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伯喻
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1 世界中医药 208 年月第 3 卷第期 25 银杏蜜环口服溶液对多发性脑梗死大鼠模型的影响徐立宋文婷姚明江 2 王益民王 2 勇王光蕊刘建勋 ( 中国中医科学院西苑医院基础医学研究所, 中药药理北京市重点实验室, 北京,0009;2 西安步长中医心脑病医院, 西安,70082) 摘要目的 : 银杏蜜环口服溶液是由银杏叶和蜜环菌组合而成的上市药物, 临床用于缺血性心脑血管疾病, 本研究探讨该药对大鼠多发性脑梗死 (MultipleCerebralInfacrtion,MCI) 模型的影响方法 : 将大鼠随机分为假手术组, 模型组, 金纳多组 (8mg/kg), 银杏叶提取物组 (9mg/kg), 天麻蜜环菌素片组 (600mg/kg), 天麻蜜环菌粉组 (300mg/kg), 银杏蜜环口服溶液组 (68mg/kg), 银杏蜜环口服溶液组 (309mg/kg) 从大鼠颈总动脉向大脑中动脉方向注射荧光微球混悬血清, 致使大脑动脉多发性阻塞, 造成大鼠多发性脑梗死模型灌胃给药 28d, 末次给药后观察药物对大鼠神经功能评分抓力血清 TNF α 脑内氨基酸类神经递质及脑组织形态学的影响结果 :MCI 模型大鼠神经功能有显著障碍, 抓力显著降低, 脑组织内谷氨酸 (Glu) 和 γ 氨基丁酸 (GABA) 水平显著升高, 血清 TNF α 水平升高, 与假手术组大鼠比较, 差异有统计学意义 (P<0 05) 组织学检查显示, 脑组织受损, 有明显的梗死灶, 神经细胞排列紊乱, 炎性细胞浸润等病理改变, 免疫组化显示 CD34 GFAP 有自修复的表达,NeuN 低表达给药 28d 后, 银杏蜜环口服溶液神经功能明显改善, 抓力增加, 脑内 Glu 和 GABA 显著降低, 血清 TNF α 水平显著下降, 与模型组比较, 差异有统计学意义 (P<0 05~0 0); 病理结果显示, 银杏蜜环口服溶液可保护脑缺血, 改善由此导致的神经缺损程度 ; 免疫组化结果显示, 银杏蜜环口服溶液可明显促进血管内皮细胞胶质细胞及神经元修复银杏蜜环口服溶液对神经功能的改善和脑内 Glu GABA 水平的降低作用显著优于银杏叶提取物 ; 增加抓力作用显著优于天麻蜜环菌 ; 降低血清 TNF α 水平程度则同时优于两者结论 : 银杏蜜环口服溶液有保护脑缺血, 改善神经功能的作用, 复方优于单一组份, 且有一定的协同增效的作用关键词银杏蜜环口服溶液 ; 多发性脑梗死 ; 氨基酸 ; 肿瘤坏死因子 ; 神经功能 EfectsofYinxingMihuanOralSolutionforRatModelswithMultipleCerebralInfarction XuLi,SongWenting,YaoMingjiang,WangYimin 2,WangYong 2,WangGuangrui,LiuJianxun (InstituteofBasicMedicalSciencesofXiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,BeijingKeyLaboratory ofpharmacologyofchinesemateriamedica,beijing0009,china;2xi anbuchangtraditionalchinese Cardio CerebrovascularDiseaseHospital,Xi an70082,china) Abstract Objective:ToinvestigatetheefectsofYinxingMihuanOralSolutioncombinedwithGinkgoLeafExtractsandArmila rielameleapowders(gle/amporalsolution),amarketeddrugforischemiccardio cerebrovasculardiseasesinratmodelsof multiplecerebralinfarction(mci).methods:sdratswererandomlydividedintoshamgroup,modelgroup,ginatongroup(8 mg/kg),extractofginkgobiloba(egb)group(9mg/kg),armilariameleatabletsgroup(600mg/kg),armilariamelea