中国农业科学 抗克百威多克隆抗体的研制 朱国念 杨挺 吴银良 浙江大学农药与环境毒理研究所 杭州 摘要 以 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃酚为反应原料经两步化学反应合成了 种克百威半抗原 2 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃基氧 羰基 氨基 己酸 ƒ 和 2 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃基氧 羰基 氨基 丁酸 ƒ 通过活性酯法和混合酸酐法将半抗原与载体蛋白! 偶联制备了克百威的人工抗原 利用 ƒ 2 和 ƒ 2 分别免疫日本大耳白家兔获得了 种抗克百威的多克隆抗体 抗 ƒ 2 抗体和抗 ƒ 2 抗体 并用间接竞争 方法测定了 种抗体的效价 关键词 克百威 酶联免疫吸附测定 抗体 2 2 2 (Ινστιτυτε οφ Πεστιχιδε ανδ Ενϖιρον μ ενταλ Τοξιχολογψ, Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ, Ηανγζηου 310029) 2 2 2 2 2 2 2 < ƒ 2 2 2 2 2 2 2 2 < ƒ 2 2 2 克百威 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃基 2 2 甲基氨基甲酸酯 商品名呋喃丹 自 年由 ƒ 公司和 化学公司开发生产后即作为一种高效! 广谱的杀虫! 杀线虫剂 广泛应用于粮食! 蔬菜! 水果及经济作物等害虫的防治 但是由于克百威的毒性大 在酸性土壤中不易降解 极易污染土壤和地下水源 尤其是在粮食和蔬菜上的大量使用 形成农药残留 对公众健康造成不可估量的危害 这已引起人们的广泛关注 同时因检测克百威的常规方法 包括气相色谱法 和高效液相色谱法 灵敏度受样品的净化! 浓缩! 衍生化等步骤的影响很大 分析过程繁琐 因此 开发一种对克百威简单! 快速 适于农药残留现 场监控的分析方法具有重要的现实意义 农药残留免疫分析技术是免疫分析应用于农药残留分析领域的一门新技术 以其简单! 快速及价廉的优点已被分析化学界所接受 目前 对于克百威 的免疫分析 国外已有相关的应用报道 但至今未见有关如何制备所应用的多克隆抗体的相关报 道 国内刘曙照等人曾报道了利用 ƒ 2 制备多克隆抗体 但尚未有半抗原 ƒ 的制备和用 ƒ 2 制备多克隆抗体的报道 本文详细研究了克百威的 种人工抗原合成 抗克百威高效价抗体的制备研究等内容 收稿日期 2 2 基金项目 浙江省自然科学基金 作者简介 朱国念 2 男 浙江诸暨人 副教授 博士 主要从事农药生态毒理学和生物技术与农药污染治理研究 2 ƒ 2 2
中国农业科学 卷 1 材料与方法 1 1 材料与仪器 1 1 1 试验材料 克百威标准品 速灭威标准品 灭多威标准品 异丙威标准品 由浙江省农药检定所提供 丁硫克百威标样 由浙江省化工研究院提供 光气 由杭州大地农药股份有限公司提供 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃酚 以下简称呋喃酚 由江苏铜山农药总厂提供 2 二甲基甲酰胺 ƒ 2 氨基己酸 2 氨基丁酸 二环已基碳二亚胺 2 羟基琥珀酰亚胺 二口恶烷 氢氧化钠 牛血清蛋白 卵清蛋白 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂 雄性成年日本大耳白家兔 由浙江中医学院提供并负责饲养 在酶联免疫吸附测定 中所用溶液的配 制方法均参照文献 1 1 2 试验仪器气 2 质联用 核磁共振仪 旋转蒸发器 ƒ ± 紫外分光光度计 2 2 型电动强力搅拌机 酶联仪 2 型 冷冻干燥机 2 低温离心机 孔聚苯乙烯酶标板 浙江黄岩五洲塑料厂 以及其它常用玻璃仪器 1 2 试验方法 1 2 1 半抗原的合成在本研究中先用呋喃酚作为反应原料和光气反应得 