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1 3587 论著黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白编码序列第 14 和 16 外显子中单核苷酸多态性研究周白玉, 张兵, 陈海明, 王兴林, 刘祖明, 李方明, 刘金伟, 杨绍华摘要背景与目的单核苷酸多态性 (SNPs) 在蛋白编码序列中多以富集成簇的方式分布, 并提示其可能有民族区域和人种之间的差异性, 然而 SNPs 在黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白 (preproef) 编码序列第 14 和 16 外显子中的分布状况迄今尚未见报道, 本研究拟对 35 例黔西南汉族受试者进行研究, 旨在分析 SNPs 在 preproef 编码序列第 14 和 16 外显子中的分布特征方法设计合成 4 条引物, 分别对 35 例汉族受试者 preproef 编码序列第 14 和 16 外显子区段进行 PCR 扩增和产物的 DN 测序 ; 检索单核苷酸多态性资料库 (dbsnp) 获取资料并与测序结果进行对比分析结果 35 例黔西南汉族受试者中 13 例 (37 1%) 在 preproef 编码序列的 2525bp 位点出现 SNPs, 为和, 频率分别为 69 2% 和 30 8%, 其频率分别为 34 6% 和 65 4%;27 例 (77 1%) 在 2576bp 位点有 SNPs, 为和, 频率分别为 66 7% 和 33 3%, 频率分别为 83 3% 和 16 7% 相比之下, 北京汉族受试者较黔西南汉族受试者在 preproef 编码序列第 14 外显子内多了 1 个单核苷酸多态位点, 即 2619bp 位点 ; 欧美等其他民族不仅在 preproef 编码序列第 14 外显子内分布有 rs 等 7 个 SNPs, 而且在其第 16 外显子内也分布有 rs 等 6 个 SNPs; 黔西南汉族和北京汉族受试者在 preproef 编码序列的第 16 外显子内均未见有 SNPs 分布结论在黔西南汉族北京汉族和欧美等民族的 preproef 编码序列第 14 和 16 外显子中, SNPs 分别具有各民族各种族的特征性分布, 据此可区分不同地域的种族和人群, 甚至进行个体识别也可将这些呈特征性分布的 SNPs 视为遗传标记进而深入研究 SNPs 与疾病发生的关系关键词汉族 ; 贵州 ; 多态性, 单核苷酸 ; 表皮生长因子前体蛋白 ; 多位点测序分型中图分类号 R394 5 文献标识码 doi: /j isn 周白玉, 张兵, 陈海明, 等. 黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白编码序列第 14 和 16 外显子中单核苷酸多态性研究 [J]. 中国全科医学,2015,18(29): [www chinagp net] ZhouBY,ZhangB,ChenHM,etal.Singlenucleotidepolymorphismsinexon14and16inthecodingsequenceof prepro-epidermalgrowthfactorinhanpeopleofqianxi nanprefecture[j].chineseeneralpractice,2015,18 (29): SingleNucleotidePolymorphismsinExon14and16intheCodingSequenceofPrepro-epidermalrowthFactorinHan PeopleofQianxi nanprefecture ZHOU Bai-yu, ZHN Bing, CHEN Hai-ming, etal. DepartmentofClinical Laboratory,Qianxi nanstatehospital,the7thfiliatedhospitalofzunyimedicalcolege,xingyi562400,china bstract BackgroundandObjective Thedistributionofsinglenucleotidepolymorphisms(SNPs)inprotein codingsequenceismainlyinclusteredintegrationandmayvarieswithdiferentnationalityregionsandraces However,thereare fewreportsaboutthedistributionofsnpsinexon14and16inthecodingsequenceofprepro-epidermalgrowthfactor (preproef)inhanpeopleofqianxinanprefecture