2 上 样 前 处 理 将 标 准 品 溶 液 或 经 过 尿 素 酶 处 理 的 尿 液 样 本, 加 入 内 标 十 七 烷 酸 (200ppm) 及 无 水 乙 醇 1000µL, 充 分 混 匀, 13000rpm 高 速 离 心 5min, 将 上 清 液 移 入 色 谱 进 样 瓶, 高
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- 矩巍 韶
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1 气 相 色 谱 质 谱 法 进 行 小 儿 遗 传 代 谢 病 的 快 速 筛 查 1 2 张 万 巧 吕 建 霞 余 2 天 1 北 京 军 区 总 院 2 赛 默 飞 世 尔 科 技 ( 中 国 ) Application Notes_C_GCMS-44 关 键 词 单 四 级 杆 质 谱 仪 ; 尿 液 ;TG-5MS 色 谱 柱 目 标 建 立 高 效 的 气 相 色 谱 质 谱 筛 查 方 法, 灵 敏 快 速 筛 查 小 儿 遗 传 代 谢 病 尿 液 样 品 经 前 处 理 衍 生 后, 用 气 相 色 谱 质 谱 联 用 仪 检 测, 同 时 对 上 百 种 遗 传 代 谢 病 进 行 筛 查 引 言 婴 幼 儿 遗 传 性 代 谢 病 种 类 繁 多, 临 床 表 现 常 常 是 非 特 异 性 的, 且 多 无 明 显 的 神 经 系 统 定 位 体 征, 只 凭 临 床 表 现 往 往 很 难 诊 断 医 学 检 测 技 术 的 不 断 完 善 及 提 高, 对 婴 幼 儿 遗 传 性 代 谢 疾 病 的 研 究 产 生 了 很 大 的 推 动 作 用 气 相 色 谱 - 质 谱 (GC-MS) 检 测 技 术 作 为 化 学 诊 断 方 法, 首 先 由 K-Tanaka 于 1966 年 应 用 于 代 谢 性 疾 病 的 诊 断, 从 1992 年 起 该 方 法 经 过 多 次 改 进, 目 前 用 此 方 法 同 时 筛 查 氨 基 酸 有 机 酸 糖 代 谢 异 常 及 脂 肪 代 谢 紊 乱 等 一 百 多 种 疾 病 本 文 采 用 赛 默 飞 世 尔 科 技 气 质 联 用 仪 建 立 了 婴 幼 儿 遗 传 代 谢 病 的 快 速 筛 查 方 法, 方 法 准 确, 敏 感 性 高, 特 异 性 强, 是 筛 查 遗 传 性 代 谢 疾 病 的 有 效 手 段 仪 器 Thermo Scientific TM ISQ 单 四 极 杆 气 质 联 用 仪, 包 括 : -TRACE 1310 气 相 色 谱, 配 分 流 不 分 流 进 样 口 -ISQ LT 单 四 极 杆 质 谱 - AS1310 自 动 进 样 器 Thermo Scientific TM TraceFinder 3.1 数 据 处 理 系 统 恒 温 干 燥 箱 离 心 机 天 平 漩 涡 混 合 器 氮 吹 仪 (Thermo Scientific) 耗 材 色 谱 柱 :TG-5MS(30 m 0.25 mm 0.25 μm) (Thermo Scientific, PN ) (Thermo Scientific) 试 剂 与 标 准 品 乙 醇 : 色 谱 纯 (Thermofisher); 衍 生 试 剂 BSTFA+TMCS(99 : 1) 尿 素 酶 十 七 烷 酸 样 品 前 处 理 标 本 收 集 : 采 用 干 燥 洁 净 的 容 器 采 集 研 究 对 象 的 新 鲜 尿 液, 本 院 样 本 直 接 分 装 到 EP 管,-20 保 存 ; 外 院 样 本 在 浸 透 尿 液 收 集 专 用 滤 纸 片 后, 于 干 燥 避 光 处 阴 干, 密 封 后 邮 递 ( 耗 时 3-5 天 ), 寄 到 实 验 室 后 -20 保 存 尿 素 酶 预 处 理 : 取 100µL 尿 液 或 尿 滤 纸 片 提 取 液, 加 入 30µL 尿 素 酶,37 孵 育 30min
