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1 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!"# $ % &' "# " 论著水甘油通道蛋白 ( 在女性绝经后肝细胞脂肪变性中的作用朱晶舒静傅晓华杭州浙江省人民医院杭州医学院附属人民医院生殖内分泌科通信作者傅晓华!7#<$ 95 = %"! &. ( >%!7? '' ( 5 摘要目的了解水甘油通道蛋白 ()*+( 在绝经后肝细胞脂肪变性中的调控作用方法建立绝经小鼠模型和油酸诱导的, - 脂肪变性模型, 染色和油红. 染色法分别观察小鼠肝组织切片和, - 细胞脂肪变性程度 /+01 法和 ' 印迹法检测小鼠肝组织切片中 )*+( 肝细胞内成脂关键酶的!1 ) 及蛋白水平检测, - 肝细胞中 )*+( 的!1 ) 及蛋白水平结果去势动物模型的低雌激素状态和对照组相比引起明显肝细胞脂肪变性脂质合成关键酶乙酰 0") 羧化酶 )00 脂肪酸合成酶 ) 甘油磷酸酰基转移酶 -+) 及磷酸甘油醛脱氢酶 -)+&, 表达上调 )*+(!1 ) 及蛋白水平表达下调差异均有统计学意义均 2 而补充雌激素可降低上述酶的表达同时 )*+(!1 ) 及蛋白水平表达上调均 2 建立油酸诱导的, - 脂肪变性肝细胞模型发现补充雌激素可减少脂质沉积 )*+(!1 ) 水平及蛋白水平相对值分别为和 ( 较对照组均明显改善而转染 )*+( '1 ) 后该效应减弱 )*+(!1 ) 水平及蛋白水平相对值分别为和均低于对照组差异具有统计学意义 2 进一步添加雌激素后 )*+(!1 ) 水平及蛋白水平的相对值分别为和均优于对照组差异有统计学意义 2 结论 )*+( 可能在雌激素调节肝细胞甘油三酯合成通路中发挥作用关键词肝细胞水甘油通道蛋白雌激素脂肪变性基金项目浙江省医药卫生科技项目 34) 34)5 浙江省自然科学基金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

2 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!"# $ % &' "# ". ( ) "%* ' +, )-#*% "". ' "- / ) "'' 01 ) - " %)# %)# /% % ) %1 "#"-* " % ) - " %)# ) )# /% % 4" ) " 56( 56( 绝经是女性必然经历的生理过程在此阶段雌激素水平呈波动性下降机体代谢紊乱明显加速致非酒精性脂肪性肝病 +45& 型糖尿病以及心血管疾病等慢性病高发肝脏是雌激素作用的主要靶器官之一肝脏的病理改变如脂肪变性等除导致肝脏局部病变如肝硬化外还被认为是糖尿病心血管疾病的独立风险因子因此探索雌激素改变对肝细胞脂肪变性的影响及调控机制对于预防绝经相关代谢性疾病具有重要的意义水通道蛋白是一类存在于多种细胞细胞膜上用来运输水分子的跨膜蛋白在哺乳动物中已发现了种亚型水甘油通道蛋白 +6 ' 是其中的一种亚家族包括和 +6 除了运输水分子外还可以运输甘油和尿素等小分子物质其中 +6. 是调控脂肪细胞甘油三酯运输的主要通道其表达异常已被证实可导致脂肪细胞内甘油三酯 7.8 浓度持续增加相关动物模型提示 +6. 也可在大鼠肝细胞质膜表达本研究试图建立动物模型及细胞实验探讨 +6. 在雌激素调控肝细胞脂肪变性中的作用报道如下材料与方法一实验材料动物与肝细胞系 9.:;5 雌鼠周龄体重 - 有正常动情周期购自上海斯莱克实验动物有限公司 7 许可证号 /9 沪. 8 清洁级标准饲养饲养湿度约室温保持在. ( 肝细胞系购自上海寰荣生物科技有限公司编号 + 99 (; 仪器和试剂仪器 " ) % ## 电泳仪美国 ; +& 公司 /3 电转仪大连竞迈科技有限公司酶标仪芬兰雷勃公司!) 移液器美国吉尔森公司 ( 水浴锅美国 5 %) 公司 ) " 成像系统上海天能科技有限公司 95 / / 光学显微镜日本尼康公司 +;. 扩增仪美国 +; 公司试剂他莫昔芬 + 皮下缓释剂及. 雌二醇皮下缓释剂美国 + 公司 +6. 抗体脂肪酸合成酶 4+/ 抗体甘油磷酸酰基转移酶 + 抗体及磷酸甘油醛脱氢酶 + &( 抗体英国 +<%)! 公司乙酰 9"+ 羧化酶 +99 抗体美国 9/ 公司携带靶向 +6. 基因的 ' + 慢病毒载体 '+6. 序列和空白对照 ' + 上海吉玛制药技术有限公司 5" 转染试剂培养基 0 5 试剂盒 /2; 9 )' = 荧光定量试剂盒 / '% 反转录酶美国 1!" 4'1 /% $% 公司 ;9+ 试剂盒南京建成生物工程研究所蛋白裂解液北京索莱宝科技有限公司油酸及牛血清白蛋白溶液美国 /-!) +# %1 公司二小鼠实验模型制备取只小鼠随机分为组每组只其中假手术组 /1)! 组小鼠腹腔注入戊巴比妥钠麻醉!5: - 打开腹腔暴露卵巢不做处理随即关腹假手术 > 雌激素拮抗剂 + 皮下缓释剂包埋组 /1)!? + 组小鼠麻醉后行假手术皮下埋植 + 缓释剂!- 释放双侧卵巢切除组组小鼠麻醉后行双侧卵巢切除术双侧卵巢切除?. 皮下缓释剂包埋组? 组小鼠行双侧卵巢切除术后皮下埋植. 缓释剂!- 释放分组后予高脂饮食脂肪周后处死取肝脏组织多聚甲醛固定后行 ( 染色肝组织样本观察 ( 染色观察小鼠肝组织切片脂肪变性程度

