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糊居
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1 嘌呤核苷磷酸化酶不同表达方式对发酵利巴韦林的影响刘莉, 李燕军, 谢希贤, 陈宁 ( 天津科技大学生物工程学院, 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室, 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室, 天津 ) 摘要 : 嘌呤核苷磷酸化酶 (PNPase, 由 pupg 基因编码 ) 是合成利巴韦林的关键酶, 本研究考察该酶的质粒过表达和基因组整合表达对鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)ta208 发酵生产利巴韦林的影响以 B. amyloliquefaciens TA208 为出发菌株, 分别利用基因过表达和无标记整合技术, 成功构建了 B. amyloliquefaciens TA2081 和 TA2082 通过实时定量 PCR 测定这 3 株菌 pupg 基因的转录水平, 结果表明与 B. amyloliquefaciens TA208 相比,TA2081 和 TA2082 的转录水平均有提高, 但 TA2081 提高的更为显著 ; 通过测定 PNPase 活性发现,B. amyloliquefaciens TA2081 和 TA2082 的 PNPase 活力分别为出发菌株 TA208 的 2 倍和 1.30 倍 7.5 L 分批补料发酵实验表明, 与出发菌 B. amyloliquefaciens TA208 相比, 工程菌 TA2081 鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率从 20.41% 提高到 98.63%,TA2082 的转化率从 20.41% 提高到 40.95% 综上所述, 增加 pupg 的表达量能提高利巴韦林的产量, 本研究为利巴韦林生产菌的代谢工程改造提供了理论依据和技术指导关键词 : 解淀粉芽孢杆菌 ; 利巴韦林 ; 嘌呤核苷磷酸化酶 ; 质粒过表达 ; 基因组整合表达文章篇号 : (2015) DOI: /j.mfst Effect of Different Expression Approaches of Purine Nucleoside Phosphorylase on Ribavirin Accumulation LIU Li, LI Yan-jun, XIE Xi-xian, CHEN Ning (College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin , China) Abstract: Purine nucleoside phosphorylase (PNPase, encoded by pupg) is the key enzyme in the synthesis of ribavirin. The effects of pupg overexpression and integrative expression was investigated, on ribavirin production in Bacillus amyloliquefaciens TA208. The overexpression and integrative expression procedures resulted in the successful construction of B. amyloliquefaciens TA2081 and TA2082 strains. Real-time polymerase chain reaction results showed that the transcriptional levels of pupg of TA2081 and TA2082 increased significantly, but the increment of TA2081 was more obvious. PNPase activity of TA2081 and TA2082 was approximately 2- and 1.30-fold compared to that of the original strain TA208, respectively. Finally, in the 7.5 L fed-batch fermentations, the molar yields of ribavirin from guanosine, by B. amyloliquefaciens TA2081 and TA2082 were 98.63% and 40.95%, respectively, whereas that of TA208 was 20.41%. In summary, the improvement of pupg expression via either plasmid-borne or chromosomal integration approach increased ribavirin production. The results of this study would be useful for development of more efficient ribavirin producers via metabolic engineering. Key words: Bacillus amyloliquefaciens; ribavirin; purine nucleoside phosphorylase; plasmid overexpression; integrative expression 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 天津市教委项目 ( ) 作者简介 : 刘莉 (1989-), 女, 硕士研究生, 研究方向 : 主要从事核苷生产菌定向改造及发酵过程优化的研究通讯作者 : 陈宁 (1963-), 男, 博士, 教授, 研究方向 : 主要从事代谢控制发酵的研究利巴韦林 (Ribavirin) 是一种高效广谱的核苷类抗病毒药物, 被应用于治疗多种病毒感染如小铁腺病毒肺炎病毒性肝炎呼吸道合胞病毒感染等 [1] 目前, 利巴韦林的生产方式主要有化学合成法酶法和发酵法 [2~4] 化学合成法是目前工业中采用的方法, 但该法对环境污染严重, 并不是最理想的生产方式酶法首先利用微生物表达嘌呤核苷磷酸化酶, 将酶纯化 63

amyloliquefaciens TA208 为出发菌株, 分别利用基因过表达和无标记整合技术, 成功构建了 B. amyloliquefaciens TA2081 和 TA2082 通过实时定量 PCR 测定这 3 株菌 pupg 基因的转录水平, 结果表明与 B.