2 2 上 样 前 处 理 将 标 准 品 溶 液 或 经 过 尿 素 酶 处 理 的 尿 液 样 本, 加 入 内 标 十 七 烷 酸 (200ppm) 及 无 水 乙 醇 1000µL, 充 分 混 匀, 13000rpm 高 速 离 心 5min, 将 上 清 液 移 入 色 谱 进 样 瓶, 高 纯 氮 气 吹 干, 残 余 物 加 入 100µL BSTFA+TMCS(99 : 1),90 孵 育 40 min, 进 行 三 甲 基 硅 烷 化 衍 生 化 处 理 待 GC-MS 分 析 实 验 条 件 色 谱 柱 :TG-5MS(30 m 0.25 mm 0.25 μm); 柱 温 :60 (2 min),10 /min 到 220 (3 min), 15 /min 到 325 (5 min); 进 样 模 式 : 不 分 流 进 样, 不 分 流 时 间 :1min, 进 样 量 :1 µl; 进 样 口 温 度 :250 ; 载 气 : 高 纯 氦 气 (99.999%), 恒 流 模 式,1.0 ml/min; 离 子 源 温 度 :280, 传 输 线 温 度 :300, 全 扫 描 模 式 检 测, 扫 描 范 围 结 果 与 讨 论 按 上 述 条 件 对 尿 液 样 品 进 行 前 处 理 和 气 质 联 用 仪 分 析, 检 测 的 化 合 物 见 表 1 以 各 化 合 物 的 峰 面 积 与 肌 酐 的 峰 面 积 比 值 为 判 断 依 据, 超 出 正 常 值 则 视 为 异 常 表 1. 检 测 的 所 有 化 合 物 的 名 称 保 留 时 间 AIB Lactate Glycolate Pyruvate Ala Gly HB HMB Oxlate Sarcosine HP VPA HB HIB HIV M3HB-21A M3HB-21B AA HIV AIB Val MMA E3HP HIC H3MV HV HB AA Urea-32
3 Ser Glycerol Leu C Phosphate EMA isoleu Thr Pro Gly PA Succinate Glycerate Uracil DT Ser Fumarate Thr H-VPA IVG PG Thymine DT Glutarate oxo-VPA DT PG MG Glutaconate Asp AMA Homoserine Mandelate Malate Erythritol DHT DHU Adipate Hpro Met Erythronate1-108
4 PyroGlu Erythronate propylglutaric-vpa Cr Phe HG KG HG HPA PEA PLA MCG TG H3MG HPPA Orn Asparagine Glu Phe Tyramine Succinylacetone HPA NacetylASP Homocysteine imidazolacetate HMuracil Ketoadipate Arabitol Lys Suberate PPA Aadipate HPPA Orotate Xylose Gln HVA Galactose Azelate Citrate Me-Citrate-177
5 Hypoxthanine Homogentisate Hydroxylysine HP3HP C Glucose Hippurate VMA Galactose VitB Mannitol HPL Sebacate Tyr Sorbitol Galactitol His VitC Cystathionine Glucose Galactonate Gluconate Xanthine HPP Hsebacate C Myo-Inositol Urate Kynurate Cit N-AcetyTyr IS(HAD) IndoleLA Trp Oleate HIAA Hhippurate C Xanthurenic_acid Glucuronic_acid Cys-225
6 IndoleLA Trp Oleate 编 号 保 留 时 间 5-HIAA-252 化 合 物 Hhippurate-223 Pseudouridine C Glucuronide-VPA Xanthurenic_acid Glucuronic_acid-287 Carbamazepine Saccharopine-275 Cys Pseudouridine Biotin Glucuronide-VPA Carbamazepine-291 Homocystine Saccharopine-275 Inosine Biotin Sucrose Homocystine deoxyguanosine-283 Inosine Sucrose-240 Lactose