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舰戚
5 years ago
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!"#$## %' 基础研究氨基末端激酶信号通路参与电刺激大鼠三叉神经节偏头痛模型降钙素基因相关肽表达调控张金璐陈新林吕海侠刘勇罗国刚西安交通大学第一附属医院神经内科陕西西安医学部神经生物学实验室陕西西安摘要目的探究 #$! 氨基末端激酶 #$! %#"'"$% 信号转导通路对电刺激大鼠三叉神经节 ( 偏头痛模型中降钙素基因相关肽 )(*+ 表达调控的作用方法成年雄性,- 大鼠随机分为空白对照组假手术组模型组 -.,/0 模型组,+10 模型组,+10 模型组采用电刺激大鼠单侧 ( 制作偏头痛模型选择 $% 信号通路特异性阻滞剂,+1 为干预药物观察偏头痛造模前后的行为学变化各组大鼠处理后 ""' 检测 ( 中磷酸化 $% 蛋白 #$% 和 $% 蛋白表达量并计算磷酸化比率免疫组织化学染色检测 )(*+ 表达量结果大鼠造模后前肢挠头次数增加爬笼次数减少 1 模型组假手术组 -.,/0 模型组,+10 模型组大鼠 ( 内 #$% 比率较空白对照组明显升高 1,+10 模型组 ( 内 #$% 比率较模型组,+10 模型组明显降低 1 模型组 ( 内 )(*+ 表达量较空白对照组,+10 模型组明显升高 1 模型组刺激侧 ( 内 )(*+ 表达量明显高于未刺激侧结论电刺激大鼠单侧 ( 可使偏头痛急性发作过程中关键的神经血管活性肽 )(*+ 表达升高引发大鼠行为学变化且 $% 信号通路参与了 ( 内 )(*+ 的表达调控过程关键词偏头痛三叉神经节降钙素基因相关肽 )(*+$%,+1 中图分类号 * 文献标志码 11!"#$%#%!"! '!#!%"#!''!"!%"#!#!%!"%#%%##!" %($#! )2% 3# 45 # / (!#99 -"'":%"!'9";':":3 $ 97 "' 3 4'':%"!'93 $ 97 "' ","")""'3 ) ()* # # '( ')"# * ##""+,-.," /" """"$0#"0!$10"$.10"" $.10"/", *#""#$.1 "/"#" ') "') * "#" / " +,-., * "#" # "##*# 1*##*# * 1')'), *# "0!$10""$.10" # 1*$.10"** "" $.10"1+,-., *# " #"$.10"1 "## 收稿日期 11 修回日期 11 基金项目国家自然科学基金资助项目 ' $" ''$##"+' 通讯作者罗国刚 # 优先出版 ***#((#"-11!"!

