熊 薇 等 基因沉默对小鼠结肠癌 细胞黏附和运动能力的影响 '"#!# 2'#0$ '"#!# $ 2#$ (" " 2 # #$ &3 6 # # # $2 #$##$0! ( '.( (!#0! ' # "! 2 "# 2 #$#$## "! $0! $(# " 0! ' # "!2 2 4 #

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1 复旦学报 医学版 #0 基因沉默对小鼠结肠癌 $.; 细胞黏附和运动能力的影响 熊 薇 唐 怡 王娅兰 徐剑侠 重庆医科大学病理教研室分子医学与肿瘤研究中心 重庆 摘要 目的 探讨单腺苷二磷酸核糖基化转移酶 & '( 3& # &( 基因沉默对小鼠结肠癌 细胞黏附 运动和侵袭能力的影响及其机制 方法 以携带 (&$.( 的慢病毒感染小鼠结肠癌 细胞 将细胞分为实验组 感染 (&$.( 慢病毒的 细胞. &$.( 对照组 感染阴性对照慢病毒 "# & # &$.(. &$.( 细胞 及未处理组 未经处理的 细胞 & 3 检测 细胞 '.( 表达变化 6 # # 检测 ( $(# " 蛋白表达的变化 用细胞基质黏附 运动和侵袭实验观察 (&$.( 对 细胞基质黏附 运动和侵袭能力的影响 结果 获得稳定沉默 ( 基因的 细胞株 &3 和 6 # # 结果均显示 实验组 '.( 和 ( 蛋白表达显著低于对照组 6 # # 结果显示实验组 $(# " 表达均显著低于对照组 实验组细胞黏附 运动 侵袭抑制率分别为 7 7 和 7 结论 单腺苷二磷酸核糖基化转移酶 & ( 基因沉默可降低 细胞的黏附 运动 侵袭能力 该作用可能与 ( 沉默后下调 $( 和 # " 活性有关 关键词 单腺苷二磷酸核糖基化转移酶 & ( 慢病毒 结肠癌 黏附 迁移 中图分类号 文献标志码 ( ) & )#0## $.; #!#"" /5-. 6(. *6(. *& /&0 '"&!!% ""%("# (" (" 6 "!%"# (" 6 " ( " % & ' 0!#$ # '( 3& # &(" "#$ # ' ' '#0 $ '"# 1 # 0! " ( &$.( # ' ' $ # # 2#$ (&$.(# 2 # 0! ' # "! (& $.( # "!# # #$ # # 2#$ "## &$.( # 2 # # "! $0! ( '.( 2 ## &3$ 0! ( $(# "2 ## 6 # #$ '#0$ 高等学校博士学科点专项科研基金联合资助项目 重庆市教委科学技术研究项目!"#$%&' 2" '

2 熊 薇 等 基因沉默对小鼠结肠癌 细胞黏附和运动能力的影响 '"#!# 2'#0$ '"#!# $ 2#$ (" " 2 # #$ &3 6 # # # $2 #$##$0! ( '.( (!#0! ' # "! 2 "# 2 #$#$## "! $0! $(# " 0! ' # "!2 2 4 #$#$# # "! $ $ # # '#0 $ '"# !# $#! $ 4 4&2 ( $ # '#0$ '"#!# 5#' # #(" "2& " #"#$## $( # " ' ( 3& # & (# ' $ '"# (! +#,!6#- " )! $ +, # # ' $8"! #! ""00.. 腺苷二磷酸核糖基化 ( 3& # 反应在生理和病理生理过程中扮演着重要角色 包括影响细胞信号传递 转录调节.( 修复 基因稳定性维持以及细胞增殖分化 黏附迁移 ( 3& # 包括 种类型 聚腺苷二磷酸核糖基化!&( 3& # 单腺苷二磷酸核糖基化 '&( 3& # 腺苷二磷酸核糖基环化 ( 3& # 氧代乙酰基腺苷二磷酸核糖基形成 '# -&#& ( 3& 单腺苷二磷酸核糖基化由单腺苷二磷酸核糖基化转移酶 '( 3& # ( 催化 其中最具特征性的 ( 是 (( ' ( 3& # & 和分泌性的胞外酶 ( ' ( 3& # & ( 特异性催化精氨酸单腺苷二磷酸核糖基化 " '& ( 3& # 其作用是将.