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1 硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠自主活动的变化 王克柱 孙军花 徐攀 陈红英 2 代志 2 王晓英 刘新民. 药用植物研究所药理毒理中心, 北京协和医学院, 中国医学科学院, 北京,0093, 中国 2. 华润三九医药股份有限公司, 深圳,580, 中国 摘要 目的 : 皮下注射硝酸甘油复制大鼠偏头痛模型, 并研究偏头痛大鼠运动能力和情绪的变化 方法 : 皮下注射硝酸甘油构建大鼠偏头痛模型, 应用空场实时监测系统实时记录模型大鼠造模后 min 的自主运动情况 结果 : 皮下注射硝酸甘油后大鼠前肢挠头 后肢挠头 甩头次数增多, 且在造模后 30 min 内偏头痛行为学症状最明显, 随时间的增加大鼠逐渐恢复正常 与对照组比较, 偏头痛大鼠的短时运动 (0 30 min) 无明显变化, 但中央区运动路程减少, 周边区运动路程增加, 说明偏头痛大鼠表现出焦虑情绪 观测偏头痛大鼠长时运动 (90 min) 情况, 与对照组比较, 自 60 min 后模型大鼠的运动路程 运动时间显著性降低, 且随着时间的增加, 运动路程也逐渐的减少 结论 : 皮下注射硝酸甘油引起大鼠搏动性头痛, 挠头 甩头等行为学症状增多, 同时影响了大鼠的自主活动能力, 并使动物产生焦虑情绪 关键词 硝酸甘油 ; 偏头痛 ; 运动能力 ; 焦虑 中图分类号 R965 文献标识码 A 文章编号 : (205) Migraine Model Rats Evoked by Nitroglycerin Decrease Autonomic Activity WANG Ke-zhu,SUN Jun-hua,XU pan,chen Hong-ying 2,DAI Zhi 2,WANG Xiao-ying,LIU Xin-min. Research Center for Pharmacology & Toxicology,Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing,0093,China 2. China Resources Sanjiu Medical &Pharmaceutical Co.,Ltd. Shenzhen,580,China ABSTRACT Objective:Migraine mode of rats was made by subcutaneous injection (s.c) of nitroglycerin and the change of antonomic activity was researched. Methods:The migraine rat model was constructed by subcutaneous injection of nitroglycerin,and autonomic activities in 0, 30,60,90 min after s.c nitroglycerin were real-time recorded by open stopping system. Results: Compared with control group,the special behaviors and symptoms,such as head scratching and shaking,increased in the migraine rats,and was most obvious within 30 min. The short movements (0,30 min)of migraine rats were not significantly changed. The movement distance in central area of model rats was significantly decreased,and the movement distance of peripheral area significantly increased compared with control rats. These indicated that the s.c nitroglycerin rats exhibited anxiety symptom. Compared with control group,the movement distance and time of model group were decreased after 60 min,and with the increase in time,movement distance also gradually reduced. Conclusion:The increase of special behaviors and symptoms,such as the 基金项目 : 科技部重大新药创制项目 (No.203ZX ) 作者简介 : 王克柱, 男, 北京协和医学院在读博士生 ; 研究方向 : 神经药理学 ; wangkezhu0628@63.com 通讯作者 : 刘新民, 男, 博士生导师 ; 研究方向 : 神经药理学 ; liuxinmin@hotmail.com 6