Powdergroup(300mg/kg),andYinxingMihuanOralSolutiongroups(68mg/kgand309mg/kg).Themultiplecerebralin farctionratmodelswereestablishedbyinjectionoffluorescentmicrospheresuspensionserousintothedirectionofmiddlecerebral arterythrougharteriacarotiscommunis.afterintragastricadministrationfor28days,theefectsofeachgroupweretested,inclu dingneurologicalfunctionscore,graspingforce,concentrationofserumtnf α,levelofaminoacidneurotransmitersandpatho morphologyinbraintisuewereinvestigated.results:comparedwiththeshamgroup,significantneurologicalfunctionimpairment wasobservedinthemcimodel,withreducedgraspingforce,aswelashigherlevelofglutamate(glu)andγ aminobutyricacid (GABA)inthebrainandTNF αintheserum.pathologicalobservationshowedbraindamagewithsignificantinfarcts,disorgan izedneuronsarangementandinflammatorycelinfiltration.theimmunohistochemistryanalysisindicatedself repairexpresionof CD34andGFAP,andlowexpresionofNeuN.AfteradministrationofYinxingMihuanOralSolutionfor28days,theneurological functionwasimproved,andthegraspingforcewasincreased.thelevelofgluandgabainthebrainandtnf αintheserum weredecreasedcomparedwiththoseinthemodelgroup(p<0 05~0 0).PathologicalobservationshowedthattheYinxingMi huanoralsolutioncouldimprovethedegreeofneurologicalfunctionimpairment,andtheimmunohistochemistryanalysisindicated theyinxingmihuanoralsolutioncouldsignificantlypromotetherepairofcerebrovascularendothelialcel,gliaandneuron.be sides,theefectsofyinxingmihuanoralsolutiononimprovementofneurologicalfunctionandreducingthelevelofgluandgaba 基金项目 : 国家科技重大专项重大新药创制 (207ZX093008); 国家自然科学基金项目 (860367) 作者简介 : 徐立 ( ), 女, 大学本科, 研究员, 研究方向 : 脑血管药理学研究,E mail:xuli230@sina com 通信作者 : 刘建勋 ( ), 男, 博士, 研究员, 研究方向 : 药理学研究,E mail:liujx0324@sina com

2 26 WORLDCHINESEMEDICINE January208,Vol.3,No. inthebrainweresuperiorthanthatintheegbgroup;theefectofyinxingmihuanoralsolutioningraspingforcewassuperior thanthatinthearmilariameleapowdergroup;andtheefectofgle/amporalsolutioninreducingtheleveloftnf αinthe