70 林业科学研究第 30 卷 noidessubsp.mongolicaindividuals,withobservedheterozygosity(h O )rangedfrom0.083to0.875andexpectedhet erozygosity(h E )rangedfrom0.180

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厉贝
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1 林业科学研究 2017,30(1):69 74 ForestResearch DOI: /j.cnki.lykxyj 基于沙棘转录组序列开发 EST SSR 分子标记李珊珊 1, 曾艳飞 1, 何彩云 1 1,2, 张建国 (1. 国家林业局林木培育重点实验室, 中国林业科学研究院林业研究所, 北京 ; 2. 南京林业大学南方现代林业协调创新中心, 江苏南京 ) 摘要 :[ 目的 ] 本研究通过对蒙古沙棘向阳品种的转录组序列进行 SSR 引物开发, 为沙棘亲本分析遗传多样性和遗传育种等研究提供支持 [ 方法 ] 利用已测得的转录组序列进行分析和筛选, 整理具有 SSR 位点的序列, 进行引物设计, 随机挑选 179 条引物进行验证 [ 结果 ] 得到具有 SSR 位点的 EST 序列条, 其中, 单核苷酸二核苷酸和三核苷酸重复基元分别占 62.77% 21.82% 和 13.77%; 二核苷酸重复基元类型以 AT 和 AG 为主, 三核苷酸重复基元类型以 AAG ATC 和 ATA 为主 9291 条序列设计出扩增 EST SSR 位点的引物, 随机合成的 179 对引物中, 142 对扩增成功, 选取其中 92 个位点的扩增产物上机检测,40 个 SSR 位点 (43.48%) 呈现多态对扩增稳定且峰图清晰的 17 个多态位点的进一步分析, 得到蒙古沙棘天然群体在各位点的观测杂合度 (H O ) 为 , 期望杂合度 (H E ) 为 [ 结论 ] 本研究开发出的 EST SSR 标记, 为后期进行沙棘属植物遗传多样性分析遗传图谱构建及分子育种等研究提供了重要支持关键词 : 沙棘 ; 转录组 ;EST-SSR; 引物中图分类号 :S 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) DevelopmentofEST SSRMarkersBasedonSeabuckthorn TranscriptomicSequences LIShan shan 1,ZENGYan fei 1,HECai yun 1,ZHANGJian guo 1,2 (1.KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivation,StateForestryAdministration,ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry, Beijing ,China;2.ColaborativeInnovationCenterofSustainableForestryinSouthernChina,NanjingForestryUniversity, Nanjing ,Jiangsu,China) Abstract:[Objective]ThetranscriptomesofHippophaerhamnoidessubsp.mongolicacv Xiangyang wereana lyzedtodesignprimersanddevelopest SSR (ExpresedSequenceTags SimpleSequenceRepeat)markers. [Method]TheprimersweredesignedandtheSSRwasdevelopedbasedontheExpresedSequence.179pairsof primerswerevalidatedrandomly.