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃基氯甲酸酯 然后利用 2 氨基丁酸和 2 氨基己酸和该产物反应得到了克百威的两种活性半抗原 ƒ 和 ƒ 反应式见图 纯化后的 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃基氯甲酸酯用色 2 质联用方法鉴定结构 半抗原采用核磁共振仪鉴定结构 图 1 克百威半抗原合成路线图 ƒ 1 2 2 人工抗原的合成利用活性酯法制备了免疫原 同时利用混合酸酐法制备了包被抗原 具体操作步骤如下 将 Λ 半抗原 ƒ 或 ƒ 溶解在 的 ƒ 中 然后在该溶液中加入等摩尔的 和 制备包被抗原时为正三丁胺和氯甲酸乙酯 让其在室温下反应过夜后 制备包被抗原时间为 离心后取上清液 Λ 缓慢加入到 的 或 碳酸缓冲溶液中 然后搅拌反应 待反应完成后 装入透析袋 先用蒸馏水透析 次 然后用 生理盐水透析 再采用紫外分光光度法在 处测定吸收值 并计算结合比 最后分装保存于 ε 的冰箱中 1 2 3 抗体的制备以复合物 ƒ 2 和 ƒ 2 作免疫原 先进行基础免疫 每种免疫原免疫 只兔子 免疫剂量为每千克兔子体重注射 免疫原 免疫原用生理盐水稀释 加等体积 的弗氏完全佐剂充分乳化 注射时采用背部皮下和大腿肌肉注射相结合的方法 周后加强免疫 加强免疫方法同基础免疫 免疫剂量为基础免疫的 倍 佐剂为不完全佐剂 以后每隔两周加强免疫 次 从第 次加强免疫开始 免疫后第 天 心脏采血测定抗体效价和特异性 达到一定效价后心脏采全血 分离抗血清 抗血清采用辛酸 2 硫酸铵二步沉淀法纯化得到抗体 透析后冷冻干燥成粉末 于 ε 下保存备用 1 2 4 抗体的鉴定 1 2 4 1 抗体效价用方阵试验法对接 抗原抗体最适工作浓度进行选择 用 碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释成不同浓度后包被 孔酶标板 每孔 Λ ε 孵育 洗涤 次 用 脱脂奶封闭 每孔 Λ 放入 ε 温箱中孵育 后洗涤 次 加入经 缓冲液
期 朱国念等 抗克百威多克隆抗体的研制 稀释的一系列浓度的抗血清 纯化抗体冻干粉 Λ 放入 ε 温箱中孵育 洗涤 次 加入经 稀释 倍的羊抗兔 2 液 Λ 放入 ε 温箱中孵育 洗涤 加入底物基质液 每孔 Λ ε 孵育 每孔加入 硫酸 Λ 终止反应 并用酶标仪测定各孔的 值 值为 左右 抗体抗原用量较少 即为抗体抗原的工作浓度 1 2 4 2 抗体亲合性和特异性利用呋喃酚! 丁硫克百威! 异丙威! 速灭威! 灭多威进行竞争性抑制试验 抗体抗原浓度根据 的结果确定 步骤如下 用 碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释后包被 孔酶标板 每孔 Λ ε 孵育 洗涤 次 用 脱脂奶封闭 每孔 Λ 放入 ε 温箱中孵育 后洗涤 次 加入系列浓度的各种农药标准溶液 Λ 再加入经 缓冲液稀释抗血清 Λ 放入 ε 温箱中孵育 洗涤 次 余下步骤同 然后绘制免疫反应抑制率和农药浓度半对数曲线图 求出抑制反应 所需的浓度 算出交叉反应率 抑制率与 交叉反应率的公式如下 抑制率 为不加农药时的吸光值 为农药 时的吸光值 为空白对照孔的吸光值交叉反应率 抑制率为 克百威的浓度 抑制率为 农药结构类似物的浓度 2 结果与讨论 2 1 人工抗原的合成与鉴定在半抗原合成中第一步化学反应所得产物经色 2 质联用得质谱图 图 2 第一步反应产物质谱图 ƒ 从图 可知合成的的分子离子峰 为 且该分子离子峰有一同位素峰的峰高为分子离子峰的 可知该物质含有 原子 同时从其离子碎片 为 和 推断出该物质即为 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃基氯甲酸酯 半抗原 ƒ 的 为 Δ ƒ 的 为 Δ 与文献值相符 可知合成的为 ƒ 和 ƒ