serumwassuperiortothatintheegbgroupandarmilariameleapowdergroup.conclusion:theyinxingmihuanoralsolution couldprotectcerebralischemiaandimproveneurologicalfunctionimpairment,andcombinationuseofginkgoleafextractsand ArmilarielaMeleaPowderswassuperiorinsinglecomponent,representedcertainsynergisticinteractionefect. KeyWords YinxingMihuanOralSolution;Multiplecerebralinfarction(MCI);Aminoacidneurotransmiters;Tumornecrosis factor;neurologicalfunction 中图分类号 :R285 5 文献标识码 :A doi:0.3969/j.isn 银杏叶提取物具有清除自由基, 调整循环系统, 抑制血小板活化因子, 抑制血小板聚集, 改善血液粘度和血流动力学等作用, 临床用于脑部及周围血流循环障碍天麻蜜环菌是与天麻伴生的真菌, 有类似于天麻的药理作用, 具有定惊熄风, 镇静安神抗眩晕和镇痛的作用, 临床用于治疗眩晕头痛, 惊风癫痫, 肢体麻木, 腰膝酸痛等症银杏蜜环口服溶液系由银杏叶提取物和天麻蜜环菌粉组成, 临床上用于治疗缺血性心脑血管疾病有研究表明该药可明显改善脑血流动力学和血液流变学指标 [], 减少 NIHSS 评分 [2], 但两者配伍使用的药理学优势鲜见报道本研究建立多发性脑梗死大鼠模型, 观察银杏叶提取物和天麻蜜环菌及两者配伍的药理学作用及机制材料与方法材料动物 SD 大鼠, 雄性,80~220g, 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 许可证号 : SCXK( 京 ) , 合格证号 : 药物银杏蜜环口服溶液 ( 邛崃天银制药有限公司生产, 批号 :6032), 银杏叶提取物 ( 邛崃天银制药有限公司生产, 批号 :60402), 天麻蜜环菌粉 ( 邛崃天银制药有限公司生产, 批号 :205027); 金纳多 ( 银杏叶提取物片, 德国威玛舒培博士药厂生产, 批号 :526063); 天麻蜜环菌片 ( 江苏神华药业有限公司生产, 批号 : ) 3 试剂与仪器谷氨酸 (Glu, 99%),- 氨基丁酸 (GABA, 99 5%),50% 氢氧化钠溶液 (NaOH),85% 磷酸 (H 3 PO 4 ), 邻苯二甲醛 (OPA), 均为 HPLC 级 ; 硼酸 (H 3 BO 3 ),ACS 级, 均为 Fluka 公司产品 ;β 巯基乙醇 (βme, 99 5%),BR 级, 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 ),ACS 级, 均为美国 SigmaAldrich 公司产品 ; 甲醇 (MeOH), 乙腈 (Acn),HPLC 级, 美国 FisherScientific 公司产品 ; 高氯酸 85%(HClO 4 ),AR 级, 北京化工试剂二厂产品 ; 水合氯醛, 上海国药集团化学试剂有限公司产品 ; 注射用青霉素钠粉针, 华北制药股份有限公司产品 TNF α 试剂盒, 批号 : GR , 由 abcam 公司提供抗体 CD34, GFP,NeuN, 均由 abcam 公司提供, 批号分别为 GR ,GR 和 GR CoulAr ray 5600 型高效液相电化学工作站 5600A 电化学检测器 582 液相泵 542 自动进样器 620 碳石墨电极 CTO 324 可控温元件箱, 美国 ESA 公司产品 AG2245 电子天平, 瑞士梅特勒托利多公司产品 UVPMS BY2 80~22μm 荧光微球, 美国 Cosp heric 公司产品, 批号 : YLS 3A 大小鼠抓力测定仪, 北京众实迪创科技发展有限责任公司台式 MIKRO22R 离心机, 德国 Hetich 公司产品超声破碎仪,VCX50PB 型, 美国 SONICS 公司针筒式微孔滤膜过滤器 : 水系 (0 22μm), 天津腾达过滤器厂产品 TELTA320pH 计, 上海 MetlerToledo 仪器公司产品 2 方法 [3 4] 2 分组与模型制备参考文献进行改良, 建立多发性脑梗死大鼠模型动物 4 0% 水合氯醛腹腔注射麻醉 (400mg/kg), 保温毯上仰卧位固定, 分离右侧颈总动脉 (CCA) 颈内动脉 (ICA) 及颈外动脉 (ECA), 结扎 ECA 并剪断,CCA 用丝线打活结暂时阻断, 