2 scratching head and shaking in migraine rats could be caused by s.c nitroglycerin,and meanwhile the model rats exhibited anxiety and impaired the autonomic activities were impaired. KEY WORDS nitroglycerin;migraine;motor ability;anxiety 偏头痛 (migraine) 是一种常见的慢性病 反复发作性血管神经性头痛, 发病率高 易反复发作, 严重影响着人类的生存质量 [] 世界卫生组织认为, 重度偏头痛在最常见的使人丧失工作能力的内科疾病的前 20 位 [2], 因此偏头痛已成为目前医学研究中急需要解决的难题 目前国际上使用较多的偏头痛动物模型多以偏头痛发病机制的某种学说为基础, 复制偏头痛的某些特点, 主要有三大类 : 基于颈动脉血管扩张的硝酸甘油模型 三叉神经血管学说模型及皮层扩散性抑制模型 (cortical spreading depression,csd) [3-4] 硝酸甘油在体内产生一氧化氮 (nitric oxide,no),no 扩散到脑膜中动脉, 刺激血管扩张, 另外硝酸甘油还可导致硬膜神经炎症, 导致脑膜中动脉流速减慢, 血浆蛋白外渗和肥大细胞脱颗粒 [5], 因此硝酸甘油模型较好的验证了颈动脉扩张及神经源性炎症在偏头痛发作中的作用 三叉神经血管学说模型指通过电刺激或化学刺激激活硬脑膜血管周围的三叉神经末梢, 后者释放血管活性肽, 如降钙素基因相关肽 (calcitonin gene-related peptide, CGRP) P 物质 (substance P,SP) 等, 使硬脑膜血管扩张, 肥大细胞脱颗粒, 引起硬脑膜和其他三叉神经分布的组织发生神经源性炎症, 可以很好的解释偏头痛各个时相的特点 [6] 皮层扩散性抑制模型采用电刺激或化学刺激三叉神经节后出现由刺激部位向周围波浪式扩布的皮层电活动的抑制, 可用于先兆偏头痛的机制研究, 但未能反映偏头痛发作的时相性特点 [7] 在评价治疗性偏头痛药物时, 动物行为是其中重要的 客观的评价指标, 而神经血管学说模型和 CSD 模型中, 由于动物处于麻醉状态, 无法观察动物的行为特点, 同时硝酸甘油模型具有一定的重复性 适用性 经济性等特点, 在药物评价方面应用广泛, 因此本实验选用硝酸甘油复制大鼠实验性偏头痛模型 临床发现, 偏头痛除了头痛这一主要症状外, 并伴有恶心 呕吐 畏光 紧张 焦虑等状态 [8] 因此本实验主要研究了硝酸甘油所致的实验性偏头痛大鼠在发作期自主活动的变化, 分析模型动物的情绪变化 材料和方法. 实验材料.. 实验动物 SD 大鼠,, 体质量 (80~220)g,SPF 级, 动物许 可证号 :SCXK( 京 ) , 购自北京维通利华实验动物技术有限公司 动物自由饮食饮水, 适应新环境 3 d 后开始进行实验, 光 / 暗周期 2 h/2 h, 光照时间 8:30~20:30, 实验室温度 22~25 本实验遵循实验动物伦理原则..2 实验仪器及试剂大鼠空场实时监测系统, 由中国医学科学院药用植物研究所和中国航天员科研训练中心共同研制 本实验选用圆形测试箱, 为 4 个相同大小的具有斜度的桶组成 : 底面直径 04 cm, 上口直径 20 cm, 高 40 cm, 桶壁斜度离垂直的角度为 7.6, 保证摄像头完整采集动物的活动情况 摄像头安置在自主活动测试箱顶端, 对动物进行实时监控, 通过摄像机将活动的视频信号传送给视频卡, 实时采集动物的运动信息 硝酸甘油注射液, 规格 ml:5 mg, ml 0 支, 批准文号 : 国药准字 H20289, 产品批号 :204030, 北京益民药业有限公司.2 实验方法.2. 分组及造模 20 只 SD 大鼠, 体质量 (80~220)g, 适应环境喂养 3 d, 然后将动物放进大鼠空场实时监测系统测试箱内让其自由适应环境 5 min, 连续适应 2 d,d 3 开始观察动物自发活动, 即动物不注射药物或生理盐水的基础行为学状况, 连续观察 90 min, 并用摄像机拍摄动物的行为情况 实验结束后人工统计动物的挠头次数 爬笼次数和甩头次数, 并综合考虑这三个指标进行随机分组 : 对照组 (Control,n=0) 和模型组 (Model, n=0) 对照组大鼠于头颈背部皮下注射 0.9% 生理盐水 3 ml kg - ; 模型组大鼠皮下注射硝酸甘油注射液剂 0 mg kg -, 注射完毕后轻柔颈背部, 以防出现血肿块.2.2 行为学检测将注射硝酸甘油的大鼠放进测试箱内, 并用摄像机拍摄动物随后 90 min 的行为表现 每 30 min 为一观察时间单位, 采用持续时间分段计数的方法观察大鼠造模后 90 min 内的偏头痛行为表现 偏头痛大鼠的自主活动监测采用 0 min 为一记录单位, 空场测试软件自动记录每 0 min 的运动路程 速度 时间等指标.3 统计学方法计量资料采用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 统计分析采用 SPSS9.0 统计软件进行单因素方差分析 (oneway ANOVA);P<0.05 即认为差异具有统计学意义 7

