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1 硕 士 学 位 论 文 论 文 题 目 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 研 究 生 姓 名 指 导 教 师 姓 名 专 业 名 称 研 究 方 向 论 文 提 交 日 期 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 张 艳 刘 励 军 急 诊 医 学 心 肺 脑 复 苏 2012 年 3 月
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3 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 中 文 摘 要 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 中 文 摘 要 第 一 部 分 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 心 肺 复 苏 后 大 鼠 神 经 功 能 及 形 态 学 的 影 响 目 的 : 评 估 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 心 肺 复 苏 自 主 循 环 恢 复 (Return of spontaneous circulation, ROSC) 后 24h 大 鼠 神 经 功 能 学 的 影 响, 观 察 窒 息 大 鼠 ROSC 后 24h 神 经 细 胞 的 凋 亡 情 况 方 法 : 健 康 雄 性 SD 大 鼠 46 只, 随 机 分 为 五 组, 实 验 对 照 组 常 温 复 苏 组 亚 低 温 复 苏 组 硫 酸 镁 复 苏 组 和 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组, 除 对 照 组 6 只 外, 其 余 各 组 均 10 只 建 立 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 模 型 观 察 复 苏 组 大 鼠 ROSC 时 间 复 苏 成 功 率 ROSC 后 存 活 率 及 神 经 功 能 缺 损 评 分 (Neuro Deficit Score, NDS), 透 射 电 子 显 微 镜 (transmission electron microscope, TEM) 对 形 态 学 改 变 进 行 观 察 结 果 :1. 复 苏 组 各 组 NDS 与 对 照 组 比 较 有 显 著 性 差 异 (P<0.01), 各 复 苏 组 间 比 较 无 显 著 性 差 异 (P>0.05) 2. 透 射 电 镜 观 察 显 示 : 与 实 验 对 照 组 比 较, 复 苏 组 神 经 元 细 胞 神 经 胶 质 细 胞 和 髓 鞘 均 发 生 了 凋 亡 改 变 ; 与 常 温 复 苏 组 比 较, 亚 低 温 复 苏 组 硫 酸 镁 复 苏 组, 尤 其 是 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组 相 应 的 凋 亡 改 变 减 轻 结 论 :1. 心 肺 复 苏 后 大 鼠 神 经 功 能 严 重 受 损 2. 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 可 以 减 少 凋 亡 的 发 生 关 键 词 : 窒 息 法 ; 心 肺 复 苏 模 型 ;NDS; 电 镜 ; 凋 亡 I
4 中 文 摘 要 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 第 二 部 分 : 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 心 肺 复 苏 后 大 鼠 海 马 caspase-3mrna 和 bcl-2mrna 表 达 的 影 响 目 的 : 探 讨 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 心 肺 复 苏 后 大 鼠 海 马 caspase-3mrna 和 bcl-2mrna 表 达 的 影 响 及 作 用 机 制 方 法 : 雄 性 SD 大 鼠 78 只, 随 机 分 为 五 组, 实 验 对 照 组, 常 温 复 苏 组, 亚 低 温 复 苏 组, 硫 酸 镁 复 苏 组 和 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组, 后 四 组 再 分 三 个 亚 组, 即 ROSC 后 6h 12h 和 24h 组, 每 个 时 间 点 6 只 建 立 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 模 型, 评 价 各 时 间 点 大 鼠 NDS 水 平, 逆 转 录 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 检 测 海 马 bcl-2 mrna 和 caspase-3 mrna 表 达 的 变 化 结 果 :1. 