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1 行 政 院 國 家 科 學 委 員 會 補 助 專 題 研 究 計 畫 成 果 報 告 大 鼠 心 臟 迷 走 節 前 神 經 元 活 性 的 延 腦 調 控 機 轉 之 探 討 Study on the medullary control mechanism of cardiac vagal preganglionic neuronal activity in rats 計 畫 類 別 : 個 別 型 計 畫 計 畫 編 號 :NSC B 執 行 期 間 :90 年 8 月 1 日 至 91 年 10 月 31 日 計 畫 主 持 人 : 陳 瑞 芬 執 行 單 位 : 國 立 臺 灣 大 學 動 物 學 系 中 華 民 國 92 年 1 月 30 日

2 行 政 院 國 家 科 學 委 員 會 專 題 研 究 計 畫 成 果 報 告 大 鼠 心 臟 迷 走 節 前 神 經 元 活 性 的 延 腦 調 控 機 轉 之 探 討 Study on the medullary control mechanism of cardiac vagal preganglionic neuronal activity in rats 計 畫 編 號 :NSC B 執 行 期 限 :90 年 8 月 1 日 至 91 年 10 月 31 日 主 持 人 : 陳 瑞 芬 國 立 臺 灣 大 學 動 物 學 系 計 畫 參 與 人 員 : 蕭 富 仁 嚴 震 東 慈 濟 大 學 神 研 所 國 立 臺 灣 大 學 動 物 學 系 一 中 文 摘 要 本 計 劃 以 雄 性 Wistar 大 鼠 為 實 驗 動 物, 採 用 正 向 及 逆 向 神 經 路 徑 追 蹤 技 術 (anterograde and retrograde tract-tracing methods), 來 探 討 延 腦 的 孤 獨 核 (nucleus tractus solitarius, NTS) 與 心 臟 迷 走 節 前 神 經 元 之 間 是 否 有 直 接 之 連 結 ; 並 以 電 生 理 記 錄 法 在 疑 核 區 (nucleus ambiguus, NA) 搜 尋 心 臟 迷 走 神 經 元, 分 析 其 電 生 理 特 性 解 剖 的 實 驗 中, 以 雙 管 玻 璃 微 電 極 在 大 鼠 延 腦 閂 門 (obex) 附 近 的 外 側 NTS, 以 微 量 注 射 麩 胺 酸 (L-glutamate, 10 mm, 5-10 nl) 的 方 式 進 行 化 學 性 刺 激, 找 到 明 顯 血 壓 下 降 的 反 應 點 後, 再 將 另 一 玻 璃 管 中 的 正 向 追 蹤 劑 10% biotin-conjugated dextran (BD, 15 nl) 注 入 此 反 應 點 經 過 7 天 的 存 活 期 後, 將 逆 向 追 蹤 劑 2.5% WGA- HRP(Sigma,10 l) 注 入 同 一 隻 大 鼠 之 心 臟 再 經 過 小 時 之 存 活 期 後, 將 動 物 灌 流 固 定, 取 出 腦 幹 及 上 段 頸 髓, 進 行 冷 凍 切 片 (50 m), 以 組 織 化 學 反 應 將 BD 與 WGA-HRP 分 別 呈 色 結 果 顯 示 在 延 腦 兩 側 NA 區 發 現 許 多 來 自 NTS 的 BD 標 定 神 經 纖 維 之 分 布, 在 NA 中 的 HRP 標 定 心 臟 迷 走 節 前 神 經 細 胞 上 亦 可 見 BD 標 定 之 神 經 末 梢 及 終 鈕 電 生 理 實 驗 中, 則 以 自 行 研 發 能 同 時 注 射 藥 物 和 記 錄 神 經 元 活 性 之 電 極, 進 行 大 鼠 延 腦 NA 區 神 經 元 活 性 之 記 錄 與 特 性 分 析, 以 及 抑 心 作 用 之 評 估 結 果 顯 示 可 在 閂 門 附 近 NA 腹 外 側 區 中, 記 錄 到 能 在 呼 氣 時 放 電 具 心 週 期 節 律 之 迷 走 抑 心 神 經 元 活 性, 此 神 經 元 活 性 能 被 血 壓 上 升 所 激 發 或 增 加 ; 少 量 麩 胺 酸 (~50 pmol) 刺 激 即 能 引 發 強 烈 抑 心 作 用 (-63 4%) 本 研 究 顯 示 NTS 之 神 經 元 可 能 藉 由 直 接 投 射 至 NA 區 之 心 臟 迷 走 節 前 神 經 元 而 調 控 抑 心 之 功 能 關 鍵 詞 : 心 臟 迷 走 節 前 神 經 元, 大 鼠 延 腦 疑 核 孤 獨 核 BD HRP 麩 胺 酸 medullary neural connection and electrophysiological characteristics of the cardiac vagal preganglionic neurons in male Wistar rats. In the anatomical experiment, we examine the projections of nucleus tractus solitarius (NTS) to the cardioinhibitory vagal neurons in the nucleus ambiguus (NA) by anterograde and retrograde tract-tracing methods. Two-barrel glass micropipettes were constructed. Biotin-conjugated dextran (BD, Molecular Probes, 10%, nl) was injected into the NTS, where