刘 云, 等. 不 同 时 期 和 不 同 来 源 鼠 胚 玻 璃 化 冷 冻 效 果 的 比 较 121 够 快 的 降 温 速 率, 过 冷 到 玻 璃 化 转 变 温 度, 而 被 固 化 成 完 全 的 玻 璃 态, 以 这 种 玻 璃 态 在 低 温 下 长 期 保 存 在 此 冷 冻 过
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- 纳唯 焦
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1 第 23 卷 第 2 期 2013 年 3 月 江 苏 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.23 No.2 Mar.2013 不 同 时 期 和 不 同 来 源 鼠 胚 玻 璃 化 冷 冻 效 果 的 比 较 刘 云 1, 胡 杰 2, 陈 小 芳 1, 殷 朝 晖 1, 糜 戊 煊 1 2, 胡 嘉 波 (1. 江 苏 大 学 附 属 第 四 医 院 生 殖 医 学 中 心, 江 苏 镇 江 ;2. 江 苏 大 学 基 础 医 学 与 医 学 技 术 学 院, 江 苏 镇 江 ) [ 摘 要 ] 目 的 : 比 较 不 同 时 期 不 同 来 源 的 鼠 胚 玻 璃 化 冷 冻 的 存 活 率 以 及 发 育 为 囊 胚 的 成 功 率 方 法 : 采 用 体 外 受 精 和 体 内 受 精 的 方 式 得 到 小 鼠 的 细 胞 期 胚 胎, 对 其 进 行 玻 璃 化 冷 冻 解 冻, 观 察 胚 胎 的 存 活 与 囊 胚 形 成, 以 未 冷 冻 的 胚 胎 作 为 对 照 组 结 果 : 由 体 外 受 精 和 体 内 受 精 获 得 的 2 细 胞 期 胚 胎 在 冷 冻 复 苏 后 的 存 活 率 分 别 为 70.67% 72.06%, 囊 胚 形 成 率 分 别 为 65.33% 67.62%;4 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 的 存 活 率 分 别 为 88% 89.71%, 囊 胚 形 成 率 分 别 为 81.33% 83.82%;8 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 的 存 活 率 分 别 为 93.33% 94.12%, 囊 胚 形 成 率 分 别 为 92% 94.12% 和 对 照 组 相 比,2 细 胞 和 4 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 囊 胚 形 成 率 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05), 而 8 细 胞 期 的 胚 胎 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0.05) 不 同 时 期 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 囊 胚 形 成 率 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05), 受 精 方 式 对 处 于 同 一 时 期 的 胚 胎 在 冷 冻 复 苏 后 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 均 无 明 显 影 响 结 论 : 玻 璃 化 冷 冻 可 以 作 为 小 鼠 胚 胎 保 存 的 有 效 方 法, 相 对 2 4 细 胞 期 胚 胎, 冷 冻 效 果 最 好 的 是 8 细 胞 期 胚 胎 [ 关 键 词 ] 玻 璃 化 冷 冻 ; 体 外 受 精 ; 体 内 受 精 ; 小 鼠 胚 胎 ; 囊 胚 形 成 率 [ 中 图 分 类 号 ] R [ 文 献 标 志 码 ] A [ 文 章 编 号 ] (2013) Efectsofvitrifyingmouseembryosfrom diferentperiods anddiferentsources LIUYun 1,HUJie 2,CHENXiao fang 1,YINZhao hui 1,MIWu xuan 1,HUJia bo 2 (1.HumanReproductionMedicineCenter,theFourthAfiliatedHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001;2.SchoolofMedical ScienceandLaboratoryMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China) [Abstract] Objective:Tocomparethepost thawsurvivalrateandthesuccesrateincontinuingtogrow toblastocystofvitrifiedmouseembryosfromdiferentperiodsanddiferentsources.methods:the2 cel, 4 cel,8 celperiodmouseembryoswereobtainedthroughfertilizationinvitroandinvivorespectively. Theseembryoswerevitrifiedandthawed.Wegottherateoftheirsurvivalandblastocystformation.And, wetookthosefreshembryosasthecontrolgroup.results:thesurvivalrateofblastocystformationofpost thaw2 cel,4 celand8 celperiodembryosfromfertilizationinvitroandinvivowere70.67% /65.33% and72.06% /67.62%,88.00% /81.33% and89.71% /83.82% and93.33% /92.00% and94.12% / 94.12% respectively.theblastocystformationrateinthephraseof2 celand4 celfrozenembryoswas lowerthanthecontrolgroup(p<0.05).nosignificantdiferencewasfoundbetweenthegroupof8 celfro zenembryosandthecontrolgroup.inaddition,fertilizationmodeshadnosignificantefectonthesurvival rateandtheblastocystformationrate(p>0.05).conclusion:vitrificationtechnologyisanefectivemethod inpreservingmouseembryos.andthe8 celperiodembryosmighthavethebestcryopreservationefect. [Keywords] vitrification;invitrofertilization;invivofertilization;mouseembryos;blastocystformation rate 辅 助 生 殖 技 术 是 具 有 较 大 发 展 前 景 的 一 门 新 技 术, 是 治 疗 不 孕 不 育 症 行 之 有 效 的 方 法 近 年 来, 玻 璃 化 冷 冻 技 术 已 成 为 辅 助 生 育 技 术 领 域 引 人 注 目 的 焦 点 [1] 玻 璃 化 冷 冻 是 使 细 胞 及 其 保 护 剂 溶 液 以 足 [ 基 金 项 目 ] 镇 江 市 科 技 基 金 资 助 项 目 (FZ ); 江 苏 大 学 科 研 立 项 资 助 项 目 (11A394) [ 作 者 简 介 ] 刘 云 (1969 ), 女, 江 苏 扬 中 人, 副 主 任 技 师, 主 要 从 事 生 殖 医 学 实 验 研 究 ; 胡 嘉 波 ( 通 讯 作 者 ), 副 教 授, 硕 士 生 导 师,E mail: hu@ujs.edu.cn
2 刘 云, 等. 