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棓怪从
7 years ago
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1 ELISA 实验操作中的注意要点日期 : :37:15 浏览次数 :101 ELISA 是免疫学检测诊断研究最常用的方法之一, 对于 ELISA 的检测原理操作规程都有明确的文献可供参考 ELISA 的试剂盒也多种多样, 一般只要严格遵照试剂盒所附说明书操作, 均能得到理想的结果这里对实际操作的过程做几点说明 : 1 样本准备血清血浆体液细胞培养上清等均可作为 ELISA 的检测样本在采集血样和分离血清的过程中应尽可能避免溶血分离血清时最好在室温或者 37 水浴中凝固, 而不要放在冰箱凝固 ELISA 血清样本要求新鲜, 如果要贮藏后再检测, 应分装在 -20 以下, 避免反复冻融 2 加样操作目前 ELISA 试剂盒中使用最多的是检测抗原的双抗体夹心法和检测抗体的间接法, 检测的第一步均是加样本加样操作需要注意的是应使样本均匀分布到 96 孔板的孔底在加样量为 50µl( 以下 ) 时, 容易出现将样本加到孔壁的情况, 应尽可能避免多数试剂盒所检测的样本量为 100µl, 因此这个问题并不经常出现随后加入标记抗体显色底物时均应注意加到孔底 3 孵育洗涤孵育一般要求为 37, 需要用封板膜对 96 孔板进行密封, 然后在 37 温箱内进行 ELISA 及其他在 96 孔板上进行的免疫学检测反应最重要的步骤便是洗涤洗涤可在自动洗板机上进行, 亦可手工洗涤自动洗板机洗涤时, 应注意洗涤程序是否符合 ELISA 及试剂盒说明书的要求一般要求洗涤 3-5 次, 每次 2-3 分钟需要注意的是,ELISA 反应的洗涤, 在每次洗涤过程中各反应孔是注满洗涤液的, 即洗涤液是在反应孔中维持 2-3 分钟而其他一些方法 ( 如时间分辨荧光检测 ) 的洗涤要求是, 反应孔注满洗涤液后即迅速将洗涤液吸尽因此在使用多功能自动洗板机的时候应该注意这一点手工洗涤时, 可使用洗瓶或者输液瓶来向反应孔注液手工洗涤第一次洗涤可以采用过洗, 即甩干样本后, 快速浸满洗涤液迅速甩干, 这可以进一步避免交叉污染手工洗涤后要求将平板在吸水纸上拍干, 此时应注意 :1, 勤换吸水纸, 务必避免吸水纸的碎屑粘到反应孔内 ;2,ELISA 一般能够承受力度较大的拍板 ( 而时间分辨荧光等不能, 这也是两种方法在自动洗板机上洗涤程序不同的原因 ), 因此最好对 96 孔板上的可拆卸板条进行标记, 以防板条脱落而混淆 4 结果判断 ELISA 结果判断一般是根据显色底物的显色深浅进行的显色反应仍要求在 37 下进行, 约需 10 分钟, 然后用终止液终止显色反应, 并用酶标仪检测特定波长下的吸光度由于酶标仪对各反应孔的检测光路是垂直方向的, 因此在进行检测时, 应保持各反应孔孔底的整洁 ; 同时, 显色底物终止液的量也应该准确, 因为孔内液体的量将影响到最后的读数一.ELISA 试验有效性与三项对照什么是有效性 (Validity)? 要获得准确的检测结果有效性评价, 就会关系到 : 为什么要设置阴性阳性和空白等不可缺少的三项对照? 要用什么样的物质担当阴性阳性和空白对照 ( 品 )? 这三项对照如何设置需要设置几个孔位? 获得的测定值如何认可取舍与计算? 随后, 又如何依照阳性对照均值 (PCx) 与阴性对照均值 (NCx) 的差值 (P-N, 或 N-P) 大小做出试验结果有效性的最终裁决呢? 等等, 这一连串的问题, 在国外正规品牌的 ELISA 试剂使用说明书中都有明细和详尽的说明既有理论要点提示, 又有具体细致的举例解说很可惜, 在 90 年前后, 国内兴起 ELISA 检测热潮之际, 在一片国外试剂说明书太详细太复杂不容易看明白等等一片埋冤声中, 正好迎合国内商家的意愿从此以后, 国产 ELISA 试剂的说明书, 越来越简单