[result]17383ssr ESTs(SSR containingest)wereidentified.ofthetotal EST SSRs,themononucleotiderepeatwasthemostdominanttype,accountingfor62.77%,folowedbydinucleoti derepeatsandtrinucleotiderepeats,accountingfor21.82% and13.77%,respectively.atandagwerethemost abundantdinucleotidemotifs;aag,atcandatawererepeateddominantmotifsintrinucleotide.basedonthese SSR ESTs,9291pairsofEST SSRprimersweredesigned;179pairsofprimerswererandomlyselectedandcom poundedforpcramplification,amongwhich142lociwereamplifiedsuccesfuly.amplificationproductionsof92 lociweregenotypedusingthednaanalyzer,ofwhich40loci(43.48%)wereidentifiedaspolymorphism.atlast, 17locithatamplifiedhighlysuccesfulyandgenotypedeasilywererecommendandanalyzedfornaturalH.rham 收稿日期 : 基金项目 : 林业公益性行业科研专项 ( ) 作者简介 : 李珊珊 (1989 ), 女, 河北邢台人, 硕士, 主要从事分子生态学研究. 通讯作者 E mail:zhangjg@caf.ac.cn

2 70 林业科学研究第 30 卷 noidessubsp.mongolicaindividuals,withobservedheterozygosity(h O )rangedfrom0.083to0.875andexpectedhet erozygosity(h E )rangedfrom0.180to0.750.[conclusion]theseest SSRmarkerswouldbevaluableforfurther researchongeneticdiversityanalysis,linkagemappingconstructionandmolecularbreedingofthegenushippophae. Keywords:Hippophaerhamnoides;transcriptome;EST SSR;primer 微卫星又称为简单序列重复 (SSR), 短串联重复 (STR), 是以 1 6 个碱基为重复单位组成的短串联重复 DNA 序列 [1] 微卫星分子标记是基于 PCR 技术发展起来的一种分子遗传标记技术, 具有重复性好共显性遗传多态性位点含量高实验操作简单检测方法简便对 DNA 质量要求不高等优点 [2] 在亲本分析, 基因图谱构建, 确立遗传和进化关系, 遗传多样性分析等研究中得到了广泛的应用 [3] 微卫星依据其来源分为两类 : 基因组微卫星 (Genomic SSR) 和表达序列标签微卫星 (SSR,EST SSR) [4] EST SSR 是基于 EST 序列开发的 SSR, 相对于 Ge nomicssr 引物开发过程简单, 成本低, 在物种间通用性较强 [5] 随着基因组的发展,EST 序列的数目在公共数据库内迅速增长 (htp:// Nih.gov), 为 SSR 标记提供了一个庞大的资源 [2,6] 沙棘属 (Hippophae) 属于胡颓子科 (Elaeagnace ae), 是多年生落叶灌木小乔木或乔木, 风媒传粉, 雌雄异株, 具有固氮作用, 适应性极强, 主要分布于中欧和中亚地区 [7] [7] [8] 依据 Sun 等和 Bartish 等学者的系统分类, 分为 7 个种和 8 个亚种沙棘是集生态效益经济效益和社会效益为一体的多用途树种, 因其果实富含 Vc 和沙棘油, 枝叶含高蛋白, 根系有根瘤等特点备受瞩目 [9] 近些年, 随着 DNA 分子标记技术的不断发展与完善, 针对沙棘遗传多样性亲缘关系和品种鉴定等的研究得到进展 [10], 如利用 RFLP ITS cpdna 等分子标记对沙棘进行了研究 [7-8,11], 但利用 SSR 分子标记对沙棘的研究较少, 同时目前开发可用的沙棘 SSR 引物较少, 仅有孙燕 [12] 琳等利用葡萄 SSR 引物筛选适用于沙棘的 SSR [13] 引物,Wang 等利用磁珠富集法开发的 9 对 SSR [14] 引物和 Jain 等利用 EST 开发的 11 对 EST SSR 引物为了丰富沙棘的 