与 对 照 组 比 较, 复 苏 组 caspase-3 mrna 的 表 达 显 著 增 加 (P<0.01) 与 常 温 复 苏 组 比 较, 亚 低 温 复 苏 组 硫 酸 镁 复 苏 组 及 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组 caspase-3mrna 的 表 达 显 著 减 少 (P < 0.05 ); 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组 caspase-3mrna 的 表 达 水 平 较 亚 低 温 复 苏 组 及 硫 酸 镁 复 苏 组 显 著 减 少 (P<0.05) 2. 复 苏 组 bcl-2mrna 的 表 达 水 平 与 对 照 组 相 比 显 著 增 加 (P<0.01) 复 苏 组 各 组 间 表 达 水 平 无 显 著 性 差 异 (P>0.05) 3. 复 苏 组 各 组 大 鼠 NDS 与 对 照 组 比 较, 有 显 著 性 差 异 (P<0.01) 复 苏 组 各 组 间 无 显 著 差 异 性 (P>0.05) 结 论 :1. 亚 低 温 和 硫 酸 镁 治 疗 可 通 过 减 少 Caspase-3mRNA 的 表 达 抑 制 凋 亡, 起 到 一 定 的 脑 保 护 作 用 2. 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组 可 显 著 减 少 凋 亡 基 因 的 表 达, 联 合 应 用 有 协 同 抗 凋 亡 的 作 用 关 键 词 : 心 肺 复 苏 ; 亚 低 温 ; 硫 酸 镁 ; 凋 亡 作 者 : 张 艳 指 导 教 师 : 刘 励 军 II
5 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 英 文 摘 要 Effect of Hypothermia and Magnesium Sulfate Treatment on the rats Neuron Apoptosis after Cardiopulmonary Resuscitation by Asphyxia Method Abstract PartⅠEffect of Hypothermia and Magnesium Sulfate Treatment on neurological function and morphological changes after Cardiopulmonary Resuscitation in rats Objective: To evaluate the effect of Hypothermia and Magnesium Sulfate Treatment on neurological function after cardiopulmonary resuscitation, and to observe neuronal apoptosis in rats at the 24th hour after restoration of spontaneous circulation by Asphyxia Method. Methods: Forty-six male SD rats were randomly divided into five groups: control group, normothermic group, mild hypothermia group, magnesium sulfate group and mild hypothermia combines magnesium sulfate group. Each group was 10 except the control group was 6. The cardiac arrest model in rats was duplicated by Asphyxia method. To observe the time of ROSC the percentage of successful resuscitation the percentage of survival on 24th hour after ROSC and Neuro Deficit Score, transmission electron microscope(tem)was used to observe the morphological changes. Results: 1. There were significant differences in NDS level between resuscitation groups and control group (P<0.01), but there were no significant difference among resuscitation groups (P>0.05). 2. TEM Observation: Compared with the control group, the resuscitative group was detected that apoptosis appeared in nerve cell neuralgia cell myelin sheath. Compared with the normothermic group, the mild hypothermia group the magnesium sulfate group and especially the mild hypothermia and magnesium sulfate III