不 同 时 期 和 不 同 来 源 鼠 胚 玻 璃 化 冷 冻 效 果 的 比 较 121 够 快 的 降 温 速 率, 过 冷 到 玻 璃 化 转 变 温 度, 而 被 固 化 成 完 全 的 玻 璃 态, 以 这 种 玻 璃 态 在 低 温 下 长 期 保 存 在 此 冷 冻 过 程 中 由 于 无 冰 晶 形 成, 液 体 由 液 相 转 变 成 为 一 种 玻 璃 状 的 固 体 状 态, 从 而 避 免 了 冰 晶 对 细 胞 的 物 理 化 学 损 伤 [2] 本 研 究 的 目 的 在 于 通 过 对 不 同 时 期 不 同 来 源 的 小 鼠 胚 胎 进 行 玻 璃 化 冷 冻, 研 究 小 鼠 胚 胎 玻 璃 化 冷 冻 的 最 佳 时 期, 为 更 安 全 更 可 靠 地 将 玻 璃 化 冷 冻 用 于 人 类 辅 助 生 殖 技 术 打 下 基 础 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 主 要 试 剂 孕 马 血 清 促 性 腺 激 素 (PMSG, 宁 波 市 三 生 药 业 有 限 公 司 ) 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 (HCG, 上 海 第 一 生 化 药 业 有 限 公 司 ), 冷 冻 载 杆 人 输 卵 管 液 (HTF) 卵 裂 液 (CSC) HEPES 缓 冲 的 人 输 卵 管 液 (mhtf) 血 清 合 成 蛋 白 (SSS) 平 衡 液 (e quilibrationsolution,es) 玻 璃 化 冷 冻 液 (vitrification solution,vs) 玻 璃 化 解 冻 液 (thawingsolution,ts) 稀 释 液 (dilutionsolution,ds) 洗 涤 液 (washingsolu tion,ws) 均 为 欧 文 公 司 产 品 实 验 动 物 鼠 龄 为 6~8 周 的 ICR 小 白 鼠, 购 自 江 苏 大 学 实 验 动 物 中 心 其 中, 雌 鼠 40 只, 体 质 量 35~40g, 雄 鼠 30 只, 体 质 量 40~45g 1.2 方 法 试 剂 配 制 将 PMSG HCG 配 制 成 100U/ ml 的 溶 液, 按 照 一 定 体 积 分 装 于 EP 管 中 ( 每 支 EP 管 内 的 溶 液 仅 一 次 性 使 用 ), 置 于 -70 的 冰 箱 中 保 存 实 验 前 一 天 晚 8 点, 配 受 精 液 ( 含 10%SSS 的 HTF) 卵 裂 液 ( 含 有 10%SSS),4 个 35mm 培 养 皿 中 做 成 6 个 50μL 的 卵 裂 液 微 滴, 表 面 覆 上 液 状 石 蜡,1 个 60mm 双 颈 培 养 皿 倒 入 已 配 好 的 受 精 液, 置 于 CO 2 培 养 箱 中 (37 5% CO 2 饱 和 湿 度 ), 平 衡 过 夜 刺 激 和 排 卵 诱 导 晚 上 6:30 给 雌 性 小 鼠 腹 腔 注 射 0.1mLPMSG(10U/ 只 ),48h 之 后, 再 各 注 射 0.1mLHCG(10U/ 只 ) 体 外 受 精 [3] 采 精 脱 颈 处 死 雄 鼠, 在 超 净 台 中 用 解 剖 剪 剖 开 小 鼠 腹 部, 维 纳 斯 剪 截 取 附 睾 尾, 再 用 精 子 处 理 液 (mhtf) 洗 涤 2 遍, 在 立 体 显 微 镜 下 用 解 剖 针 刺 破, 释 放 出 精 子, 将 其 挑 到 200μL 平 衡 过 夜 的 HTF 受 精 获 能 液 滴 中, 置 于 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 条 件 下 培 养 1~1.5h, 使 精 子 获 能 取 卵 在 注 射 完 HCG14h 后, 脱 颈 处 死 雌 鼠, 截 取 输 卵 管, 用 冲 卵 液 (mhtf) 洗 涤 2 遍, 在 解 剖 显 微 镜 下 用 解 剖 针 刺 破 输 卵 管 的 膨 大 部, 取 出 卵 母 细 胞, 之 后 用 巴 斯 德 管 将 其 放 入 含 有 受 精 液 的 60mm 双 颈 培 养 皿 中 往 其 中 加 入 5~10μL 精 液 (200 个 精 子 /μl), 置 于 培 养 箱 中 培 养 6h 后 洗 卵, 将 受 精 卵 挑 出 放 入 含 有 卵 裂 液 的 35mm 培 养 皿 中 再 培 养 24 48h, 分 别 获 得 2~8 细 胞 期 胚 胎 体 内 受 精 在 注 射 完 HCG 之 后, 将 雌 鼠 与 雄 鼠 按 照 1 1 的 数 量 合 笼, 第 2 天 早 上 8 点 观 察 雌 鼠 是 否 有 阴 道 栓 将 有 阴 道 栓 的 雌 鼠 与 雄 鼠 分 开 饲 养, 在 分 别 注 射 完 HCG h, 将 雌 鼠 脱 颈 处 死, 用 维 纳 斯 剪 截 取 出 输 卵 管, 用 冲 卵 液 洗 涤 2 遍, 在 立 体 显 微 镜 下 用 较 钝 的 针 头 套 在 输 卵 管 伞 上, 分 别 冲 出 细 胞 期 胚 胎 [3] 胚 胎 的 玻 璃 化 冷 冻 冷 冻 将 体 外 受 精 和 体 