SSR 分子标记, 本研究通过对向阳沙棘转录组序列进行分析, 开发出大量 EST SSR 标记, 为沙棘亲本分析遗传多样性遗传育种等研究提供支持 1 材料与方法 1.1 植物材料及 DNA 提取本研究中涉及转录组测序的沙棘品种向阳 (H.rhamnoidessubsp.mongolicaalXiangyang) 是俄罗斯专家通过天然蒙古沙棘选育所得随机选取采自新疆青河县莫齐克村的天然种群蒙古沙棘中的 16 个个体, 采用植物全基因组 DNA 提取试剂盒 ( 北京天根生物公司 ) 从其叶片中提取总 DNA, 用于引物筛选和多样性检测 1.2 EST 序列来源 SSR 检测及 SSR 引物设计 EST 序列来源沙棘 EST 序列来源于本实验室对向阳品种的转录组测序所得收集向阳沙棘新鲜根茎叶提取 RNA, 构建 cdna 文库, 再利用 IluminaHiseq2000 测序平台 (IluminaInc) 进行高通量测序, 最后用 Trinity [15] 软件将测序序列拼接成无冗余的独立基因集, 即由 EST 序列组成的一个转录组该实验由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成所得转录组序列已提交到 NCBI 数据库, 序列号为 SRP EST SSR 位点统计和引物设计利用软件 MISA(htp://pgrc.ipk gatersleben.de/misa/misa.ht ml) 检测转录组序列中简单重复序列, 确定 SSR 位点 SSR 的搜索标准为 : 单二三四五和六核苷酸的最少重复次数分别为 , 同时搜索复合 SSR 对不同 SSR 类型在转录组中的密度分布进行统计根据 SSR 位点两端的保守区域, 利用 Primer 3 [16] 设计引物用于 SSR 位点扩增具体参数如下 : 引物长度为 20 28bp, 最适长度为 24bp;(G+C) 含量为 40% 65%, 最适为 50% 随机挑选 179 对预期扩增产物为 bp 重复单元为二或者三核苷酸的 SSR 引物, 交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 1.3 EST SSR 位点 PCR 扩增和筛选以 8 个蒙古沙棘个体的 DNA 为模板, 用上述 179 对引物进行 PCR 扩增筛选 PCR 反应体系为 10μL: 去离子水 3.6μL,2 MasterMix( 艾德莱 )5 μl;10μmol L -1 的 F 和 R 端引物各 0.2μL, 模板 DNA1μL( 约 ng) PCR 反应在 ABISys tem9700(appliedbiosystems,lifetechnologies) 上进行, 具体程序如下 :94 预变性 4min,30 个循环

3 第 1 期李珊珊, 等 : 基于沙棘转录组序列开发 EST SSR 分子标记 71 的 94 变性 30s,55 复性 30s,72 延伸 45s, 最后 72 延伸 10min 利用 1.2% 的琼脂糖凝胶对 PCR 产物进行检测筛选出能够扩增出目标片段的引物后, 利用 16 个蒙古沙棘个体进行多态性检测为节约成本, 采 [17] 用通用 M13 引物标记荧光的方法进行 PCR 扩增和检测 PCR 反应体系 20μL: 去离子水 13.5μL, 10 PCR 缓冲液 2μL,2.5mnol LdNTP1.6μL, 10μmol L -1 的 M13 荧光引物 0.8μL,10μmol L -1 的 F 和 R 端引物分别为 0.8μL 和 0.2μL,5U μl -1 LrTaqDNA 聚合酶 ( 大连宝生物 )0.1μL, 模板 DNA1μL( 约 ng) PCR 反应在 ABI System9700PCR 扩增仪 (AppliedBiosystems,Life Technologies) 上进行, 反应条件为 :94 预变性 4 min,30 个循环的 94 变性 30s,56 复性 30s,72 延伸 45s, 另加 8 个循环的 94 变性 30s,53 复性 30s,72 延伸 45s, 最后 72 延伸 10min 将 4 种带有不同荧光标记 (Fam,Hex,Rox 和 Tam ra, 上海生工 ) 的 PCR 产物各 0.3μL 与 9.0μL 的甲酰胺,0.5μL 的 Liz500 混合后 94 变性 5min, 变性产物在 ABI3130 测序仪上进行毛细管电泳, 最后利用 