Inthisstudy,weconductedresearcheson35HanpeopleofQianxinan PrefecturetoinvestigatethedistributionfeaturesofSNPsinexon14and16inthecodingsequenceofpreproEF.Methods Fourprimersweredesignedandsynthesized,andPCRamplificationandDNsequencingoftheproductswereconductedonthe sectionsofexon14and16inthecodingsequenceofpreproefin35hansubjects; comparisonwasmadebetweenthe sequencingresultsanddataretrievedfromdbsnp.results mongthe35hansubjectsofqinxinanprefecture,13(37 1%) subjectshadsnpsshownat2525bpsiteinthecodingsequenceofpreproef,andthegenotypeswere and,with 基金项目 : 贵州省黔西南州医院科研基金 [ (2009)84] 作者单位 : 贵州省兴义市, 黔西南州人民医院遵义医学院第七附院检验科 ( 周白玉, 张兵, 陈海明, 王兴林, 刘祖明, 李方明 ); 遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室 ( 刘金伟 ); 海口保税区远兮细胞分子技术应用研发有限公司 ( 杨绍华 ) 通信作者 : 周白玉, 贵州省兴义市, 黔西南州人民医院遵义医学院第七附院检验科 ; @qq com

2 3588 frequenciesof69 2% and30 8% respectivelyandalelefrequenciesof34 6% and65 4% respectively;27(77 1%) subjectshadsnpsshownat2576bpsite,andthegenotypeswereand,withfrequenciesbeing66 7% and33 3% respectivelyandalelefrequenciesbeing83 3% and16 7% respectively Incomparison,HansubjectsofBeijinghadan extrasiteofsnpsinexon14,whichwas2619bpsite;subjectsofeurope,theu S andsomeothernationalitieshad7extra sitesofsnpsinexon14,suchasrs ,andtheyalsohad6extrasitesofsnpsinexon16;hansubjectsofqianxinan prefectureandbeijinghadnosnpsinexon16.conclusion monghanpeopleofqianxinanprefectureandbeijingandpeople ofeurope,theu S andsomeothernationalities,thedistributionofsnpsinexon14and16inthecodingsequenceof preproefvarieswithdiferentethnicgroupsandraces,whichcouldbeservedasareferencefordistinguishingdiferentracesor populationsfromdiferentregionsandevenindividualidentification TheSNPswithfeatureddistributioncouldbetakenasgenetic markersforfurtherresearchoftherelationbetweensnpsanddiseases. Keywords Hannationality;uizhou;Polymorphism,singlenucleotide;preproEF;Multilocussequencetyping 单核苷酸多态性 (singlenucleotidepolymorphisms, SNPs) 广泛分布于全球各色人种的染色体及其基因序列中 [1] 表皮生长因子前体蛋白 (prepro-epidermal growthfactor,preproef) 基因具有 SNPs 分布的代表性或典型性 [2] preproef 基因位于染色体 4q25, 序列全长约 110 kb, 含有 24 个外显子 ; 其表达转录的 mrn 序列长约 5kb, 编码一条含 