西安交通大学学报 医学版 第 卷 疗 化疗和综合治疗 这些治疗在取得一定疗效的同时会带来较多的副作用和并发症 黄芩苷是从中药黄芩中提取的一种单体化合物 具有抗氧化 抗炎 抗 菌 免疫活化和抗病毒等多种功能 新近的研究发现 黄芩苷在体内外均有广泛的抗肿瘤作用 且在 发挥这种抗肿瘤作用时对正常细胞没有明

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 中医药研究 黄芩苷对宫颈癌 细胞侵袭转移的抑制作用及其机制 张 悦 符乔珊 刘 餠 高 庆 西安市第四人民医院妇产科 陕西西安 西安交通大学第二附属医院妇产科 陕西西安 摘要 目的 观察黄芩苷对宫颈癌 $#%& 细胞侵袭转移的作用及其相应机制 方法 利用 ' 法检测黄芩苷对 $#%& 细胞增殖的影响 &!# 小室法检测黄芩苷对 $#%& 细胞侵袭能力的影响 #&()#*+ 法检测黄芩苷对 ''*''*,-. 表达水平的影响 /##!0 法检测黄芩苷对 ''*''*, 蛋白表达的影响 /##! 0 法检测黄芩苷对 *1 和 *1 蛋白表达的影响 #&()#*+ 法检测黄芩苷和 1 联合应用对 ''* 和 ''*,-. 表达水平的影响 结果 黄芩苷能够有效抑制 $#%& 细胞的增值 当质量浓度超过 )% 时 与对照组相比 )% 差异出现统计学意义 在低于细胞增殖抑制浓度时 黄芩苷也能够有效抑制 $#%& 细胞的侵袭 )% 组穿过基质胶到达小室底端的细胞数目分别为对照组的,11,, 和 黄芩苷能够有效抑制 $#%& 细胞中 ''* 和 ''*, 的表达及有效抑制 $#%& 细胞中 *1 的磷酸化水平 *1 信号通路抑制剂预处理 能够增强黄芩苷对 ''* 和 ''*, 表达的抑制作用 结论 黄芩苷能够有效抑制 $#%& 细胞的侵袭转移 这种作用可能与其通过调节 *1 信号通路的活性进一步调节 ''* 和 ''*, 的表达有关 关键词 黄芩苷 $#%& 细胞 侵袭 *1 信号通路 基质金属蛋白酶中图分类号 文献标志码.!"! "#"$"$ $.- 2"# 34 5(&0&! %64 /#(.7 5(! 8#&)#!097#(&!!#00:(;&!-0$0(&:(;&! 8#&)#!097#(&!!#00##0!.9((&#$0(&09 :(;&!(&00!4!(#(:(;&!+(!& %&'%##"##() #"! "######()#& ##*"()#+"! "" &!,-., "/*!!-"!!-,,'0 &1"/*!!-!!-,-1"*-1* &##"# *()#""*" ## )&0#"#" # ##+" ",'0"*/*!!-"!!-,""** -1&--1* #" # ## /*!!-"!!-,& "##"#"##!!-"!!-,()#-1* & (' # ()#-1* /*!!- 宫颈癌是最为常见的妇科恶性肿瘤之一 发病率位于妇科恶性肿瘤的第 位 近年来 岁以下年轻 女性中宫颈癌的发病率逐年上升 这与 $*< 感染率的增高相关 宫颈癌的常规治疗包括手术治疗 放 收稿日期 修回日期 通讯作者 高庆 )&((!&00) 优先出版!(!# )#&(,,1)!"#"!

