第 卷第 期 年 月 水 产 学 报! "#$% #% &'% 文章编号 % ()%%%% 鲤胰岛素样生长因子结合蛋白 和 基因启动子克隆与序列分析 陈文波 李文笙 林浩然 % 中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室 水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室 广东广州 % 河南理工大学资源环境学院 河南焦作 摘要 胰岛素样生长因子 /0$/,$/234#1'5 6.&'#4070 系统对鱼类的生长和繁殖有着重要的作用 利用 )! 方法克隆获得了鲤胰岛素样生长因子结合蛋白 /0$/,$/234#1'5 6.&'#4 8//3 94#'/7+) 和 基因的上游启动子部分序列 长度分别是 89 和 89 启动子区域没有 :: 框和!: 框 同时 中只含有 :: 框 但没有!: 框 研究结果表明 二者启动子不具备典型的启动子特征 同时 在二者启动子上还发现了 &;) 应答元件和肝细胞核因子结合位点 以及 )/',&', 和 7 等结合位点 研究认为 鲤 和 基因的表达受到潜在的多因子调控 关键词 鲤 胰岛素样生长因子结合蛋白 启动子 序列分析中图分类号 * 文献标识码 胰岛素样生长因子结合蛋白 /0$/,$/2 34#1'5 6.&'#48//3 94#'/07+)0 是胰岛素样生长因子 /0$/,$/234#1'5 6.&'#4070 系统的重要组成部分 在哺乳动物的循环系统和细胞外液中 大部分 70 都高亲和地与 7+)0 家族成员 结合 以免受降解并调节自身的生物学效应 目前 在哺乳动物和硬骨鱼类中 个相互区别的 7+)0 已经被分离和克隆 分别命名为 7+), 到 7+), 它们各自代表一个独立的基因产 物 7+)0 在结构上有很高的相似性 都含有相对保守的 端 含有 个半胱氨酸残基! 端 含有 个半胱氨酸残基 结构域和变化较大的中间区域 7+)0 与 70 结合后 对 70 的生物 学效应既有增强作用又有抑制作用 鲤 属于鲤形目!94//, 6#4-0 鲤科!94//. 鲤属 鲤几乎分布于北半球的所有淡水区域 特别是在我国 东南亚和非洲 其生长速度快 肉质细嫩肥美 营养丰富 是淡水养殖鱼类中最常见的优良品种之一 因此 研究鲤的生长发育和繁殖调控机制对于提高鲤的养殖产量 获取更大的经济价值具有重要意义 截止到目前 我们已经克隆得到了鲤 和 的基因 并对其表达模式进行了初步的探讨 结果显示其 - 表达分布广泛但表达量存在很大的差异 * 如今 除了在模式动物斑马鱼 中克隆得到了其 部分启动子序列外 目前 还没有关于鱼类其它 启动子序列的报道 因此 本研究首先克隆了鲤 和 基因的启动子序列 然后利用生物软件对其潜在的转录因子结合位点进行分析 以期了解潜在的基因表达调控机制 为进一步研究鲤的生长和繁殖机制提供基础资料 材料与方法 材料实验用健康鲤 龄 体重约 * 3 购自广州 收稿日期 * 修回日期 * 资助项目 国家 九七三 重点基础研究计划!+!+ 国家自然科学基金项目 广东省科技计划项目 + 通讯作者 李文笙 林浩然,-./$$0$10-./$%00%%&
水 产 学 报 卷 水产市场 冰上取其肝脏样品 液氮速冻 然后保存于 * 冰箱备用 药品与试剂 /40.$ 7#-.$24 :; /' 为 + +/#0&/&0 公司产品 基因组 提取试剂盒 % <%% '/0/' 为 -3. 公司产品 限制性内切酶 为 :=+.9. 公司产品!" #$ 为 :...9. 公司产品 胶回收试剂盒 %<%% 7$ >'4.&'/# /' 和质粒提取试剂盒 %<%% )$.0-/ >'4.&'/# /' 为 -3.+/#:2 公司产品 0(&$# :; )! )4#&'!$#/3 /' 载体连接试剂盒和 %& )#$-4.0 购自 ;+4-'.0 公司 其余为国产分析纯试剂 )! 所用引物和 测序由上海英骏生物技术有限公司完成 构建鲤 文库基因组 提取 取 -3 鲤肝脏组织于 % - 灭菌的离心管内 加入 : + 64 后用 - 一次性注射器抽提混匀 然后加入 )4#'.0 溶液 -3 (- 水浴 5 至肝组织完全消化 每隔半小时 旋转混匀一次 加入.0% 3 (- 水浴 -/ 冷却至室温 加入 )!) + 64 涡旋 0 混匀 冰上放置 -/ 后于室温下?3 离心 -/ 先用 异丙醇沉淀 然后用 @ 酒精洗涤 空气中干燥大约 A -/ 后 加入 溶解 -/ 后 放置过夜 最后 稀释 倍后 紫外分光光度计测 值 @ 琼脂糖凝胶电泳验证 质量 保存备用 酶切和纯化 利用限制性内切酶!" 和 #$ 建立 个反应 分别酶切大约 % 3 基因组 酶切完全后 用饱和苯酚和氯仿进行分层分离得到酶切后的 继而用冰溶的 @ 乙醇 -#$( 的.& 和糖原沉淀 得到的 沉淀用 *@ 乙醇洗涤两次 空气中干燥 双蒸水溶解后 %@ 琼脂糖凝胶中电泳 测 值 保存备用 酶切产物加接头 分别用 种酶切产物建立以下反应体系?/3.'