3 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!"# $ % &' "# " 表,-. 引物及其序列引物引物序列片段大小 < /0,1 = / -/-- >. > --/--/--/ -- > /-- > - --/ - // - / - >. > / ---/-- - /-//-- > / > / -//- // >. > /// -/--/ -/-/ / >,/ > -/ --/ / -/ - >. > -/ /- - >,/& > / -/- --/---/ // >. > --/- /- /-/-/ > ) /0,1 >/- /--/ / //-//->. >---//--/ -// // > /-- > -/ / ---//- - - >. > / ---/ -/ --/-/ - > ) / > --// // // / >. > - / >,/ > - - -/- -/ - - >. > /-/ / - > ),/& > -/---/ /-- >. > --/--/--- - / > 注 /0,1 水甘油通道蛋白 1/-- 脂质合成关键酶乙酰 -"/ 羧化酶 / 脂肪酸合成酶,/ 甘油磷酸酰基转移酶 /,& 磷酸甘油醛脱氢酶上游引物. 下游引物 ()* 以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为结果判断标准 +,-. 法检测 /0,1 及成脂关键酶包括 /-- /,/ /,&!. / 水平用 "# 试剂盒提取肝组织总. / 逆转录合成 %& /+,-. 采用试剂盒用 /31,-. 仪扩增引物序列见表 /,& 作为内参,-. 扩增条件为 )! 个循环 ) ' ' 共个循环 -+ 方法计算基因相对表达量每组实验重复次 5 ' 印迹法检测 /0,1 及成脂关键酶蛋白水平取约 6 肝组织研磨成粉后加入蛋白裂解液提取总蛋白 3-/ 试剂盒进行蛋白质样品的定量蛋白分离采用 7 的 &,/ 胶电泳结束后将蛋白转移到 - 膜上 7 脱脂奶粉封闭后一抗孵育过夜加入二抗室温封闭 8 洗膜后 -9 化学发光法检测条带灰度值采用!:6 软件分析 /,& 作为内参三肝细胞脂肪变性试验模型制备肝细胞随机分为组处理高脂肝细胞 '. / 空白对照组 ' - 组将 9 - '. / 约!"# 溶于 9 ; 4 4 无血清培养基中 9 9" 溶于 9 ; 4 4 无血清培养基中! 后两者混合室温静置! 转染复合物形成后加入培养皿中进行细胞转染转染 8 后加入油酸!"# 9 再次等待 8 后 7 多聚甲醛固定用油红 ; 溶液染色高脂肝细胞 '. / 空白对照加雌激素组 ' - 组 ' - 组加入油酸后继续加入!"# 9 牛血清白蛋白溶液后固定染色高脂肝细胞 '/0,1 转染组 '/0,1 组将 9 /0,1 '. / 约!"# 溶于 9 ;!! 无血清培养基中 9 9" 溶于 9 ; 4 4 无血清培养基中! 后两者混合室温静置! 后续处理方法同 ' - 组高脂肝细胞 '/0,1 转染加雌激素组 '/0,1 组 '/0,1 组加入油酸后继续加入!"# 9 牛血清白蛋白溶液后固定染色肝细胞指标观察光学显微镜下观察肝细胞油红 ; 染色显示肝细胞脂肪变性程度结果判定标准以细胞质内出 ( * 现橘红色的脂滴为脂肪变性细胞 +,-. 和 5 ' 印迹法检测肝细胞 /0,1!. / 和蛋白水平表达的变化处理方法参考前述操作四统计学分析采用, 软件进行统计分析实验数据组间比较采用单因素方差分析多组间比较采用 : ' 检验校正统计检验水平双侧为差异有统计学意义结果一小鼠模型试验结果肝组织切片脂肪变性程度染色观察肝组织切片发现与 8:! 组和 ; 组相比 ; 组和 8:! /4 组内脂肪含量明显增加可见外源性雌激素补充可明显降低 ; 组小鼠肝组织内脂质沉积见图