2 或利用菌体细胞作为酶原催化嘌呤核苷生成核糖 -1- 磷酸, 再与前体物 1,2,4- 三氮唑 -3- 羧甲酰胺 (1,2,4-triazole-3-carboxamide,TCA) 反应合成利巴韦林 ( 反应式如图 1) [3] 由于使用核苷和 TCA 双底物为原料, 成本高, 酶法合成利巴韦林不适合大规模生产 1976 年 Ochiai 等首次提出发酵法, 该法利用核苷生产菌自身产生前体物鸟苷和表达嘌呤核苷磷酸化酶, 只向培养基中添加 TCA, 即可实现利巴韦林的合成 [4] 由于菌株自身的嘌呤核苷磷酸化酶活性低, 利巴韦林产量仅有 0.28 g/l 然而, 发酵法较其他两种方法的优势在于, 避免了核苷的分离和纯化过程, 具有原料成本低污染少, 工业化潜力强的优点异性上存在很大差异如枯草芽孢杆菌中嘌呤核苷磷酸化酶以两种形式存在, 分别为 pupg 基因表达的低分子量同源三聚体和 deod 基因表达的高分子量同源六聚体 [5] 本实验室前期对比研究了多种来源的 PNPase, 结果表明,pupG 表达的 PNPase 对底物鸟苷的转化率最高, 可以达到 87.62% [6] Bacillus amyloliquefaciens TA208 是本实验室通过多级诱变得到一株具有多种缺陷型的鸟苷生产菌 [7] B. amyloliquefaciens TA208 自身 pupg 基因的表达量不高, 不能完全利用其产生的前体物鸟苷, 导致利巴韦林的产量低因此, 增加 PNPase 的表达量可能是提高利巴韦林产量的有效手段本研究克隆了来源于 B. subtilis 168 的 pupg 基因, 通过质粒 pwb980 过表达和无标记基因组定点整合两种方式来提高 PNPase 在 B. amyloliquefaciens TA208 中的表达量 1 材料与方法图 1 酶法合成利巴韦林步骤 Fig.1 Ribavirin synthesis catalyzed by PNPase 不同嘌呤核苷磷酸化酶在氨基酸序列和底物特 3.2 主要菌株和质粒本研究所用菌株和质粒见表 1 表 1 本研究所用菌株和质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study Strains and plasmids Genotype Source E. coli DH5α F -, φ80d/lacz M15, (laczya-argf)u169, deor, reca1, enda1, hsdr17(r k -, m k + ), phoa, supe44, λ -, thi-1, gyra96, rela1 Lab stock B. subtilis 168 trpc2 Lab stock B. subtilis WB600 trpc2, npre, nprb, apr, epr, mpr, bpr, Em r Lab stock B. amyloliquefaciens TA208 Ade -, 8AG r, MSO r, overproducing guanosine Lab stock B. amyloliquefaciens TA2081 B. amyloliquefaciens TA208 containing plasmid pwb980-pupg This study B. amyloliquefaciens TA2082 B. amyloliquefaciens TA208 npre PP (PP fragment containing P43 promoter, sacb, pupg) This study pwb980 Ori Bacillus, Km r, Ble r, P43 promoter, sacb signal peptide, 3.8 kb Lab stock pwb980-pupg pwb980 containing pupg fragment This study pks1 Temperature-sensitive plasmid vector, 5.1 kb, Em r, Km r Lab stock pksn pks1 containing npre fragment This study pksnpp pksn containing PP fragment This study 1.2 引物表 2 为本研究使用的引物, 均由 Primer Premier 5.0 软件设计 1.3 主要试剂和仪器电穿孔仪,Eppendorf 公司 ; 实时定量 PCR 仪, ABI 公司 ; 高效液相色谱 Agilent 1200, 美国安捷伦 ; 7.5 L BioFlo 115 自动控制发酵罐, 美国 NBS 公司限制性内切酶,Fermentas 公司 ;Solution I 连接酶, 大连宝生物工程有限公司 ;TransStart FastPfu DNA Polymerase, 北京全式金生物技术有限公司 ; 质粒快速提取试剂盒, 北京博迈德生物技术有限公司 ;PCR 产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒, 北京天恩泽基因科技有限公司 ; 蛋白胨酵母粉为 Oxoid 公司产品 ;1,2,4- 三氮唑 -3- 甲酰胺 (1,2,4-triazole-3-carboxamide,TCA) 64