用动脉夹夹闭 ICA 后, 于 ECA 剪开切口, 注射荧光微球混悬血清, 致使大脑动脉多发性阻塞假术组只分离 CCA 结扎 ECA, 不注射微球实验过程中保温毯设定温度 37~37 5, 保持大鼠体温术后 24h 动物进行神经学评分, 剔除 0 分及 4 分大鼠, 其余随机分组 : 假手术组, 模型组, 金纳多组 (8 mg/kg), 银杏叶提取物组 (9mg/kg), 天麻蜜环菌素片组 (600mg/kg), 天麻蜜环菌粉组 (300mg/kg), 银杏蜜环口服溶液组 (68mg/kg), 银杏蜜环口服溶液组 (309mg/kg) 2 2 给药方法术后 2d 开始灌胃给药, 给药体积为 5mL/kg( 银杏蜜环口服溶液高剂量组给药体积为 6mL/kg), 连续给药 28d 末次给药后动物进行神经功能评分, 并测定左前爪抓力麻醉取血, 分

3 世界中医药 208 年月第 3 卷第期 27 离血清冷冻保存, 并迅速取出大脑, 离后缘 4mm 处冠状切一刀, 分离纹状体, 液氮固化,-80 保存, 高效液相 - 电化学法测定中枢氨基酸类神经递质, 后脑区福尔马林固定, 经脱水包埋切片 HE 染色, 分析脑组织的病理变化, 免疫组化观察微血管胶质细胞和神经元的修复情况 2 3 行为学检测术后 24h 采用单盲法观察神经行为学以 Longa5 分制评分, 其标准为 : 无神经损伤症状,0 分 ; 不能完全伸展左侧前爪, 分 ; 向非缺血侧转圈,2 分 ; 行走时向非缺血侧倾倒,3 分 ; 不能自发行走, 意识昏迷,4 分给药 28d 后再次评分 2 4 抓力检测右手抓持大鼠后按放在抓力测定仪的抓力板上, 左手向前推住抓力板, 然后右手向后滑至鼠尾部, 左手轻轻松开抓力板, 待大鼠用左侧前爪用力抓住抓力板时及时加力后拉, 测定大鼠的最大抓力每个动物测定 3 次, 取平均值作为该大鼠的抓力值 2 5 Glu/GABA 测定 2 5 色谱条件 WatersXTeraMSC8 色谱柱 (3 0mm 50mm,2 5μm), 流动相 :00mM 磷酸氢二钠,20% 甲醇,3 5% 乙腈,pH 值 (6 70±0 02) ESA582 液相泵流速为 0 4mL/min; 电势 +50,+ 650mV; 柱温 30 氨基酸衍生程序 4, 吸取 50 μl 衍生工作液, 加入 25μL 脑匀浆样品中, 混合 3 次,30μL/ 次, 静置 min, 进样 20μL 分析氨基酸衍生试剂储备液的配制 27mg OPA, 溶于 ml 甲醇, 加入 5μLβME, 加入 9mL, 0 mol/l 硼酸溶液 (NaOH 调至 ph9 3),4 保存,5d 内使用衍生工作液的配制取 2 5mL 氨基酸衍生试剂储备液, 加入 7 5mL,0 mol/l 硼酸溶液 (NaOH 调至 ph9 3), 每日现用现配 2 6 病理学检查 HE 染色, 光镜下观察脑组织梗死灶神经元数目病变程度小胶质细胞增生程度等形态学指标 2 7 免疫组化脱水 0% 中性福尔马林固定, 再行梯度脱水 (70% 酒精 60min 80% 酒精 60min 90% 酒精 60min 95% 酒精 60min 00% 酒精 30 50min 00% 酒精 60min ), 透明 ( 二甲苯 60min 2), 浸蜡 ( 蜡 Ⅰ60min 蜡 Ⅱ 60min 蜡 Ⅲ30min ) 包埋: 用干净的石蜡融化后浇注组织切片 : 切片厚度 5μm 指标检测及检测方法采用 PV 6000 二步法免疫组化法采集图像及图像分析 :CREB 抗体着色表达细胞核, 其余抗体着色表达细胞胞质, 高倍镜下拍摄 3 个视野, 将采集的图像应用 Image proplus5 图像分析系统进行分析, 所得数据作免疫组织化学染色阳性信号累积光密度 (IOD), 以 IOD 值作为组织表达的定量标准累积光密度 (IOD)= 平均光密度 (AOD) 阳性面积 (A) 3 统计学方法剔除死亡动物后, 各组数据以均值 ± 标准差 ( x±s) 珋表示数据用 SPSS6 0 统计软件对数据进行统计学分析, 以 One wayano VA 进行统计学处理, 以 P<0 05 为差异有统计学意义 2 结果 2 对 MCI 大鼠神经功能评分和抓力的影响后 24h 进行为学评分, 假手术组动物神经行为未发现异常 ; 手术造成大鼠肢体行为学异常, 可见明显的神经功能损伤, 主要表现为左肩内收屈曲, 前肢无力, 向非缺血侧转圈, 行走时向非缺血侧倾倒等按评分标准进行评分, 去掉 4 分和 0 分大鼠并随机分组, 使组间差异没有统计学意义, 但与假手术组比较, 差异均有统计学意义 (P<0 0) 给药 28d 后, 模型组行为学功能变化不大, 