2 期张金璐陈新林吕海侠等 #$! 氨基末端激酶信号通路参与电刺激大鼠三叉神经节偏头痛模型降钙素基因相关肽表达调控 #(# "# " #') * ') * #+,-., +,-.)(,##"" +,-. ' (')$.1 偏头痛是神经科一种常见的慢性复发性疾病给患者家庭和社会带来沉重负担偏头痛的发病机制尚未完全阐明较为广泛接受的是三叉神经 # 血管学说电刺激大鼠三叉神经节 '9"99 ( 可以诱发三叉神经支配区血浆蛋白外渗以降钙素基因相关肽 9""#'"""")(*+ 为代表的血管活性肽类物质释放增加局部脑膜血流变化等非特异性 # 炎症反应偏头痛发作与血清内 )(*+ 水平变化的 1 显著相关性是三叉神经 # 血管学说的核心本研究前期实验证实细胞内有丝分裂型细胞内丝裂原激活的蛋白激酶.+ 信号转导通路中的 2* 和 )#$! 氨基末端激酶 $% 通路均参与了 ( 离体培养后 )(*+ 表达上调本研究旨在探究 $% 信号通路对电刺激大鼠 ( 偏头痛模型中 )(*+ 表达的调控作用 / 材料与方法 // 主要试剂与器材同心圆电极.''" 公司 )(*+ 特异性抗体公司 # $! 氨基末端激酶 $% 磷酸化 #$! 氨基末端激酶 #$% 特异性抗体 ), 公司 $% 信号通路特异性抑制剂,+1), 公司 9 溶于二甲基亚砜 -.,/ 中制成母液浓度为 14 < 保存工作液仍使用 -.,/ 稀释推荐浓度为 14 /01 动物分组及电刺激偏头痛模型制作选择,+; 级,- 雄性大鼠 1 只体质量 9 由西安交通大学医学部实验动物中心提供并获得西安交通大学动物实验管理委员会批准造模电刺激 ( 偏头痛模型方法为 94 水合氯醛全身麻醉大鼠并固定头顶正中剪毛十字切开皮肤刮除软组织暴露颅骨表面标记前囟利用立体定位仪定位右侧刺激侧前囟后旁开位置牙科钻钻孔缓慢将电极插入深度约 1 连接同心圆电极 # 导线 # 电流输出装置调整恒定输出电流周期波宽 1 持续时间 1 # 刺激结束后将电极缓慢垂直提拉拔出电极缝合头皮切口并擦涂红霉素软膏大鼠侧卧至麻醉复苏观察大鼠的行为学变化将大鼠随机分为对照组假手术组模型组 -.,/0 模型组,+10 模型组,+10 模型组对照组不做任何手术处理或者药物干预假手术组仅在电刺激部位使用牙科钻打孔电极插入 1 但不进行电刺激其余各组均造模其中模型组仅进行电刺激 ( 偏头痛造模 -.,/0 模型组同时进行干预药物,+1 的溶剂 -.,/ 侧脑室注射,+10 模型组,+10 模型组同时分别进行干预药物 1 14,+1 侧脑室注射 /0 免疫组织化学法检测 *) 表达将大鼠用 94 多聚甲醛灌注固定解剖 ( 进行冰冻切片晾干于 < 保存湿盒中复温 +=, 溶液浸泡后用 44' 3# 浸泡 +=, 冲洗后使用 44 / 溶液浸泡并冲洗用 44 山羊血清室温封闭弃去擦干滴加兔抗大鼠 )(*+ 抗体室温孵育后 < 过夜次日滴加羊抗兔二抗试剂辣根过氧化物酶试剂室温分别孵育后冲洗擦干配制 -= 显色脱水透明封片每组选择张倍镜图片使用 6# 9"#+'+!1 进行平均吸光度值和累积吸光度值 6 分析 /0.!"#! 检测 ' + 和 + 表达将大鼠使用冰生理盐水灌注固定解剖 ( 提取蛋白并煮样进行电泳设置参数 > > 转膜后将 +>-; 膜置于牛奶中室温封闭使用 +=, 稀释一抗封膜后室温孵育 < 摇床过夜次日加二抗 1 室温孵育结束后 +=, 洗膜暗室内显影对胶片使用 69" $3 软件进行灰度值 -+6 分析并利用获得数据计算每组 #$% 比率 /0 统计学处理本研究采用 +,, 统计软件进行数据录入和处理采用 ('# ++'1 进行图表绘制采用均数? 标准差? 来表示计量资料使用检验对两个样本均数进行单因素分析使用方差分析对多个样本进行单因素分析 1 为差异具有统计学意义 1 结果 1/ 偏头痛模型对大鼠行为学的影响预实验与正式实验阶段共对只模型组大鼠进行了造模前和造模后为期的行为学前肢挠头爬笼过度理毛观察以? 表示并对前后数据分别进行两!"!

西安交通大学学报医学版第卷独立样本均数检验造模大鼠的前肢挠头次数明显增加而爬笼次数明显减少过度理毛次数差异未见统计学意义图图 /

'9"' 平均前肢挠头次数 = 平均爬笼次数 ) 平均过度理毛次数与造模前比较 1 101 偏头痛模型及 (22/1 对 + 磷酸化的影响各组大鼠分别干预后用 ""' 检测

#,/0 模型组大鼠 ( 内 #$% 比率明显升高值分别为假手术组较对照组 # $% 比率明显升高 @ 而与模型组之间无明显差异 @ 但无超过模型组趋势,+10 模型组 ( 内

( 进行免疫组织化学染色并进行和 6 分析显示模型组 ( 内 )(*+6 明显高于对照组 @ 和,+10 模型组 @ 而,+10 模型组与空白对照组无明显差异 @

图 1 各组大鼠内 + 和 ' + 表达及 ' + + 比率变化 ;9""'":#$%$%"': #$%$% "9'! 分别为对照组假手术组模型组 -.