2 这其中商家就有两个好处 : 好处之一, 用 A4 或 B5, 甚至比 B5 还要小的一张纸, 代替国际试剂的好几页的使用说明书 ( 等同于一份操作手册 ), 每年就可节省一大笔印刷成本费 ; 好处之二, 如同国际试剂说明书上向用户交待的各种表明本试剂质量有关的详尽内容, 国产试剂的所谓说明书上统统可以删除回避拒绝向用户通报和承诺我 90 年前后收集的 < 美 > 雅培 < 法 > 巴斯德 < 荷 > 阿克苏等相关试剂的原文说明书, 几经搬动全都处理, 很是可惜近日, 杭州检疫局朋友送了一份生物梅里埃中国有限公司的中文版人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒 ( 酶联免疫法 ) 使用说明书对照阅读之下, 深深感到这才是一份真正意义上的使用说明书呀! 在我下文提到的若干概念问题, 从中都可以找到答案我现在参照我本人 1993 年的肝炎 ELISA 试剂质量与检测结果有效性评价会议讲稿相关内容, 就三项对照与检测结果有效性表示如下认识和讨论二. 三项对照要求与用途 ELISA 检测, 按照试剂说明书要求, 每次试验每块扳上都要设置以下 3 项对照和用途 : 1. 空白对照 : 仅用稀释液代替检测样本用以观测最终反应的显色本底并用于酶标仪消除扣除本底, 即 : 以本底为零读取阳性阴性对照孔和样本检测孔的吸光值 (A); 或者, 在计算阴性对照均值 (NCx) 阳性对照均值 (PCx) 样本读数的 S/C.O. 值时减去空白对照的本底吸光值早年的酶标仪无自动扣除空白对照孔读数功能, 这种酶标议现已淘汰不用了, 写上这段话的意思是补充说明设置空白对照的用途空白孔具体如何读取读数, 则依照说明书操作例如, 生物梅里埃中国有限公司的中文版人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒 ( 酶联免疫法 ) 使用说明书上提示 : 以空气读空白 ( 不放板架和板条 ), 在 450nm ( 单波长 ) 或 450nm 和 mn( 底物是 TMB) 参考波长进行读数 2. 阴性对照 ( 品 ): (1) 阴性对照 ( 品 ) 的概念与要求 : 所谓阴性对照 ( 品 ), 应当是本项检测试验中采用与待捡物 ( 样品人用试剂就是人的血清等 ) 具有同源性和同质性, 又不含有待检物质, 并能客观比较和鉴别处理因素 ( 血清免疫学试验中有特异性抗原与抗体反应 ) 之间的差异因此, 用动物血清或其制品 ( 如牛血清白蛋白等 ) 代替阴性人血清作为对照品, 从理论和实践上都是不可取的, 弊端甚多, 无须细述注意 : 据我所知, 国产 ELISA 试剂中, 有的厂牌是用动物血清制品稀释配置或与部分人血清混合配置的 ; 其二, 阴性对照读数, 并非是越低越好 NCx 值接近 0.00X 水平, 这是假象! 试想一下, 真正采用阴性人血清的阴性对照品,NCx 值会如此之低吗? 举个例子, 雅培乙肝六项 EIA 试剂的 NCx 值, 分别为 :0.010 (HBsAg) 0.027( 抗 HBs) 0.035(HBeAg) 1.083( 抗 HBe) 1.065( 抗 HBc) ( 抗 HBc-IgM) 生物梅里埃的 HIV 试剂 NCx 是辨别试剂 NCx 值是否合理的一个很简单的方法, 只要对比大量阴性样本的实际读数就一目了然啦! 一个题外插曲 : 表明 ELISA 试剂内在质量的一个重要统计标志, 就是要看 : 阴性样本的的上限不应当大于必须小于 C.O.I.=1.00; 反之, 阳性样本的的下限不可小于应当大于 C.O.I.=1.00! 早年我用 SPSS 软件输出阿克苏 HIV 和国产甲乙试剂检测 600 例左右的健康人体检血清的三幅直方图, 可以表明阴性样本的不同分布特征, 颇有意思我为什么要如此细说 NCx 呢? 因为 NCx 值在 Cut off 值计算中是相当举足轻重的 ( 详后 ) (2) 阴性对照 ( 品 ) 分为两类一是代表受检人血清中并不含有或方法学灵敏度未能检出的待检物的基准水平, 并且是结果判断值 (Cut off) 计算式中决定是 ( 阳性 ) 或否 ( 阴性 ) 的唯一可变值阴性对照值高, 导致假阴性 ; 反之, 导致假阳性如 :HBsAg HBeAg 抗 HBc 等二是阴性对照设置, 在方法学上要求加入指示性定量标准品, 如中和剂 HBeAg, 定量 HBcAg 等, 用以检测抗 HBe 抗 HBc 或者, 选取代表平均水平的正常人血清用作阴性对照, 如检测

