $1/"&$,$!, C** 并采集空腹 服糖后 # 和服糖后 # 个时间点静脉血 用于检测 C 7 的血样本用普通促凝管收集 采血后 # 内以 离心分离血清 冻存 待 C 7 检测 其它常规生化指标 血样本按照临床常规方法进行收集和检测 二 材料生物合成的 C 7 ;6 C 7 ;6 C 7;6 C 7;6 多肽纯品 以 C 7 ;6 为抗原制备兔抗人 C 7 多克隆抗体 该抗体能够识别其它 种 C 7 多肽 以 C 7 ;6 为抗原 采用杂交瘤技术制备抗 C 7 ;6 单克隆抗体 再以上述 种 C 7 多肽分别筛选 获得同时能够特异性识别 种形式 C 7 包括具有生物活性的 C 7 C 7 和无活性的 C 7 C 7 的鼠源性单克隆抗体 将此单克隆抗体以辣根过氧化物酶 #+1!$1/'!# %$1+5'/!$ 6 7 标记 以上多克隆抗体和单克隆抗体均由美国 ;+3+' /5 公司提供 三 方法 酶标板包被 取包被抗体 兔抗人 C 7 多克隆抗体 0 用包被缓冲液作 稀释至 0 加于微孔板中 每孔 置 # 取出 用蒸馏水冲洗 次 拍干 用 8 牛血清白蛋白 磷酸盐缓冲液 2+3"$!$1- / 2- "%#+!%#/,$2- $1!+ -,+" 7 作为封闭液 每孔 置 # 后用蒸馏水冲洗 次 拍干 标准液配制及标准曲线建立 取合成肽抗原 C 7 ;6 固体 溶于缓冲液 8 8 *4$$" 7 配制抗原浓度约为 + 在检测前将标准液用封闭液作倍比稀释 连续检测 ' 每个浓度做复孔 取平均值 检测 在反应孔内分别加入标准液 待测血清 每孔 # 用蒸馏水洗涤 次 拍干 加入 6 7 标记抗 C 7 单克隆抗体 稀释 每孔 置 # 取出 用蒸馏水冲洗 次 拍干 加邻苯二胺底物显色 室温 " 用 + 硫酸终止显色 使用主波长 " 副波长 " 酶标仪比色 精密度试验 对 份血清样本 * 9 患者和健康人各 份 重复检测 次 每次测定做复孔 取其平均值 共重复试验 ' 分别计算批内及批间变异系数 &+$ &$",+ 3/1/,+" 6 稳定性试验 同时将同一批次建立的 C 7 试剂盒置 温箱 和 ' 与

3 检验医学 年 月第 卷第 期 /2+1/,+1.9$' &"$ -0-!, :+;+ 保存 和 个月的试剂盒平行检测标准品浓度为 " + 的标准液 每份同时检测 次 以评价检测方法的稳定性 常规生化项目检测 采用德国罗氏诊断产品公司的 (+2/! & 全自动生化分析仪和 (+2/! & 免疫分析仪及原装配套试剂 按照临床实验室常规方法检测样本葡萄糖 0 -&+!$C ; 胆固醇 &#+ $!,$1+ (6 甘油三酯,10.&$1'$ *C 低密度脂蛋白胆固醇 +4'$"!,. %+%1+,$" &#+ $!,$1+ ( 高密度脂蛋白胆固醇 # 0#'$"!,. %+%1+,$" &#+ $!,$1+ 6( 使用日本东曹 C 型高效液相色谱法糖化血红蛋白 #$ " & 62 & 分析仪及配套试剂检测 62 & 应用西门子特定蛋白仪 ; 测定高敏 ( 反应蛋白 # 0#!$"!,3,.(1$/&,3$%1+,$"#!( 7 四 统计学方法所有统计分析使用 7 统计软件完 成 标准曲线建立分别进行直线回归和二次 三次回归分析 选择最佳回归方程建立标准曲线方程 健康人群生物参考区间采用正态性检验和频数分布图进行统计描述 对于不同组别各指标的差异比较采用 检验或方差分析并进行两两比较 以 ) 为差异有统计学意义 结 果一 标准曲线的建立将 C 7 标准液用封闭液倍比稀释至 和 " + 系列浓度 以封闭液为 点 连续检测 ' 每次做复孔 所测得吸光度 值均值 标准差 / 6 及 8 可信区间等结果见表 通过对所得数据分别进行直线回归 二次回归和三次回归分析 结果显示本试验所建立的方法检测区间为 " + 分析敏感性为 " + 6)8 的最低标准液浓度 回归方程见图 表 + 连续 ' 标准液检测结果 值 项目 C 7 标准液浓度 " + " / 8 可信区间 68 当日分别重复检测 份样本 * 9 患者和健康人各 份 各 次 批内 6 分别为 8 和 8 见表 注 $ $ ) 图 + 总 C 7 定量 检测标准曲线 二 生物参考区间的初步确定对 名健康人空腹血清 C 7 总含量浓度分别进行测定并绘制频数分布图 见图 初步确定健康人血清 C 7 总含量生物参考区间为 " + 三 精密度试验 批内精密度试验 用自建血清总 C 7 图 名健康人空腹血清 C 7 浓度分布