3 为本实验室自制 ; 山梨醇甘露醇购于天津博美科生物技术有限公司 ; 其余试剂均为国产分析纯产品表 2 本研究所用引物 Table 2 Primers used in this study Primers Sequences (5-3 ) Description P1-S GAGAGGATCCCAAGGACAGAATTGAACGC pupg (Xho I) P1-A TGCACTGCAGCATATTTATTCGTACTGAGCG pupg (Pst I) P2-S AGATAAGCTTAGAATGCGAGATTGCTGGTT npre upstream homologous arm (Hind III) P2-A TGAGTCGACATTACGATGTAGGGCCCTTAGAAA CGGCTTCAGGTGAT npre upstream homologous arm (Apa I) P3-S CCCTACATCGTAATGTCGACTTCTTCTGAAAGCGGCAAAT npre downstream homologous arm (Kpn I) P3-A CGATGGTACCTAAAAGTTGATGACGGAGTGAGG npre downstream homologous arm (Sal I) P4-S ACGTGGGCCCAAAGGTGGAGATTTTTTGAGTGA PP fragment (Apa I) P4-A TCGAGTCGACTTCGTTCTTTTTTTACCTCTCG PP fragment (Sal I) DL-S TATGAAGGCTACTCAATGGAGAAAG pupg(rt-qpcr) DL-A GGGTTTGTTCCCATAAAGTTGATA pupg(rt-qpcr) 1.4 培养基 (1) 种子培养基 (g/l): 葡萄糖 20, 豆饼水解液 20, 酵母粉 10, 玉米浆 30,NaCl 2.5,MgSO 4 7H 2 O 1,KH 2 PO 4 1, 味精 5,pH 7.0 (2) 发酵培养基 (g/l): 葡萄糖 80, 酵母粉 18, 豆饼水解液 42, 玉米浆 23,(NH 4 )SO 4 15,MgSO 4 7H 2 O 8,K 2 HPO 4 2.5, 味精 15,MnSO ,FeSO , 无水 CaCl 2 2.5,D- 葡萄糖酸钠 2,pH 感受态的制备及转化方法解淀粉芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化方法参见文献 [8], 具体转化操作如下 : 将构建成功的质粒电转入枯草芽孢杆菌株 WB600 进行 DNA 的修饰, 筛选得到阳性转化子, 提取纯化质粒后进行解淀粉芽胞杆菌的电转操作其他分子生物学操作参见精编分子生物学实验指南 [9] 1.6 实时定量 PCR 分析将解淀粉芽胞杆菌 (B. amyloliquefaciens)ta208 TA2081 和 TA2082 三株菌接于 5 ml 摇管培养至对数期, 按照 RNA 提取试剂盒说明书提取总 RNA, 利用反转录试剂盒获得 cdna, 并以之为模版以 B. amyloliquefaciens 的 16S rdna 为参比, 进行实时定量 PCR, 根据 2 - CT 法计算相关基因的转录水平 1.7 PNPase 活性检测粗酶液的制备蛋白质定量分析和 PNPase 活性测定参见文献 [10] 粗酶液的制备 : 将菌株在 M9 培养基中 r/min 过夜培养, 在 4 下以 5500 r/min 离心 10 min 后收集菌体, 用磷酸盐缓冲液 (ph 7.6) 洗涤菌体两次利用超声破碎仪破碎菌体制得粗酶液蛋白浓度检测 : 粗酶液中蛋白浓度采用 BCA 蛋白定量试剂盒检测酶活测定 : 反应体系为 200 µl, 含 1 mmol/l 肌苷 25 mmol/l 的磷酸盐缓冲液 (ph 7.6) 和适量的粗酶液, 反应液在 37 下保温 3 min, 迅速煮沸终止反应催化生成的次黄嘌呤采用 HPLC 定量分析 PNPase 酶活定义 : 在上述酶活测定条件下,1 min 内催化肌苷生成 1 µmol 次黄嘌呤所需要的酶量定义为一个酶活单位 (U) 根据粗酶液蛋白浓度计算 PNPase 比酶活为 :1 g 总蛋白所对应的酶活 (U/g) 1.8 发酵培养摇瓶培养 : 将 B. amyloliquefaciens TA208 TA2081 和 TA2082 菌株经斜面活化后接种于装液量为 30 ml 的种子培养基中 (500 ml 摇瓶 ),36 培养 10 h 后以 10% 接种量接种于 30 ml 发酵培养基中 (500 ml 摇瓶 ), 每组 3 个平行 36 培养, 发酵周期为 60 h, 期间补加葡萄糖每 12 h 添加 20 g TCA, 共添加 3 次 7.5 L 发酵罐培养 : 将菌株经斜面活化后接种于装液量为 100 ml 的种子培养基中 (1 L 摇瓶 ), 共 4 瓶 36 培养 10 h 后将种子培养基按 10% 接入 7.5 L 发酵罐中 ( 装液量为 4 L) 发酵过程中通过自动流加氨水控制 ph 在 7.0 左右, 培养温度为 36 当培养基中葡萄糖浓度降至 2% 时, 以设定脉冲速度 (5 g/l/h) 将 65