与模型组比较, 对照药金纳多 8mg/kg 剂量组和银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 和 309mg/kg 均有改善神经症状的作用, 其中银杏蜜环口服溶液 68 mg/kg 作用最强, 309mg/kg 次之, 但与金纳多组比较差异无统计学意义 (P>0 05) 给药 28d 后, 与假手术组大鼠比较, MCI 模型组大鼠抓力显著减小, 差异有统计学意义 (P<0 0); 与模型组大鼠比较, 对照药金纳多组银杏叶提取物组以及银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 和 309mg/kg 组大鼠抓力均明显增加, 差异有统计学意义 (P<0 05~0 0), 与蜜环菌片及蜜环菌粉比较, 差异有统计学意义 (P<0 05~0 0) 见表 2 2 对 MCI 大鼠脑组织谷氨酸 (Glu) γ 氨基丁酸 (GABA) 的影响模型组大鼠脑组织内脑内谷氨酸 (Glu) γ 氨基丁酸 (GABA) 水平有所增加, 与假手术组大鼠比较, 差异有统计学意义 (P<0 0) 与模型组大鼠比较, 银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 组大鼠脑组织中 Glu 水平显著降低 ; 蜜环菌片 600mg/kg 组银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 组及 309mg/kg 组的 GABA 水平显著降低, 差异有统计学意义 (P<0 05~0 0), 金纳多银杏叶提取物和天麻蜜环菌粉因大鼠个体差异较大, 数据无统计学意义 (P>0 05) 银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 组与术

4 28 WORLDCHINESEMEDICINE January208,Vol.3,No. 表对 MCI 大鼠神经功能评分和抓力的影响 ( x±s) 珋分组剂量 (mg/kg) 神经功能评分 24h 28d 抓力 (g) 假手术组 (n=0) ±42 4 模型组 (n=0) 2 33± ± ±28 3 金纳多组 (n=0) ±0 4 80± ±59 4 银提组 (n=0) ±0 4 90± ±59 0 蜜环菌片组 (n=0) ± ± ±39 3 密环菌粉组 (n=0) ± ± ±47 2 银蜜高剂量组 (n=0) ±0 4 50± ±34 2 银蜜低剂量组 (n=0) ± ± ±37 7 注 : 与假手术组比较, P<0 05, P<0 0; 与模型组比较, P<0 05, P<0 0; 与银杏叶提取物比较, P<0 05, P<0 0; 与天麻蜜环菌片比较, P<0 05, P<0 0; 与天麻蜜环菌粉比较, P<0 05, P<0 0 金纳多组比较,Glu 水平比较, 差异有统计学意义 (P<0 05), 银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 组与金纳多银杏叶提取物组比较,GABA 水平下降, 差异有统计学意义 (P<0 05) 见表 2 表 2 对 MCI 大鼠脑组织 Glu GABA 的影响 ( 珋 x±s) 分组剂量 (mg/kg) Glu (μg/g) GABA (μg/g) 假手术组 (n=0) 823 2± ±8 4 模型组 (n=0) ± ±7 8 金纳多组 (n=0) ± ±58 8 银提组 (n=0) ± ±32 2 蜜环菌片组 (n=0) ± ±3 9 密环菌粉组 (n=0) ± ±66 2 银蜜高剂量组 (n=0) ± ±35 0 银蜜低剂量组 (n=0) ± ±44 2 TNF α 水平均显著降低 (P<0 05~0 0), 以天麻蜜环菌片 600mg/kg 组, 银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 和 309mg/kg 组最优, 天麻蜜环菌片 600mg/kg 组与金纳多组银杏叶提取物组以及天麻蜜环菌粉组比较, 差异均有统计学意义 (P<0 05~0 0); 银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 和 309mg/kg 组与金纳多组银杏叶提取物组天麻蜜环菌片组以及天麻蜜环菌粉组比较, 差异均有统计学意义 (P<0 0) 见表 3 注 : 与假手术组比较, P <0 05, P <0 0; 与模型组比较, P<0 05, P<0 0; 与金纳多组比较, P<0 05, P<0 0; 与银杏叶提取物比较, P<0 