1207 个氨基酸的蛋白多肽链, 即 preproef, 其中的表皮生长因子 (53 个氨基酸 ) 对人体表皮细胞的生长分化和代谢发挥十分重要的作用 ; 此外, 该蛋白还含有数段重复的低密度脂蛋白受体和类表皮生长因子结构域并且兼具潜在的 Ca 2+ 结合位点, 这表明 preproef 蛋白除了具有表皮生长因子的功能外, 还兼具低密度脂蛋白受体组成细胞膜结构和参与出凝血机制的生物学功能, 对机体细胞的生长代谢和生理功能发挥多方面的重要作用 [3] 另一方面, 有研究显示 preproef 基因的遗传变体或多态, 特别是其 SNPs 可能与冠心病智力发育障碍和肿瘤发生等临床疾病具有相关性研究表明 preproef 基因序列第 61bp 位点的 SNPs(/) 与欧美人群发生黑色素瘤密切相关 [4] 由此可见, 探索鉴定 SNPs 在 preproef 基因和编码序列中的分布情况不仅对于人类分子遗传学, 而且对医学研究皆具重大意义在对 SNPs 探究早期, 有研究认为从概率上讲 SNPs 以平均 1/1000 个单核苷酸的概率分布于 DN 序列中, 但之后有研究显示 SNPs 也会以富集成簇的方式间隔分布 [5] 随着研究的不断深入和扩展, 迄今已发现了数以千万计的 SNPs 分布在人类基因组序列中与此同时, 美国生物技术信息中心 (National Center for BiotechnologyInformation,NCBI) 的单核苷酸多态性资料库 (singlenucleotidepolymorphism database,dbsnp) 汇总并向全球公开了这些 SNPs [1] 目前已有研究凭借 NCBI 平台对 dbsnp 的 SNPs 进行检索, 表明相关 SNPs 多以密集丛簇的方式间隔分布于编码 preproef 的 mrn/cdn 序列中, 其中尤以 SNPs 较多地集中分布在以外显子 11~12 和 16~19 区段为间隔的第 13~15 外显子区段颇具典型特征 [1,6] dbsnp 相关 SNPs 在我国除北京地区以外的汉民族群体 preproef 编码序列中的分布情况尚不清楚 [1] 为弥补此项不足, 本研究拟对贵州省黔西南州汉族人群 preproef 编码或 mrn/cdn 序列中具有 SNPs 分布特征的上述典型区段进行实验研究和资料分析, 以探明 SNPs 的分布特征及其与不同国家地区民族和种群之间是否存在差异性, 为进一步的群体遗传学和分子医学的诊疗应用提供基础的和有价值的参考 1 资料与方法 1 1 研究对象至选取 35 例彼此互无血缘关系且其父母双亲均是汉族的健康个体, 来源于贵州省黔西南州人民医院体检中心年龄 18~59 岁, 平均年龄 (35 3±14 7) 岁 ; 男 19 例, 女 16 例 1 2 方法主要试剂与仪器 DN 提取试剂盒 ( 美国 Qiaen 公司 ),PCR 扩增试剂盒 ( 日本 TaKaRa 公司 ), 50 TE; 电泳缓冲液 ( 上海生物工程公司 ) 核酸测定仪 ( 德国 Eppendorf 公司 ),PCR-2400 扩增仪 ( 美国 PE 公司 ), Mastercycler 梯度 PCR 扩增仪 ( 德国 Eppendorf 公司 ), 平板电泳仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ), 凝胶成像仪 ( 美国 SYNENE 公司 ) PCR 扩增及 DN 测序引物的合成 ( 上海赛百盛公司 ) DN 样本的制备和引物设计按照 DN 提取试剂盒操作程序从受试者外周血样本提取 DN 对比参照 NCBIBlast 程序选出的引物序列, 分别在 preproef 基因的第 14 和 16 外显子所属区段内设计了 4 条用于 PCR 和 DN 测序的引物 ( 见表 1) 目标区段的 PCR 扩增配制 PCR 反应液 :10 PCRBufer5 0μl,dNTPMixture( 各 2 5mmol/L)4 0 μl, 受试者 DN 模板 8 0μl, 正反向引物各 0 5μl, 灭菌纯水 31 5μl, 充分混匀后再加入浓度为 5 0U/μl 的 TaKaRaTaq 酶 0 5μl 至反应总体积为 50 0μl, 轻轻