内 受 精 形 成 的 小 鼠 胚 胎 按 照 不 同 时 期 进 行 玻 璃 化 冷 冻 事 先 准 备 好 拉 细 的 吸 管 液 氮 罐 泡 沫 盒 子 玻 璃 化 冷 冻 液 (VS) 玻 璃 化 冷 冻 载 杆 取 50μLES VS 于 60mm 培 养 皿 上, 置 于 显 微 镜 下, 保 持 室 温 从 温 箱 中 取 出 含 有 胚 胎 的 培 养 皿, 用 拉 细 的 吸 管 吸 取 5~8 枚 胚 胎, 放 在 ES 表 面, 让 胚 胎 自 然 下 沉, 然 后 出 现 皱 缩 再 回 复, 当 胚 胎 膨 大 到 最 大 限 度 的 时 候 ( 大 约 在 10min 左 右 ), 迅 速 用 拉 细 的 吸 管 取 出 胚 胎, 放 入 VS 中, 时 间 为 30s 之 后 用 拉 细 的 吸 管 吸 取 胚 胎 装 在 载 杆 最 前 端 ( 此 过 程 需 在 1min 内 完 成, 因 VS 含 有 毒 性, 操 作 时 间 过 长 可 能 会 对 胚 胎 产 生 不 良 影 响 ) 装 好 后, 迅 速 把 载 杆 放 入 装 有 液 氮 的 泡 沫 盒 中, 放 好 以 后 轻 晃 一 下, 这 样 可 以 使 胚 胎 加 速 降 温 之 后, 一 手 拿 着 载 杆 的 后 柄, 一 手 拿 夹 子 夹 住 套 管 盖, 套 管 应 先 放 入 液 氮 中 套 好 套 管 盖 之 后, 装 入 冷 冻 支 架, 放 置 液 氮 罐 中 冷 冻 保 存 解 冻 在 胚 胎 放 入 液 氮 罐 中 1 个 月 后, 取 出 解 冻 事 先 准 备 好 TS DS 和 WS 提 前 20min 吸 取 50μLTS 放 入 60mm 培 养 皿 中, 放 入 37 的 恒 温 箱 中 保 存 从 冷 冻 室 提 取 出 液 氮 罐, 使 之 靠 近 超 净 台 上 的 显 微 镜, 以 取 得 载 杆 进 入 TS 的 最 短 距 离 同 样, 将 载 杆 从 液 氮 罐 中 取 出 后 放 入 装 有 液 氮 的 泡 沫 盒 中, 在 液 氮 中 将 载 杆 的 套 管 用 夹 子 打 开, 把 装 有 TS 的 60mm 培 养 皿 放 在 恒 温 的 立 体 显 微 镜 下 以 最 快 的 速 度 将 载 杆 插 入 TS 中, 并 在 显 微 镜 下 确 定 胚 胎 已 从 载 体 上 落 到 TS 中 胚 胎 在 TS 中 的 时 间 约 为 1min 用 拉 细 的 吸 管 吸 取 胚 胎 将 其 转 移 到 50μL 的 DS 中, 放 置 约 4min 之 后 将 胚 胎 放 入 50μL 的 WS1 液 体 表 面, 待 其 自 然 下 沉, 不 用 吹 吸, 在 WS1 中
3 122 江 苏 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) 第 23 卷 的 时 间 为 4min 最 后 将 胚 胎 转 移 到 50μL 的 WS2 液 体 中, 反 复 吹 吸 解 冻 之 后, 在 显 微 镜 下 观 察 胚 胎 的 复 苏 情 况, 存 活 指 标 为 卵 裂 球 清 晰 完 整 的 比 率 大 于 50% [4] 计 数, 记 下 数 据 胚 胎 培 养 将 复 苏 后 的 胚 胎 转 移 到 事 先 配 置 好 的 含 有 卵 裂 液 的 35mm 培 养 皿 中, 放 入 CO 2 温 箱 中 继 续 培 养 对 细 胞 期 胚 胎 分 别 培 养 h 之 后, 观 察 囊 胚 的 形 成 情 况, 囊 胚 形 成 是 以 胚 盘 中 出 现 卵 裂 腔 作 为 标 记 同 时, 把 之 前 未 冷 冻 的 鼠 胚 标 为 对 照 组, 观 察 其 生 长 情 况, 记 下 相 应 的 数 据 1.3 统 计 学 分 析 采 用 SPSS19.0 统 计 软 件 进 行 处 理, 通 过 对 数 据 的 整 理 与 运 算, 进 行 χ 2 检 验, 以 P<0.05 判 断 每 组 数 据 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 2 结 果 2.1 体 外 受 精 的 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 2 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 与 4 8 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 