4 检验医学 年 月第 卷第 期 /2+1/,+1.9$' &"$ -0-!, :+;+ 表 血清总 C 7 精密度试验结果 样本 检测次数 血清总 C 7" + 批内批间 批内 68 批间 健康人 * 9 患者 批间精密度试验 同一样本重复检测 ' 的批间 6 分别为 8 和 8 见表 四 稳定性试验对所建立的 试剂稳定性进行测试 包被板及所有相关试剂在 放置与 保存不同时间后 对含量为 " +C 7 标准品测定结果分别为 和 " + 保存 ' 后 C 7 检测结果降低 8 保存 个月后结果降低 8 表明所建立的总 C 7 稳定性较好 五 ;C* C** 9 组各指标水平分析 例 ;C* 例 C* 和 例 * 9 患者空腹血清 C 7 及其它常规生化指标情况 * 9 患者空腹 C ;62 & 和 #!( 7 均显著高于 ;C* 组 ) C* 组 62 & 和 #!( 7 水平也高于 ;C* 组 ) 分析空腹 C 7 水平 * 9 组显著高于 ;C* 组 ) C* 组虽然在数值上看似也增高 但与 ;C* 组差异无统计学意义 < 见表 表 各组研究对象空腹状态下常规临床生化指标水平比较 组别 年龄 岁 例数 男 女 C+ ; C 7" + *C+ ;C* 组 C* 组 * 9 组 组别 (6+ (+ 6(+ 62 & 8 #!( 7 0 ;C* 组 C* 组 * 9 组 注 与 ;C* 组比较 ) 进一步分析不同组别各研究对象 C** 过程中各时间点血清 C 7 浓度变化 * 9 患者空腹血清 C 7 含量高于正常组 C* 组虽然看似偏高 但与 ;C* 组比较 差异无统计学意义 < 观察服糖后 C 7 变化趋势 发现 ;C* 组患者在服糖后 # 血清 C 7 含量显著升高 至 # 逐渐回落 而 C* 组和 * 9 组均呈现餐后 # C 7 水平不升反降的趋势 至餐后 # 血清 C 7 回升不显著 提示 C* 组和 * 9 组存在 C 7 分泌不足 但是 分析每一例研究对象在进行 C** 中 C 7 含量变化的趋势 我们发现 ;C* 组 例研究对象空腹 服糖后 # 服糖后 # C 7 变化趋势均一致 但 例 C* 患者中有 例 例 * 9 患者中有 例 C 7 变化与 ;C* 组一致 在服糖后 # 出现 C 7 水平显著升高 # 回落 这与前述组中的多数患者 C 7 变化趋势不同 表明并不是所有 C** 9 患者都存在服糖后 C 7 分泌不足 患者的糖代 谢异常可能存在其他机制 见表 表 各组患者餐后血清 C 7 含量变化分析 C 7" + 组别 例数 空腹 服糖后 # 服糖后 # ;C* 组 = C* 组 == == * 9 组 = 注 与 ;C* 组比较 )) 与空腹比较 =)==) 空腹状态下 * 9 组 C 7 水平显著高于 ;C* 组 ) 但与 C* 组无显著差异 < 各组内服糖后 C 7 水平比较 ;C* 组服糖后 # C 7 水平显著上升 # 后回落至空腹水平 C* 组服糖后 # 降低 ) 服糖后 # 仍然低于空腹水平 ) * 9 组服糖后 # C 7 水平显著降低 ) 服糖后 # C 7 水平从数值上看仍然低 但与空腹