3 西安交通大学学报医学版第卷独立样本均数检验造模大鼠的前肢挠头次数明显增加而爬笼次数明显减少过度理毛次数差异未见统计学意义图图 / 电刺激大鼠三叉神经节模型塑造前后的大鼠行为学变化 ;9*"'9"":'":"'""!'9"' 平均前肢挠头次数 = 平均爬笼次数 ) 平均过度理毛次数与造模前比较偏头痛模型及 (22/1 对 + 磷酸化的影响各组大鼠分别干预后用 ""' 检测 ( 内 $% 与 #$% 并进行灰度值 -+6 分析进一步计算 #$%$% 比率并进行单因素方差分析结果显示与空白对照组相比假手术组模型组 -.#,/0 模型组大鼠 ( 内 #$% 比率明显升高值分别为假手术组较对照组 # $% 但无超过模型组趋势,+10 模型组 ( 内 #$% 而,+10 图 10 偏头痛模型及 (22/1 对内 *) 表达的影响取空白对照组模型组以及,+10 模型组各只大鼠 ( 进行免疫组织化学染色并进行和 6 分析显示模型组 ( 内 )(*+6 明显高于和,+10 而,+10 组之间比较差异均无统计学意义图另外对于模型组大鼠右刺激侧左未刺激侧 ( 内 )(*+ 表达情况进行检测右侧刺激侧 )(*+ 表达情况明显高于左侧图图 1 各组大鼠内 + 和 ' + 表达及 ' + + 比率变化 ;9""'":#$%$%"': #$%$% "9'! 分别为对照组假手术组模型组 -.,/0 模型组,+1 0 模型组,+10 模型组 = 各组 #$%$% 比率与对照组比较 1 与模型组比较 1 图三叉神经节内降钙素基因相关肽 *) 免疫组织化学染色 ;9""'" :)(*+ ("""!"'A 空白对照组 =,+10 模型组 14,+1 刺激侧 ) 模型组刺激侧 - 模型组未刺激侧 ) 中黑色箭头所指为典型 )(*+ 阳性细胞!"!

4 期张金璐陈新林吕海侠等 #$! 氨基末端激酶信号通路参与电刺激大鼠三叉神经节偏头痛模型降钙素基因相关肽表达调控图三叉神经节内降钙素基因相关肽 *) 免疫组织化学染色结果的统计学分析 ;9""'" :)(*+ ("""!"' )(*+ 阳性染色比较 =)(*+ 阳性染色 6 比较和,+10 而对照组和,+10 模型组 )(*+ 染色 6 比较讨论根据解释偏头痛发病机制的血管源性学说皮层扩散抑制学说三叉神经血管学说研究人员分别构建出了多种偏头痛动物模型综合考虑通路激活的特异性实验动物复制难易程度等因素最终选择以三叉神经血管学说为基础的电刺激大鼠 ( 作为本研究的模型在三叉神经 # 血管学说中偏头痛发作时存在无菌性炎症 >, 激活及血管舒缩异常等核心过程其中起到重要作用的是 )(*+ 实验研究结果显示受到有效刺激后三叉神经的反射活动引起 )(*+ 释放量增多可以导致偏头痛发生 )(*+ 在 ( 内含量最为丰富其合成表达量可以作为判断 ( 激活程度的标志而在本研究相关的前期研究也证实 ( 体外培养模型中存在 )(*+ 释放增 # 高在电刺激大鼠 ( 时可以明显看到刺激侧的口鼻分泌物增多和咀嚼肌及眼肌收缩提示电极对于 ( 形成了有效刺激在后续的蛋白检测中发现刺激侧的 ( 内 )(*+ 表达明显升高与其他研 1 究学者进行的研究结果一致证明了该模型科学有效模拟了 >, 的激活过程另外模型组大鼠刺激侧 )(*+ 表达明显高于未刺激侧说明起源于一侧的 >, 激活所导致的 )(*+ 表达升高主要限于该侧这可能是偏头痛呈现偏侧发作的机制之一研究表明多种大鼠偏头痛模型会引起其行为学 1# 改变行为学结果显示电刺激后大鼠前肢挠头次数明显增加爬笼次数明显减少过度理毛次数前后无明显差异分析该结果的原因可能为为了完全消除麻药对于行为学的影响选择了手术后进行观察在这一过程中 ( 损伤导致的 >, 激活态而引起的生理不适持续存在故前肢挠头次数增加而由于时间过久大鼠已经由躁狂多动状态转为抑郁逃跑欲望不强烈因而导致爬笼次数的减少后期需进一步扩大样本量规范行为学观察环境完善该模型对于大鼠行为学影响的数据资料 $% 系统是.+ 信号转导系统的条信号通路之一本研究所在项目的前期实验进行了以体外培养 ( 模型为基础的研究结果显示离体 ( 内 )(*+ 水平升高而.+ 通路中的 2* 通路和 $% 通路均参与了该调节过程其中 $% 信号通路起到了更为关键的作用因此本研究将调节 )(*+ 表达的焦点定位于 $% 信号通路本研究结果显示电刺激 ( 可以激活 $% 通路并可被浓度 14 的,+1 所阻断而 14 浓度组却未见明显阻断提示,+1 的阻断作用可能存在剂量依赖性本研究的假手术组大鼠 ( 也存在部分 $% 信号蛋白激活可能与电极插入所带来的机械性损伤有关说明机械损伤可能也会激活 $% 信号通路机械刺激和电刺激可相互叠加 $% 信号通路的活化过程为了验证 $% 信号通路是否参与了 )(*+ 表达的调控本研究对比了模型组和,+10 模型组大鼠 ( 内 )(*+ 的表达结果显示模型组大鼠 ( 内 )(*+ 阳性颗粒的累积吸光度值 6 明显高于,+10 模型组大鼠提示 $% 信号通路特异性阻断剂,+1 可以阻断 )(*+ 的升高提示 $% 信号通路参与了电刺激大鼠 ( 所介导的 )(*+ 的表达上调的调控过程综合以上分析认为该模型可以模拟偏头痛发作!"!