6 英 文 摘 要 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 group had the apoptosis reduced Conclusion: 1. The neurological function were severely impaired in rats after cardiopulmonary resuscitation. 2. Mild hypothermia and Magnesium Sulfate Treatment can reduce neuronal apoptosis. Keywords: Asphyxia method; Model of Cardiopulmonary Resuscitation; Neuro Deficit Score; Transmission electron microscope; Apoptosis PartⅡ Effect of mild hypothermia and Magnesium Sulfate Treatment on the expression level of caspase-3mrna and bcl-2mrna in rat s hippocampus Objective: To explore the effect and the mechanism of mild hypothermia and magnesium sulfate treatment on the neuron apoptosis in rats after cardiopulmonary resuscitation. Methods: Seventy-eight male SD rats were randomly divided into five groups: control group (n=6), normothermic group, mild hypothermia group, magnesium sulfate group and mild hypothermia combining magnesium sulfate group. The later four groups were again divided into three subgroups: ROSC 6, 12 and 24 hours groups (each subgroup n =6). The cardiac arrest model in rats was duplicated by Asphyxia method. To evaluate Neuro Deficit Score at corresponding time. The expression of caspase-3 and bcl-2mrna expression level in brain tissue was measured by RT-PCR. Results: 1. Compared with that in the control group, the caspase-3 expression were increased significantly (P<0.01) in the resuscitation group. Compared with that in the normothermic group, the expression of caspase-3mrna were reduced significantly (P< 0.05) in the mild hypothermia group, the magnesium sulfate group and the mild hypothermia combining magnesium sulfate group. The expression level of caspase-3mrna in the mild hypothermia and magnesium sulfate group was lower than IV
7 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 英 文 摘 要 that of the mild hypothermia group and the magnesium sulfate group (P<0.05).2. The expression level of bcl-2mrna in the resuscitation groups were higher than the control group (P<0.01). There were no significances among the resuscitation groups. 3. There were significant differences in NDS level between the resuscitation groups and the control group, but there were no significant difference among the resuscitation groups. Conclusion: 1. The mild hypothermia and magnesium sulfate can inhibit the apoptosis by reducing the expression of aspase-3mrna, so it has protective effect to the brain injuries. 2. Mild hypothermia and magnesium sulfate can significantly reduce the expression of apoptosis gene; Mild hypothermia and magnesium sulfate have developed synergism effect. Keywords: Cardiopulmonary arrest; Mild hypothermia; Magnesium sulfate; Apoptosis; Written by Zhang Yan Supervised by Liu Li-jun V