3 2 结果 2. 偏头痛大鼠挠头次数 爬笼次数 甩头次数的变化皮下注射硝酸甘油前 90 min, 对照组和模型组大鼠挠头次数 爬笼次数和甩头次数没有显著性差异 造模后观察 min 内的挠头次数 爬笼次数 甩头次数 由 Fig. 显示, 与对照组比较, 模型组的前肢挠头次数 (P<0.00,P<0.00) 后肢挠头次数 (P<0.00, P<0.0) 和甩头次数 (P<0.00,P<0.0) 于注射硝酸甘油后 30 min 和 60 min 都呈现显著性的升高, 而在 90 min 时间段后肢挠头次数和甩头次数有显著性的差异 (P<0.05,P<0.0), 前肢挠头次数则没有明显差异 (P>0.05) 模型组大鼠爬笼次数与对照组比较没有显著性差异 2.2 偏头痛大鼠自发活动的变化皮下注射硝酸甘油后大鼠 0 min 内的自主活动的变化如 Tab. 所示, 与对照组比较, 模型组大鼠的总路程 运动时间 静置时间和平均速度均无显著性的变化 进一步分析大鼠在测试箱不同区域的运动情况发 现, 模型组大鼠的中央区运动路程比率 中央区运动时间比率显著性的低于对照组 (P<0.0,P<0.05); 周边区运动路程比率显著性的升高 (P<0.0) 实验结果发现动物腹腔注射硝酸甘油后 30 min 偏头痛行为症状较明显, 故而我们分析了动物在 30 min 内的自主活动的变化 由 Tab.2 看出, 模型组大鼠在空场实验的水平运动 ( 总路程 运动速度 运动时间和静止时间 ) 没有显著性差异 与对照组比较, 模型组大鼠的中央区运动路程比率 中央区运动时间比率显著性的降低 (P<0.0, P<0.0), 周边区运动情况没有明显变化 然后进一步分析大鼠在注射硝酸甘油后偏头痛发病全程 (90 min) 的运动情况 ( 见 Fig.2) 由 Fig.2 可以看出, 对照组和模型组大鼠在 90 min 运动路程 运动时间和平均速度均呈现逐渐下降的趋势 ; 而与对照组比较, 模型组大鼠的总路程在 min 时间段显著性降低 (P<0.05, P<0.05), 运动时间 平均速度于 60 min 时间段出现差异 (P<0.05,P<0.05), 静止时间两组别在三个时间段均无显著性的差异 Fig. Effects of nitroglycerin on scratching,climbing,and shaking in rats A:the number of scratching of forelimb,b:the number of scratching of hind limb,c:the number of climbing,d:the number of shaking. x±s,n=0. * P<0.05, ** P<0.0, *** P<0.00 vs control group. 8

4 Tab. Effects of nitroglycerin on locomotor activity in 0 min of rats (x±s,n=0) Control Model Total distance(cm) 678.0± ±8.78 Movement time(s) 87.3± ±65.63 Rest time(s) 42.82± ±65.63 Average speed (cm s - ).02±0.9.06±0.23 Ratio of movement distance in central area (%) 42.2± ±3.33 ** Ratio of speed in central area (%).05± ±0.09 * Ratio of movement distance in peripheral areas (%) 57.79± ±3.33 ** Ratio of speed in peripheral areas (%) 2.07±0.73.7±0.64 Note: * P<0.05, ** P<0.0 vs control group. Tab.2 Effects of nitroglycerin on locomotor activity in 30 min of rats (x±s,n=0) Control Model Total distance(cm) ± ±8.23 Movement time(s) ± ±64.98 Rest time(s) ± ±25.07 Average speed (cm s - ) 2.04± ±0.30 Ratio of movement distance in central area (%) 04.36± ±.93 ** Ratio of speed in central area (%).60± ±0.3 ** Ratio of movement distance in peripheral areas (%) 62.3± ±30.33 Ratio of speed in peripheral areas (%) 3.35± ±0.74 Note: ** P<0.0 vs control group. Fig.2 Effects of nitroglycerin on locomotor activity in 90 min of rats A:total distance,b:average speed,c:the movement time,d:the rest time. x±s,n=0. * P<0.05 vs control group. 9

5 3 讨论偏头痛 (migraine) 是一种临床常见 反复发作的慢性神经血管紊乱性疾病, 现代医学称之为原发性血管神经头痛 目前对偏头痛的发病机制尚不十分清楚, 可能与遗传 内分泌 血管因素 神经递质 免疫因素等有关 [9] Tassorelli [0] 研究报道硝酸甘油诱导动物偏头痛, 其偏头痛行为表现 ( 挠头 甩头 爬笼 ) 及其病理生化改变同人类偏头痛发作时的表现及变化有一定的相似性 本实验采用 30 min 持续时间分段计数的方法对硝酸甘油诱导大鼠偏头痛行为学表现进行了系统的验证 我们发现, 与对照组比较, 皮下注射硝酸甘油后 30 min 和 60 min 大鼠出现挠头次数 甩头次数显著性升高, 说明了大鼠硝酸甘油实验性偏头痛模型建立成功 而与对照组比较, 模型组大鼠的爬笼次数没有明显的变化, 与 Tassorelli 报道的偏头痛大鼠爬笼次数显著性增多不符 其可能原因是实验前大鼠在空场测试箱中的适应时间不够, 导致新奇环境掩盖了硝酸甘油对大鼠爬笼的变化 