( 的一个 ( 3& 核糖基转移到目的蛋白精氨酸残基 修饰目的 蛋白 影响其功能 关于 ( 的研究 目前主要集中在非肿瘤性 疾病 有文献报道 人呼吸道上皮细胞 ( 可以特异性修饰人类中性粒细胞防御素 &$' #!$!!# &,.3& 位点的精氨酸 从而改变,.3& 的生物活性 同时在支气管肺炎患者的支气管肺泡灌洗液中也分离出了被单 ( 3 核糖基化的,.3& 认为 ( 在炎症性疾病的发生发展过程中扮演了非常重要的角色 但 ( 与肿瘤的关系尚不清楚 本研究小组先前研究显 示 沉默聚 腺苷二磷酸核糖 水解酶 3 ( 3&" $ 3( 或者抑制聚 腺苷酸二磷酸核糖 聚合酶! ( 3&!'3( 3 可以降低结肠癌细胞的黏附 迁 移 侵袭能力 聚腺苷二磷酸核糖基化在结肠癌的浸润转移中具有重要作用 但单腺苷二磷酸核糖基化与肿瘤的关系尚不清楚 抑制 ( 是否也能像抑制 3( 3 一样 对结肠癌细胞的黏附 运动和侵袭能力产生影响 亦未见文献报道 因此 本研究将慢病毒 (&$.( 感染小鼠结肠癌 细胞株 观察该细胞 ( 基因沉默后 黏附 运动和侵袭能力的改变 初步探索 ( 在结肠癌侵袭转移中的作用及其可能的机制 材料和方法 细胞与主要试剂 小鼠结肠癌 细胞系由四川大学生物治疗国家重点实验室魏于全教授惠赠 (&$.( 重组慢病毒 阴性对照病毒. "# # &$.(. &$.( 中国上海吉凯基因化学技术有限公司 -#! &3 试剂盒 日本 4 公司 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计 合成 抗 ( 抗体 美国 ( " # 公司 抗 $( 抗体 美国 2 公司 抗 # " 抗体 美国 # 公司 抗 # 抗体 中国博士德生物工程有限公司 辣根酶标记山羊抗兔二抗 北京中杉金桥生物技术公司 2 侵袭小室 美国! 公司 #" 美国

3 复旦学报 医学版 年 月 公司 # 美国 # 公司 ( 蛋白浓度测定试剂盒 &3( % 凝胶配制试剂盒 6 # 及 53 细胞裂解液 &3( % 蛋白上样缓冲液 / % 13 上海碧云天生物技术研究所 细胞培养 常规培养小鼠结肠癌 细胞 慢病毒 %02% 感染 $.; 细胞.( 慢病毒载体为 3 51& 3 其框架结构为 & (&$.(& & 3(&$.( 与阴性对照序列如表 所示 细胞感染参照说明书进行 取对数生长期的 细胞 个于 孔板中 待细胞生长到融合度为 7 时 弃去培养液 每孔重新加入 1 培养液 同时加入滴度为 '1 的病毒液 1$ 后 观察细胞形态 更换新鲜培养基 感染后 天 荧光显微镜下照相 观察感染效率 表 0+ 2% 序列 0+ 8! 2%! % 1! % (&$.( (( (((( ( ( ( ( ( (. "## &$.( (( ( (( ( ( (( ( ( (( %0" 2% 检测 采用 &3 进行检测 提供 (4 号. 由上海生工生物工程技术服务有限公司设计 合成 ( 引物 上游引物 &( ( ( & 下游引物 & (( ( ( & (& 内参上游引物 &( (& & 下游引物 &((& ( ( (& 将细胞分为实验组 感染 (&$.( 慢病毒 细胞. &$.( 对照组 感染阴性对照慢病毒 细胞 未处理组 未经处理 细胞 按每组 个细胞提取各组细胞总.( 操作步骤按 -#!& 3 试剂盒说明书进行 ( 反应条件 ' 个循环 内参反应条件 ' ' 个循环 反应结束后 取 3 反应液 1 进行琼脂糖凝胶电泳 图像分析仪分析结果 以目的基因 ( 与 & # 的扩增条带的吸光度比值代表其 '.