GeneMapperversion4.0(AppliedBiosystems,Life Technologies) 分析电泳结果得到基因型数据 1.4 沙棘 EST SSR 多态性分析从筛选出具有多态性 ( 等位基因数 2) 的引物中, 进一步筛选在蒙古沙棘个体中扩增成功率高且上机检测峰图明晰的 EST SSR 位点利用 GENA LEX6 软件计算每个位点在这 16 个沙棘个体中的等位基因数量观测杂合度 (H o ) 和期望杂合度 (H E ) 2 结果与分析 2.1 沙棘 ESR SSR 重复类型及频率对沙棘转录组中的 EST 序列去冗余后共收集条具有 SSR 位点的序列, 其中包括复合 SSR 类型序列 828 条, 因其特殊性不计入 SSR 类型分析在非复合的 SSR 类型中, 单核苷酸重复类型数量最多, 所占比例达到 62.77%(10392); 其次是二核苷酸和三核苷酸重复类型, 所占比例分别为 21.82% (3613) 和 13.77%(2279) 四核苷酸五核苷酸六核苷酸重复类型较少, 分别仅占 1.45%(240) 0.09%(15) 0.10%(16) 在所检测到的 3613 个二核苷酸重复 EST SSR 中,AT 和 AG 两种类型的重复基元出现的次数较多, 分别为 1814 个 (50.21%) 和 1521(42.10%) ( 图 1a) 在检测到的 2279 个三核苷酸重复中, AAG 为优势类型, 共 783 个 (34.36%),ATC 和 ATA 两种类型次之, 分别为 400 个 (17.55%) 和 395 个 (17.33%)( 图 1b) 图 1 沙棘 ESR SSR 二核苷酸 (a) 和三核苷酸 (b) 重复基元类型及其数量 Fig.1 Observedcountsofidentifiedmicrosatelitelocifordiferentrepeatsequencemotifsof(a)di nucleotideand (b)tri nucleotiderepeatsfromthetranscriptomesequencesofhippophae 2 2 ESR SSR 的引物设计与筛选利用 Primer3.0 为 9291 条 EST 序列设计了适宜的 SSR 扩增引物, 剩余的 8092 条序列没能得到合适的引物从设计的引物中随机挑选 179 对二核苷酸三核苷酸重复的 EST SSR 引物进行 PCR 扩增检测, 发现 142 个位点能够在预期片段大小的位置扩增出清晰的条带, 扩增效率为 79.33%

4 72 林业科学研究第 30 卷选择 92 个位点的引物进一步结合 M13 荧光引物扩增 16 个蒙古沙棘个体, 并在 ABI3130 测序仪上检测各位点扩增产物 ( 图 3), 发现 40 个位点在这些个体的扩增产物中找到 2 个以上的等位基因 ( 表 1), 即呈现出多态, 多态位点比率为 43.48% 从这 40 个多态位点中, 挑选出 17 个扩增效果稳定且峰图清晰的 EST SSR 位点, 其在所分析的天然蒙古沙表 1 沙棘 17 个多态 EST SSR 位点的引物信息棘种群中的等位基因个数为 2 6 个不等, 观测杂合度 (H O ) 为 , 期望杂合度 (H E ) 在 ; 分析得到该蒙古沙棘种群各位点平均期望观测杂合度为 0.488, 平均期望杂合度为这 17 个位点的引物序列信息扩增结果及多态性等见表 1 Table1 Informationof17HippophaeEST SSRlociintranscriptomesequencesandtestedwith16sample 退火温度等位基因数量等位基因大小观测杂合度期望杂合度引物编号引物序列 (5-3 ) 重复基元 Annealing Numberof Alelesize (H O )Observed (H E )Expected Primerpairs Primersequence(5-3 ) Repeatmotif temperatures/ aleles range/bp heterozygosity heterozygosity Hs008 F:ACTCATGCCCATCACCTTTT (AT) R:GCTCGTTGCCACTGTTACAA Hs032 F:GCAGTCCGGACAGTCAGAAA (GTT) R:CCAAAGCAAAACCACGCAGA Hs047 F:GTGCAAAAACCAGGAGTGCC (TAG) R:TACAACCCTGCTACCCCCAT HS097 