!2 ( 及蛋白水平均增加差异有统计学意义均而补充外源性雌激素可显著降低这些关键酶的基因表达均 3 见表 (4 的表达比较组间 (4!2 ( 及蛋白水平表达差异均有统计学意义 5 和均 3 与 )*+! 组相比 )*+!-.(/ 组和 1 组中 (4!

4 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!"# $ % &' "# " 5 )*+! )*+!-.(/ 1 1 (4 ( & (, 注 )*+! 组假手术组 )*+!-.(/ 组假手术 - 雌激素拮抗剂他莫昔芬皮下缓释包埋剂组 1 组双侧卵巢切除组 1 - 组双侧卵巢切除 - 雌二醇缓释皮下包埋剂组 (4 水甘油通道蛋白 ( & 磷酸甘油醛脱氨酶内参图组小鼠肝细胞 (4 蛋白表达水平 0 & 注 ( 假手术组 )*+! 组, 假手术 - 雌激素拮抗剂他莫昔芬皮下缓释包埋剂组 )*+!-.(/ 组 0 双侧卵巢切除组 1 组 & 双侧卵巢切除 - 雌二醇缓释皮下包埋剂组 1 - 组图组小鼠肝组织切片染色成脂关键酶的表达组间成脂关键酶 (00 () 以及 (.!2 ( 及蛋白水平表达差异均有统计学意义均 3 其中与 )*+! 组相比 1 组和 )*+!-.(/ 组中 (00 () 以及 (.!2 ( 及蛋白水平均增加差异有统计学意义均而补充外源性雌激素可显著降低这些关键酶的基因表达均 3 见表 (4 的表达比较组间 (4!2 ( 及蛋白水平表达差异均有统计学意义 5 和均 3 与 )*+! 组相比 )*+!-.(/ 组和 1 组中 (4!2 ( 水平及蛋白表达水平均明显降低均补充外源性雌激素后 (4 表达明显增加均 3 见表及图提示 (4 与去势手术诱导的肝细胞脂肪变性之间存在相关性二肝细胞模型试验结果为进一步验证雌激素和 (4 在体外肝细胞脂肪变性中的作用建立 1( 诱导的肝细胞脂肪变性模型体外细胞模型分为组 ' 0 组 - ' 0 组 '(4 组 -'(4 组组间比较 (4!2 ( 及蛋白水平表达差异均有统计学意义和均其中与 ' 0 组相比 -' 0 组 (4!2 ( 水平及蛋白水平均明显升高差异有统计学意义均 3 而 '(4 转染后 (4!2 ( 水平及蛋白水平均显著降低均进一步补充雌激素后 -'(4 组 (4!2 ( 水平及蛋白水平均明显改善差异有统计学意义均 3 见表及图 1( 诱导 * 后 ' 0 组细胞胞浆中脂滴增加雌激素补充后脂滴数量明显减少而 '(4 转染可减弱雌激素的保护作用见图以上数据表明雌激素补充对肝细胞的保护作用可能部分通过增加 (4 的表达表小鼠肝组织成脂关键酶及 (4 的!2 ( 及蛋白表达水平差异 6 组别 (00 () (.!2 ( 蛋白!2 ( 蛋白!2 ( 蛋白 )*+! 组 )*+!-.(/ 组组组 % % 5 % 值值 5 + (4!2 (!2 ( 蛋白 % 7 5 注 (4 水甘油通道蛋白 (00 脂质合成关键酶乙酰 0"( 羧化酶 () 脂肪酸合成酶 (. 甘油磷酸酰基转移酶 )*+! 组假手术组 )*+!-.(/ 组假手术 - 雌激素拮抗剂他莫昔芬皮下缓释包埋剂组 1 组双侧卵巢切除组 1 - 组双侧卵巢切除 - 雌二醇缓释皮下包埋剂组与 )*+! 组比较与 1 组比较 % 8 3