TGAGTCGACATTACGATGTAGGGCCCTTAGAAA CGGCTTCAGGTGAT npre upstream homologous arm (Apa I) P3-S CCCTACATCGTAATGTCGACTTCTTCTGAAAGCGGCAAAT npre downstream homologous arm (Kpn I) P3-A

4 葡萄糖溶液流加至培养基中, 以维持葡萄糖的浓度在肽的 pupg 片段, 命名该片段为 PP 经限制性内切酶 2~3% TCA 添加方式同摇瓶培养 Sal I 和 Apa I 双酶切片段 PP 和质粒 pksn, 二者切胶 1.9 分析方法回收后通过 Solution I 连接, 构建好整合质粒 pksnpp 重叠片段中 npre 基因作为基因组整合的位点, 发酵过程中, 取适量发酵液稀释后用紫外分光光通过双交换的方式将片段 PP 整合到基因组上, 即将度计测定 600 nm 处的吸光度值取 10 ml 发酵液, 带有强启动子 P43 和 sacb 信号肽的 pupg 插入基因组, r/min 离心 10 min, 用蒸馏水洗涤菌体 3 次, 置最终获得整合工程菌 B. amyloliquefaciens TA2082 构于真空干燥箱中 80 干燥至恒重, 用分析天平称重建步骤如图 2 所示葡萄糖浓度采用 SBA-40C 生物传感仪测定取适量发酵液离心, 用高效液相色谱法测定上清液中的利巴韦林, 色谱分离条件 : 采用离子柱 Accurasil C18, 以 4% 乙腈为流动相, 流速为 1 ml/min, 柱温为 18.5, 检测波长为 207 nm; 另取适量发酵液煮沸, 离心后取上清, 用高效液相色谱法测定鸟苷, 色谱分离条件 : 采用离子柱 Accurasil C18, 以 10% 乙腈为流动相, 流速为 1 ml/min, 柱温为 30, 检测波长为 254 nm 1.10 计算方法菌体生物量以干重 (DCW) 表示 :1 OD 600 nm =0.245 g/l 干菌体鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率 (%)=[ 产物利巴韦林 (mmol/l)]/[ 产物利巴韦林 (mmol/l)+ 剩余鸟苷 (mmol/l)] 100% 2 结果与讨论 2.1 过表达重组菌的构建以 pwb980 质粒为基本骨架, 构建过表达质粒 pwb980-pupg 以 B. subtilis 168 的基因组为模版, 用引物 P1-S/P1-A 扩增 pupg 基因基因 pupg 和表达载体 pwb980 分别经限制性内切酶 Xho I 和 Pst I 双酶切, 切胶回收目的片段和载体, 通过 Solution I 连接将构建好的质粒通过电转方式导入 B. amyloliquefaciens TA208 中, 获得过表达 pupg 的工程菌 B. amyloliquefaciens TA 整合重组菌的构建以温敏质粒 pks1 为基本构架构建整合质粒 pksnpp 以 B. amyloliquefaciens TA208 的基因组为模版, 分别用引物 P2-S/P2-A 和 P3-S/P3-A 扩增基因 npre 上下游同源臂采用重叠 PCR 的方法扩增重叠片段 npre, 使用限制性内切酶 Hind III 和 Kpn I 双酶切 npre 和质粒 pks1, 二者切胶回收后通过 Solution I 连接, 获得质粒 pksn 再以质粒 pwb980-pupg 为模版, 用 P4-S/P4-A 引物扩增带有强启动子 P43 及 sacb 信号图 2 无标记基因整合流程 Fig.2 Marker-less gene integration strategy 2.3 pupg 基因的转录分析嘌呤核苷磷酸化酶 PNPase 对利巴韦林积累起着至关重要的作用, 其 mrna 含量可反映编码基因 pupg 的转录水平本研究对三株菌的 pupg 转录水平进行了 RT-qPCR 分析, 结果发现,B. amyloliquefaciens TA2081 的 pupg 转录水平是出发菌 TA208 的 32 倍, TA2082 的 pupg 转录水平是 TA208 的 4 倍分析结果见表 3 表 3 RT-qPCR 检测 pupg 基因相对表达水平 Table 3 Reverse transcriptase quantitative PCR analysis of pupg gene expression levels during exponential phase Strains pupg gene relative expression B. amyloliquefaciens TA ±0.11 B. amyloliquefaciens TA ±2.34 B. amyloliquefaciens TA ± PNPase 活性分析 PNPase 是发酵法合成利巴韦林的关键限速酶, 催化鸟苷或肌苷生成核糖 -1- 磷酸, 核糖 -1- 磷酸再在该酶的作用下结合底物 TCA 生成利巴韦林, 其酶活性的高低直接影响利巴韦林的合成量酶活性分析 ( 图 3) 表明过表达 pupg 使工程菌 B. amyloliquefaciens TA2081 的 PNPase 活力达到 U/g, 是出发菌株 TA208 的 2 倍刘逸寒等利用质粒 pwb980, 实现了 66

的吸光度值取 10 ml 发酵液, 带有强启动子 P43 和 sacb 信号肽的 pupg 插入基因组, 13000 r/min 离心 10 min, 用蒸馏水洗涤菌体 3 次, 置最终获得整合工程菌 B.