profound depressor response was induced by microinjection of glutamate solution (Glu, 10 mm, 5-10 nl). Seven days later, WGA-HRP (Sigma, 2.5%, 10 l) was injected into the heart. After hours survival, the animal was reanesthetized, perfused and fixed. The brainstem was sectioned and processed with immunohistochemistry. We found many BD labeled fiber terminals, which projected from NTS, in cardioinhibitory region of NA, bilaterally. We also observed that BD-labeled fiber terminals and buttons on HRP-labelled NA neurons. In the electrophysiological experiment, we recorded the activity of the cardiac vagal neuron in the NA by using our recent invention of a recording /injection microelectrode. We found that the cardiac vagal neuron displayed cardiac cycle related rhythm, discharged during the expiratory period, and increased their activity after i.v. injection of phenylephrine despite their low spontaneous activity. Profound bradycardia (-63 4%) was elicited with picomoles of Glu (~50 pmol). The data suggested that the NTS may play an important role in controlling the cardioinhibitory function by direct projecting to the cardiac vagal preganglionic neurons in NA. Keywords: cardiac vagal preganglionic neuron, rat, medulla, nucleus ambiguus, BD, HRP, glutamate. Abstract In the present study, we investigate the 1

3 二 緣 由 與 目 的 心 臟 的 機 能 在 多 種 自 主 神 經 調 控 機 轉 的 控 制 之 下, 維 持 在 相 當 穩 定 平 衡 的 狀 態, 其 中 又 以 感 壓 心 跳 反 射 (baroreceptor heart-rate reflex) 為 最 重 要 的 調 節 機 轉 感 壓 接 受 器 (baroreceptor) 的 傳 入 纖 維 將 訊 息 傳 入 延 腦 的 孤 獨 核 區 (nucleus tractus solitarius, NTS) 之 後, 經 由 延 腦 神 經 網 路 的 整 合, 調 節 交 感 和 副 交 感 神 經 的 活 性 來 控 制 心 跳 的 機 能 [1, 11] 一 般 相 信 感 壓 反 射 所 引 起 的 心 搏 徐 緩 (bradycardia) 現 象, 主 要 是 由 於 心 臟 迷 走 神 經 活 性 的 增 加 所 引 起 [5, 6], 可 能 是 由 NTS 將 訊 息 傳 至 延 腦 的 疑 核 區 (Nucleus ambiguus, NA) [1, 3, 13], 直 接 控 制 心 臟 迷 走 神 經 元 的 活 性 本 研 究 將 對 感 壓 心 跳 反 射 所 引 起 的 迷 走 性 bradycardia 究 竟 是 由 NTS 直 接 興 奮 NA 中 的 心 臟 迷 走 神 經 元, 還 是 間 接 經 由 RVLM 對 NA 的 影 響 而 來, 作 進 一 步 的 研 究 探 討 因 此 針 對 大 鼠 延 腦 心 臟 迷 走 神 經 元, 進 行 神 經 元 活 性 的 電 生 理 記 錄 與 特 性 之 分 析, 並 採 用 正 向 及 逆 向 神 經 路 徑 追 蹤 技 術 (anterograde and retrograde tract-tracing methods), 由 解 剖 方 面 來 探 討 其 中 樞 神 經 網 路 之 連 結, 以 增 加 對 調 控 心 臟 機 能 的 迷 走 神 經 機 制 結 構 與 功 能 之 瞭 解 三 結 果 與 討 論 A 正 向 及 逆 向 追 蹤 實 驗 將 雄 性 Wistar 大 鼠 以 sodium pentobarbital (50 mg/kg) 麻 醉 後, 做 股 動 靜 脈 插 管, 以 監 測 動 脈 血 壓 及 心 跳 速 率, 股 靜 脈 插 管 則 供 必 要 時 注 射 麻 醉 藥 及 補 充 體 液 之 用 ; 經 由 橫 膈 肌 電 圖 記 錄 呼 吸 ; 以 自 動 調 溫 的 恆 溫 電 毯 維 持 體 溫 將 大 鼠 頭 部 固 定 於 立 體 定 位 儀 上, 露 出 延 腦, 以 延 腦 背 面 的 