F:CAGCCGCCCTCTGACTAAAA (AT) R:GCTTCGAGGAAGAATTACAGGGA Hs100 F:CTTGGCTGCCCATCTCGATT (TA) R:ACGAATAAACCCCAGAACAGT Hs111 F:ACAACTCAGTCCGTACATATGGT (AG) R:GCGGCTGGAATCATCTTGGA Hs146 F:ACAAGCGTGTGAGGATTCTT (CTA) R:CGATGAGAGGCCGGCATATT Hs149 F:ACATTCCCCTTTCACAGACCC (TAT) R:CCAGTTGGGATTTTCTTGTTTGAGT Hs177 F:TGCGTCTTGATTTGGCACTTC (AC) R:ACTCCAGGGTTCTCAAAGGA Hs192 F:TCGCTTCAAAAGGGAACAACA (AT) R:GCACACATAACACCCGCTTC Hs195 F:TCCTCCTGACTGTCTCGACC (TA) R:CCCTAGTGAAGCTCAGTTTTGC Hs227 F:CCTTAGCATCACCAAAGCGC (ACA) R:CCTTGTGTGCACATTTCTGCA Hs278 F:CGCAGCAGGTTGACAGACTA (CT) R:TCAAACAACGCACTTTGGGC Hs282 F:TGTCTTGCTACTCCTCCTGC (CA) R:ACAGCGTGTTAGGAAAGTTGC Hs284 F:CCCATCTTGCCTCATGCTGT (AT) R:ACCACAAGTCACGGAAATCCT Hs296 F:TGAACGCTCATGATCAAAACGT (TGA) R:CAGCTGGTGGAAGTTGAGGT Hs297 F:TCATGCTCACTTCCGTTGCT (CAC) R:AGGATTGAGCGGCGTGTTAA 平均 Mean 讨论 3.1 沙棘 EST SSR 特性分析本研究通过对具有 SSR 位点的条 EST 序列的分析发现, 在沙棘转录组序列中, 单核苷酸重复类型的 SSR 最多, 其次是二核苷酸重复类型和三核苷酸重复 ; 四核苷酸, 五核苷酸和六核苷酸重复类型的总和不到 1.7% 由于单核苷酸的特殊性, 大

5 第 1 期李珊珊, 等 : 基于沙棘转录组序列开发 EST SSR 分子标记 73 多数研究不将其作为 SSR 的研究对象 [18] 因此, 忽略单核苷酸重复不计, 沙棘的 EST SSR 位点以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主, 这与目前大多数植物的研究一致 [19] 先前研究表明, 二核苷酸重复在许多种的基因组中是常见类型, 但是在编码区出现的频率低于非编码区, 编码区常见的重复类型为三核苷酸这可能是因为编码区的序列为密码子序列, 随着三核苷酸的增加或减少会改变阅读框架 [6], 但是不会引起移码突变 [20], 而本研究中, 二核苷酸重复类型所占比例高于三核苷酸重复类型, 不同于胡杨 EST SSR 的研究 [20] 这可能是由于不同研究搜索 SSR 的标准 (SSR 重复类型次数长度等 ) 不同造成的差异 [19] 在沙棘二核苷酸重复基元的 EST SSR 位点中, AT 和 AG 是出现次数最多的两种类型, 分别占 50 21% 和 42.10%; 在三核苷酸重复基元中,AAG 为优势重复类型, 占 34.36%,ATC 与 ATA 基元所占比例之和将近 35% 沙棘的重复基元的主要类型与白桦银杏杨树北美鹅掌楸火炬树蒙古栎等木本植物基本相同 [2], 与水稻高粱玉米等作物存在差异, 不同物种之间重复基元存在的差异可能与各研究所用 EST 来源及数目不同, 也可能与物种转录组的特异性等有关 [21] 3.2 沙棘 EST SSR 引物扩增效果及多态性本研究设计的 EST SSR 引物在天然蒙古沙棘种群中扩增效率较高, 达到 79.33% 剩余引物无法扩增的原因可能是 : 基因组 DNA 存在许多内含子片段,SSR 位点所设计的一端或两端引物的位置刚好位于内含子或者外显子剪切点, 致使引物在基因组中找不到结合位点 [19] 另外, 在引物的初筛过程中统一采用 55 退火进行 PCR, 这也可能造成最适退火温度低的引物无法成功扩增判断 SSR 分子标记可用性的主要依据是其多态性, 本研究通过对天然蒙古沙棘种群的 16 个个体分析, 发现 40 对具有多态性的引物, 多态比率为 43 48%, 低于胡杨 (P.euphraticaOliv.,52.5%) [20] 和中华猕猴桃 (Actinidia chinensis Planch., 81.25% ) [22], 高于银杏 (Ginkgo biloba Linn., 31.9%) [23] 对 17 个扩增稳定且上机峰图明细的位点进一步分析, 得到来自新疆的天然蒙古沙棘种群遗传多样性处于中等水平 (H O =0.488,H E = 0.514) 由于沙棘为雌雄异株, 所以沙棘种群的遗传多样性相对较高, 不同位点多样性水平差别较大, [13] 但是这些位点的平均多样性水平仍高于 Wang 等利用磁珠法开发的基因组 SSR 所估算的中国沙棘亚种的多样性这说明利用编码区的 SSR 位点估计的遗传多样性水平不一定低于基因组 SSR 位点 4 结论本研究利用 EST 序列成功开发了 40 对具有多态性的沙棘引物利用蒙古沙棘的 16 个样品对 2 种开发的引物进行多态性水平的检验和多态性相关分析, 发现利用序列数据开发的引物多样性高且多态性信息含量相对比较丰富, 可为沙棘属植物进行遗传多样性分析遗传图谱构建系统发育分析和分子育种等多个方面的研究提供有力的支持参考文献 : [1]TautzD.Hypervariabflityofsimplesequencesasageneralsourcefor polymorphicdna markers[j].nucleicacidsresearch,1989,17 (16): [2] 许玉兰, 蔡年辉, 康向阳, 等.EST SSR 标记的开发及其在木本植物中的分布特点 [J]. 中国农学通报,2012,28(4):1-7. [3]KaliaRK,RaiM K,KaliaS,etal.Microsatelitemarkers:ano verviewoftherecentprogresinplants[j].euphytica,2011,177 (3): [4] 程小毛, 黄晓霞.SSR 标记开发及其在植物中的应用 [J]. 中国农学通报,2011,27(5): [5] 赵罕, 朱高浦, 刘梦培, 等. 微卫星分子标记及其在林业中的应用 [J]. 世界林业研究,2013,26(6): [6]UenoS,MoriguchiY,UchiyamaK,etal.A secondgeneration frameworkfortheanalysisofmicrosatelitesinexpresedsequence tagsandthedevelopmentofest SSR markersforaconifer[j]. Cryptomeriajaponica.BMCGenomics,2012,13:136. [7]SunK,ChenX,MaR,etal.MolecularphylogeneticsofHippophae L.(Elaeagnaceae)basedontheinternaltranscribedspacer(ITS) sequencesofnrdna[j].plantsystematicsandevolution,2002, 235(1): [8]BartishIV,JeppsonN,NybomH,etal.PhylogenyofHippophae (Elaeagnaceae)inferedfromparsimonyanalysisofchloroplastDNA andmorphology[j].systematicbotany,2002,27(1): [9] 齐虹凌, 于泽源, 李兴国. 沙棘研究概述 [J]. 沙棘,2005,18 (2): [10] 李蓉, 于永涛.DNA 分子标记及在沙棘遗传育种中的应用展望 [J]. 国际沙棘研究与开发,2008,6(2): [11]WangA,SchluetzF,LiuJ.Molecularevidencefordoublemater naloriginsofthediploidhybridhippophaegoniocarpa(elaeagnace ae)[j].botanicaljournalofthelinneansociety,2008,156(1): [12] 孙燕琳, 阮成江, 金华. 沙棘 SSR 分子标记的开发 [J]. 安徽农业科学,2007,35(1): [13]WangA,ZhangQ,WanD,etal.NinemicrosateliteDNAprimers

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