8 目 录 引 言...1 第 一 部 分 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 心 肺 复 苏 后 大 鼠 神 经 功 能 及 形 态 学 的 影 响...3 材 料 与 方 法...3 结 果...10 讨 论...22 结 论...24 附 图...25 第 二 部 分 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 心 肺 复 苏 后 大 鼠 海 马 caspase-3mrna 和 bcl-2mrna 表 达 的 影 响...26 材 料 与 方 法...26 结 果...32 讨 论...56 结 论...60 参 考 文 献...61 综 述 : 治 疗 性 亚 低 温 减 轻 脑 缺 血 后 神 经 元 凋 亡 的 分 子 作 用 机 制...67 中 英 文 对 照 缩 略 词 表...78 攻 读 学 位 期 间 公 开 发 表 的 论 文...79 致 谢...80
9 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 引 言 引 言 随 着 心 肺 复 苏 术 的 发 展 和 普 及, 越 来 越 多 的 心 脏 骤 停 患 者 得 以 恢 复 自 主 循 环, 但 这 些 自 主 循 环 恢 复 (Return of spontaneous circulation, ROSC) 后 且 存 活 的 患 者 多 遗 留 有 严 重 的 意 识 障 碍, 给 社 会 和 家 庭 带 来 沉 重 的 负 担 因 此, 如 何 进 一 步 提 高 ROSC 后 患 者 的 神 经 功 能 预 后, 即 改 善 脑 功 能 已 成 为 心 肺 复 苏 领 域 研 究 的 热 点 和 难 点 [1-4] 目 前 研 究 显 示 [1], 凋 亡 的 活 化 是 脑 缺 血 / 再 灌 注 损 伤 级 联 瀑 布 样 反 应 的 一 个 重 要 后 果 细 胞 凋 亡 是 一 个 复 杂 的 过 程, 凋 亡 的 信 号 转 导 通 路 之 间 彼 此 联 系, 构 成 了 一 个 复 杂 的 网 络 各 种 通 路 之 间 相 互 促 进 和 制 约 等 复 杂 的 病 理 生 理 变 化 仍 需 进 一 步 研 究 以 阐 明 其 确 切 的 关 系 心 脏 骤 停 后 脑 缺 血 / 再 灌 注 可 触 发 多 种 细 胞 信 号 途 径, 导 致 细 胞 的 损 伤 甚 至 死 亡 这 种 缺 血 和 再 灌 注 损 伤 造 成 的 细 胞 死 亡 中, 除 部 分 细 胞 由 于 损 伤 强 度 大 而 发 生 细 胞 胀 亡 外, 细 胞 凋 亡 的 增 加 成 为 神 经 元 细 胞 数 量 减 少 的 另 一 重 要 原 因 研 究 表 明 [5], 心 脏 骤 停 后 存 活 的 患 者, 在 复 苏 成 功 后 数 小 时 至 数 天 均 有 神 经 元 凋 亡 的 发 生, 特 别 是 在 丘 脑, 海 马 及 大 脑 皮 层 神 经 细 胞 凋 亡 的 发 生 与 心 脏 骤 停 后 缺 血 缺 氧 导 致 N- 甲 基 -D- 天 ( 门 ) 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartate, NMDA) 受 体 上 调 有 关,NMDA 受 体 的 激 活 可 使 钙 离 子 内 流 增 加 并 使 氧 自 由 基 产 生 增 加 ; 而 细 胞 核 内 钙 离 子 信 号 又 控 制 了 许 多 关 键 的 细 胞 核 功 能, 包 括 基 因 的 转 录 DNA 的 复 制 和 细 胞 核 被 膜 的 裂 解 等 在 缺 氧 期 间 核 内 钙 离 子 超 负 荷 可 能 还 引 起 促 凋 亡 蛋 白 如 Bax 表 达 的 增 加, 以 及 抗 凋 亡 因 子 Bcl-2 (B-cell lymphoma/leukemia-2,b 细 胞 淋 巴 瘤 / 白 血 病 基 因 2) 的 减 少 已 有 研 究 表 明, Bcl-2 能 通 过 调 节 细 胞 浆 及 核 内 钙 离 子 的 浓 度, 以 及 抗 氧 化 作 用 而 抑 制 凋 亡 的 发 生 [6] 另 外, 凋 亡 通 路 的 最 后 执 行 者 天 冬 氨 酸 特 异 性 半 胱 氨 酸 蛋 白 酶 3(Cysteine-containing aspartate-specific proteases 3, Caspase 3) 在 细 胞 凋 亡 过 程 中 占 有 极 为 重 要 的 作 用, 因 为 不 论 是 内 源 性 还 是 外 源 性 凋 亡 途 径, 都 会 涉 及 到 caspase-3 的 激 活 而 最 终 导 致 细 胞 的 凋 亡 研 究 表 明 脑 缺 血 缺 氧 后 caspase3 的 表 达 及 活 性 明 显 提 高, 故 此,caspase-3 表 达 的 高 低 可 以 反 映 细 胞 凋 亡 的 程 度 [7] [8] 低 温 治 疗 已 被 认 为 是 神 经 保 护 最 重 要 的 方 法 之 一 自 1987 年 Busto 等 发 现, 轻 1