3 抗 HBc IgM 此类 Cut off 值计算时, 多数均包括阴性和阳性对照值 2 个可变值 3. 阳性对照 ( 品 ): (1) 阳性对照 ( 品 ) 的概念与要求 : 同阴性对照 ( 品 ), 只是采用精选的含有待检物质的人血清制备而成所谓精选, 就是把收集的阳性人血清经过数种试验进行筛试把含有干扰性物质的血清剔除不用, 以避免出现假阳性干扰试验结果 (2) 阳性对照 ( 品 ) 设置, 也可区分为两种类型与用途 : 一是阳性对照主要用于评价该项试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性而所设的阳性对照的测量值不列入 Cut off 值计算但是不可不做如 HBsAg 抗 HBs HBeAg 等二是阳性对照的设置, 不仅用于评价试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性, 而且计入 Cut off 的计算此时的 Cut off 值的含义是代表该标志物在健康 ( 正常 ) 人群中正常值范围的上限待检样本检测值超过该上限 (Cut off) 时表示有诊断意义例如抗 HBe 抗 HBc 抗 HBc IgM 等 H 三. 阴性与阳性对照平均值计算与判断 1. 阴性对照平均值 NCx 有效性计算判断举例 : (1) 第一类 NCx 计算与评价 : 以 HBsAg 为例 Ⅰ. 设置 3 孔的 NCx 计算 :NCx=( )/3=0.010 Ⅱ. 任一个 NC 值应至 ; Ⅲ. 各 NC 值也应介于 0.5 NCx 至 1.5 NCx 之间此时各孔的 NC 值均处于 NCx±0.006 范围内, 其中遇有一孔 NC 值偏离该范围时, 则弃去该 NC 值, 再计算 NCx 如有 2 孔 NC 值超出该范围时, 本次试验 ( 无效 ) 应予复试 Ⅳ. 不同厂牌对 NCx 的具体要求略有不同, 但总的原则几为一致, 如 < 法 > 巴斯德 HBsAg EIA Kit (2) 第二类 NCx 计算与评价 : 可包括抗 HBc 抗 HBe 以抗 HBc 抗 HBe 为例 : Ⅰ. 取 3 孔阴性对照 A 值的平均值 : 抗 HBc NCx=( )/3=1.065 抗 HBe NCx=( )/3=1.083; 请各位注意 : 这 2 个 NCx 是不是很接近 1.00 呀? 也就是说, 十分接近 C.O.I.(C.O./S, 或 C.O./A)=1.00! 这不是一种偶然, 而是国际试剂 ( 如雅培 ) 的质量标志如果偏大, 例如 1.50 以上, 或者偏小,0.50 以下, 待检样本中会导致出现什么现象呢? 请读者自己思考吧 Ⅱ. 各孔 NC 值均应 <2.000, 并处于 0.5 NCx 至 1.5 NCx 之间若其中 1 孔 NC 值偏离该范围时, 弃去, 再计算 2 孔的 NC 值的 NCx 如有 2 孔 NC 值偏离该范围时, 应重新试验 2. 阳性对照平均值 PCx 有效性计算与评价也分为两类 : (1) 第一类 PCx 计算与评价 : 以 HBsAg 为例 DauI*sZmR Ⅰ. 第一类 PCx 的计算不列入 Cut off 计算, 可取 ( 设 )2 3 孔阳性对照的平均值 PCx (Abbott): PCx=( )/2=1.027 注意: 本例雅培试剂 HBsAg 的 Cutoff 值 =NCx+0.05=0.06,PCx 的 S/C.O.=1.027/0.06=17.12 如果 S/C.O. 超过以上, 提示 HBsAg 阳性对照含量太高! Ⅱ. 参照方法学的要求, 也可规定 PCx 应 1.000( 指 A 值 ), 而且各孔 PC 值要求 0.5 PCx 至 1.5 PCx

4 Ⅲ. PC 的设置及 PCx 的计算, 主要用于评价本次试验结果是否有效和各批 / 次试验结果的稳定性和可比性, 并不参与 Cut off 值的计算同一个批号试剂及其阳性对照品在规定保存条件和有效期内, 各次试验时 PCx 值也应保持相对稳定水平换句话说, 实验结果有效性评价时, 也应观测阳性对照的统计过程控制 (SPC) 处于稳定状态输出控制图 (2) 第二类 PCx 的计算与评价 : 也以抗 HBc 为例 Ⅰ. 可取 ( 设 )2 3 孔 PC 的 A 值得平均值 PCx: PCx=( )/2=0.045 Ⅱ. 参照方法学要求, 也可规定各孔 PC 值应处于 0.5 PCx 至 1.5 PCx 范围内 Ⅲ. PCx 值参与 Cut off 值的计算, 例如抗 HBc 的 Cut off(abbott): Cut off=0.4(ncx)+0.6(pcx) 该值 (Cut off) 可以理解为 : 指示性定量 HBcAg 反应值的 40% 加定量抗 HBc 反应值的 60% 之和, 恰为健康人群血中抗 HBc 正常值范围的界限任一待检样本的检出值低于该 Cut off 值时则判为抗 HBc 阳性, 大于该 Cut off 值时则判为抗 HBc 阴性 3. 