2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 疗 化疗和综合治疗 这些治疗在取得一定疗效的同时会带来较多的副作用和并发症 黄芩苷是从中药黄芩中提取的一种单体化合物 具有抗氧化 抗炎 抗 菌 免疫活化和抗病毒等多种功能 新近的研究发现 黄芩苷在体内外均有广泛的抗肿瘤作用 且在 发挥这种抗肿瘤作用时对正常细胞没有明显毒性 研究发现 黄芩苷对包括结肠癌 乳腺癌 肺癌和淋巴 瘤在内的多种肿瘤中具有明确的抗肿瘤作用 但关于黄芩素对宫颈癌细胞侵袭转移作用的报道较少 基于以上 本研究拟探讨黄芩素对宫颈癌细胞侵袭转移的作用及其可能机制 ) 材料与方法 )) 主要试剂 黄芩苷购于美国 ()& 公司 &! # 小室购于美国 +0!(! 公司 ' 细胞增殖及活性检测试剂 =+. 蛋白浓度检测试剂盒 8'7 (!8. 溶液 蛋白分子量标记 细胞裂解液 $* 标记的羊抗兔 6$>% 抗体和 *<83 膜购于碧云天公司 兔抗人 ''*''*,*1 和 *1 购于 +#(!& 公司.*8$ 购于 &!&+" 公司 )* 细胞培养 $#%& 细胞为本实验室保有 细胞培养液为含有 )%% 血清的 8'' 培养基 培养基中含有 4)% 青霉素和 4)% 链霉素 细胞在?)%%+7 的细胞培养箱中培养 每 换液 次 细胞融合率达到 1 时进行传代培养 )+ 黄芩苷溶液的配制 利用 8'7 配制黄芩苷母液 原液质量浓度为 ))% 储存温度为? 所有实验中用药均采用 8'' 培养基现用现配的方法 所有培养液中 8'7 的终质量浓度均小于 % ),-. 法检测黄芩苷对 细胞增殖的影响 取对数生长期的 $#%& 细胞 )% 悬液接种于, 孔板中 每孔接种量为 % 细胞贴壁培养 后 利用含有黄芩苷药物的溶液培养细胞 药物质量浓度为 1)% 其中 )% 组为对照组 其后, 孔板中每孔加入 ))% '% 置于? 环境中培养 在加入 8'7 后于酶标仪中选取!) 进行吸光度. 读数 每组实验均独立重复 次 抑制率 6AB 治疗组. 对照组.@ )/ 细胞侵袭实验 取对数生长期 $#%& 细胞 胰酶常规消化后利用含 )%% )% 细胞悬液 在 &!# 小室上室中加入含有不同浓度黄芩素的细胞悬液 )% 下室中加入血清浓度为 )%% 的常规培养基 后取出 小室对细胞进行固定 用棉签去除上室中残留细胞并对小室底部的细胞进行固定 染色和拍照 并在显微镜下进行计数 每个浓度组随机选择 个视野 ),0 1$ 检测黄芩苷对..1* 和..1 转录水平的影响 (C0 法提取各组细胞总 -. 根据 &D&& 公司 *()#(*+ D( 试剂说明书进行反转录 8-. 以 8-. 为模板进行 #&()#*+ 反应并对结果进行分析 引物设计见表 每组实验均独立重复 次 表 )1$ 引物序列 &#!##(9( ()#&("#90#&()#*+ 基因序列 &(! & ### ''* & ### ''*, & ### ),(" 检测黄芩苷对侵袭转移相关蛋白的影响 黄芩苷处理 $#%& 细胞 后 细胞常规消化 冰 *= 洗涤 次 然后加入裂解液进行裂解 利用 =+. 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度 并根据蛋白提取物浓度确定上样量 8 凝胶中每孔加入等量蛋白 根据不同分子量的目的蛋白调整电泳时间和电压 其后转膜 转膜结束后 在 % 脱脂牛奶中封闭 然后将膜封闭于含有各种抗体的溶液中? 摇床过夜 第 天 *= 洗涤 次 每次 )(! 然后常温封闭相应二抗 再次用 *= 洗涤 次 最后一次用 *= 洗涤 时间均为 )(! 每组实验均重复 次 最后利用成像系统对结果图像进行采集 并对数据进行分析 ), 统计学分析 本实验数据用 * 统计软件进行分析处理 数据以均数 标准差 表示 组间均数比较采用单因素方差分析 均数间的多重比较采用 %8 法 采用线性趋势检验分析不同浓度黄芩苷对 $#%& 细胞增殖的抑制作用 为差异具有统计学意义 * 结 果 *,) 黄芩苷对 细胞增殖的影响 本研究发现黄芩苷能够明显抑制 $#%& 细胞的增殖 随着黄芩苷浓度的升高 其对 $#%& 细胞增殖的抑制作用逐渐增强 与对照组相比 当浓度达到 )% 时出现统计学差异 图!"#"!