deoxyguanosine-283 Guanosine Lactose Cholesterol-290 Guanosine Cholesterol-290 利 用 气 相 色 谱 - 质 谱 法 对 遗 传 性 代 谢 病 (IMD) 高 危 儿 进 行 尿 液 化 学 分 析, 结 果 411 利 用 气 相 色 谱 - 质 谱 法 对 遗 传 性 代 谢 病 (IMD) 高 危 儿 进 脂 肪 酸 代 谢 异 常 4 例,Citrin 缺 陷 症 络 氨 酸 血 症 半 乳 例 IMD 高 危 儿 中 检 测 出 代 谢 异 常 269 例 (65.5%), 其 中 确 诊 IMD19 例 (4.6%), 包 括 行 尿 液 化 学 分 析, 结 果 411 IMD 高 危 儿 中 检 测 出 代 谢 糖 血 症 3- 甲 基 巴 豆 酰 辅 酶 A 羧 化 酶 缺 乏 症 枫 糖 尿 症 甲 基 丙 二 酸 血 症 15 例 ; 丙 酸 血 症 高 苯 丙 氨 酸 血 症 尿 素 循 环 异 常 和 焦 谷 氨 酸 尿 症 各 异 常 269 例 (65.5%), 其 中 确 诊 IMD19 例 (4.6%), 包 各 1 例 ; 其 他 代 谢 异 常 228 例 (55.5%), 表 现 为 尿 乳 酸 1 例 ; 疑 似 IMD22 例 (5.4%), 包 括 乳 酸 血 症 13 例, 原 发 性 甘 油 尿 症 5 例, 脂 肪 酸 代 括 甲 基 丙 二 酸 血 症 15 例 ; 丙 酸 血 高 苯 丙 氨 酸 血 症 蔗 糖 乳 糖 半 乳 糖 N- 乙 酰 络 氨 酸 琥 珀 酸 双 羧 酸 谢 异 常 4 例,Citrin 缺 陷 症 络 氨 酸 血 症 半 乳 糖 血 症 3- 甲 基 巴 豆 酰 辅 酶 A 羧 化 酶 缺 尿 素 循 环 异 常 和 焦 谷 氨 酸 尿 症 各 1 例 ; 疑 似 IMD22 水 平 增 高 以 及 丝 氨 酸 / 苏 氨 酸 比 例 异 常 等 乏 症 枫 糖 尿 症 各 1 例 ; 其 他 代 谢 异 常 228 例 (55.5%), 表 现 为 尿 乳 酸 蔗 糖 乳 糖 (5.4%), 包 括 乳 酸 血 症 13 例, 原 发 性 甘 油 尿 症 5 例, 半 乳 糖 N- 乙 酰 络 氨 酸 琥 珀 酸 双 羧 酸 水 平 增 图 高 1 以 为 及 实 丝 际 样 氨 品 酸 的 / 苏 检 氨 测 酸 全 扫 比 描 例 的 异 总 常 离 等 子 流 图 图 1 为 实 际 样 品 的 检 测 全 扫 描 的 总 离 子 流 图 RT: Relative Abundance Time (min) NL: 1.36E8 TIC MS U RT: NL: 4.29E8 TIC MS U Relative Abundance Time (min) 图 1. 尿 液 检 测 结 果 总 离 子 流 图 ( 上 图 为 正 常 情 况 的 尿 液, 下 图 为 甲 基 丙 二 酸 (9.28min) 血 症 患 儿 尿 液 的 检 测 谱 图 )
7 图 1 尿 液 检 测 结 果 总 离 子 流 图 ( 上 图 为 正 常 情 况 的 尿 液, 下 图 为 甲 基 丙 二 酸 (9.28min) 血 Tracefinder 软 件 可 以 方 便 的 给 出 目 标 物 与 肌 酐 的 峰 面 积 和 定 性 离 子 的 提 取 离 子 谱 图 分 别 列 出, 离 子 丰 度 比 也 都 症 患 儿 尿 液 的 检 测 谱 图 ) 比 值, 如 图 2 所 示 图 每 1 Tracefinder 个 尿 液 化 检 合 测 物 结 软 果 与 件 总 肌 可 离 以 酐 子 方 的 流 便 图 峰 的 ( 面 给 上 出 积 图 目 为 比 标 正 值 物 常 与 情 肌 况 显 酐 的 示 尿 峰 在 液 面, 图 积 下 上 比 图 值 为, 样 甲 如 基 品 图 丙 中 2 二 所 目 酸 示 标 (9.28min) 物 每 个 的 化 全 合 扫 血 物 描 谱 图 与 参 考 物 的 全 与 肌 酐 的 峰 面 积 比 值 (response ratio) 症 患 儿 列 尿 在 液 计 的 算 检 结 测 果 谱 中 图 ) 该 软 件 还 可 以 同 时 对 化 合 物 进 行 定 (response ratio) 列 在 计 算 结 果 中 该 软 件 还 可 以 同 时 对 扫 