5 在 B. subtilis DB403 中高效表达异源中温 α- 淀粉酶, 酶活达到 770 U/mL [11] 说明 pwb980 为优秀的异源蛋白表达载体然而, 微生物细胞携带的外源基因表达质粒具有潜在的不稳定性, 且抗性筛选标记的残留会影响菌株的安全性和进一步遗传操作因此, 本研究后期利用温敏质粒 pks1 将带有 P43 启动子和 sacb 信号肽的 pupg 基因整合到 B. amyloliquefaciens TA208 因组上, 增加了 pupg 的转录水平, 提高了 PNPase 的活力工程菌 B. amyloliquefaciens TA2082 的 PNPase g/l, 结合转录和酶活分析发现其原因是 TA208 自身 pupg 表达水平低, 导致 PNPase 活性低, 鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率只有 10.54% 与之相比, 质粒表达的工程菌 TA2081 利巴韦林产量提高了 7 倍, 前体物鸟苷几乎没有剩余, 鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率达到了 99% 工程菌 TA2082 利巴韦林的产量比出发菌株提高了 58.30%, 鸟苷仍有大部分剩余, 转化率只有 16.30%, 说明整合工程菌 PNPase 活力不足以将前体物鸟苷全部转化活力达到 U/g, 仅为出发菌株 TA208 的 1.30 倍, 说明表达体系有待进一步优化, 来获得更高的 PNPase 表达量 2.5 利巴韦林发酵为了研究嘌呤核苷磷酸化酶的不同表达方式 ( 质粒过表达和基因组整合过表达 ) 对利巴韦林积累的影响, 本研究进行了利巴韦林摇瓶发酵和 7.5 L 发酵罐分批补料发酵, 分别比较了三株菌的生长情况耗糖速率利巴韦林积累量以及鸟苷剩余量表 4 为利巴韦林摇瓶发酵 60 h 后的发酵参数由结果可知, 出发图 3 三株菌的 PNPase 活性比较 Fig.3 Comparison of PNPase activities of three strains 菌 B. amyloliquefaciens TA208 利巴韦林产量仅为 1.32 表 4 三株菌的摇瓶发酵参数比较 Table 4 Comparison of parameters of three strains in shake flask fermentation Strains DCW/(g/L) Glucose consumption/(g/l) C(ribavirin)/(g/L) C(guanosine)/(g/L) B. amyloliquefaciens TA ± ± ± ±0.20 B. amyloliquefaciens TA ± ± ± ±0.25 B. amyloliquefaciens TA ± ± ± ± L 发酵罐分批发酵结果表明 ( 图 4), 工程菌 B. amyloliquefaciens TA2081 生长较出发菌 TA208 缓慢, 可能是附加质粒增加了菌体的生长负担, 导致其生长受到影响而在摇瓶发酵中, 出发菌 TA208 反而生长慢, 可能是由于其 PNPase 活性低, 不能完全利用前体物 TCA,TCA 的局部积累对菌体生长造成一定毒害作用 ; 在发酵罐中可能由于搅拌均匀而未表现出该特性出发菌 TA208 是鸟苷生产菌, 发酵 40 h 后鸟苷积累量为 9.07 g/l, 由于自身的 PNPase 活力低, 鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率只有 20.41% 工程菌 TA2081 由于过表达 pupg 基因增加了 PNPase 活性, 发酵过程中鸟苷几乎全部转化为利巴韦林, 转化率高达 98.63%, 利巴韦林产量为 g/l 枯草芽孢杆菌在表达外源蛋白的同时也会向胞外分泌大量蛋白酶, 使外源蛋白无法稳定存在, 这也是枯草芽孢杆菌作为宿主菌的瓶颈之一选择 B. amyloliquefaciens TA208 的 npre 基因 ( 编码中性蛋白酶 ) 作为 pupg 整合位点, 试图同时敲除 npre 来减少蛋白酶对 PNPase 的降解有研究报道,nprE 基因的敲除不影响枯草芽孢杆菌的生长 [12] 从图 4 可以看出, 工程菌 B. amyloliquefaciens TA2082 发酵前期生长速率与出发菌 TA208 基本一致, 发酵 40 h 后,TA2082 的生长逐渐放缓生物量趋于稳定, 而 TA208 则保持恒定的速率生长, 最终获得了较高的生物量发酵前期工程菌 TA2082 耗糖速率略高于出发菌, 发酵中后期二者葡萄糖消耗速率相差不大由于工程菌 TA2082 在基因组上增加了一个 pupg 的拷贝,PNPase 的酶活提高, 发酵结束时鸟苷积累量为 6.02 g/l, 鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率为 40.95%; 而与之相比,TA208 在发酵结束时有 9.04 g/l 鸟苷积累, 鸟苷转化率只有 20.41% 工程菌 TA2082 利巴韦林产量为 3.60 g/l, 比出发菌 TA208 高出 80% 有趣的是,TA208 在发酵 40 h 后利巴韦林的浓度开始下降, 推测原因可能是由于 PNPase 活力下降, 导致生成的利巴韦林发生逆反应分解为核糖 -1- 磷酸, 而核糖 -1- 磷酸作为碳源加速了 67

amyloliquefaciens TA2082 的 PNPase g/l, 结合转录和酶活分析发现其原因是 TA208 自身 pupg 表达水平低, 导致 PNPase 活性低, 鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率只有 10.