之 间 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0.05);4 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 与 8 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 之 间, 存 活 率 无 明 显 差 异 (P>0.05), 但 囊 胚 形 成 率 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05);2 4 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 与 对 照 组 之 间 囊 胚 形 成 率 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05);8 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 与 对 照 组 之 间 囊 胚 形 成 率 无 明 显 差 异 (P>0.05) 见 表 1 表 1 体 外 受 精 的 各 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 的 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 Tab1 Survivalrateandblastocystformationrateofpost thawembryosbyinvitrofertilization 组 别 冷 冻 数 存 活 数 囊 胚 数 存 活 率 /% 囊 胚 形 成 率 /% 2 细 胞 期 胚 胎 组 a a,c 4 细 胞 期 胚 胎 组 b,c 8 细 胞 期 胚 胎 组 对 照 组 a:p<0.05, 与 4 8 细 胞 期 冷 冻 组 比 较 ;b:p<0.05, 与 8 细 胞 期 比 较 ;c:p<0.05, 与 对 照 组 比 较 2.2 体 内 受 精 的 各 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 的 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 2 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 与 4 8 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 之 间 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0.05);4 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 与 8 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 之 间, 存 活 率 无 明 显 差 异 (P>0.05), 但 囊 胚 形 成 率 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05);2 4 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 与 对 照 组 之 间 囊 胚 形 成 率 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05);8 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 组 与 对 照 组 之 间 囊 胚 形 成 率 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0.05) 见 表 2 表 2 体 内 受 精 的 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 Tab2 Survivalrateandblastocystformationrateofpost thawembryosbyinvivofertilization 组 别 冷 冻 数 存 活 数 囊 胚 数 存 活 率 /% 囊 胚 形 成 率 /% 2 细 胞 期 胚 胎 组 a a,b 4 细 胞 期 胚 胎 组 b,c 8 细 胞 期 胚 胎 组 对 照 组 a:p<0.05, 与 4 8 