3 期 张 悦 符乔珊 刘 餠 等 黄芩苷对宫颈癌 $#%& 细胞侵袭转移的抑制作用及其机制 机制 我们利用 #&()#*+ 技术检测了黄芩苷对 ''* 和 ''*,-. 转录水平的影响 结果发现 黄芩苷能够在 -. 水平明显抑制 ''* 和 ''*, 的转录 )% 浓度组 ''* 为对照组的,1 和 1 ''*, 为对照组的 1 图 ) 黄芩苷对 细胞增殖的抑制作用 3(#(!(((0!09&(&(!0!#0(9#&(0!09$#%& # 与 )% 组比较 *,* 黄芩苷对 细胞侵袭能力的影响 本研究前期实验结果显示 黄芩苷在浓度高于 )% 时 能够明显抑制 $#%& 细胞的增殖 为此我们选择低于 )% 浓度的黄芩苷作为检测其抗侵袭能力的实验浓度 以消除其抗增殖能力对实验结果的影响 结果显示 在低于细胞毒性浓度的情况下 黄芩苷能够明显抑制 $#%& 细胞的侵袭 )% 浓度组细胞穿过基质胶到达小室底端的细胞数目 分别为对照组 1, 和,1 差异具有统计学意义 图 *,- 黄芩苷对..1* 和..1 蛋白表达的影响 同 项 我们检测了黄芩苷对 $#%& 细胞 ''* 和 ''*, 蛋白表达的影响 结果发现 黄芩苷能够明显抑制 ''* 和 ''*, 的蛋白表达 对照组和黄芩苷治疗组 ''* 和 ''*, 的相对表达量分别为 和, 和 差异具有统计学意义 图 的,11,, 和 这种抑制作用随着药物浓度的升高而增强 差异具有统计学意义 图 图 + 黄芩苷对 细胞中..1* 和..1 转录水平的影响 3(##9#09&(&(!0!#&!((0!09''* &! ''*,(!$#%& #&#)-.## 与 )% 组比较 图 * 黄芩苷对 细胞侵袭转移能力的影响 3( #(!((0#9#09&(&(!0!#(!&(0!09 $#%& #. 不同浓度组穿过基质胶到达小室低端的细胞 紫色 = 对小室底端细胞进行计数后的统计结果 与 )% 组比较 *,+ 黄芩苷对..1* 和..1% 转录水平的影响 为了进一步检测黄芩苷抑制 $#%& 细胞侵袭转移的 图 - 黄芩苷对..1* 和..1 蛋白表达的影响 3(##9#09&(&(!0!###(0!09''* &! ''*,(!$#%& #&#0#(!##. 各组细胞 ''*''*, 和.8*$ 的蛋白表达情况 = 对各蛋白表达的灰度值进行统计后的结果 与 )% 组比较!"#"!