描 谱 图 对 比 显 示 在 右 下 方, 可 帮 助 我 们 对 目 标 物 进 一 性 确 Tracefinder 认, 如 图 3 所 软 示 件, 可 目 以 标 方 物 便 的 定 给 量 出 离 目 子 标 和 物 定 与 性 肌 离 酐 子 的 的 峰 提 面 取 积 离 比 子 值 谱, 图 如 分 图 别 2 列 所 出 示, 每 离 个 子 化 丰 合 度 物 比 化 合 物 进 行 定 性 确 认 也 与, 都 肌 如 显 酐 图 示 的 在 峰 3 图 面 所 上 积 示 比 样, 值 品 (response 目 中 标 目 物 标 物 的 ratio) 的 定 全 量 扫 离 列 描 在 谱 子 计 图 算 与 结 步 参 果 考 定 中 物 性 的 确 该 全 软 认 扫 件 描 还 谱 可 图 以 对 同 比 时 显 对 示 化 在 合 右 物 下 进 方 行, 可 定 帮 性 助 确 我 认 们, 如 对 图 目 标 3 所 物 示 进, 一 目 步 标 定 物 性 的 确 定 认 量 离 子 和 定 性 离 子 的 提 取 离 子 谱 图 分 别 列 出, 离 子 丰 度 比 也 都 显 示 在 图 上 样 品 中 目 标 物 的 全 扫 描 谱 图 与 参 考 物 的 全 扫 描 谱 图 对 比 显 示 在 右 下 方, 可 帮 助 我 们 对 目 标 物 进 一 步 定 性 确 认 Application Notes_C_GCMS-44 图 2 Tracefinder 软 件 计 算 结 果 2. Tracefinder 图 2 Tracefinder 软 件 计 算 结 果 浏 览 Lactate-4 定 量 离 子 定 量 离 子 浏 览 Lactate-4 定 性 离 子 及 比 值 定 性 离 子 及 比 值 样 品 U 图 谱 样 品 U 图 谱 标 准 图 谱 标 准 图 谱 图 3 Tracefinder 软 件 定 性 结 果 浏 览 结 论 图 3 Tracefinder 软 件 定 性 结 果 浏 览 3. Tracefinder 览 利 用 赛 默 飞 世 尔 科 技 全 新 一 代 气 相 色 谱 质 谱 联 用 仪 进 行 小 儿 遗 传 代 谢 病 的 筛 查 完 全 可 行 结 论 尿 液 经 尿 素 酶 处 理 后, 衍 生 用 气 质 联 用 仪 分 析,Tracefinder 软 件 可 以 直 接 给 出 需 要 的 比 结 论 利 用 赛 默 飞 世 尔 科 技 全 新 一 代 气 相 色 谱 质 谱 参 联 考 用 文 仪 献 进 行 小 儿 遗 传 代 谢 病 的 筛 查 完 全 可 利 用 赛 默 飞 世 尔 科 技 行 全 新 尿 液 一 经 代 尿 气 素 相 酶 色 处 理 谱 后 质, 谱 衍 生 联 用 气 仪 质 进 联 行 用 仪 分 析,Tracefinder 软 件 可 以 直 接 给 出 需 要 的 比 [1] 彭 薇, 张 万 巧, 封 志 纯. 气 相 色 谱 - 质 谱 法 检 测 遗 传 代 小 儿 遗 传 代 谢 病 的 筛 查 完 全 可 行 尿 液 经 尿 素 酶 处 理 后, 谢 性 疾 病 高 危 患 儿. 临 床 儿 科 杂 志 2014 (09) 衍 生 用 气 质 联 用 仪 分 析,Tracefinder 软 件 可 以 直 接 给 出 需 要 的 比 值 结 果, 操 作 简 单 方 便 该 方 法 用 于 411 例 IMD 高 危 儿 尿 液 筛 查, 筛 查 结 果 检 测 出 代 谢 异 常 269 例 该 方 法 准 确, 敏 感 性 高, 特 异 性 强, 是 筛 查 遗 传 性 代 谢 疾 病 的 有 效 手 段 赛 默 飞 世 尔 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司 免 费 服 务 热 线 : ( 支 持 手 机 用 户 ) AN_C_GCMS-44
(2015-2016-2)-0004186-04205-1 140242 信 号 与 系 统 Ⅰ 学 科 基 础 必 修 课 37 37 1 教 203 17 周 2016 年 06 月 13 日 (08:00-09:35) (2015-2016-2)-0004186-04205-1 141011
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