10 引 言 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 度 低 温 可 明 显 减 轻 缺 血 缺 氧 后 脑 组 织 的 损 伤, 并 就 此 提 出 亚 低 温 的 概 念 这 使 得 低 温 的 脑 保 护 作 用 的 研 究 再 次 成 为 关 注 的 热 点 2002 年 新 英 格 兰 杂 志 发 表 了 两 篇 具 有 里 程 碑 意 义 的 前 瞻 随 机 多 中 心 的 对 照 研 究 [9-10], 其 结 果 表 明 治 疗 性 低 温 (32-34 ) 能 显 著 提 高 院 外 室 颤 患 者 复 苏 后 的 存 活 率 和 神 经 功 能 预 后 治 疗 性 低 温 ( 也 称 亚 低 温 ) 之 所 以 能 够 改 善 脑 功 能, 可 能 与 其 能 明 显 减 少 脑 缺 血 / 再 灌 注 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 数 量, 以 及 提 高 神 经 元 的 完 整 性 密 切 相 关 [11] 在 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 经 历 缺 血 / 再 灌 注 损 伤 过 程 中, 另 一 个 引 起 关 注 的 病 理 生 理 现 象 是 细 胞 内 钙 离 子 超 载 细 胞 浆 和 核 内 钙 离 子 超 负 荷 及 其 引 发 的 一 系 列 的 连 锁 反 应 是 促 使 凋 亡 途 径 启 动 的 重 要 环 节 因 此, 减 轻 或 阻 止 细 胞 内 钙 离 子 超 载 可 能 是 脑 复 苏 后 脑 保 护 的 关 键 环 节 之 一 与 钙 离 子 相 对 应 的 是 镁 离 子, 它 是 维 持 细 胞 功 能 另 一 个 重 要 的 二 价 阳 离 子, 它 不 仅 在 细 胞 增 殖 过 程 中 发 挥 重 要 作 用, 并 且 在 细 胞 代 谢 方 面, 如 维 持 细 胞 膜 Na + -K + -ATP 酶 活 性, 细 胞 内 外 离 子 稳 态 方 面 也 不 可 或 缺 研 究 还 发 现, 镁 离 子 在 凋 亡 中 也 扮 演 着 重 要 角 色, 镁 离 子 的 缺 乏 可 诱 导 细 胞 凋 亡 的 产 生 [12-14] ; 且 在 缺 血 缺 氧 性 脑 损 伤 中 镁 离 子 具 有 抗 神 经 元 凋 亡 的 作 用 镁 离 子 的 这 些 作 用 可 能 主 要 是 通 过 降 低 caspase-3 及 Bax 活 性, 并 上 调 bcl-2 [6, 而 起 到 抗 神 经 元 凋 亡 的 作 用 15] 另 外, 镁 离 子 其 它 抗 凋 亡 作 用 的 机 制 可 能 还 包 括 : 1 拮 抗 兴 奋 性 氨 基 酸 的 神 经 毒 性 作 用 ;2 抑 制 胞 浆 内 钙 离 子 超 载 ;3 减 少 自 由 基 形 成 ; 4 调 节 脑 血 流 量, 改 善 缺 血 区 血 液 供 应 等 综 上 所 述, 治 疗 性 低 温 ( 亚 低 温 ) 和 对 抗 钙 离 子 超 载 的 措 施 均 有 减 轻 缺 血 / 再 灌 注 损 伤 的 作 用, 但 是 这 两 种 措 施 的 联 合 是 否 能 够 进 一 步 减 轻 心 肺 复 苏 后 细 胞 损 伤 和 凋 亡, 尚 未 发 现 报 道 故 本 研 究 拟 通 过 透 射 电 镜 观 察 亚 低 温 硫 酸 镁 和 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 心 肺 复 苏 后 大 鼠 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响, 并 检 测 相 关 凋 亡 基 因 caspase-3 bcl-2 表 达 的 变 化, 试 图 验 证 亚 低 温 和 硫 酸 镁 联 合 干 预, 是 否 具 有 协 同 减 轻 心 肺 复 苏 后 缺 血 / 再 灌 注 所 致 脑 损 伤 的 作 用, 以 便 为 临 床 实 践 的 应 用 提 供 实 验 依 据 2
11 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 第 一 部 分 第 一 部 分 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 心 肺 复 苏 后 大 鼠 神 经 功 能 及 形 态 学 的 影 响 材 料 与 方 法 1 实 验 动 物 与 分 组 成 年 健 康 清 洁 级 雄 性 SD 大 鼠 46 只, 体 重 358±24g, 由 上 海 斯 莱 克 实 验 动 物 中 心 提 供, 许 可 证 号 :SCXK( 沪 ) 大 鼠 随 机 分 为 五 组, 除 对 照 组 6 只 外, 其 余 每 组 10 只 1.1 实 验 对 照 组 ( 假 手 术 组,Sham 组 ): 麻 醉 后 行 气 管 切 开 插 管, 股 动 静 脉 置 管, 不 进 行 窒 息 及 心 肺 复 苏, 机 械 通 气 1 小 时 后 处 死 动 物 取 材 (n=6 只 ) 1.2 常 温 复 苏 组 (N-R 组 ): 麻 醉 后 行 气 管 切 开 插 管, 股 动 静 脉 置 