4 西安交通大学学报 医学版 第 卷 *,/ 黄芩苷对 + 磷酸化水平的影响 为了进一步探讨黄芩苷抑制 $#%& 细胞侵袭转移的可能调控机制 检测了黄芩苷对 *1 信号通路活性的影响 结果发现 黄芩苷能够明显抑制 *1 信号通路的活性 随着黄芩苷浓度的升高 *1 的磷酸化水平明显降低 差异具有统计学意义 图 而黄芩苷与 *1 信号通路抑制剂联合应用后 1 组 1> 黄芩素和黄芩苷组 ''* 为对照组的 111, 1 和 ''*, 为对照组的 1,1, 和 图 图 / 黄芩苷对 + 信号通路活性的影响 3( ##9#09&(&(!0!#&((09*1(!& &&. 各组细胞中 *1 和 *1 蛋白的表达情况 = 对各个蛋白的灰度值进行统计后的结果 与 )% 组比较 图 0 黄芩苷与 "*+/ 联合应用对..1* 和..1 表达的影响 3( ##9#09&(&(!&!10!### (0!09''*&! ''*, 与 )% 组比较 + 讨 论宫颈癌是最为常见的妇科恶性肿瘤之一 发病率位于妇科恶性肿瘤的第 位 随着 $*< 的感染率增高宫颈癌呈现出年轻化的趋势 表现为 岁以下 年轻女性中宫颈癌的发病率逐年上升 宫颈癌的常规治疗包括手术治疗 放疗治疗 化学治疗和综合治疗 但对于晚期宫颈癌患者 这些治疗在取得一定疗效的同时会带来较多的副作用和并发症 黄芩苷是从中药黄芩中提取的一种单体化合物 具有抗氧化 抗炎 抗 菌 免疫活化和抗病毒等多种功能 新近的研究发现 黄芩苷能在对正常细胞无明显毒性的情况下 发挥明显的抗肿瘤细胞作用 提示黄芩苷是一种高效低毒的 抗肿瘤中药 但是至今为止还未见关于黄芩苷在宫颈癌侵袭转移过程中作用的报道 本研究发现 黄芩苷能够有效抑制宫颈癌细胞的增殖 同时在低于细胞毒性浓度时也能够有效抑制宫颈癌细胞的侵袭转移 肿瘤细胞的侵袭转移过程极为复杂 许多分子参与其中 在这个过程中肿瘤细胞需要从原发部位脱离 经过很多环节最终到达转移位点 肿瘤细胞完成这一过程 需要获得新的特性 这些新的特性的获得能够帮助它们从原发肿瘤脱离 迁移进入周围组织 渗入循环系统 到达远处并最终在到达部位形成新的肿瘤病灶 基质金属蛋白酶 '&( )#&00#(!&#''* 被认为是促使肿瘤细胞完成侵袭转移过程的关键性分子 其中最具有代表性的是 ''* 和 ''*, 研究发现 ''* 和 ''*, 与宫颈癌的发生发展及 1 预后密切相关 在 ''* 和 ''*, 的表达升, 高后 宫颈癌细胞的侵袭能力明显增强 而在 ''* 和 ''*, 的表达受到抑制之后 宫颈癌的 侵袭受到明显抑制 本研究发现黄芩苷能够有效降低 ''* 和 ''*, 的转录与表达 提示其对宫颈癌细胞侵袭转移的抑制作用 可能与其对 ''* 和 ''*, 表达的抑制作用相关 *1 信号通路对宫颈癌细胞增殖 凋亡等发挥重要的调节作用 既往研究发现 激活 *1 信号通路能够有效增强下游多种靶点的表达与活化 其中就包括 ''* 和 ''*, 此外研究发现 *1 信号通路能够通过调节 ''*, 启动子位点的活性调节 ''*, 的表达 从而进一步调节细胞的侵袭转移 在本研究中发现 黄芩苷能够降低 $#%& 细胞 *1 的磷酸化水平 在与 *1 信号通路抑制剂联合应用后 其对 $#%& 中 ''*''*, 表达的抑制作用明显增强 提示其对 $#%& 细胞侵袭转移的抑制作用可能是通过对 *1 信号通路的活性的调节实现的 综上所述 本研究发现黄芩苷能够有效抑制宫颈癌细胞的侵袭转移 这种抑制作用与通过下调 *1 信号通路的活性进一步抑制 ''*''*, 的表达相关 本研究为黄芩苷在宫颈癌临床治疗中的应用奠定了一定的实验基础!"#"!