3 3589 混匀后置于 PCR 仪进行 DN 扩增其有效扩增条件为 : 先 94 3min 预变性, 后于 94 30s 变性, s 引物复性和 72 1min30s 延伸, 进行 29 个循环, 然后 72 7min 后降温至 4 保持恒温显示受试者编码 preproef 的第 14 外显子序列内有两个位点出现了单核苷酸替换改变, 即 2525bp(/) 和 2576bp(/), 且在这两个位点还呈现有 SNPs 杂合套峰的现象 ( 见图 2) 表 1 4 条测序引物序列表 Table1 Sequenceof4primers 引物 17DE-1(5 3 ) 17ER-2(5 3 ) 17din-3(5 3 ) 17Nr-4(5 3 ) 序列 TCTCCCTTCTTC TTCCTCCTTCCC CCCTCTTTTT CCTTTCC PCR 产物的 DN 测序及其序列分析 PCR 扩增的目标 DN 片段送上海英骏生物技术有限公司和宝生物 ( 大连 ) 工程有限公司进行 DN 序列测定应用 BI3130 BI3700 和 BI3730 等 DN 测序仪对 PCR 产物进行测序同时根据研究的需要, 对 PCR 扩增的 DN 片段进行必要的双向和重复测序测序结果以 NCBI 的 enbank 数据库进行对比分析 1 3 统计学方法计算汉族 SNPs 的和频率通过检索 dbsnp, 对比黔西南北京汉族群体和其他种族之间的异同, 列表并进行统计学分析以 P< 0 05 为差异有统计学意义 2 结果 2 1 PCR 扩增产物采用 10g/L 琼脂糖凝胶电泳分别检测受试者 DN 的 PCR 产物, 于紫外光灯下可见两条分别长约 0 64kb 和 0 59kb 的 DN 扩增带 ( 见图 1), 其中 1~7 泳道为第 14 外显子区段,8~11 泳道为第 16 外显子区的 PCR 扩增产物注 :M 为 200bpDNLadder 图 1 黔西南汉族受试者 DN 的 PCR 扩增产物 Figure1 PCRamplificationproductsofDNinHansubjectsofQianxinan Prefecture 2 2 DN 序列测定和 dbsnp 资料对比分析对 PCR 扩增产物进行 DN 序列测定测序图谱注 : 为黔西南汉族 preproef 编码序列第 14 外显子的 DN 测序图谱及序列, 箭头指示代表单核苷酸多态 (2525bp 位点 ) 和 (2576bp 位点 ) 替换的测序峰为杂合型套峰 ( 见图顶排放大的测序峰图序 );B 与 NCBI 基因资料库相应 DN 序列比较, 可见在 preproef 编码序列的第 2525bp 和 2576bp 位点各有一个 / 或 / 替换 ;C 为 dbsnp 对照图谱, 左侧箭头指示在对照图谱序列该位点为碱基, 右侧箭头指示在对照图谱序列该位点为碱基 ;D 箭头指示单核苷酸多态 (2525bp 位点 ) 或 (2576bp 位点 ) 替换的测序峰均为纯合单一峰 ;E 与 NCBI 基因资料库的相应 DN 序列比较, 可见在 preproef 编码序列的第 2525bp 和 2576bp 位点各有一个 / 或 / 替换 ;F 为 dbsnp 对照图谱, 左侧箭头指示在对照图谱序列该位点为碱基, 右侧箭头指示在对照图谱序列该位点为碱基图 2 黔西南汉族受试者 DN 测序图谱和 dbsnp 对照图谱 Figure2 SequencingchromatogramofDNinHansubjectsofQianxinan prefectureandthedbsnptonrol

4 3590 对测序结果进行计数统计, 有 13 例受试者在 2525 bp 位点有 SNPs, 占 37 1%, 其有和两种 ; 有 27 例受试者在 2576bp 有 SNPs, 占 77 1%, 其也有两种, 即和 ( 见表 2) 表 2 黔西南汉族受试者 preproef 编码序列第 14 外显子两个位点的 SNPs n(%) Table2 SNPsoftwositesinexon14inthecodingsequenceofpreproEF inhansubjectsofqianxinan 位点例数 2525bp (69 2) 4(30 8) 9(34 6) 17(65 4) 2576bp (66 7) 9(33 3) 0 45(83 3) 9(16 7) 与北京汉族受试者 SNPs 分布情况相比结果显示 35 例黔西南汉族受试者在 2525bp 和 2576bp 两个位点的 SNPs 基因频率与 43 例北京汉族受试者比较, 差异无统计学意义 (P>0 05, 见表 3 4) 表 3 不同地区汉族受试者 preproef 编码序列第 14 外显子 2525bp 位点和频率比较 n(%) Table3 Comparisonofgenotypeandalelesfrequencyof2525bpsitein exon14inthecodingsequenceofpreproefamonghansubjects ofdiferentregions 地区例数黔西南 (43 2) 16(45 1) 4(11 7) 46(65 7) 24(34 3) 北京 [1,6] (58 1) 14(32 6) 4(9 3) 64(74 4) 22(25 6) χ 2 值 P 值表 4 不同地区汉族受试者 preproef 编码序列第 14 外显子 2576bp 位点和频率比较 n(%) Table4 Comparisonofgenotypeandalelesfrequencyof2576bpsitein