我们进一步分析了大鼠在偏头痛发作期的短时运动 ( 造模后 0 30 min) 长时运动 ( 造模后 90 min) 及其情绪的变化 实验中我们采用空场实验系统, 其主要是在固定的区域内对动物的自主活动进行实时观察记录, 通常用于判断动物的兴奋或抑郁状态, 在抑郁 镇静 焦虑等神经精神药理研究领域中广泛使用 [] 本次实验结果表明, 偏头痛大鼠在 0 min 及 30 min 的运动能力 ( 运动总路程 运动速度 运动时间 ) 与对照组比较没有显著性, 说明硝酸甘油对大鼠的短时运动没有明显的影响 进一步分析大鼠在中央区和周边区的运动情况发现模型大鼠中央区运动路程和时间急剧下降, 周边区运动路程增加, 说明偏头痛大鼠产生了焦虑情绪 [2] 我们进一步分析了动物在 90 min 内的运动情况, 从 Fig.2 看出, 与对照组比较, 模型组大鼠的运动能力从 30 min 后显著性的降低, 表现出运动路程 平均速度和运动时间的减少, 与实验中观察到的皮下注射硝酸甘油 30 min 后动物精神不振 反应迟钝 行走缓慢 倦怠疲乏, 静卧休息时反复变动体位的行为表现相对应 [3] 从以上实验结果我们发现, 偏头痛大鼠在发作期伴随着明显的焦虑情绪, 其短时运动能力没有受损, 但长时运动能力显著性的受到损害 临床研究发现, 偏头痛病人一般会表现出视觉 感觉 运动 情绪及胃肠道自主神经功能紊乱等症状 [4] 因此, 我们的研究结果与其相符 一种合格的动物模型不仅可以模拟偏头痛的某些病理生理学过程, 更可以用于正确评价治疗性药物的有效性及安全性 [5] 注射硝酸甘油后, 脑膜中动脉扩张, 引起血管性搏动性头痛, 同时模型动物又表现出焦 虑 运动功能紊乱等症状, 因此, 此实验为全面评价偏头痛治疗性药物提供方法学参考, 即药物评价不仅集中到头痛症状, 与之伴随的焦虑 运动 感觉等方面也要得到重视 参考文献 [] Sait Ashina,Lars Bendtsen,Messound Ashina. Pathophysiology of migraine and tension-type headache[j]. Techniques in Regional Anesthesia and Pain Management,202,6 (): 4-8. [2] Leonardi M,Steiner T J,Scher A T,et al. The global burden of migraine:measuring disability in headache disorders with WHO s Classification of Functioning,Disability and Health (ICF)[J]. Headache Pain,2005,6: [3] 曹克刚, 李焕芹, 俞丽华. 关于建立具有时相性特点偏头痛动物模型的思考 [J]. 中国中医基础医学杂志,2009,5 (4): [4] 张帆, 王金钢. 偏头痛实验模型综述 [J]. 湖北中医药大学学报,202,4 (6):69-7. [5] Uwe Reuter,Hayrunnisa Bolay,Inger Jansen-Olesen,et al. Delayed inflammation in rat meninges:implications for migraine pathophysiology [J]. Brain,200,24 (2): [6] Melo Carrillo A,Lopez Avila A. A chronic animal model of migraine,induced by repeated meningeal nociception, characterized by a behavioral and pharmacological approach [J]. International Headache Society,203,33 (3) [7] Sonu Bhaskar,Kolsoum Saeidi,Parvin Borhani,et al. Recent progress in migraine pathophysiology:role of cortical spreading depression and magnetic resonance imaging [J]. Eur J Neurosci,203,38 (): [8] 章正祥, 曹克刚, 高永红. 从临床到基础 : 硝酸甘油实验性偏头痛大鼠模型信度和效度评价 [J]. 中国实验动物学报, 2009,7 (4): [9] Pietrobon D,Moskowitz M A. Pathophysiology of migraine [J]. Annu Rev Physiol,203,75: [0] Cristina Tassorelli,Rosaria Greco,Wang De-chun,et al. Nitroglycerin induces hyperalgesia in rats a time-course study [J]. Eur J Pharmacol,2003,464 (2-3): [] 王琼, 刘新民, 买文丽, 等. 自主活动实时测试分析处理系统的建立与开心散安神镇静作用验证 [J]. 中草药,2009, 40 (): [2] Salim S,Sarraj N,Taneja M,et al. Moderate treadmill exercise prevents oxidative stress-induced anxiety-like 0

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