7-324 ' '+ - '-324 '-324 大学对多种族人群开展了性激素营养与糖脂代谢性疾病的研究利用 *+ 及 &,- 等仪器对脂肪进行精确构建结果发现绝经是女性脂肪含量改变的重要决定因素绝经后女性脂肪含量明显高于相同年龄及.

5 4 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!"# $ % &' "# " 组别表组 5 细胞间 -324!+ - 及蛋白表达差异!+ - 水平蛋白水平 ' 组 4 '-324 组 ' 组 4 6 '-324 组 % 值值 7 7 注 -324 水甘油通道蛋白 4' 组高脂肝细胞 '+ - 空白对照组 ' 组高脂肝细胞 '+ - 空白对照加雌激素组 '-324 组高脂肝细胞 '-324 转染组 '-324 组高脂肝细胞 '-324 转染加雌激素组与 ' 组比较与 '-324 组比较 % ' '+ - '-324 '-324 大学对多种族人群开展了性激素营养与糖脂代谢性疾病的研究利用 *+ 及 &,- 等仪器对脂肪进行精确构建结果发现绝经是女性脂肪含量改变的重要决定因素绝经后女性脂肪含量明显高于相同年龄及.* 的绝经前女性而在围绝经期雌激素改变的早期首先出现的是脂肪分布的异常脂肪积聚于肝脏等内脏器官并且这种变化独立于全身脂质的增加与代谢综合征和糖尿病等发生密切相关人群前瞻性研究进一步表明围绝经期肝脏发生的 ( ) 病理改变独立并且早于全身的变化出现本研究基于小鼠模型发现双侧卵巢切除小鼠肝组织切片脂肪含量明显增加而外源性雌激素补充可明显降低小鼠肝组织内脂质沉积而对肝组织内成脂关键酶表达的检测发现 /, 组和 01! -* 组中 -2&5 注 -324 水甘油通道蛋白 4' 组高脂肝细胞 '+ - 空白对照组 ' 组高脂肝细胞 '+ - 空白对照加雌激素组 '-324 组高脂肝细胞 '-324 转染组 '-324 组高脂肝细胞 '-324 转染加雌激素组 -324 水甘油通道蛋白 4-2&59 磷酸甘油醛脱氢酶内参 - -0 以及 2-!+ - 及蛋白水平均增加而补充外源性雌激素可显著降低这些关键酶的基因表达人群和动物实验均证明 -324 表达异常时可导致脂肪细胞内甘油浓度持续增加甘油三酯合成 ( ) 增强肥胖发生但是 -324 是否参与雌激素对图组 5 细胞 -324 蛋白表达水平 -. 肝细胞脂质代谢的调控目前未见报道本研究发现与 01! 组相比 01! -* 组和 /, 组中 -324!+ - 水平及蛋白表达水平均明显降低补充外源性雌激素后 -324 表达明显增加提示 -324 与去势手术诱导的肝细胞脂肪变性之间存在相关性为进一步验证 -324 的作用我们构建油酸诱导的 5 细胞模型研究发现补充雌激素后脂滴数量明显减少可有效降低肝细胞脂肪变性程度 & 但该保护作用可被 -324 '+ - 减弱表明雌激素注 - 高脂肝细胞 '+ - 空白对照组 ' 组. 高脂肝细胞 '+ - 空白对照加雌激素组 ' 组高脂肝细胞 '-324 转染组 '-324 组 & 高脂肝细胞 '-324 转染加雌激素组 '-324 组图组 5 细胞脂滴沉积情况油红 / 染色补充对肝细胞的保护作用可能部分通过增加 -324 的表达但雌激素调节 -324 转录的具体机制需要进一步实验验证目前国内外对于雌激素调控 ( 4) -324 在脂代谢的研究也有一些新进展等在讨论雌激素调控去势小鼠 -324 表达的研究发现雌激素调控 -324 的表达具有组织选择性即去势小鼠围绝经期是女性各项生理功能发生显著变化 () 的重要时期前期工作中我们联合美国哥伦比亚内脏脂肪 -324 表达降低皮下脂肪 -324 表达无明显改变也有研究认为绝经女性 -324 表达降低