( 相对表达水平 实验重复 次 %0 % 和 0 检测 采用 6 # # 进行检测 将各组处于对数生长期的细胞分别培养至 个 分别提取各组细胞总蛋白 操作按试剂盒说明书进行 ( 法测定浓度 7 & 3( % 凝胶电泳 湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯! 3 膜上 用含 7 脱脂牛奶的 封闭非特异性结合位点后 分别加入 ( $(# " 抗体 过夜 辣根过 氧化物酶标记的 5" 二抗室温孵育 $% 1 试剂盒化学发光显影 采用 & 凝胶成像仪显影 并用 ## - 软件进行相对定量分析 实验重复 次 $.; 细胞侵袭能力检测 采用侵袭实验检测 选取规格为 孔板 膜孔径 ' 的细胞侵袭小室 按无血清 3 5 培养液 基质胶为 的比例稀释 将稀释好的基质胶 1 室包被小室 封口胶密封孔板 过夜 次日在下室中加入 1 含 7 胎牛血清的培养基 上室加入 1 无血清的细胞悬液 '1 将细胞分为未处理组. &$.( 对照组 实验组 每组设 个复室 放入细胞培养孵箱 7 - 培养 $ 后 从孔板取出小室 擦去上室细胞 常温下 7 多聚甲醛固定 7 结晶紫染色 倍镜下随机观察侵袭小室膜下表面 个视野 细胞计数 细胞侵袭抑制率 未处理组平均侵袭细胞数 & 实验组平均侵袭细胞数 未处理组平均侵袭细胞数 7 $.; 细胞迁移能力检测 采用迁移实验检测 步骤同侵袭实验 仅上室不用基质胶包被 细胞迁移抑制率 未处理组平均迁移细胞数 & 实验组平均迁移细胞数 未处理组平均迁移细胞数 7 $.; 细胞黏附能力检测 采用黏附试验检测 用浓度为 "'1 纤维连接蛋白 # 1 均匀包被 孔板 封口胶密封孔板 过夜 次日取出孔板 吸出孔内多余水分 用

4 熊 薇 等 基因沉默对小鼠结肠癌 细胞黏附和运动能力的影响 '"'1 牛血清白蛋白 ' ' ( 封闭 $ 将细胞按 孔接种于 孔板中 每组设 个复孔 置 7 - 孵箱中培养 $ 后取出孔板用 3 洗去未黏附的细胞 每孔加入 '"'1 1 静置 $ 后弃 每孔加入二甲基亚砜 1 震荡 ' 用酶标仪测 ' 波长吸光度值 ' 值 实验重复 次 细胞黏附抑制率 未处理组平均 ' 值 实验组平均 ' 值 未处理组平均 ' 值 7 统计学分析 计量数据用, # 表示 采用 3 统计分析软件 多组数据之间采用单因素方差分析 为差异具有统计学意义 结 果. &$.( 对照组为 未处理组为 实验组 ( '.( 表达与未处理组比较差异有显著统计学意义. &$.( 对照组 ('.( 表达与未处理组比较差异无统计学意义 图 6 # # 检测 细胞 ( 基因沉默后 各组细胞 ( 蛋白表达的变化 实验组 细胞 ( 蛋白表达为. &$.( 对照组为 未处理组为 实验组 ( 表达量与未处理组比较差异有显著统计学意义. &$.( 对照组 ( 蛋白表达与未处理组比较差异无统计学意义 图 表明 (&$.( 感染成功 慢病毒本身对 细胞的 ( 蛋白表达无明显影响 $.; 细胞 %0 基因沉默鉴定 (& $.( 慢病毒感染 细胞 天后 荧光显微镜下观察可见细胞中绿色荧光蛋白 细胞感染效率高于 7 图 &3 检测 ( 基因沉默后 '.( 的表达 实验组 细胞 ( '.( 为 图. 各组 $.; 细胞的 %0" 2% 的表达,.) %0" 2%$.; #!! 1 ( 1 '4 1 # 2#$ (&$.(& 1 # 1 # 2#$. &$.(&1 # 1# # 图 0$.; 细胞慢病毒染情况 =0,0$.; # %0 2%!=0 ( '! '" # #2#$ (&$.(&1 # -!# '! '" # # 2#$ (&$.(& 1 # '! '" # # 2#$. &$.(&1 # -!# '! '" ## 2#$. & $.(&1 # 图 各组 $.; 细胞的 %0 表达, ) %0 $.; #!! 1 ( # 2#$ (&$.(& 1 # 1 # 2#$. &$.(& 1 # 1# # 各组 $.; 细胞 % 和 0 表达 实验组 $( 和 # " 蛋白的表达量见图 实验组 $( 蛋白表达量为 低于. &$.( 组的 和未处理组的