05, P<0 0 表 3 对 MCI 大鼠血清 TNF α 的影响 ( x±s) 珋分组剂量 (mg/kg) TNF α(ng/l) 假手术组 (n=0) 0 332±0 036 模型组 (n=0) 0 426±0 099 金纳多组 (n=0) ±0 033 银提组 (n=0) ±0 058 蜜环菌片组 (n=0) ±0 03 # 密环菌粉组 (n=0) ±0 085 银蜜高剂量组 (n=0) ±0 023 ## 银蜜低剂量组 (n=0) ±0 08 ## 注 : 与假手术组比较, P<0 05, P<0 0; 与模型组比较, P<0 05, P <0 0; 与金纳多组比较, P <0 05, P<0 0; 与银杏叶提取物比较, P<0 05, P<0 0; 与天麻蜜环菌片比较, P<0 05, P<0 0; 与天麻蜜环菌粉比较, # P<0 05, ## P< 对 MCI 大鼠血清 TNF α 的影响模型组大鼠血清 TNF α 水平升高, 与假手术组比较差异有统计学意义 (P <0 05) 与模型组比较, 金纳多 8mg/kg 组, 天麻蜜环菌片 600mg/kg 组, 银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 和 309mg/kg 组大鼠血清图各组脑组织病理形态比较注 :A 假手术组,B 模型组,C 金纳多组,D 银杏叶提取物组,E 天麻蜜环菌片组,F 天麻蜜环菌粉组,G 银杏蜜环口服溶液高剂量组,H 银杏蜜环口服溶液低剂量组 HE 染色, 对 MCI 大鼠脑组织病理形态的影响假手术组 : 脑组织均未见明显异常, 未见组织坏死灶及神经元变性 / 坏死模型组脑组织标本均可见脑组织坏死灶, 发生区域以单侧丘脑区坏死灶最为常见, 其次为大脑皮质和海马区 ; 主要表现为丘脑组织局灶性多灶性或片状坏死, 坏死区可见组织细颗粒样崩解或中央液化性坏死, 神经元变性 / 坏死 ( 皱缩浓染 ) 或消失, 可伴炎细胞浸润, 以及坏死区和周围组织胶质细胞增生组织空泡形成等坏死后修复反应 ; 大脑皮质可见明显组织坏死所致组织溶解缺失与模型组比较, 金纳多组银杏蜜环口服溶液 309mg/kg 组和 68mg/kg 组脑组织坏死发生率均明显降低, 程度亦有明显减轻, 这 3 组脑组织均以坏死后组织修复反应为主要表现, 坏死急性期的反应如组织崩解和液化性坏死发生率较低或程度较轻, 大脑皮质均

世界中医药 208 年月第 3 卷第期 29 表 4 对 MCI 大鼠脑 CD34 GFAP 和 NeuN 表达的影响 ( 珋 x±s) 分组剂量 (mg/kg) 灰度值 (IOD) CD34 GFAP NeuN 假手术组 (n=0) 309950±23768 53936±67822 824303±88587 模型组 (n=0) 3858±84500 229264±88993

47694±302329 65869±233062 银蜜高剂量组 (n=0) 68 45664±207672 3623±36432 650885±20485 银蜜低剂量组 (n=0) 309 46047±06479 349994±238799 63075±26349 注 : 与假手术组比较, P<0 05, P<0 0; 与模型组比较, P<0 05, P<0 0 未见明显组织坏死,

CD34 GFAP 阳性细胞数增多, 表明坏死组织在修复 ; 银杏蜜环口服溶液 309mg/kg 组和 68mg/kg 组脑组织的 CD34 和蜜环菌粉组银杏蜜环口服溶液 309mg/kg 组和 68mg/kg 组脑组织的 GFAP 着色更重, 与假手术组比较, 差异有统计学意义 (P<0 05), 表明修复作用强于模型组模型组 NeuN 正常着色减少, 坏死程度较重, 与假手术组比较,

5 世界中医药 208 年月第 3 卷第期 29 表 4 对 MCI 大鼠脑 CD34 GFAP 和 NeuN 表达的影响 ( 珋 x±s) 分组剂量 (mg/kg) 灰度值 (IOD) CD34 GFAP NeuN 假手术组 (n=0) ± ± ±88587 模型组 (n=0) 3858± ± ±27453 金纳多组 (n=0) ± ± ±93897 银提组 (n=0) ± ± ±2679 蜜环菌片组 (n=0) ± ± ± 密环菌粉组 (n=0) ± ± ± 银蜜高剂量组 (n=0) ± ± ±20485 银蜜低剂量组 (n=0) ± ± ±26349 注 : 与假手术组比较, P<0 05, P<0 0; 与模型组比较, P<0 05, P<0 0 未见明显组织坏死, 可明显缓解和改善动物脑梗死状态 ; 天麻蜜环菌片组脑组织坏死发生率和病变程度亦有降低, 