细 胞 期 组 比 较 ;b:p<0.05, 与 对 照 组 比 较 ;c:p<0.05, 与 8 细 胞 期 比 较 2.3 体 外 受 精 与 体 内 受 精 形 成 的 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 比 较 由 表 1 和 表 2 可 知, 两 种 受 精 方 式 得 到 的 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 复 苏 后, 相 同 时 期 的 胚 胎 存 活 率 囊 胚 形 成 率 之 间 的 差 异 均 无 统 计 学 差 异 (P>0.05); 两 个 对 照 组 之 间 差 异 也 无 统 计 学 意 义 (P>0.05) 2.4 体 外 受 精 和 体 内 受 精 的 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 形 成 的 囊 胚 比 较 体 外 受 精 和 体 内 受 精 的 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 形 成 的 囊 胚 在 形 态 上 相 似, 见 图 1 3 讨 论 [5] 自 1972 年 Whitingham 等 和 Wilmut [6] 开 创 性 地 成 功 冷 冻 保 存 哺 乳 动 物 胚 胎 以 来, 胚 胎 冷 冻 技 术 便 成 为 研 究 的 热 点 常 用 的 慢 速 程 序 化 冷 冻 技 术 需 昂 贵 的 程 序 化 冷 冻 仪, 耗 时 长, 耗 液 氮 如 果 冷 冻 仪 在 运 行 中 出 现 故 障, 将 会 给 胚 胎 带 来 不 可 逆 的 无 法 挽 回 的 损 伤 Ral 等 [7] (1985) 首 先 采 用 提 高 二 甲 亚 砜 浓 度 的 速 冻 法 冻 贮 小 鼠 胚 胎 获 得 成 功, 称 为 玻 璃 化 技 术, 其 冷 冻 保 护 剂 即 VS 之 后, 自 1998 年
4 刘 云, 等. 不 同 时 期 和 不 同 来 源 鼠 胚 玻 璃 化 冷 冻 效 果 的 比 较 123 图 1 两 种 受 精 方 式 胚 胎 冷 冻 复 苏 后 形 成 的 囊 胚 ( 400) Fig1 Blastocystofpost thawembryosformedfrom invitrofertilizationandinvivofertilization [8] Mukaida 等 以 乙 二 醇 (ethyleneglycol,eg) 为 基 本 冷 冻 液 对 人 类 4~8 细 胞 期 的 胚 胎 进 行 了 玻 璃 化 冷 冻 复 苏 移 植,1 例 成 功 分 娩 双 胞 胎, 之 后 世 界 各 地 相 继 开 展 了 人 类 胚 胎 玻 璃 化 冷 冻 的 临 床 研 究 但 对 玻 璃 化 冷 冻 的 机 制 尚 不 十 分 了 解, 冷 冻 是 否 对 细 胞 膜 细 胞 器, 特 别 是 遗 传 物 质 造 成 损 伤, 或 者 是 否 对 冷 冻 保 存 的 配 子 或 胚 胎 产 生 的 后 代 造 成 远 期 损 伤, 尚 缺 乏 大 规 模 的 研 究 [9] 目 前 还 没 有 一 种 较 为 完 善 和 实 用 的 冷 冻 保 护 液, 而 且 冷 冻 和 解 冻 过 程 采 用 多 少 步 骤 也 不 太 明 了, 所 以, 对 玻 璃 化 冷 冻 胚 胎 技 术 还 有 较 大 的 研 究 空 间 另 外, 玻 璃 化 冷 冻 胚 胎 的 效 果 其 实 也 与 胚 胎 所 处 的 发 育 时 期 有 关 和 人 一 样, 鼠 胚 的 发 育 从 受 精 卵 开 始, 经 2 细 胞 期 4 细 胞 期 8 细 胞 期 囊 胚 本 实 验 主 要 针 对 不 同 时 期, 不 同 来 源 鼠 胚 进 行 玻 璃 化 冷 冻, 探 讨 最 佳 冷 冻 时 期 结 果 显 示, 体 外 和 体 内 受 精 两 种 方 式 得 到 的 细 胞 期 胚 胎, 在 冷 冻 复 苏 后 胚 胎 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 间 差 异 不 明 显, 说 明 胚 胎 的 存 活 率 和 囊 胚 的 形 成 [10] 率 跟 胚 胎 的 获 得 方 法 无 关 这 与 赵 丹 凤 等 的 研 究 结 果 类 似 另 外,2 细 胞 期 与 4 8 细 胞 期 胚 胎 相 比, 冷 冻 解 冻 后 存 活 率 和 囊 胚 形 成 