6 菌体的生长 3 结论 3.1 枯草芽孢杆菌属是优秀的外源表达系统, 无明显密码子偏爱性, 无致病性, 具有分泌外源蛋白的功能, 并且表达的蛋白多具有生物活性, 纯化方便本研究中, 利用高效表达载体 pwb980 过表达嘌呤核苷磷酸化酶, 实现了一步法生产利巴韦林从酶活性上分析, B. amyloliquefaciens TA2081 较原菌 PNPase 酶活提高了 2 倍经 7.5 L 发酵罐优化, 利巴韦林产量较出发菌 B. amyloliquefaciens TA208 提高了 5.76 倍, 鸟苷转化为利巴韦林的转化率提高了 78.22% 可见, 利用高拷贝质粒增加 pupg 的拷贝数, 进而增加酶的表达量, 能够有效提高利巴韦林的产量然而,pWB980 这类表达质粒靠滚环方式复制, 复制过程中会产生大量单链 DNA, 使得质粒不稳定, 在无选择压力下很容易丢失 ; 高拷贝质粒的复制和维持将消耗过多能量, 导致宿主菌生长缓慢 [13] 因此, 工程菌 B. amyloliquefaciens TA2081 实际上并不是最适合生产利巴韦林的菌株 3.2 本研究进一步对工程菌 B. amyloliquefaciens TA208 进行改造, 通过无痕基因整合技术构建出 B. amyloliquefaciens TA2082, 它较原菌酶活提高了 1.30 倍, 产量提高了 1.80 倍, 鸟苷转化为利巴韦林的转化率提高了 20.54% 然而,B. amyloliquefaciens TA2082 较 TA2081 利巴韦林积累低, 鸟苷剩余量高, 说明 pupg 基因的拷贝数还是不够的但是, 将 pupg 基因整合到基因组解决了发酵后期质粒不稳定的问题因此在本研究基础上, 下一步继续将 pupg 基因多拷贝整合入宿主菌基因组中, 获得高效稳定的表达, 为实现利巴韦林的发酵法大规模生产奠定基础参考文献 [1] Bausch D G, Hadi C M, Khan S H, et al. Review of the literature and proposed guidelines for the use of oral ribavirin as postexposure prophylaxis for Lassa fever [J]. Clinical Infectious Diseases, 2010, 51(12): [2] Crotty S, Maag D, Arnold J J, et al. The broad-spectrum antiviral ribonucleoside ribavirin is an RNA virus mutagen [J]. Nature Medicine, 2000, 6(12): 图 4 嘌呤核苷磷酸化酶不同表达方式对菌体生长耗糖利巴韦林产量和鸟苷积累量的影响 Fig. 4 Effects of different ways of PNPase expression on cell growth, glucose consumption, ribavirin production and guanosine accumulation 注 :1: B. amyloliquefaciens TA208; 2: B. amyloliquefaciens TA2081; 3: B. amyloliquefaciens TA2082 [3] 邱蔚然, 唐洁宇, 高嫒, 等. 由鸟苷经酶法生产利巴韦林 [J]. 中国医药工业杂志,1997,28(1):14-17 QIU Wei-ran, TANG Jie-yu, GAO Yuan, et al. Enzymatic production of ribavirin from guanosine [J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 1997, 28(1):

韦林从酶活性上分析, B. amyloliquefaciens TA2081 较原菌 PNPase 酶活提高了 2 倍经 7.5 L 发酵罐优化, 利巴韦林产量较出发菌 B. amyloliquefaciens TA208 提高了 5.76 倍, 鸟苷转化为利巴韦林的转化率提高了 78.

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说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基

说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基内部资料东北师范大教运行基本状态据报告 2015 年春季期教务处 2015 年 10 月 27 日说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度,

中图分类号：；文献标识码： ；文章篇号: (2004)01-000#-0#

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