5 期 张 悦 符乔珊 刘 餠 等 黄芩苷对宫颈癌 $#%& 细胞侵袭转移的抑制作用及其机制 "#"1*+* "#&- 参考文献 & #&*1,&.(')(0'$2&# 1( (' 6&/*/ " # #* *# ## *,"!-8 #",* &-)$3 ####/&0 1,,&,& )0',,(0'$40&-,( 62!(0' 1&#*5 *### "# (-%*!!!-!!-"!!-,"* #5!, &3# #####&./*,,,1& -1,1,1,& )( 1)(&0##" $3'.($1.&("#(60. ##&!"1 **####,,& /*!!-",/*& (3 4!10'$(0' (&#.11,11& #" # #**,!0, $-,$' (0'6,0 )&*1 *1!0-* ###&0#- #"*5"!0-0- #$,11& ""## "!!-"!!- 6 (0',# &.#,11& (0'$&#** ##" $36 #"(7 10',7',60 0,&$ '" &-#& *1!0- * ## "*&', (0' 2(6(')&6.#,,1,& -05* ""#** )3$.(!((2(3$1&-1!0-#*.0 5 *# #& /. ##/*,&.#,,1&.1,1& 编辑!&(**"###### 卓选鹏 上接第, 页 & 张汝学 贾正平 李富盛 等枝茯苓胶囊小剂量组对亚硝酸钠导致缺氧小鼠存活 & 淫羊藿总黄酮对缺氧模型小鼠的抗缺氧作用 & 中药材,1& 时间 桂枝茯苓胶囊大剂量组对异丙肾上腺素导致缺 1$&*#""& 氧的小鼠存活时间有显著改善 通过异丙肾上腺素 0!"1,1& 致大鼠心肌缺血缺氧实验发现 空白组大鼠心肌细胞 邹丽琰 傅延龄 & 桂枝蒸馏液对离体灌流鼠心缺血 再灌注损伤的保护作用排列规则 整齐 模型组大鼠心肌间质细胞增生 核排 & 北京中医药大学学报,,& 1 徐幕鸽 魏凯峰 & 桂枝活血机理及配伍规律探析 & 中医药导列密集 大量炎性细胞浸润 出现空泡样变性 水肿样报,1& 变 心肌片状坏死等 与文献报道一致 病理结果表, 李永芳 杨梅 寇毅英 等 & 八味沉香散对异丙肾上腺素诱导的大明 桂枝茯苓胶囊大小剂量组也出现间质细胞增生 炎鼠心肌缺血损伤的保护作用 & 中药药理与临床 1 & 细胞浸润等 但是与模型组相比 坏死面积显著减少 ) )1 120'&0" #"#"*# 综上所述 心肌缺血 缺氧 心肌组织坏死重构是 #" #"**#" 慢性心衰的重要病理学特征 也是促使心力衰竭进一 &.",1,& 步恶化的原因之一 桂枝茯苓胶囊可提高机体缺氧.(,$0'$'$,6!0'' $.()6 ((&0" #"#"#" * " 耐受力 改善心肌组织损伤 对慢性心衰的预防和治 *** " #*## & () 疗具有重要临床意义 *1,& 刘昊琛 邓忠 张忆雯 等 & 乙醇致家兔急性心衰模型的建立 & 参考文献 西安交通大学学报 医学版 1& 赵江红 苍海 李静琼 & 桂枝茯苓丸治疗心脑血管病的药理研究,!! 6)$', 6$.(', (&6* 进展 & 河南中医学院院报,11& *" 李佳川 刘朋 刘晓帅 等 & 桂枝茯苓丸对垂体后叶素致大鼠急性 &."#,,,1 心肌缺血的保护作用 & 西南民族大学学报 自然科学版,&,,& 刘新岩 & 枸杞多糖对异丙肾上腺素致心力衰竭大鼠的保护作用 杨学斌 & 浅析桂枝茯苓丸治疗脑血管病 & 光明中医 1 及其机制 & 宁夏医科大学学报 & 1& 编辑 卓选鹏 陈主初 & 病理生理学!& 北京 人民卫生出版社 &!"#"!

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