管, 窒 息 后 心 肺 复 苏, 窒 息 至 复 苏 过 程 中 维 持 大 鼠 正 常 体 温 (37±1 ),ROSC 后 立 即 用 生 理 盐 水 0.4ml/kg 静 推, 然 后 自 股 静 脉 通 路 予 1ml/kg/h 泵 入, 维 持 6h 1.3 亚 低 温 复 苏 组 (H-R 组 ):ROSC 后 立 即 用 冰 袋 迅 速 降 温, 在 15min 内 将 体 温 降 至 33±1 ( 以 肛 温 监 测 代 替 脑 温 ), 全 身 亚 低 温 治 疗 维 持 6h ROSC 后 立 即 用 生 理 盐 水 0.4ml/kg 静 推, 然 后 自 股 静 脉 通 路 1ml/kg/h * 6h 泵 入 1.4 硫 酸 镁 复 苏 组 (M-R 组 ):ROSC 后 立 即 用 10% 硫 酸 镁 (MgSO 4 )40mg/kg 静 推, 然 后 自 股 静 脉 通 路 泵 入 100mg/kg/h * 6h 窒 息 至 复 苏 过 程 中 维 持 大 鼠 正 常 体 温 (37±1 ) 1.5 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组 (H-M 组 ):ROSC 后 立 即 用 冰 袋 进 行 物 理 降 温, 在 15min 内 将 体 温 降 至 33±1 ( 以 肛 温 监 测 代 替 脑 温 ), 全 身 亚 低 温 治 疗 维 持 6h 同 时 在 ROSC 后 予 MgSO 4 40mg/kg 静 推, 然 后 100mg/kg/h * 6h 由 股 静 脉 泵 入 2 主 要 实 验 仪 器 和 试 剂 2.1 实 验 仪 器 (1) 动 物 呼 吸 机 (ALC-V8A, 上 海 奥 尔 科 特 生 物 科 技 有 限 公 司 ) 3
12 第 一 部 分 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 (2) 多 导 心 电 监 护 仪 (HEWLETT PACKARD Viridia 24C,Germany) (3) 血 气 分 析 仪 (GEM Premier 3000, 美 国 实 验 仪 器 有 限 公 司 ) (4) 透 射 电 子 显 微 镜 (H-600 型, 日 立 集 团 有 限 公 司 ) (5) 超 薄 切 片 机 (EMUC6 型, Leica 公 司, 德 国 ) 2.2 主 要 试 剂 (1) 水 合 氯 醛 ( 批 号 : , 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ) (2) 盐 酸 肾 上 腺 素 注 射 液 ( 批 号 :110504, 上 海 禾 丰 制 药 有 限 公 司 ) (3)5% 碳 酸 氢 钠 ( 批 号 : , 江 苏 正 大 丰 海 制 药 有 限 公 司 ) (4)25% 硫 酸 镁 ( 批 号 : , 天 津 药 业 焦 作 有 限 公 司 ) (5)0.9% 氯 化 钠 注 射 液 ( 批 号 :1H82F5, 中 国 大 冢 制 药 有 限 公 司 ) (6) 戊 二 醛 ( 中 国 医 药 集 团 上 海 化 学 试 剂 公 司 ) 3 溶 液 配 制 (1)3.6% 水 合 氯 醛 : 将 3.6g 水 合 氯 醛 加 入 100ml 生 理 盐 水 中 配 制 而 成 (2)1% 肾 上 腺 素 : 将 1mg(1ml) 肾 上 腺 素 加 入 99ml 生 理 盐 水 中, 配 制 成 终 浓 度 1% 肾 上 腺 素 (3)10% 硫 酸 镁 溶 液 : 将 25% 硫 酸 镁 40ml 加 入 到 60ml 生 理 盐 水 中 配 制 成 终 浓 度 为 10% 硫 酸 镁 溶 液 (4)0.2mol/L 磷 酸 缓 冲 液 (PBS) 的 配 制 : 取 2.6g 磷 酸 二 氢 钠 (NaH2PO4 H2O) 和 29g 磷 酸 氢 二 钠 (NaHPO4 12H2O) 加 双 蒸 水 至 500ml, 调 整 PH 值 至 7.4 (5)2.5% 戊 二 醛 (20ml) 配 制 :25% 戊 二 醛 1ml, 加 入 5ml 0.2mol/L PBS, 用 双 蒸 水 定 容 至 10ml, 调 整 PH 值 至 7.3~7.4 4 窒 息 法 心 肺 复 苏 模 型 的 建 立 大 鼠 术 前 不 禁 食, 自 由 进 水 按 照 无 菌 要 求 进 行 手 术 操 作 心 肺 复 苏 模 型 参 照 [16] Hendrickx 等 所 建 立 的 方 法 进 行, 并 加 以 改 进 3.6% 水 合 氯 醛 (1 ml /100 g) 腹 腔 注 射 麻 醉 后, 将 大 鼠 固 定 于 操 作 台 上, 心 电 监 护 标 准 肢 体 导 联 连 续 监 测 心 电 变 化 将 肛 温 探 头 用 石 蜡 油 润 滑 后 插 入 肛 门 深 约 4cm, 持 续 肛 温 监 测 以 替 代 脑 温 监 测 气 管 切 4