5 复旦学报 医学版 年 月 而 # " 蛋白的 表达量为 也低于. &$.( 组的 少不明显 其迁移抑制率为 7 图 和未处理组的 $.; 细胞基因沉默后侵袭能力的变化 实验组 细胞侵袭 #" 胶穿过微孔膜的细胞数 较未处理组 明显减少 其侵袭抑制率为 7. &$.( 对照组 与未处理组差异无统计学意义 其侵袭抑制率为 7 图 $.; 细胞基因沉默后迁移能力的变化 实验组 细胞穿过微孔膜的细胞数 比未处理组 显著减少 其迁移抑制率为 7. &$.( 对照组 较未处理组减 图 / 各组 $.; 细胞 % 和 0 的表达,/)% 0 $.; #!! 1 ( # 2#$ (&$.(& 1 # 1 # 2#$. &$.(& 1 # 1# # 图 5 各组侵袭 # 到微孔膜下表面的 $.; 细胞 =.,5$.; ###!" "=. (# 2#$(&$.(&1 # # 2#$. &$.(&1 # # # 图 ; 各组迁移到微孔膜下表面的 $.; 细胞 =.,;$.; #"#!" "=. (# 2#$(&$.(&1 # # 2#$. &$.(&1 # # # $.; 细胞基因沉默后黏附能力的变化 实验 组 细胞对 的黏附能力较未处理组和. &

6 熊 薇 等 基因沉默对小鼠结肠癌 细胞黏附和运动能力的影响 $.( 对照组都有明显降低 表 表. 感染 %02% 慢病毒后 $.; 细胞黏附能力的变化.$.; # %02%! ", #! ' ' 5$ ##7 (&$.(. &$.( # # # # # # 2#$. &$.(&1 # "! 讨 论 慢病毒 # 是反转录病毒的一种 相比其他非慢病毒可将外源基因有效地整合到宿主染色 体上 从而实现持久稳定的表达 本研究利用此优点 运用慢病毒感染技术 观察 基因沉默后细胞相关因子及细胞生物学行为的变化 ( 是真核生物体内少量表达的 ( 3& 核糖基化转移酶 特异性地参与精氨酸单腺苷二磷酸核糖基化过程 其可以将.( 的一个 ( 3& 核糖基转移到目的蛋白的精氨酸残基上 改变目的蛋白的原有活性与功能 在心肌细胞缺血再灌注损伤的修复过程中 ( 特异性抑制剂间位碘代苄胍 ' #&5 "" 5 可抑制血管内皮细胞的过度增生 ( 对细胞的增殖分化都有促进作用 同时 ( 可调节细胞内的信号传递 被认为是对骨骼肌增殖和迁移必不可少的因素 在平滑肌细胞中 5 也可通过下调 $( 的活 性 抑制细胞的迁移能力 但在肿瘤细胞中其是否也可以影响肿瘤细胞的迁移 尚未见文献报道 我们先前的研究显示 在大肠癌细胞中 ( 表达较对照正常肠黏膜明显增加 并与血管内皮生长因子 #$ "2#$# % 表达 呈正相关 提示其可能促进肿瘤血管生成 为此 本研究通过细胞黏附 转移 侵袭实验 观察了结肠癌 细胞 基因沉默后黏附 运动和侵袭能力的变化 结果显示 基因沉默后 结肠癌 细胞的黏附 运动和侵袭能力明显减弱 提示 ( 与结肠癌 细胞的黏附 运动和侵袭能力相关 肿瘤细胞在细胞外基质 % 迁移是一个非 常复杂的过程 涉及到了细胞骨架系统的改变 细胞与基质的黏附 % 的组成等 大多数细胞的迁移是受来自邻近细胞或者 % 扩散因子的信号刺 激 蛋白是细胞膜上重要的信号蛋白 其中小 蛋白 $( 介导的 $( - 信号通路在肿 瘤细胞的迁移过程中作用显著 研究表明 在成纤维细胞中 活化的 $( 可快速介导张力纤维和黏着斑 $ ( 的形成 从而影响细胞的能动性 同时还可调节整合素 及其下游因子的 活性与功能 $( 的表达和活性在人类肿瘤组织中是增高的 $( 在肿瘤的各个阶段都可 能发挥作用 处于细胞膜上的整合素 作为细胞与 % 黏附的介质 受 $( 的调控 在肿瘤细胞的侵袭迁移过程中具有重要作用 整合素在细胞外识别 % 中的 序列 ("& &(! 