5 西安交通大学学报医学版第卷过程过程中存在 $% 信号通路的激活并介导了刺激侧 )(*+ 表达升高目前偏头痛的治疗已经由单纯干预血管舒张所引发的症状发展为特异性阻断 )(*+ 受体来直接调节血管舒缩情况其针对性特异性精细程度均有了长足的进步本实验在前期研究的基础上在大鼠活体水平证实了 $% 信号通路参与偏头痛发病过程中重要分子 )(*+ 的表达调控为进一步从分子水平研究安全有效的 $% 抑制剂从更上游水平阻断甚至预防偏头痛发病提供基础研究数据参考文献 1 /0%'$$1' 2,10$34.+,-." #"* '-'11 于生元匡培根张凤英等电刺激三叉神经节诱发三叉神经分布区血浆蛋白外渗中国疼痛医学杂志沈飞飞万琪季燕等电刺激三叉神经节诱导偏头痛大鼠脑膜非特异炎症神经病学与神经康复学杂志 1 刘婷沈飞飞韦俊超等头痛宁对电刺激三叉神经节大鼠脑膜血流与 +,-. 的影响中国疼痛医学杂志 1$5,5$1!31)!101$'1"#" #(### "" +,-.##"# *. 罗国刚雷莉樊文静等三叉神经节离体培养后降钙素基因相关肽调变的细胞内信号转导机制研究中国临床神经科学 /', ', 42',$# 1#"#+,-." "#111-2!',.$%'0'3-')! ""# '!. "" !,!1$)1/5!# ".3.! !' -)',!'+# " "###.#'#"$#$ ,,22' /## "+,-.# ++'# 罗国刚袁兴运袁博博等肿瘤坏死因子白介素和舒马曲坦对大鼠三叉神经节离体培养后降钙素基因相关肽 -' 表达水平的影响西安交通大学学报医学版 0%'$$1' 2)!' -'$' +# """ #" " "#+3"*! 1 李征于生元梁景耀等反复电刺激大鼠上矢状窦后的抑郁行为学表现中国实验动物学报张红岩于挺敏毛西京等雌激素对偏头痛大鼠行为学改变及中脑导水管周围灰质 1 表达的影响吉林大学学报医学版王淑华武胜昔周亮等雌激素对偏头痛大鼠三叉神经节内降钙素相关基因肽 -' 表达的影响第四军医大学学报 1 编辑国荣!"!

中草药

中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (