杭州师范大学学报 自然科学版 年 形胶质细胞中表达 而且也在少突胶质细胞中表达 例如 :#" 等人利用 2!, 品系小鼠发现 2 和少突胶质细胞的标记分子 $' #.. 表达在相同的细胞中 而 +". 等人也发现 2 表达在分化的少突胶质细胞细胞核中 但在已经形成髓鞘的少突胶质细胞中表达量降低 而且

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1 第 卷第 期 年 月 杭州师范大学学报 自然科学版!"#"$%% '" $(() 脊髓中 基因的表达模式研究 黄 浩 赵晓枫 邱猛生 杭州师范大学生命与环境科学学院 浙江杭州 摘 要 2 是一种钙离子结合蛋白 与阿尔兹海默症 帕金森症 神经痛等多种神经系统疾病有关 实验通过原位杂交和免疫荧光技术对 2 在中枢神经系统的表达模式进行直接分析 发现 2 主要表达在脊髓灰质星形胶质细胞和脊髓白质中正在成熟的少突胶质细胞中 表明其并不能很好的作为星形胶质细胞的分子标记物 关键词 2 星形胶质细胞 少突胶质细胞 脊髓中图分类号 1 文献标志码 - 文章编号 ) 引 言 2$2#%$# 是一种具有!, 手构象的.# A 结合蛋白 通过二硫 键形成同源二聚体 而且这种二聚体的形成对其神经营养功能的发挥是必须的 将形成二硫键的半胱氨酸残基突变 可以诱发中枢神经系统 /#((%(". 中星形胶质细胞 -( %( 和小胶质细胞 3$'$# 的炎症应答反应 有些研究结果显示 2 能够结合 并抑制其转 录活性 与星形胶质细胞瘤 原发性恶性黑色素瘤等癌症的发展有关 在神经系统中 研究表明 2 与多种中枢神经系统疾病以及神经系统损伤有关 1=$ 等人发现过表达 2 会导致小鼠的运动协调能力下降 羟色胺水平下调 而多巴胺水平上升 说明 2 可能与帕金森症的发病机制有关 类似 的研究表明 2 与阿尔兹海默症和神经痛等神经系统疾病相关 小鼠 2 基因的敲除能够增 强免疫反应性 诱发慢性的胶质过多症 增强癫痫发生等 另一方面 2 在中枢神经系统的功能具有双重性 在中枢神经系统损伤后的炎症应答反应中 2 作为神经营养因子促进神经元存活 而当活化的胶质细胞过量分泌 2 时 又会引起神经炎症反应和神经元功能紊乱 脊椎动物中枢神经系统主要有神经元 少突胶质细胞 $'%(=( 星形胶质细胞和小胶质细胞几种细胞 其中神经元负责神经冲动的产生和传导 少突胶质细胞负责围绕神经元轴突形成髓鞘并几十倍的加快神经冲动的传导速度 小胶质细胞参与免疫 而星形胶质细胞是中枢神经系统数量最多 功能最复杂的细胞类型 但是 由于星形胶质细胞标记物的缺乏使得对其发育的研究受到一定限制 2 一直以来在发育生物学中被广泛用作星形胶质细胞的标记物 但是 很多证据表明 2 不只在星 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金项目 11 通信作者 邱猛生 男 教授 博士 主要从事神经发育生物学研究!"#$"@$%#"

2 杭州师范大学学报 自然科学版 年 形胶质细胞中表达 而且也在少突胶质细胞中表达 例如 :#" 等人利用 2!, 品系小鼠发现 2 和少突胶质细胞的标记分子 $' #.. 表达在相同的细胞中 而 +". 等人也发现 2 表达在分化的少突胶质细胞细胞核中 但在已经形成髓鞘的少突胶质细胞中表达量降低 而且在缺乏 2 的髓鞘损伤后的再生过程中以及 2 突变小鼠中 少突胶质细胞的成熟都明显延迟 这说明 2 确实表达在正在成熟的少突胶质细胞中 并促进少突胶质细胞相应的发育过程 但是 2 在中枢神经系统尤其是脊髓中各种类型细胞中的表达模式并没有被完整的分析 实验通过原位杂交和免疫荧光实验确认了 2 在脊髓灰质中的星形胶质细胞和即将或正在成熟的少突胶质细胞 主要分布在脊髓白质 中的表达 说明 2 并不能作为单纯的星形胶质细胞的分子标记物 而只是在部分星形胶质细胞和特定发育阶段的少突胶质细胞中表达 材料和方法 实验材料 液 小鼠不同时期的脊髓组织分离后在 多聚甲醛,- 溶液中 9 固定过夜 之后换入 蔗糖溶 9 浸泡过夜后 包埋后放 1 9 保存 切片厚度原位杂交实验为 1" 免疫荧光实验为 " 原位杂交 将小鼠脊髓组织冰冻切片 1" 贴在载玻片上 9 烘干 "$ 依次浸泡,- "$B "$'"= 蛋白酶 溶液 "$,-"$B"$B/!- 溶液 "$B "$ 室温预杂交 加 - 探针 9 杂交反应过夜 然后在 9 的 B. 溶液中洗 转入 : 的 3 /$( 缓冲液中 "$ 用绵羊血清封闭后加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体 9 孵育过夜 取出后在 : 的 3 /$( 缓冲液浸泡 再在含 3' A 和底物 /. 的 : 的 3 /$( 缓冲液中反应显色 显色完成后甲醇中脱色处理后封片拍照 将 2 基因 +- 序列的 22 克隆到 //+# 载体中 通过体外转录得到 2 的探针 ) 免疫荧光 切好的片子放入 B 每次 "$ 次 山羊血清室温封闭 "$ 加入按比例稀释的一抗 9 过夜反应 片子取出后放入 B 每次 "$ 次 再加入荧光标记的二抗 室温孵育 B 每次 "$ 次后封片拍照 抗体为 #$2-2#"-#$."$3-#$,-3$$-1 #$3$$3-#$ 由 3$#' 赠送 #$..-2#"- 结果与分析 在脊髓中的表达模式 为了探究 2 在脊髓中的表达模式 购买了 2 的抗体 通过免疫荧光技术检测 2 在小鼠各个不同发育时期的脊髓中的表达 结果发现 2 在胚胎期 受孕后! 时在脊髓及其周围组织的表达都不明显 如图 - 而! 时就开始在脊髓侧边的背根神经节 +(#'#'$+ 细胞 如图 红色箭头 图 和脊髓外围的脊椎骨细胞 如图 白色箭头 中高表达 这一结果暗示 2 可能调控这些 + 神经元的发育过程而参与机体感觉的形成过程 再考虑到 2 对.# A 代谢的调控功能 2 可能和骨质形成有关 在脊髓中 2 的表达在胚胎期! 才开始出现 主要在脊髓的腹侧中央的部分神经上皮细胞以及少量刚迁移出不远的细胞中表达 在随后的发育时期 这些细胞不断产生和增殖 到!1 时 这些细胞虽然还是主要分布在脊髓的腹侧区域 但数量逐渐增多 并开始在脊髓边缘的白质中大量出现 直到出生后第 这些细胞便在脊髓的各个区域都有分布 表达量也较高 而在出生后两周左右 少

3 !第"期 黄! 浩"等%脊髓中 +!$$P 基因的表达模式研究 % 突胶质细胞基本都已成熟" +!$$P 的表达也相应开始下调 )即 +!$$P 只在小鼠出生前后一段时期内 在脊 髓 中高表达!如图!) F"!) X#) 图 (!) (BB= 在不同发育时期小鼠脊髓中的表达模式 N ) (BB=3 3:F 31 / (!C9 - 但是"在此 也 发 现 实 验 结 果 和 有 些 报道的结果 有 不 一 致 的 地 方 )!I.!%"这 可 能 是 由 于 所 使 用 的 +!$$P 抗 体 不 同 的 原因 )因此制备了 +!$$P 的 LE 探 针" 通 过 原 位 杂 交 技 术 原 位 检 测 +!$$P 基 因 LE 的表达 )结果表 明 检测 +!$$P LE 的表 达 与 免 疫 荧 光 实 验 直 接 检 测 +!$$P 蛋 白 的 表 达 模 式 是 吻 合 的(同 时 也 购 买 了 另 一 个 公 司 的 +!$$P 抗 体 做相同的检 测"同 时 在 其 他 人 已 发 表 的 图,!) (BB= 蛋白和 :RO' 原位检测的一致性 论文 )#中也有和我们一 致 的 结 果!如 图 (BB= 3 91 J 9 1: 3 F1 3G 9) (BB=:RO' -.,!) ##)这说明我们的 +!$$P 的抗体是正确的"结果是可靠的 ),.,!)(BB= 不在神经元中表达 为了检测 +!$$P 是否在脊髓神经元中表达"我们用神经元特异性表达的蛋白,= 标记神经元"发现 除了脊髓腹侧个别体积较大的运动神经元弱表达 +!$$P 外"其他的 神 经元 均不表 达 +!$$P!如图 #)这 一 结果与之前的报道是一致的 ),. A!)(BB= 只在灰质中的星形胶质细胞中表达 为了分析 +!$$P 在星形胶质细 胞 中 的 表 达 情 况"利 用 MDEB 标 记 脊 髓 白 质 中 的 纤 维 状 星 形 胶 质 细 胞"用 M+ 标记脊髓灰质中的原浆型星形胶质细胞"检测 +!$$P 在这两 种 细 胞 中 的 表 达"以 刚 出 生 时! B$#