exon14inthecodingsequenceofpreproefamonghansubjects ofdiferentregions 地区例数黔西南 (53 1) 14(39 5) 2(7 3) 51(72 9) 19(27 1) 北京 [1,6] (46 5) 15(34 9) 8(18 6) 55(64 0) 31(36 0) χ 2 值 P 值计算黔西南汉族受试者的基因频率并与 dbsnp 的资料比较本研究在第 14 外显子序列内未检测到 2619bp 位点有 SNP 发生 ; 与其他地区种族 ( 例如美欧人群 ) 的 SNPs 分布情况相比, 本研究在第 16 外显子序列内未检测到任何单核苷酸改变即 SNPs 发生 ( 见表 5) 表 5 在不同地区民族和种族 preproef 编码序列中 SNPs Table5 ComparisonofSNPsinthecodingsequenceofpreproEFamong peopleofdiferentnationalityregionsandraces 外显子 rs SNPs 位点 (bp) 黔西南州汉族北京汉 [1,6] 族其他种 [1,6] 族第第 N 注 : + 代表该位点 SNPs 阳性 ; 其他种族主要指美欧和非洲等地的多种民族 3 讨论 3 1 鉴于 SNPs 与黑色素瘤等疾病相关, 因而探究其在 preproef 基因序列中的分布状况已引起广泛关注 [2,7] 现已有研究表明,SNPs 在 preproef 基因组序列中多以平均 1/1000 个单核苷酸概率或密度分布, 在内含子中的分布亦是如此 ; 而在编码 preproef 的 24 个外显子中则多以富集丛簇间隔分布为特征, 这在第 14 和 16 外显子最为典型 [1-2,6] 然而, SNPs 在本地区汉民族 preproef 编码序列中的分布是否也具同样的特征尚不清楚为此, 本研究采用 PCR DN 测序并数量分析等技术从定性与定量两个方面探究了 SNPs 在 35 例黔西南汉族受试者 preproef 编码序列第 14 和 16 外显子中的分布状况在定性方面, 首先可观察到有两个 SNPs (rs 和 rs ,2525bp 和 2576bp 位点 ) 彼此间仅相隔 51bp 而分布于第 14 外显子中, 提示这是一个 SNPs 富集分布的热点外显子 ; 与之相反, 在序列长度为 122bp 的第 16 外显子中未见到有任何 SNPs, 提示该外显子可能系保守序列, 可视为 SNPs 分布的间隔外显子这一结果与之前有关 SNPs 在人 preproef 编码序列第 14 外显子内富集成簇而在第 16 外显子内却是零 [6] 分布的报道基本上可相互印证其次, 在数量方面, 有 13 例 SNPs 分布在 2525bp 位点,27 例 SNPs 分布在 2576bp 位点同时, 这 2 个 SNPs 位点各自独具其特征

5 3591 性的和频率, 具体在 2525bp 位点其是和, 频率分别为 69 2% 和 30 8%, 频率分别为 (34 6%) 和 (65 4%); 而在 2 576bp 位点其则为和, 频率分别为 66 7% 和 33 3%, 频率分别为 (83 3%) 和 (16 7%) 黔西南汉族特有的这些 SNPs 和频率将有助于区域群体的区分和鉴定, 对群体遗传学的研究显然具有参考价值和意义 [8] 3 2 参考 dbsnp 中 SNPs 的资料, 本研究对比分析了北京和黔西南的汉族受试者, 结果显示 preproef 编码序列第 14 外显子中的 2 个 SNPs 即 rs 和 rs 在两个群体中均可见到 ; 在北京汉族受试者 preproef 编码序列第 14 外显子中还可见到 1 个位于 2619bp 的 SNPs 即 rs [1,6,9] 因此, 在北京汉族受试者 preproef 编码序列第 14 外显子中有 3 个 SNPs 位点分布, 而黔西南汉族受试者中仅只有 2 个 SNPs 位点这既是北京汉族的 SNPs 分布特征之一, 同时也是区别于黔西南汉族的一个明确的 SNPs 标志, 提示虽然同为居住在国内的汉族, 却可能因地处南北区域的不同而出现其 SNPs 分布的差异性另一方面, 比较分析北京和黔西南汉族受试者 2525bp 和 2576bp 位点的基因频率虽未见其差别有统计学意义, 但并不意味着二者的 SNPs 基因频率也是如此, 尚待进一步的研究予以解答 3 3 作为 SNPs 富集成簇分布间隔区段的第 16 外显子, 在本研究中并未见到任何 SNPs 分布于其中, 这一结果与有关研究报道相一致 [6] 然而, 通过检索 dbsnp 并观察其 SNPs 在全球各民族 / 种族中的分布, 本研究结果与之相比, 分布在 preproef 编码序列中的 SNPs 明显增多, 不仅第 14 外显子有 SNPs 分布, 而且本来是零分布的第 16 外显子也有 SNPs 分布其中 ; 计数在这两个外显子内的 SNPs 共有 13 个, 