率 均 明 显 降 低 4 细 胞 期 与 8 细 胞 期 胚 胎 相 比, 冷 冻 解 冻 后 存 活 率 并 无 明 显 差 异, 而 囊 胚 形 成 率 明 显 降 低, 说 明 早 期 胚 胎 冷 冻 效 果 欠 佳, 随 着 胚 胎 的 发 育, 存 活 率 显 著 提 [11] 高, 并 趋 于 稳 定 我 们 的 结 论 与 连 安 等 的 研 究 结 果 一 致 Cseh 等 [12] (1997) 的 研 究 结 果 显 示, 桑 椹 胚 及 早 期 囊 胚 的 复 苏 率 为 80%,4~8 细 胞 期 胚 胎 的 复 苏 率 为 47%,2 细 胞 期 胚 胎 为 51%, 而 扩 张 囊 [13] 胚 的 复 苏 率 仅 为 17% 高 珊 等 的 研 究 表 明,ICR 小 鼠 合 笼 得 到 的 细 胞 期 胚 胎 冷 冻 解 冻 后 复 苏 率 分 别 在 48.3% ~69.5% 71.7% ~82.3% 83.4% ~94%, 囊 胚 形 成 率 分 别 为 23% ~38.8% 65.5% ~80.5% 75.2% ~90.2% 通 过 比 较, 我 们 的 实 验 结 果 要 好 于 Cseh 等, 与 高 珊 等 的 结 果 相 比, 除 2 细 胞 期 胚 胎 囊 胚 形 成 率 较 高, 其 余 结 果 均 大 致 相 符 研 究 中 还 发 现, 小 鼠 胚 胎 培 养 均 用 的 是 人 胚 胎 的 培 养 条 件, 并 得 到 了 较 高 的 受 精 率 卵 裂 率 囊 胚 率 由 于 培 养 出 的 小 鼠 胚 胎 质 量 较 高, 且 在 采 用 玻 璃 化 冷 冻 时, 使 用 的 是 开 放 式 冷 冻 载 杆, 只 需 很 少 的 承 载 体 积, 降 温 速 度 更 快, 所 以 玻 璃 化 效 果 也 更 好, 另 外 较 少 的 玻 璃 化 冷 冻 液 有 利 于 在 解 冻 时 迅 速 去 除, 从 而 降 低 冷 冻 液 对 胚 胎 的 毒 性 作 用, 增 加 冷 冻 后 胚 胎 的 继 续 发 育 能 力 [14] 所 以 获 得 了 较 好 的 胚 胎 冷 冻 和 复 苏 效 果 在 本 实 验 过 程 中, 大 多 数 冷 冻 解 冻 过 后 的 胚 胎 与 对 照 组 一 致, 在 理 论 时 间 内 形 成 囊 胚 一 部 分 生 长 速 度 较 缓 慢, 但 最 后 也 形 成 了 囊 胚 分 析 其 原 因, 在 玻 璃 化 冷 冻 与 解 冻 的 操 作 过 程 当 中 某 些 因 素 可 能 会 对 胚 胎 的 生 长 速 度 造 成 影 响, 并 且 这 种 影 响 是 否 会 对 小 鼠 子 代 生 长 发 育 造 成 影 响, 还 有 待 进 一 步 研 究 本 实 验 结 果 表 明, 玻 璃 化 冷 冻 小 鼠 胚 胎 的 囊 胚 形 成 率 与 鼠 胚 的 发 育 阶 段 有 关, 在 8 细 胞 期 冷 冻 效 果 最 好, 并 且 在 合 适 的 阶 段 对 胚 胎 进 行 冷 冻, 将 不 影 响 胚 胎 正 常 发 育 的 整 体 质 量 参 考 文 献 [1] WongJY,WongAY.Phasing inofvitrification into routinepractice:why,how,andwhat[j].hongkong MedJ,2011,17(2): [2] AbdelhafezF,XuJ,GoldbergJ,etal.Vitrificationin openandclosedcariersatdiferentcelstages:ases mentofembryosurvival,development,dna integrity andstabilityduringvaporphasestoragefortransport [J].BMCBiotechnol,2011,11:29. [3] AndrasN,MarinaG,KristinaV, 等. 小 鼠 胚 胎 实 验 操 作 手 册 [M]. 孙 青 原, 陈 大 元 译.3 版. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社,2006: , [4] 鲁 栋 梁, 崔 曙, 陈 在 贤.EDS 40 玻 璃 化 液 冻 存 小 鼠 4 细 胞 胚 胎 的 研 究 [J]. 四 川 医 学,2012,33(2): ( 下 转 第 129 页 )
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