閂 區 (obex) 做 為 電 極 前 後 左 右 上 下 移 動 的 參 考 點 首 先 以 雙 管 玻 璃 微 電 極 在 大 鼠 的 尾 端 側 NTS 區 域 內 ( 閂 區 前 後 0.5 mm 中 線 側 面 mm 距 延 腦 表 面 約 0.3 mm), 以 微 量 注 射 麩 胺 酸 (L-glutamate, 10 mm, 5-10 nl) 的 方 式 進 行 化 學 性 刺 激 [4], 找 到 降 壓 反 應 點 後 ( 圖 一 ), 以 壓 力 注 射 方 式 將 10% Biotin-conjugated dextran ( BD, Molecular Probes, Eugene, OR)[2] 微 量 (15-30 nl) 注 入 此 降 壓 點 中, 以 正 向 追 蹤 NTS 神 經 元 在 NA 中 的 投 射 動 物 存 活 7 天 後, 再 將 WGA-HRP (Sigma, 2.5%) 注 入 心 臟, 以 逆 向 追 蹤 心 臟 迷 走 神 經 元 在 NA 中 的 位 置 經 過 小 時 存 活 期 後, 將 動 物 再 次 麻 醉, 進 行 灌 流 固 定, 取 出 鼠 腦 及 上 段 頸 髓, 進 行 冷 凍 切 片 (50 m) 及 組 織 化 學 反 應 先 以 TMB-AHM method 將 WGA-HRP 呈 色 [9], 再 以 DAB 穩 定 之, 反 應 產 物 將 呈 現 黃 棕 色 ; 接 著 再 進 行 BD 之 呈 色 反 應, 先 形 成 HRP-avidin-biotin complex (Vector labs, A2004), 再 進 行 Nickel-Cobalt DAB 反 應, 反 應 物 將 呈 現 黑 色 將 此 雙 重 染 色 之 切 片 置 於 顯 微 鏡 下 分 析 結 果 顯 示 在 延 腦 兩 側 NA 區, 發 現 許 多 來 自 NTS 的 BD 標 定 神 經 纖 維 之 分 布 在 NA 中 的 HRP 標 定 心 臟 迷 走 節 前 神 經 細 胞 上, 亦 可 見 BD 標 定 之 神 經 末 梢 及 終 鈕 ( 圖 二 ) 圖 一 微 量 注 射 麩 胺 酸 (10 mm, 7.5 nl) 至 大 鼠 延 腦 尾 端 NTS 區 所 引 起 之 降 壓 反 應 圖 二 NA 區 的 顯 微 相 片, 顯 示 在 圖 一 大 鼠 的 NTS 降 壓 點 注 入 BD(15%, 15 nl) 後, 可 在 NA 中 黃 色 的 HRP 標 定 細 胞 上, 發 現 BD 標 定 神 經 末 梢 及 終 鈕 ( 綠 色 箭 號 ) 刻 度 尺 為 50 m B 電 生 理 實 驗 大 鼠 以 -chloralose(60 mg/kg) 及 urethane 2

4 (450 mg/kg) 混 合 液 經 腹 腔 注 射 麻 醉 後, 自 頸 部 做 氣 管 插 管, 以 自 動 調 溫 的 恆 溫 電 毯 維 持 體 溫 於 37±0.5 一 側 之 股 動 靜 脈 分 別 插 管, 以 監 測 動 脈 血 壓 及 心 跳 速 率, 和 注 射 藥 物 及 補 充 液 體 之 用 記 錄 橫 膈 肌 電 圖, 以 監 測 動 物 的 吸 氣 期 呼 氣 期 以 及 呼 吸 頻 率 將 大 鼠 頭 部 固 定 於 立 體 定 位 儀 上, 露 出 延 腦 背 側 表 面, 以 自 行 研 發 的 能 同 時 注 射 藥 物 和 記 錄 神 經 元 活 性 之 電 極 [10, 12 ], 進 行 大 鼠 延 腦 NA 區 心 臟 迷 走 神 經 元 活 性 之 記 錄 與 特 性 分 析, 以 及 抑 心 作 用 之 評 估 結 果 顯 示 可 在 大 鼠 閂 門 附 近 之 NA 腹 外 側 區 中, 記 錄 到 能 在 呼 氣 時 放 電 具 心 週 期 節 律 之 迷 走 抑 心 神 經 元 活 性, 此 神 經 元 活 性 能 被 血 壓 上 升 所 激 發 或 增 加 ; 少 量 麩 胺 酸 (~50 pmol) 刺 激 即 能 引 發 強 烈 抑 心 作 用 (-63 4%) ( 圖 四 ) 上 述 劑 量 遠 小 於 許 多 先 前 文 獻 所 報 導 之 劑 量 [7, 8] 本 研 究 顯 示 NTS 之 神 經 元 可 能 藉 由 直 接 投 射 至 NA 區 之 心 臟 迷 走 節 前 神 經 元 而 調 控 抑 心 之 功 能 圖 三 NA 區 所 記 錄 之 心 臟 神 經 元 活 性 之 perievent histogram, 此 unit 具 cardiac rhythm EKG: 心 電 圖 ;BP: 血 壓 圖 四 圖 三 中 同 一 unit 之 放 電, 可 被 靜 脈 注 射 phenylephrine (PE, 10 g/kg) 所 引 起 的 血 壓 上 升 大 量 激 發 HR: 心 跳 速 率 ;BP: 血 壓 3

5 五 計 畫 成 果 自 評 本 計 劃 採 用 神 經 路 徑 追 蹤 技 術 及 電 生 理 記 錄 法, 來 探 討 大 鼠 心 臟 迷 走 節 前 神 經 元 的 中 樞 網 路 連 結 以 及 電 生 理 特 性 雖 成 功 證 明 延 腦 NTS 的 確 有 神 經 纖 維 直 接 投 射 至 NA 抑 心 區 中 的 心 臟 迷 走 神 經 元, 也 進 行 大 鼠 延 腦 NA 區 心 臟 迷 走 神 經 元 活 性 之 記 錄 與 特 性 分 析, 以 及 抑 心 作 用 之 評 估 但 尚 須 進 一 步 的 以 電 顯 來 觀 察 NTS 神 經 元 與 心 臟 迷 走 神 經 節 前 神 經 元 間 是 否 有 突 觸 直 接 連 結 也 必 須 進 行 興 奮 NTS 核 區, 觀 察 是 否 能 影 響 NA 抑 心 區 中 