计算 NCx PCx 有效性与统计控制应用读者如果注意到 NCx 与 PCx 有效性计算规则, 很有点像电视上的去掉一个最小值去掉一个最大值的评分办法, 就知道统计学上的异常值粗略取舍法, 把 3 个对照值中的 1 个最小或最大异常值剔除, 再重新计算余下的 2 个对照值的平均值这样, 不但可以比较前后试验的各次反应板之间的 NCx 与 PCx 的波动状态, 用这样的 NCx PCx 去绘制控制图, 也可以减少因为含有异常值的平均值造成的假失控机率况且, 无论是单值控制图或是均值控制图, 质控数据中是不应当含有异常值数据的 4.ELISA 试验统计控制如何借鉴 PCx 有效性计算与应用, 拟在另文中讨论四. 计算 P-N 与 N-P 差值的意义用途 1. 国际品牌的 EIA 试剂, 很注重观测阳性与阴性 (P-N) 或阴性与阳性 (N-P) 对照均值之间的差值, 以及 P/N( 或 N/P) 比值与 C.O.I. 指数的比较, 并把它视为 : 在评价试剂质量或判断试验结果有效性时是不可或缺的评价指标我用雅培的 EIA 乙肝试剂为例列表如下 ( 见附表 4 1): 附表 4 1 HBsAg(a b d 法 ) 抗 HBsHBeAg 抗 HBe 抗 HBc 抗 HBc-IgM CutoffNCx+0.05NCx+0.05NCx (NCx)+0.5(PCx)0.4(NCx)+0.6(PCx) 0.25(PCx)+NCx P-N 或 N-P = = = = =0.801 P/N( 或 N/P) 与 A/C.O.( 或 C.O./A) 比较 P/N=1.027/0.01=102.7A/C.O.=1.027/0.06= /0.027= /0.077= / /0.095=12.28N/P=1.083/0.040=27.08C.O./A=0.562/0.01= /0.045= /0.045=10.07P/N=0.846/0.045=18.8A/C.O.=0.846/0.257=3.29 例如 :HBsAg 的 P-N 要求 0.400(A B C 法 ), 其它各项试剂要求 >0.400 或 P-N 或 N-P 意义是 : 如果小于或 0.300, 需考虑试验操作有误 ; 如复试后仍小于或 0.300, 则考虑试剂失效同样说法, 用 P/N 或 N/P 比值与 C.O.I. 指数的比较, 也是提供实验者观测实验结果是否有效可否成立的参考水平敬请注意, 国内有的 EIA 试剂配套提供的阳性 (PC) 或阴性 (NC) 对照物含量过高, 达

5 到甚至超过部临检中心临床高值血清的含量此时, 不能参与上述的 N-P 或 P-N 的标准进行评价 2. 可以反过来提问 : 国际品牌试剂说明书就如此可靠可信吗? 我的答复是 : 实际用过国际品牌试剂后, 您就会获得如下感受和观点 : 如此详细的试剂使用说明书, 就相当于一份相当完整的质量保证指导书, 正如 < 生物梅里埃中国有限公司的中文版人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒 ( 酶联免疫法 ) 使用说明书 > 中所郑重声明的 :14 性能特点当按照说明书正确操作结合适当的检测仪器以及相关附件或者生物梅里埃公司的设备时, 生物梅里埃公司保证这个体外诊断试剂正确的实验性能请大家体会一下, 国际品牌试剂竟有如此胆量敢于公开做出如此的书面承诺, 靠的是什么? 就是当前的一句名言 : 靠品牌意识靠 ISO 的质量管理和保证至于说明书中提供的计算举例 ( 附表 4 2), 包括 :NCx=0.091, 清除异常的质控对照, 确定 PC1-NCx PC2-NCx PC3-NCx 0.400, 计算界限值 (Cut off) 等等, 其引用的具体数据, 不是臆造不是写着好看的, 而是参照正常的实验数据举例演算可供用户参考对比的如果您的实验数据与附表 4 2 中举例的数据相差太大太离谱, 它可以提示您多加思考找找原因如果有网友也在用生物梅里埃公司的 HIV 试剂, 不妨用您的实验数据对照一下, 是不是这个情况, 向大家说说 3. 如果再注意说明书上的其它信息, 例如说明书中的表都是很值得细看和推敲的 :/ *; (1)HIV 抗体阳性样品诊断敏感性 : 不仅是 3 个 100%, 而且更要注意它的阳性样本的数量是和 303 份 ( 附表 4 3), 这可是颇为可观的样本数量哦! 