将细胞与 % 相连 在细胞内又与细胞骨架系统相连 这样就构成了 %& 整合素 & 骨架结构 黏着斑结构 这种结构不仅可以双向传递细胞内外信号 还可以诱导细胞内微丝的重组 从而影响细胞的生长 增殖 迁移和凋亡 在骨骼肌细胞中 ( 可修 饰整合素 促进整合素与层黏蛋白结合 有文献报道 整合素 与其配体结合后随之激活黏着斑激酶 $ 4 ( 可通过 % 途径促进细胞的迁移 在非转移的癌细胞中 # " &( 是没有活性的 然而在转移性癌细胞中 # " &( 就显示了充分的活性 采用 $.( 技术干扰对 # " 进行研究 显示 # " 控制了 ( 的活性和 # " &( 通路 促进了细胞的迁移 亦有文献报道 ( 影响血管平滑肌增殖 分化和迁移 主要是通过调节 $ 影响其下游分子表达实现的 结肠癌 细胞中 ( 是否也能通过 $ 调节 # " 表达 尚未见文献报道 我们对此进行了 检测 结果显示 (&$.( 可以抑制结肠癌 细胞 $( 和 # " 表达 提示在结肠 癌 细胞中 ( 基因沉默可以抑制细胞黏附 转移 侵袭 可能与下调 $( 及其下游因子的活性有关 推测可能是通过下调 $( 活性 影响 $( - 信号通路 抑制张力纤维和黏着斑的形成 降低细胞的迁移能力 同时 基因沉默下调了 # " &( 活性 抑制整合素与层黏蛋白结合 减少黏着斑结构的形成 进一步降低细胞的迁移能力 然而详尽机制还需进一步研究

7 复旦学报 医学版 年 月 参 考 文 献, 3-, %. ( 3& ## ''' 2$ 2 # 2$ 2 ""!! ). # $ # # $'( 3& $ (,! "$# ##$ #!# ( 3& # % -",$',.( 2 ## ' #$ " &!( 3& #!# & ( ' # #&( 3 " #( 3& " $ ) )#!%# # 1(1 1$ ( 3& # $',.3& # #$! ' # #$ '" 2#$#$ ' #$% 李巧转 王娅兰 李娴 慢病毒 3(&$.( 转染降低大肠癌 细胞基质黏附 运动和侵袭能力 基础医学与临床 黎明 王娅兰 3( 3 抑制对小鼠结肠癌细胞侵袭能力的影响 中山大学学报 医学科学版 柏琦 那鑫妮 冯姗姗 慢病毒载体的发展历程及现状 中国医药指南 *13 #& " $ # " &!#'( 3& #!# #' $!! $, *11#$ $' %" '& ( 3& # ' # '#$ '! #'"#!# 4.&!# #& 0! $) 杨炼 王娅兰 盛永涛 等 大肠癌 ( 的表达与 % 整合素 的表达相关性并影响微血管形成 基础医学与临床 3$"3 $3 '# ##( ( "" " 李永金 王忠诚 陈永昌 整合素与 $( 蛋白激酶 ( 在肿瘤迁移过程中的作用 中国细胞生物学学报 $ 2 4&6 4 " $&#' # # # # #$'# # $ ( ) +$$+ $ - (3" "3#$2 ( 5#' "#3 #""# " ($3 " $) #$' ( $ 5'!## # " #$ "("!## # +$+ 4& " ( ( 3& # # " ' # #$ " # " # ' ) 2$1 6 # ( % # "&'#$ '# # 4 " " ( # $ (6 " ( 5# " & $ 4 " " # #$! # ' ### '# #$" % 收稿日期 编辑 张秀峰 上接第 03 页 +1+$",1# ''# '# # ## #&#'' ## ($# %1 $# $ $ $ '4 (. % # '!" " # 0!!# # '$'!' "# ## ("# " #., 2#, # $ '# ##!# & 3&1 # $!# ' #!'# '"# $'$!#' 1" (" 6/6" / 2 " # $ # $'$!#' ) )# #( " & 收稿日期 编辑 段佳