其中 7 个分布于包括汉族在内的全球多个民族 / 种族的 preproef 编码序列第 14 外显子, 而余下的 6 个则分布在除汉族以外的其他民族 / 族的 preproef 编码序列第 16 外显子中 [1] ; 进一步观察发现, 除了在汉族 preproef 编码序列第 14 外显子中的 3 个 SNPs 为全球多民族 / 种族共有分布外, 其余 10 个 SNPs, 即 rs rs rs rs rs rs rs rs rs 和 rs 皆为其他民族 / 种族所拥有, 因此这些 SNPs 可望作为标志性或标签 SNPs 用来区分是汉族抑或是其他种族, SNPs 在 preproef 编码序列第 14 和 16 外显子中的分布特征表现出了不同民族之间或种族之间具有差异性总而言之, 本研究表明 SNPs 在黔西南汉族北京汉族和欧美等其他民族的 preproef 编码序列第 14 和 16 外显子的分布存在着不同程度的差异性参考文献 [1] cland,qarwalar,barett,etal.databaseresourcesofthe NationalCenterforBiotechnologyInformation [J]. Nucleiccids Res,2013,41(Databaseisue):D8-20. [2] Wang M, LiFM, Liu ZM, etal. Characterization ofsingle nucleotidepolymorphismsinhumanepidermalgrowthfactorprecursor gene[j].journalofzunyimedicaluniversity,2012,35 (2): (inChinese) 王敏, 李方明, 刘祖明, 等.SNPs 在人 preproef 基因内的分布特征初探 [J]. 遵义医学院学报,2012,35(2): [3] BelI,FongNM,StempienMM,etal.Humanepidermalgrowth factorprecursor: cdn sequence, expresion in vitro and gene organization [J]. Nucleic cidsres, 1986, 14 (21): [4] ShahbaziM, PravicaV, NasreenN, etal. sociationbetween functionalpolymorphisminefgeneandmalignantmelanoma[j]. Lancet,2002,359(934): [5] KoboldtDC,MilerRD,KwokPY.DistributionofhumanSNPsand itsefectonhigh-throughputgenotyping[j].hum Mutat,2006, 27(3): [6] ChenHM,LiFM, ZhangB, etal. Bioinformaticsdistributionof single nucleotide polymorphisms in mrn cdn ofhuman epidermalgrowth factorprecursor[j]. China Medicaluides, 2014,11(1):14-17.(inChinese) 陈海明, 李方明, 张兵, 等. 人 preproef 的 mrn/cdn 序列中 SNPs 及生物信息学分布探究 [J]. 中国医药导报,2014,11 (1): [7] Lozano-SantosC,Martinez-VelasquezJ,Fernandez-CuevasB, etal. Vascular endothelial growth factor (VEF) gene polymorphismshaveanimpactonsurvivalinasubgroupofindolent patientswithchroniclymphocyticleukemia[j].plosone,2014, 9(6):e [8] DengL,HohBP,LuD,etal.Thepopulationgenomiclandscapeof humangeneticstructure, admixturehistoryandlocaladaptationin PeninsularMalaysia [J]. Hum enet, 2014, 133 (9): [9] MarthT,KorfI,YandelMD,etal.generalapproachtosingle -nucleotidepolymorphism discovery[j]. Natenet,1999,23 (4): ( 收稿日期 : ; 修回日期 : ) ( 本文编辑 : 赵跃翠 )

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