6 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!"# $ % &' "# " / 是卵泡刺激素 ()* 通过受体 ()*+ 直接下调 0 1,-./ 的表达但现有研究主要还是集中在脂肪组织及细胞中样本量较少研究结果仍需进一步验证综上所述本研究通过建立小鼠及细胞模型试验发现雌激素可通过影响,-./ 的表达从而影响肝细胞的脂代谢研究结论可以解释部分绝经后脂肪肝发病率明显增高的现象同时为补充雌激素干预绝经后脂肪肝及代谢性疾病提供新的思路后续可探索在生物体内特异性的调节,-./ 表达对肝细胞脂代谢的影响提出针对,-./ 的调节方案开展进一步改善绝经后肝细胞脂代谢异常相关的临床治疗工作参考文献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刘彦华才丽平林庶茹等大鼠肝脏水通道蛋白 / 的表达 0 1 中国组织化学与细胞化学杂志 &4 / 5 '' 8* 3. )+ # = ''" "$ > " / # ' " # "$ *' "%!' 6 36 "%!' 6 &4 / 5 '' 0;1 & < 9 " 7 ' #. "2 ''! 2! '' ' $" " #%" "#% $ 6 # ' ' 0 1 " # : ' " "# / ; 0 1 杨林辉陈东风油酸诱导培养肝细胞脂肪变性模型的建立 0 1 重庆医学 / ;/ &4 ;;5 '' / / 8 2 * 3 &( ' #'! "$ "%6 ' "''!" #' % 6 "# % % " 2> 2 9 /;/ &4 ;;5 '' / / 01 ( )" 2, " 8 #,''"% " "$ 2" # " 6 $! "#% '<' 3 ' "! 0 1. #% * # ; &4 /5); 01 ( ( " # # $ %%! # " ''"%! "#% '<' 6" " # $ "! # 79 3 ' # '0 1, 9 ; &4 ;5 / 01 傅晓华裘胜春陈正云等绝经特异性脂肪分布改变与代谢风险因子的关系 0 1 浙江大学学报医学版 / &4 /5 '' ;; ( * - )3 3 8 #,''"% " "$! " ' # ' %$% $ ' " % 2 '! "#% '< $ % " ' % # )% / &4 /5 '' ;; 01." "' 2 8. # :#6% "#! "#'! # " "%6 ' $ "!.@(, # '! #!" # $"! "#% '6 "! 0 1 *"! 9 + ' &4 5' ;/; 01 * * # &6'$ % " "$,-./ # $, " # 22 "$ "'%# "'' *6" ' / ;; &4 5! 6 / 01 #"9 ## $ % 9+ #, "' '' = ''" "$ 2#6% "# % # > " / 2 ' # ' " ' 6 " 6 '0 1 3# "% "# 9 /; ; &4 5 % / 0/ # '' ' %$% $$ % ' "$ ' "2 " 2#6% "# % # > " / = ''" " % "!?!" '!" # "$! " ' 0 1 3#! % % / ; &4 5;// / ;; 01 陈露婷水通道蛋白 / 介导的卵泡刺激素对脂肪细胞成脂作用机制研究 0&1 杭州浙江大学 3,> " /! ' $ % " "$ $"##% # '! # 2 "!" " #"2 '' "%6 ' 0&1 * 2? " ' 6 收稿日期

中草药

中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (

国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!"# $ % &' "# ". ( ) "%* ' +, )-#*% "". ' "- / ) "'' 01 ) - " %)# %)# /% % ) %1 "#"-* " % ) - " %)# ) )# /% % 4" ) "

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