5 检验医学 年 月第 卷第 期 /2+1/,+1.9$' &"$ -0-!, :+;+ 水平差异无统计学意义 < 讨 论鉴于 C 7 在 * 9 发病机制和治疗中的重要作用 检测 * 9 患者和正常人血液中的 C 7 浓度以及进食后的反应性变化引起国内外研究者的极大兴趣 有关血液中 C 7 检测 目前主要以检测 C 7 来反映体内生物活性 C 7 的方法报道较多 但由于 C 7 容易被 77 : 降解 并且其相对分子质量小 体内半衰期仅为 " 即可被 77 : 从 ; 末端剪去 个氨基酸残基变成无生物活性的 C 7 或 C 7 片段 因此在对具有生物活性的 C 7 检测时 极易造成检测结果偏低 并且在血液采集 分离血清 样本保存和检测操作过程的诸多环节中 很难确保生物活性 C 7 8 不被降解 更增加了检测结果的不确定性 因此检测 C 7 不能完全反映体内 C 7 的分泌情况 目前市售的 C 7 检测试剂盒多采用一种特异识别 C 7 的单克隆抗体作为捕捉抗体 另一种 C 7 单克隆抗体 抗 C 7 另一抗原表位的单克隆抗体 用以检测具有生物活性的 C 7 遗憾的是到目前为止还没有令临床满意的免疫学检测方法 本研究建立的定量 通过能够识别各种形式 C 7 有 无活性 单克隆抗体能够一次检测人体内 种形式的 C 7 不管其是否具有活性 这样的定量检测结果能较客观和真实地反映体内 C 7 的分泌状况 本研究建立的检测方法检测范围覆盖 " + 并初步确立了成人 C 7 正常生物参考区间为 " + 该检测方法的稳定性和精密度也较好 为 C 7 检测在 * 9 和其它疾病中的临床研究及临床应用奠定了实验基础 现认为 C 7 的生理作用不仅可刺激 C 依赖的 ; 分泌 而且能促进胃泌素的分泌和抑制胰高血糖素的分泌 抑制胃排空和胃酸分泌 并能减少食物的摄入 对于 * 9 患者 其 肠促胰岛素效应 受损 主要表现为 C 7 分泌缺陷 并且服糖后其浓度升高幅度较正常人有所减小 但其促进 ; 分泌以及降血糖的作用并无明显受损 并且动物实验和临床研究已经证明 C 7 可通过多种机制明显地改善 * 9 动物模型和患者的血糖情况 这些研究为 * 9 的治疗方案提 供了一个非常好的选择 同时 C 7 具有 C 浓度依赖性降糖特性 是其临床应用安全性的基础与保障 从而免除了人们对现有糖尿病治疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担忧 目前部分 C 7 类似物的药物已经应用于临床 * 9 患者血糖的控制 按照循征医学的要求 C 7 类似物的药物应该应用在 C 7 分泌缺乏的 * 9 患者 因此在使用 C 7 类似物的药物前应当首先检测患者血液中 C 7 的浓度 判断患者体内是否真正存在 C 7 缺乏 但目前尚没有可靠的用于临床 C 7 检测的免疫学方法 部分临床研究通过常规疗效评估指标如 C 62 & 等选择药物的适应人群和评价疗效评估 本研究通过应用本实验室建立的 C 7 定量 检测方法 对 ;C* C** 9 组人群血清 C 7 及其它常规生化指标进行分析 结果显示 * 9 患者空腹 C ;62 & 和 #!( 7 均显著高于 ;C* 组 C* 组 62 & 和 #!( 7 也高于 ;C* 组 这些结果与其它临床研究结果一致 提示 ; 抵抗和炎症反应在 * 9 患者发病机制中的作用 * 9 组患者空腹 C 7 水平明显高于对照组 并且与其它两组比较差异有统计学上意义 说明了 C 7 在糖尿病患者血糖异常中的作用 但 C 7 的浓度异常是疾病的致病机制还是表现尚不能确定 我们的研究显示糖尿病组空腹血清 C 7 浓度较正常人增高 这与 * B* ; ; 等报道的结果一致 ; *6 ;; 等采用放射免疫方法检测 例 ;C* C* 和 * 9 组患者血清空腹 C 7 水平 发现 C* * 9 组患者空腹 C 7 水平较 ;C* 组偏高 但未达到统计学差异 导致 C** 9 患者空腹 C 7 升高趋势的分子机制不明 对于 C** 或饮食引起的 C 7 分泌变化 以往的很多研究结论各异 去年 ( ;; 等 在一篇 9$,/ 分析中认为 * 9 患者在 C** 或饮食后并不存在 C 7 分泌的降低 不同人种 C 7 变化也存在差异 我们观察了 ;C* C* 和 * 9 组 C 7 浓度随服糖后时间的动态变化 结果提示 C* 组和 * 9 组患者存在服糖后 C 7 分泌缺陷 尤其是 * 9 组患者在服糖后 # 明显降低 服糖后 # 有所恢复 数值上低于空腹平均水平 但无统计学差异 说明 C* 和 * 9 患者在服糖后随着血糖的升高 患者 C 7 的分泌不升反降 支持 * 9 患者 肠促胰岛素