13 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 第 一 部 分 开 插 管 ( 以 动 物 专 用 呼 吸 机 内 附 Y 形 气 管 插 管 进 行 ), 以 24G 套 管 针 行 左 侧 股 动 脉 置 管, 成 功 后 接 压 力 换 能 器, 监 测 有 创 动 脉 血 压, 用 稀 释 的 肝 素 盐 水 间 断 性 冲 管 在 右 侧 股 静 脉 建 立 静 脉 通 路 操 作 完 成 稳 定 10 min 后, 予 机 械 通 气 1 min, 呼 吸 机 参 数 如 下 : 呼 吸 频 率 40 次 /min 潮 气 量 7mL/kg 吸 氧 浓 度 100%; 然 后 将 吸 氧 浓 度 改 为 21% 继 续 通 气 4min 采 用 呼 气 末 夹 闭 气 管 导 管 模 拟 窒 息,CA 判 定 标 准 如 下 [17] : 收 缩 压 (systolic blood pressure, SBP) 25 mm Hg, 并 持 续 3 min 此 后 开 始 复 苏, 予 机 械 通 气 ( 呼 吸 频 率 60 次 /min, 潮 气 量 7 ml/kg, 吸 氧 浓 度 100%), 同 时 以 食 指 和 中 指 进 行 胸 外 心 脏 按 压, 频 率 200 次 /min, 按 压 深 度 为 大 鼠 胸 廓 前 后 径 1/3 复 苏 开 始 10 s 后, 经 股 静 脉 注 射 肾 上 腺 素 (0.01mg/kg) ROSC 的 标 志 : 出 现 自 主 心 律 和 SBP 60 mm Hg, 并 持 续 10 min 以 上 [17] 复 苏 15min 未 建 立 自 主 循 环 者 则 放 弃 在 复 苏 后 采 动 脉 血 0.5ml 查 血 气 指 标 ( 予 补 充 等 量 生 理 盐 水 ), 调 整 呼 吸 机 参 数, 必 要 时 予 5% 碳 酸 氢 钠 注 射 液 1mmol/kg 经 股 静 脉 推 注, 使 动 脉 二 氧 化 碳 分 压 维 持 在 35mmHg 左 右 ROSC 后 常 温 组 及 硫 酸 镁 复 苏 组 肛 温 均 控 制 在 (37±1 ),ROSC 后 亚 低 温 复 苏 组 及 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组 肛 温 控 制 在 (33±1 ), 维 持 此 低 温 状 态 6h 硫 酸 镁 复 苏 组 和 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组 在 复 苏 后 由 股 静 脉 予 负 荷 剂 量 40mg/kg 静 推, 然 后 100mg/kg/h 由 股 静 脉 泵 入 持 续 6h, 常 温 复 苏 组 和 亚 低 温 组 给 予 同 等 剂 量 的 生 理 盐 水 在 观 察 时 点 进 行 [16] 神 经 功 能 缺 损 评 分, 然 后 断 头 取 脑 获 取 脑 组 织 标 本 整 个 实 验 过 程 按 Utstein 模 式 执 行 复 苏 后 0.5~1 小 时 内 大 鼠 的 自 主 呼 吸 已 恢 复, 可 及 早 脱 机, 脱 机 后 初 期 给 予 面 罩 吸 纯 氧 ROSC 后 l 小 时, 若 大 鼠 基 本 生 命 体 征 平 稳, 拔 除 气 管 插 管, 缝 合 气 管 插 管 切 口, 缝 合 颈 部 皮 肤, 单 独 放 于 鼠 笼 置 于 25 的 恒 温 空 调 屋 中 对 于 亚 低 温 和 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 复 苏 组, 亚 低 温 6h 后 室 温 下 (25 ) 进 行 缓 慢 复 温 ( 复 温 速 度 0.25~0.5 /h) 在 大 鼠 MAP<60 mm Hg 时 给 予 生 理 盐 水 3ml/kg 静 推 以 提 升 血 压 另 外, 在 大 鼠 脱 机 后 早 期 不 能 进 食, 次 日 予 20ml/kg 的 生 理 盐 水 分 三 次 进 行 皮 下 注 射 以 补 充 血 容 量 [18] 5
14 第 一 部 分 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 5 复 苏 相 关 指 标 的 观 察 5.1 复 苏 时 间 : 指 从 开 始 CPR 至 确 认 自 主 循 环 恢 复 的 时 间 5.2 ROSC 率 : 每 组 恢 复 自 主 循 环 的 动 物 数 占 该 组 动 物 总 数 的 百 分 (%) 5.3 ROSC 后 24h 存 活 率 : 观 察 自 主 循 环 恢 复 后 24h 点 动 物 存 活 数 占 该 组 动 物 数 的 百 分 比 率 (%) 6 神 经 功 能 缺 损 评 分 在 24h 点 对 大 鼠 进 行 神 经 功 能 评 分, 评 分 共 7 项, 总 分 为 80 分,80 分 正 常,0 分 表 示 脑 死 亡 [19] 由 受 过 专 业 训 练 的 两 名 实 验 员 对 各 组 大 鼠 进 行 双 盲 评 分, 取 两 者 平 均 值 神 经 功 能 评 分 从 80 分 ( 最 好 ) 到 0 分 ( 脑 死 亡 ), 具 体 评 分 项 目 包 括 : 意 识 正 常 昏 睡 或 无 反 应, 眼 睛 睁 开 反 应 评 价 觉 醒 程 度, 呼 吸 功 能 用 正 常, 异 常 ( 过 度 通 气 或 通 气 不 足 ) 或 缺 失 反 应 评 价 脑 干 反 射 用 下 列 项 目 进 行 评 估 :1 对 食 物 气 味 的 嗅 觉 反 应 ;2 视 觉, 大 鼠 对 光 照 射 的 头 部 运 动 反 应 ;3 瞳 孔 对 光 反 射 ;4 角 膜 反 射 ;5 惊 觉 反 射 ;6 胡 须 触 觉 刺 激 ;7 吞 咽 液 体 或 固 体 的 测 试 运 动 的 评 估 包 括 正 常 异 常 和 运 动 缺 失 感 觉 的 评 估 包 括 四 肢 对 疼 痛 的 反 应 运 动 行 为 的 评 估 包 括 步 态 协 调 性 和 平 衡 能 力 ( 平 衡 