但不如上述 3 组明显 ; 天麻蜜环菌粉组脑组织坏死发生率略有降低, 但病变程度无明显降低 ; 银杏叶提取物 9mg/kg 组脑组织坏死发生率和病变程度均无明显降低, 对缓解和改善动物脑梗死状态效果不显著见图 2 5 对 MCI 大鼠脑 CD34 GFAP 和 NeuN 表达的影响免疫组化结果显示, 模型组 CD34 GFAP 阳性细胞数增多, 表明坏死组织在修复 ; 银杏蜜环口服溶液 309mg/kg 组和 68mg/kg 组脑组织的 CD34 和蜜环菌粉组银杏蜜环口服溶液 309mg/kg 组和 68mg/kg 组脑组织的 GFAP 着色更重, 与假手术组比较, 差异有统计学意义 (P<0 05), 表明修复作用强于模型组模型组 NeuN 正常着色减少, 坏死程度较重, 与假手术组比较, 差异有统计学意义 (P<0 0); 天麻蜜环菌片 600mg/kg 组, 天麻蜜环菌粉 300mg/kg 组, 银杏叶提取物 9mg/kg 组及银杏蜜环口服溶液 68mg/kg 组的 NeuN 着色加强, 与模型组比较, 差异均有统计学意义 (P<0 05) 提示银杏蜜环口服溶液对缓解和改善动物脑梗死状态有促进作用, 对血管内皮胶质细胞以及神经元均有修复作用见表 4, 图 2~4 图 2 各组脑组织 CD34 表达的比较注 :A 假手术组,B 模型组,C 金纳多组,D 银杏叶提取物组,E 天麻蜜环菌片组,F 天麻蜜环菌粉组,G 银杏蜜环口服溶液高剂量组,H 银杏蜜环口服溶液低剂量组 400 图 3 各组脑组织 GFAP 表达的比较注 :A 假手术组,B 模型组,C 金纳多组,D 银杏叶提取物组,E 天麻蜜环菌片组,F 天麻蜜环菌粉组,G 银杏蜜环口服溶液高剂量组,H 银杏蜜环口服溶液低剂量组 400 图 4 各组脑组织 NeuN 表达的比较注 :A 假手术组,B 模型组,C 金纳多组,D 银杏叶提取物组,E 天麻蜜环菌片组,F 天麻蜜环菌粉组,G 银杏蜜环口服溶液高剂量组,H 银杏蜜环口服溶液低剂量组讨论 Glu 是哺乳动物中枢神经系统主要的兴奋性神经递质, 研究发现 Glu 可以有效促使培养的成人脊髓神经元以及成人海马神经元恢复神经电生理活动不仅如此, 生理状态下 Glu 通过激活兴奋性氨基酸受体对神经元的分化中枢神经系统的发育神经元胶质细胞耦联以及长时程增强效应和记忆的形成都有重要作用只有在脑缺血缺氧急性损伤等病理情况下,Glu 过度释放, 在神经元外周间隙大量积聚时, 可造成神经元损伤正常情况下,GABA 受体的激活起到抑制兴奋毒性镇静催眠抗惊厥降血压等生理作用, 但在脑缺血时, 其过度激活却对神经细胞有毒性作用 [5] 本研究结果显示, 模型大鼠脑组织内谷氨酸 (Glu) γ 氨基丁酸 (GABA) 水平显

6 30 WORLDCHINESEMEDICINE January208,Vol.3,No. 著升高, 银杏蜜环口服溶液经口给药 28d, 脑内 Glu 和 GABA 水平显著降低脑缺血发生后, 会有一列的细胞因子介导炎性反应, 肿瘤坏死因子 (TNF α) 就是其中之一 TNF α 是一种多肽类细胞因子, 主要是由激活的单核巨噬细胞分泌产生的细胞因子,T 细胞 B 细胞血管内皮细胞星形胶质细胞小胶质细胞和神经元都是其分泌细胞 [6] 脑缺血发生时,TNF α 能介导白介素 (IL ) 白介素 6(IL 6) 和前列腺素 E 2 (PGE2) 等多种炎性递质的产生 TNF α 还可以通过上调血管内皮细胞和白细胞上的黏附因子 (ICAM ) 的表达加剧脑内炎性反应, 增加血管通透性 [7] ;TNF α 还可刺激前列环素 (PGI2) 和血栓素 B2(TXB2) 的释放, 引起血管收缩和血小板聚集 TNF α 的水平与脑梗死以及行为障碍程度呈正相关 [8] 本研究观察到模型组大鼠血清 TNF α 水平升高, 银杏蜜环口服溶液组血清 TNF α 水平显著下降 CD34 GFAP NeuN 这 3 种抗体均可用来评价脑组织坏死后血管内皮胶质细胞及神经元的修复反应 [9 ],CD34 和 GFAP 染色越强, 说明组织修复越明显, 在组织坏死及修复早期, 这 2 种抗体染色较强, 在组织修复后期会逐渐减弱本研究观察到模型组大鼠 CD34 GFAP 染色强于假手术组, 表明脑损伤后脑组织有自修复的作用, 灌胃给药后, 银杏蜜环口服溶液组大鼠脑组织中 CD34 GFAP 染色强于模型组, 表明血管内皮胶质细胞的修复作用进一步增强 NeuN 正常着色减少越明显, 说明脑组织坏死越严重, 坏死周围组织 NeuN 加深, 可能提示坏死组织有修复趋势本研究观察到模型组 NeuN 着色减轻, 银杏蜜环口服溶液组着色加深, 表明有明显的组织修复作用此外, 银杏蜜环口服溶液对神经功能的改善和抑制脑内 Glu GABA 过度释放作用显著优于银杏叶提取物 ; 增加抓力作用显著优于天麻蜜环菌 ; 降低血清 TNF α 水平程度则同时优于两者结论 : 银杏蜜环口服溶液有保护脑缺血, 改善神经功能的作用, 复方优于单一组份, 且有一定的协同增效的作用参考文献 [] 孔伟. 