6 检验医学 年 月第 卷第 期 /2+1/,+1.9$' &"$ -0-!, :+;+ 效应 受损的理论 我们进一步分析每一例受试者餐后 C 7 水平变化 发现少数患者 C 7 的变化与 ;C* 组患者表现一致 说明并不是所有 C* 和 * 9 患者都存在 肠促胰岛素效应 受损 此发现提示在临床进行 C 7 替代疗法或 77 : 抑制疗法之前应检测患者 C 7 的分泌状况 可以帮助选择治疗方法及剂量 准确可靠地检测 C 7 浓度 对 * 9 个性化治疗和 C 7 类似物药物或 77 : 抑制剂类药物的选择具有指导意义 对 * 9 患者疗效评估和预后判断提供有效的循证医学支持也有重要的临床价值 参考文献 (6 (> C ; A /"',#$1/%$-,& %+,$",/ + C 7 ",#$,1$/, $",+ ' /2$,$! A 1-0!&+3*+'/. ; :L* CCA $,/*#$!$%/1/,$ /"' &+ 2 "$' %/&,+,#$ ",$!,"/ #+1 +"$! C 7 C 7 /"' C 7 +" 0 -&/0+"!$&1$,+" ",.%$ ' /2$,$! A A7#.!+ "'+&1"+ 9$,/2 (6 ; 9: (@ $,/ 2$!,./"',.%$ ' /2$,$! %/1 "!- ""'-&$'!-%%1$!+" + 0.&+0$"+.!! /! 4$ /! 0 -&+"$+0$"$!!A/2$,$! 9 9 ;*? ( 7+,$",/ &/1' +%1+,$&,3$ /&,+" + C $"&#,+2$'!'$ A 9$,/2+! 6A ( B; 9 (@D 9 $,/ "/.!!+ 0 -&/0+"$%$%,'$ 4#/,,+ $/!-1$ A ( " (# &,/ 刘珊 谢波 郝素娟 等 胰高血糖素样肽 及其类似物的生物学活性测定方法 A 中国生化药物杂志 ( ;; (6 * ;;9 6 * A $,/ $&1$,+" + 0 -&/0+"$%$%,'$ " %/,$",!4,#,.%$ ' /2$,$! $,-!!.!,$ /,&1$3$4/"' $,/ /"/.!$!+ & " &/!,-' $! A/2$,+ +0/ 吴美芬 武革 蔡晓玲 等 初发 型糖尿病患者 C 7 水平变化对胰高血糖素及早相胰岛素分泌的影响 A 中国临床新医学 ;(@ 9 B(6 ;+C 7 2/!$',#$1/% $! "&1$/!$&/"&$11! A/2$,$!(/1$ -%% * B*; ;9 96*9 9 $,/ $,$1 "/",!+,#$ %/1$'!$&1$,+" + 0 -&/0+"$%$%,'$ ",.%$ ' /2$,&%/,$",! A A( " "'+&1"+ 9$,/2 ; *6 ;;? *6 ; ( $,/ 7 /! / $3$!+ 0 -&/0+" $%$%,'$ /!+&/,$ 4,# ' /!,+ & -"&,+" " $ '$1. $" A/2$, 9$' A ; ; C $, /60#$1"!- " /"' 0 -&/0+"$%$%,'$ C 7 $3$! " #$/,#..+-"0 +-,#!/"! /! &+ %/1$',+ (/-&/!/"! '-1"0 /" +1/ 0 -&+!$,+ $1/"&$,$!, A 9$,/2+! 收稿日期 本文编辑 姜 敏 参加 检验医学 检验医学新技术 继续教育回执 复印有效 姓名性别出生年月日年龄学历 职称职务联系电话 手机 / 单位 邮编 单位地址 家庭地址 邮编 注 单位和家庭地址可任选其一填写 原则上按您的通信地址填写 地址填写格式 省 市 区 县 路 弄 号 室

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