4 杭州师范大学学报!自然科学版# %2 #$!# 年! 图 A! 脊髓神经元细胞!特异性表达 O FO"不表达 ) (BB= F / / S 2=MO FO23 N ) (BB= 3 31 / 2 -.A!O M:1 时期为例"结果如图 2)可见脊髓边缘白质中的 MDEBe 的纤维状星形胶质细胞基本不表达 +!$$P!图 2) E "F#"而灰质中 M+e 的星形胶质细胞高表达 +!$$P"即 +!$$P 与 M+ 同时表达在相同的细胞中!荧 光重 叠 后显示为黄色"图 2) C"D#)这表明 +!$$P 并不是表达在所有 星形 胶质细 胞中"只 是表达 在灰质中 的星形 胶质细胞中 ) 图 H!) (BB= 不在脊髓白质 T'$U 纤维状星形胶质细胞表达而只表达灰质中的 T)U 星形胶质细胞中 (BB= N T)U 1 =F 3 3G9 :1 T'$U / 2 -.H!) M:1 M M,. H! 特定发育阶段的少突胶质细胞表达 )(BB= 由图 2) D 可以看出"尽管脊髓灰质中表达 +!$$P 的细胞大部分为 M+e 的星形 胶质细胞"但是 在脊 髓 边缘的白质中仍然有大量表达 +!$$P 的细胞并不是星形 胶质 细胞!荧光 显示为 红色#"推测 它们 是少 突 胶 质细胞 )因此用少突胶质细胞特异性表达的标记分子 +'_!$ 和正在成熟的少突胶质细胞 的标 记物 FF! 与 +!$$P 分别共同标记"以 B2 时期为例"结果如图 " 所示 ) +'_!$ 在 3!#) " 少突胶质细胞刚产生时就 开始 表 达" FF! 从 B$ 时期开始表达在 正 在 成 熟 的 少 突 胶 质 细 胞 中"而 +!$$P 开 始 表 达 的 时 间 则 位 于 这 二 者 之 间 )从图 ") F 中可以 看 出"除 了 脊 髓 灰 质 中 少 量 +!$$Pe 细 胞 外"在 脊 髓 边 缘 的 白 质 中"几 乎 所 有 表 达 +!$$P 的细胞都表达 +'_!$!显 示 为 黄 色#"但 表 达 +'_!$ 的 细 胞 数 量 比 表 达 +!$$P 的 细 胞 多!只 表 达 +'_!$ 的细胞显示为红色荧光#(由图 ") D 可见所有表达 FF! 的细胞都表达 +!$$P)因此" +!$$P 在 准备 成 熟的或者正在成熟的少突胶质细胞中表达 )

5 第 期 黄 浩 等 脊髓中 2 基因的表达模式研究 图 ( 表达在准备或者正在成熟的少突胶质细胞中 (""" %'"1%."! %.!"!$%"!%'"!$ 结 论 2 从小鼠! 开始在脊髓中开始表达 在出生后几天表达量达到峰值 并在出生后大概两周时开始下调 在细胞水平上 脊髓中 2 表达在灰质中的星形胶质细胞以及准备成熟或者正在成熟的少突胶质细胞中 不表达在脊髓白质中的星形胶质细胞和神经元细胞中 因此 2 并不能作为中枢神经系统中星形胶质细胞特异性的标记分子 而只能作为灰质中的星形胶质细胞和白质中正在成熟的少突胶质细胞粗略的标记物 参考文献 $#':##:$+.'#$#$(@#(($"$2#'/#($$#'#$2% %($$$(#$''#%"(/#$'$#."$(%1 :$"#..#A2$$'$($#((%(""$#(# (2/%#"#//#"$#$(@$-2$#$(#$#$"2$$'$(!##$"$(%,!1111 $$'#"3#,#=#'$($##($##$$$("2$#2# $(#$$#($$%($($(/#.$'%1 #/=#" - =$'$(##2%($($(#$$#""#%((($#( %(#"$'$#"$(%#$# =$$'#3/#'.$2$$#($$##$$%2%#$"2$$'$/# $'$#."$(% 3#5$.$$$$#$###$#$("#"$$2$(#$" "((($#$#3$$#."$(% 1 1"3(3:$2#$#"#'#'#$3$(%(##/$@ =$$#$#':#$$?#'=$#'#('$"$#(#$(C($(#(-$(3$# (# 3#!'$$ /.#$#(%$2#(($5$%($$($#"%$#@( -$"C($(#(##'%#!$"#'% #!$=$$2#(($$-$"C($(#(#$#'%$2#$'$($$"$#

6 杭州师范大学学报 自然科学版 年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目 录 1 50ETF 波 动 依 旧 较 低, 隐 含 波 动 率 差 值 有 所 收 敛... 4 2 成 交 热 度 出 现 回 升, 投 资 者 情 绪 维 持 中 性... 6 3 两 节 期 间 市 场 成 交 低 迷, 建 议 买 入 日 历 价 差 组 合... 9 请 务 必 阅 期 权 研 究 证 券 研 究 报 告 证 券 分 析 师 祝 涛 022-28451653 zhutao@bhzq.com 市 场 波 动 依 旧 较 低, 投 资 者 情 绪 维 持 中 性 核 心 观 点 : 期 权 9 月 第 5 周 周 报 分 析 师 : 祝 涛 SAC NO:S1150516060002 2016 年 09 月 29 日 50ETF 波 动 依 旧 较 低, 隐 含 波

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