心 臟 迷 走 神 經 元 的 活 性, 以 證 明 功 能 上 之 相 關 此 外 將 針 對 NTS RVLM 及 NA 等 腦 核, 進 行 multi-site 刺 激 和 記 錄, 觀 察 各 腦 核 與 疑 核 處 之 神 經 元 活 性, 分 析 三 者 在 感 壓 反 射 操 作 時 功 能 上 之 相 關 性 六 參 考 資 料 [1] Averil, D. B. (2000) Neurochemical and peptidergic pathways of the baroreflex arch in the medulla oblongata: an introduction. Brain Res. Bull. 51: [2] Brandt, H. M. and A. V. Apkarian (1992) Biotin-dextran: a sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. J Neurosci. Methods 45: [3] Dampney, R. A. L. (1994) Functional organization of central pathways regulating the cardiovascular system. Physiol. Rev. 74: [4] Goodchild, A.K., Dampney, R.A.L. and Bandler, R. A. (1982 ) Method for evoking physiological responses by stimulation of cell bodies, but not axons of passage, within localized regions of the central nervous system. J. Neurosci. Methods 6: [5] Levy, M. N. and M. R. Warner (1994) Parasympathetic effects on cardiac function. In: Neurocardiology edited by J.A. Armour and J.L. Ardell, New York:Oxford Univ. Press, pp [6] Loewy, A. D. and K. M. Spyer (1990) Vagal preganglionic Neurons. In: Loewy, A. D., Spyer, K. M., eds. Central regulation of autonomic function. New York: Oxford Univ. Press, pp [7] Machado, B. H. and M. J. Brody (1990) Mechanisms of pressor response produced by stimulation of nucleus ambiguus. Am. J. Physiol. 259:R955-R962. [8] McKitrick, D.J. and Calaresu, F.R. (1996) Nucleus ambiguus inhibits activity of cardiovascular units in RVLM. Brain Res. 742: [9] Olucha, F., F. Martinez-Garcia and C. Lopez-Garcia (1985) A new stabilizing agent for the TMB reaction product in the histochemical detection of horseradish peroxidase. J Neurosci. Methods. 13: [10] Shaw, F. - Z., and R. - F. Chen (2001) A simple method for constructing the recording- injection microelectrode. Acta Zoologica Taiwanica 12(1): [11] Taylor, E. W., Jordan, D. & Coote, J. H. (1999) Central control of the cardiovascular and respiratory systems and their interactions in vertebrates. Physiological Reviews 79, pp [12] Tsai M. L., C. Y. Chai and C. - T. Yen (1997) A simple method for the construction of a recording-injection microelectrode with glass-insulated microwire. J. Neurosci. Meth. 72: 1-4. [13] Wang, J., M. Irnaten, R. A. Neff, P. Venkatesan, C. Evans, A. D. Loewy, T. C. Mettenleiter and D. Mendelowitz (2001) Synaptic and neurotransmitter activation of cardiac vagal neurons in the nucleus ambiguus. Annals of the New York Academy of sciences 940:

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