银杏蜜环口服溶液对于脑缺血性疾病治疗的临床探究 [J]. 世界最新医学信息文摘,207,7(54): [2] 周欣满, 宋宝林. 银杏蜜环口服液治疗缺血性脑血管疾病疗效观察 [J]. 世界最新医学信息文摘,206,6(23):63. [3]TakagiK,MiyakeK,TaguchiT,etal.Failureinlearningtaskand losofcorticalcholinergicfibersinmicrosphereembolizedrats[j]. ExpBrainRes,997,4(2): [4]KanekoD,NakamuraN,OgawaT.Cerebralinfarctioninratsusing homologousbloodemboli:developmentofanewexperimentalmodel [J].Stroke,985,6(): [5] 徐立, 宋文婷, 林成仁, 等. 塞络通胶囊对大鼠多发性脑梗死恢复期 Glu 和 GABA 合成以及 NMDA 受体亚型表达的影响 [J]. 药学学报,202,47(7): [6] 杨金升. 肿瘤坏死因子在脑卒中时的表达及作用 [J]. 国外医学脑血管疾病分册,996,4(2): [7] 杨延林, 武继彪, 隋在云. 肿瘤坏死因子与脑缺血 [J]. 浙江中西医结合杂志,2009,9():60 6. [8] 张明义, 韩俊英, 张蕴, 等. 血清肿瘤坏死因子 α 对急性缺血性脑卒中患者预后的影响 [J]. 中国现代神经疾病杂志,2007,7(3): [9] 朱惠斌, 陈懿, 谭琥, 等. 脑泰方提取物对局灶性脑缺血大鼠 CD34 表达的影响 [J]. 中药新药与临床药理,20,22(2):4 44. [0] 闫世军, 何晓明, 李昕华, 等. 局灶性脑缺血预处理星形胶质细胞 GFAP 表达变化 [J]. 中国实验诊断学,2009,3(0): [] 耿倩, 邹玉, 薛茜. 康脑液对脑缺血再灌注大鼠 GFAP 和 NeuN 表达的影响 [J]. 中国临床药理学杂志,202,28(): ( 收稿责任编辑 : 张文婷 ) ( 上接第 24 页 ) [3] 李磊, 任建勋, 林治荣, 等. 丹酚酸 A 不同给药途径对犬急性心肌缺血影响 [J]. 四川中医,206,4(5): [4] 湛月娥, 孙莉莎, 程玉芳, 等. 丹酚酸 B 对犬心肌耗氧量的影响 [J]. 实用医学杂志,2006,22(9): [5] 董亚琴, 修春英, 朱小香, 等. 急性缺氧对心包经循行线上经皮氧分压及心功能的影响 [J]. 福建中医药大学学报,204,24():6 8. [6] 丁兰婷, 李晟, 江勤, 等. 黄蜀葵花总黄酮对麻醉犬血流动力学及心肌耗氧量的影响 [J]. 中药药理与临床,203,29(3): [7] 鄢晓平, 黄煜, 彭亚飞, 等. 银杏叶提取物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制 [J]. 中国老年学杂志,207,5(): [8] 陈家欢, 黄仁彬, 何萍, 等. 银杏叶提取物对心脏血流动力学和冠脉流量的影响 [J]. 广西中医学院学报,207,37(3): ( 收稿责任编辑 : 王明 )

22 WORLDCHINESEMEDICINE January208,Vol.3,No. 材料与方法材料动物健康杂种犬 36 只, 雌雄各半, 体质量 4 0~20 0kg, 由北京沙河通利试验动物养殖场, 许可证号 :SCXK( 京 ) 本实验过程均遵守美国国立卫生院倡导的实验

22 WORLDCHINESEMEDICINE January208,Vol.3,No. 材料与方法材料动物健康杂种犬 36 只, 雌雄各半, 体质量 4 0~20 0kg, 由北京沙河通利试验动物养殖场, 许可证号 :SCXK( 京 ) 本实验过程均遵守美国国立卫生院倡导的实验世界中医药 208 年月第 3 卷第期 2 银杏蜜环口服溶液改善犬急性心肌缺血的研究任建勋郭浩李磊林成仁 2 王益民王 2 勇史跃马彦雷刘建勋 ( 中国中医科学院西苑医院基础医学研究所, 中药药理北京市重点实验室, 北京,0009;2 西安步长中医心脑病医院, 西安,70082) 摘要目的 : 观察银杏蜜环口服溶液对犬急性心肌缺血的保护作用方法 :36 只犬随机分为 6