如果该公司选用的抗体阳性样本是按照 WHO 的要求预先已经用蛋白印迹法确认为 HIV 1 2 型抗体和抗原阳性血清, 那么, 附表 4 2 敏感性的 3 个 100% 是很有高度指导价值的附表 4 3 抗体阳性样品的诊断敏感性样本数量敏感性 445 份 HIV 1 抗体阳性标本 100% 200 份 HIV 2 抗体阳性标本 100% 303 分 HIV 抗原阳性 100% (2) 再看分析特异性附表 4 4 提示多达 4796 例的献血员标本特异性竟然有 99.9%! 如果是按照 WHO 的要求, 可参考 Bull.WHO.70(6):751-,1992;72(1):129-,1994, 这 4796 例献血员标本事前经过蛋白印迹法确认是 HIV 阴性样本的话, 那么, 附表 4 3 的 3 个 100%, 才是真正的顶级国际水平, 实在令人惊喜再看附表 4 5 列举人血清中对于 ELISA 检测会产生非特异性干扰的 9 种物质 ( 成份 ) 检测全部阴性的结果, 也很有临床参考价值这 2 幅附表提供如此重要的敏感性和特异性的数据信息, 在国产试剂说明书中是难以查悉的五. 阳性与阴性灰带此处所指阳性与阴性灰带率 %, 既是试剂本身的质量评价指标, 也是判断待检样本中是否有需要重复复检的可疑样本范围 (Sample Retest Range), 及各批 / 次试验时可疑样本占有率例如雅培 EIA 乙肝试剂的阳性与阴性灰带 % 要求如下 :HBsAg 定为 0.0%, 意思是 : 不应当有阳性或阴性灰带样本 ; 其余各项目都是 10.0% 这又是一个负责任的对试剂质量标准的公开承诺! 这儿说的灰带, 就是 : 待检样本判为可疑的 S/C.O.=1.00+/-10% 的范围该样本需要复检六. 笔者附注 :. 笔者一点感想 : 我 90 年开始接触 ELISA, 当时详细讲解 ELISA 的书籍并不多随后的数年

6 中, 借助应用过几个品牌进口试剂的机会, 从反复阅读原版试剂说明书中逐渐地悟出了有关 EIA 试剂质量的一些理解与心得这些理解与心得, 从当时的国产试剂说明书上是难以查询获得的我写这一段话, 意思是希望朋友们, 是否找一篇国际上标准的 EIA 试剂使用说明书细细地读一读, 比如生物梅里埃中国有限公司的中文版人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒 ( 酶联免疫法 ) 使用说明书, 并与国产 ELISA 试剂说明书对比着看看, 我想大家一定会有不同的感受本篇文章来源于检验在线原文链接 :

7 分析中质控 ELISA 实验的结果受操作影响很大, 每个步骤包括加样, 温育, 洗涤, 显色, 酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥 ELISA 的高灵敏, 强特异的优点因此, 应建立实验项目的标准操作程序 (SOP) 加样加样应用微量移液器 ( 加样枪 ) 按规定的量加入微孔板的 1/3 处避免加在孔壁上部, 并注意不可溅出, 不可产生气泡每次加样应更换吸嘴, 做到一人一吸头, 以免发生交叉污染 ; 干吸头预先在血清中抽吸三次样本稀释, 目的是为了减少非特异性反应, 所以一定要先加稀释液后加样本, 特别注意加样后要在微量振荡器上振荡 30 秒钟, 同时注意防止液体溢出如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样温育抗原抗体反应需要在一定温度下 (37 C), 经过一定的时间才能达到反应的平衡点 ELISA 边缘效应是由温育形成的所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法一种放在水浴箱的隔板上, 另一种是放在温箱的湿盒里水要浸至板条的 1/3 处, 不可将板条叠加放置边缘效应 (2ng/mlHBsAg 一步法三种不同温育法的结果 ) 洗涤 ELISA 是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的, 同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球细菌中的酶干扰清除掉手工洗涤一般采用浸泡方法 :1) 甩去孔内反应液 ; 2) 用洗涤液过洗一遍 ( 即注满孔后即甩去 ); 3) 微孔重新注满洗液后浸泡 2-3 分钟, 间歇摇动 ; 