木 测 试 : 将 大 鼠 放 于 宽 2cm 长 1m 的 木 条 上, 木 条 一 端 悬 空, 距 离 地 面 0.5m 正 常 大 鼠 可 平 稳 站 立, 如 果 大 鼠 尝 试 却 不 能 持 续 保 持 平 稳 或 出 现 跌 落 则 为 异 常, 放 置 于 木 条 上 即 刻 出 现 跌 落 为 平 衡 能 力 缺 失 其 他 行 为 反 射 评 估 有 :1 翻 正 反 射 ( 将 大 鼠 背 侧 放 置, 能 纠 正 至 正 常 体 位 );2 转 弯 行 为 ( 动 物 行 走 在 0.5m 的 通 道 中, 能 够 在 最 后 15cm 处 返 回 );3 视 觉 定 位 ( 动 物 被 提 起, 能 够 在 视 觉 上 对 自 己 的 位 置 和 深 度 进 行 定 位 );4 负 向 趋 地 反 应 ( 将 大 鼠 头 向 下 放 置 于 与 地 面 呈 45 斜 面 的 平 板 上, 动 物 可 回 转 180 往 上 爬 ) 最 后 一 项 评 分 是 癫 痫 的 发 生 情 况 NDS 标 准 详 见 表 1 7 透 射 电 镜 观 察 7.1 标 本 取 材 在 ROSC 后 24h 行 NDS 评 分 后 予 10% 氯 化 钾 2ml 处 死 大 鼠, 切 开 胸 骨 暴 露 心 脏, 直 视 下 将 穿 刺 针 经 左 心 室 穿 入 升 主 动 脉, 剪 开 右 心 耳, 经 心 脏 快 速 灌 注 生 理 盐 水 6
15 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 第 一 部 分 250ml 至 右 心 房 流 出 液 变 清, 迅 速 断 头 取 脑, 分 离 出 大 脑 的 海 马 组 织, 迅 速 放 入 预 冷 的 2.5% 戊 二 醛 固 定 液 中, 将 其 切 成 体 积 约 1mm 3 的 组 织 块, 置 于 2.5% 戊 二 醛 固 定 液 中,4 保 存, 备 作 透 射 电 镜 用 7.2 透 射 电 镜 制 样 将 2.5% 戊 二 醛 固 定 的 组 织 块 进 行 制 样, 具 体 操 作 流 程 见 流 程 图 制 样 完 毕 后 用 TEM 观 察, 拍 照 ( 注 : 在 电 镜 观 察 拍 照 过 程 中 的 实 验 员 对 各 组 大 鼠 标 本 的 观 察 为 单 盲 观 察 ) 8 统 计 学 分 析 采 用 SPSS16.0 统 计 软 件 处 理 数 据, 进 行 统 计 分 析 计 量 资 料 采 用 均 数 ± 标 准 差 ( x ±s) 表 示, 多 组 间 均 数 比 较 采 用 方 差 分 析 计 数 资 料 的 比 较 采 用 χ 2 检 验 P<0.05 为 差 异 有 显 著 性 7
16 第 一 部 分 亚 低 温 联 合 硫 酸 镁 干 预 对 窒 息 大 鼠 心 肺 复 苏 后 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 表 1 大 鼠 神 经 功 能 损 伤 评 分 表 评 分 项 目 全 身 行 为 学 缺 陷 :1 意 识 状 态 2 觉 醒 状 态 3 呼 吸 脑 干 反 射 :1 嗅 觉 2 视 觉 3 瞳 孔 反 射 4 角 膜 反 射 5 惊 觉 反 射 6 胡 须 触 觉 反 射 7 吞 咽 运 动 运 动 评 估 : 力 量 ( 左 侧 和 右 侧 分 别 测 试 并 评 分 ) 感 觉 评 估 疼 痛 ( 左 侧 和 右 侧 分 别 测 试 并 评 分 ) 运 动 行 为 :1 步 态 协 调 2 平 衡 能 力 行 为 :1 翻 正 反 射 2 负 向 趋 地 反 射 3 视 觉 定 位 4 转 弯 行 为 癫 痫 发 作 评 分 标 准 正 常 [10], 昏 睡 [5], 昏 迷 [0] 自 主 睁 眼 [3], 刺 痛 睁 眼 [1], 不 睁 眼 [0] 正 常 [6], 异 常 [0], 缺 失 [0] ( 总 分 =19) 存 在 [3], 缺 失 [0] 存 在 [3], 缺 失 [0] 存 在 [3], 缺 失 [0] 存 在 [3], 缺 失 [0] 存 在 [3], 缺 失 [0] 存 在 [3], 缺 失 [0] 存 在 [3], 缺 失 [0] ( 总 分 =21) 正 常 [3], 强 直 的 / 无 力 的 [1], 无 运 动 / 瘫 痪 [0] ( 总 分 =6) 疼 痛 刺 激 迅 速 躲 避 [3], 反 应 弱 或 异 常 [1], 无 躲 避 反 应 [0] ( 总 分 = 6) 正 常 [3], 异 常 [1], 缺 失 [0] 正 常 [3], 异 常 [1], 缺 失 [0] ( 总 分 = 6) 正 常 [3], 异 常 [1], 缺 失 [0] 正 常 [3], 异 常 [1], 缺 失 [0] 正 常 [3], 异 常 [1], 缺 失 [0] 正 常 [3], 异 常 [1], 缺 失 [0] ( 总 分 =12) 无 癫 痫 发 作 [10], 局 灶 性 癫 痫 发 作 [5], 广 泛 性 癫 痫 发 作 [0] ( 总 分 =10) 8
0 年 上 半 年 评 价 与 考 核 细 则 序 号 部 门 要 素 值 考 核 内 容 考 核 方 式 考 核 标 准 考 核 ( 扣 原 因 ) 考 评 得 3 安 全 生 产 目 30 无 同 等 责 任 以 上 道 路 交 通 亡 人 事 故 无 轻 伤 责 任 事 故 无 重 大 质 量
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