中国农业科学 卷 按照合成免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例 取 ƒ 或 ƒ 的 ƒ 溶液 ƒ 为 ƒ 为 生理盐水溶液 和 复合物稀释液 相当于 蛋白 分别以 ƒ 和生理盐水为对照 进行紫外检测 同样取 ƒ 或 ƒ 的 ƒ 溶液 ƒ 为 ƒ 为 生理盐水溶液 和 复合物稀释液 相当于 蛋白 进行紫外检测 检测结果如表 表 1 样品紫外检测结果 免疫原 吸光值 包被抗原 吸光值 ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ 2 ƒ 2 ƒ 2 ƒ 2 免疫反应的的 值分别为 Λ 和 Λ 由相同方法测出了呋喃酚! 丁硫克百威! 异丙威! 速灭威! 灭多威这 种的 再计算出交叉反应率 结果见表 由表可知 所获得的 种抗体对具有苯并呋喃环的呋喃酚和丁硫克百威的交叉反应率在 之间 相对于其余 种无此结构的类似物交叉反应率均小于 而言 它们具有一定的交叉反应性 从而可知苯并呋喃环是其特征化学结构 从异丙威的交叉反应率略大于速灭威可知 异丙威的苯环结构上拥有的异丙基基团 类似于 个甲基的作用 对于结合抗体有一定的影响 间接表明了苯并呋喃环上两个甲基也是不可缺少的特征化学结构 因此 这两种抗体对克百威具有高特异性 从表中可见 复合物在 处的吸光值均高于相应的蛋白的吸光值 根据 吸收的加合性可认为半抗原已与载体蛋白发生偶联 通过三者在 的吸光值可推算结合比 结合比可用下式 计算 结合比 Ε 复合物 Ε 载体蛋白 Ε 半抗原经计算后得结合比 ƒ 2! ƒ 2! ƒ 2! ƒ 2 分别为 Β! Β! Β! Β 由于在农药免疫分析中 人们常用更少量的半抗原来与蛋白质偶联 所以本试验在合成包被抗原时采用了与合成免疫原不同的偶联方法 得到的结合比远小于免疫原的结合比 2 2 抗体的效价根据方阵滴定结果 当包被抗原 ƒ 2 浓度为 Λ 时 抗 ƒ 2 抗血清效价分别为!! 而相应的冻干粉的效价分别!! 当包被抗原 ƒ 2 浓度为 Λ 相应抗血清工作浓度为!! 相应的冻干粉的效价分别为!! 各取 种备用 2 3 抗体的特异性克百威的标准曲线见图 由图求得克百威对 图 3 克百威标准曲线 ƒ 3 讨论 特异性抗体的制备是利用免疫学方法进行化学农药残留分析的最关键因素 而农药多为小分子化合为 抗体的制备往往很困难 本研究根据半抗原的特点 采用 2 二氢 2 2 二甲基 2 2 苯并呋喃酚作为合成呋喃丹半抗原的起始原料 合成的半抗原采用活性酯法偶联到载体蛋白上 是因为该法偶联效率高 对蛋白的变性作用较小 在获得人工抗原后经免疫兔子获得了高效价的抗克百威抗体 种抗克百威多克隆抗血清的最高 效价分别为! 制成冻干粉后效价则达到! 能够满足运用 方法测定克百威的需要 同时抗体的特异性较好 对呋喃酚和丁硫克百威的交叉反应率在 之间 对不具有苯并呋喃环的异丙威! 速灭威! 灭多威 种农药的交叉反应率均小于
期 朱国念等 抗克百威多克隆抗体的研制 在得到了抗克百威抗体后 目前我们已经建立了蔬菜! 土壤! 水中的克百威 检测方法 并与 该抗体建立的放射免疫分析方法 进行了比较 表 2 抗克百威抗体特异性试验 2 抗 ƒ 2 抗体 2 ƒ 2 抑制中浓度 交叉反应率 2 抑制中浓度 抗 ƒ 2 抗体 2 ƒ 2 交叉反应率 2 克百威 呋喃酚 2 丁硫克百威 异丙威 速灭威 灭多威 ± Νε ω Μαν υαλ οφ Πεστιχι δ ε 刘乾开 朱国念 新编农药使用手册 上海 上海科学出版社 2 ϑ. ΑΟΑΧΙντ 2 2 2 ϑ. Χηροματογρ Ενϖιρον Σχι. Τεχηνολ ƒ ƒ ϑ. Αγριχ. Φοοδ χηε μ ϑ. Αγριχ. Φοοδ Χηε μ ƒ ± ƒ 2 2 ϑουρν αλ οφ Αναλψτιχαλ Σχιε νχε 刘曙照 冯大和 陈美娟 钱传范 对克百威具高度特异性的免疫分析技术研究 分析科学学报 2 2 ϑ. Αγριχ. Φοοδ Χηε μ. 2 2 ϑ. Αγριχ. Φοοδ Χηε μ.