4) 甩去孔内液体, 拍板, 用纸吸干重复以上操作至少 5 次注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用洗板机洗板一定要预先把板架放平, 使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底, 将孔内液体全部吸干, 同时要设置一定的浸泡时间如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗 2 次以上关机前要用蒸溜水冲洗管道, 避免堵孔显色 HRP 催化底物的一步呈色反应, 同样需要一定的时间和温度, 一定要按照说明书规定的时间温度 ( 一般为 37 C,10-15 分钟 ) 恒定反应后终止或根据临界值质控血清吸光度值达 0.2 左右使的时间而恒定反应时间. 酶标仪判读结果显色反应终止后应立刻比色 (30 分钟内 ) 常见的显色系统有 OPD 和 TMB 二种, 以后者最为常见, 而 TMB 酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果 OPD 终止后显棕色, 测定波长为 490nm; TMB 终止后显黄色, 测定波长为 450nm, 二种底物的校正波长均用 630nm 使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色, 否则吸光度易出现负值或损坏滤光片

8 报告方式定性试验国内外为便于统一计算, 一律按 S/C.O 方式报告,S 为标本 A 值,C.O 即 CutOff 值 ( 阳性判定值 ) 夹心法和间接法以 S/C.O 1 为阳性 ; 竟争法与中和法以 S/C.O<1 为阳性 CutOff 的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有 : A) C.O=2.1 N( 当 N 不足 0.05 时按 0.05 计 ), 此公式由 P/N>2.1 换算而来, 常用于夹心法 B)C.O=0.5 N, 从抑止率公式换算而来, 常用于竟争, 中和法 C)C.O=N+C(C 为常数 ), 用于间接法 D) C.O=C P+N(C 为常数 ), 用于间接法此公式最客观, 但对生产厂家要求很高, 阴阳性对照测定值要基本恒定

9 引起测定错误结果的原因主要有 : 标本因素 ; 试剂因素 ; 操作因素下面就一些常见操作过程中的问题一一分析 1. 样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应, 如果血清不稀释, 不可避免会产生很强的非特异性反应, 出现假阳性因此, 国外检测血清抗体的试剂盒, 均规定将血清稀释至适当的倍数, 以降低非特异性反应, 使特异性的抗原抗体反应充分体现出来一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定, 以保证试验的灵敏度和特异性但是, 有些用户未能严格按使用说明书操作, 如某些产品应取样品进行稀释, 个别用户取甚至样品进行稀释, 由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够, 因此造成样品稀释倍数不准确, 检测结果出现问题 2 试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温 ( 约 25 ), 一般需在室温放置 20~30 分钟以上平衡时间太短会造成试剂混匀不够, 样品孵育时间相对缩短, 反应不够充分冬季室温低, 可将试剂盒置 37 温箱 20 分钟 3 样品和试剂的混匀稀释前后的样品必须充分混匀, 所有试剂在加样前也须摇匀, 以保证试验的均一性 4 加样在现在的商品试剂盒中, 必然有使用微量加样器加入样本的步骤注意的关键点是 : 加样不可太快, 要避免加在孔壁上部, 不可溅出和产生气泡加样太快, 无法保证微量加样的准确性和均一性加在孔壁上部的非包被区, 易导致非特异吸附溅出会对邻近孔产生污染出现气泡则反应液界面有差异所以, 有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性, 下次测定为阴性, 往往就是上述加样及试剂的错误所致

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人