/# + 64%.9'#4%.9'#4% : 连接酶 3 酶切纯化 最后加水至终体积 连接 5 然后 -/ 失活连接酶 向每管加入 进行稀释 低速涡旋 A 0 保存备用 引物设计 用已获得的鲤 和 & 序列 与人和鼠等其它物种的 基因序列进行比对 预测鲤 和 基因的外显子和内含子的大致位置 从而保证使扩增所用引物位于第一个外显子上 另外 引物设计的位置尽量使预计扩增得到的序列与之前克隆获得的 & 序列大约有 89 以上的重叠区域 以保证扩增得到的序列为所需要的序列 所用引物见表 表 鲤 和 基因启动子克隆所需引物!"#$%&#' %$%&& '$ 引物 94/-40 引物序列 B,B 0C&0B,B 基因特异性引物 3,09&/6/&94/-40 &&+)) &&+)) &&+)) &&+)) B77!::777:!!!7!7!B B7777:!!!7:7!!7!B B!:!77:!7!777!7:!:B B:!!:7!!:777!:!:!B 基因组步移接头引物 3#-1.$24..9'#494/-40 ) ).9'#4.9'#4 B7::!7!:!!::777!B B!::777!!7!7:77:B B7::!7!:!!::777!!7!7:77:!7!77!!!777!:77:B B,!!!7!!) B 鲤 和 基因启动子的克隆 以基因组 酶切加尾后的产物为模板 分别以 &&+)) 和 &&+)) 加上接头引物 ) 为引物 进行第一轮 )! 扩增 退火温度均
期陈文波 等 鲤胰岛素样生长因子结合蛋白 和 基因启动子克隆与序列分析 为 * 然后以第一轮 )! 扩增产物稀释 倍后作为第二轮 )! 扩增的模板 分别以 &&+)) 和 &&+)) 加上接头引物 ) 为引物 进行第二轮嵌套 )! 扩增 退火温度分别为 * 和 序列分析通过 0/0'% 对启动子序列和 & 序列重叠区域进行比对 同时 将所获得启动子序列经过网上启动子转录调控元件分析软件 : 5 '9111%&8/$%9% (&3/,8/ ('0('0 以及其它在线分析软件进行分析 获得潜在的转录因子结合位点 结果与分析 鲤基因组 ()* 的提取与酶切分别用 和 溶液进行 @ 琼脂糖凝胶电泳 结果如图 所示 从图上可以看出 所得到的 大约位于 28 处 条带较为清晰 整齐单一 没有出现拖尾和弥散现象 说明获得的基因组 质量较高 可以进行以下实验 核酸蛋白测定仪测得其 ( * 为 % 质量较纯 同时酶切结果显示基因组 被 种限制性内切酶完全酶切 图 鲤 基因启动子的克隆与序列分析通过嵌套 )! 方法 测序得到了 * 89 的 序列 其中包含了之前克隆得到的 89 的 & 序列 通过对二者重叠区域的比较 结 果表明所扩增得到的片段确为鲤 的启动子序列 图 图 鲤基因组 ()* 电泳分析 ;% 28 分子量标准 % 溶液 % 溶液 +#'*'$',$#$%'#&()* % #-%&& ;% 28 $.4 % 0#$'/# % 0#$'/#% 图 鲤基因组 ()* 酶切产物电泳分析 ;% 89 9$0 分子量标准 % % %!" %#$ +#'*'$',$#$%'#&()* #'$#!, $#&#.&$ ;% 89 9$0$.4 % % %!" %#$ % 图 启动子与 &()* 序列的比对阴影表示重叠部分 +#'*#'%&& &()*$/.&$ :5#4$.9 /0/ 05.% 对 89 的 启动子序列进行分析 结果显示 鲤 启动子没有 :: 框和!: 框的存在 不具备典型的启动子特征 但在此区域存在一个 ) 结合位点和富含 7(! 的基簇 在启动子下游区域存在 个潜在的 &;) 应答元件! + 同时也存在 个肝细胞核因子 59.'#&'&$.46.&'#4 的结合位点 另外 还存在着若干个 )/',&', 和 7 的结合位
水 产 学 报 卷 点 图 图 鲤 基因启动子序列及其分析之前克隆所得到的 & 序列用 表示 感兴趣的潜在转录因子结合位点均在序列中用下画线或阴影等标明 +#').&#$/.&,$#$%&& :5 &0C&&$# 94/#0$ /0#' 8 '40' 9'.'/'4.0&4/9'/# 8//3 0/'0.44$/ #405.% 鲤 基因启动子的克隆与序列分析 通过嵌套 )! 方法 测序得到了 * 89 的 序列 其中包含了之前克隆得到的 89 的 & 序列 通过对二者重叠区域的比较 结果表明所扩增得到的片段为鲤 的启动子序列 图 图 启动子与 &()* 序列的比对阴影表示重叠部分 +#'*#'%&& &()*$/.&$ :5#4$.9 /0/ 05.%
期陈文波 等 鲤胰岛素样生长因子结合蛋白 和 基因启动子克隆与序列分析 对 89 的 启动子序列进行分析 结果显示 距离转录起始位点 89 处存在一个 :: 框 但是在其上游并没有发现!: 框的存在 取而代之的是一个 ) 结合位点 图 与鲤 启动子一样 启动子上也发现 个肝细胞核因子 结合位点和若 干个 )/',&', 和 7 的结合位点 不同的是 上只发现一个潜在的 &;) 应答元件! + 而且 在 启动子上还存在一个潜在的信号转导子与激活子 :: 的结合位点 图 鲤 基因启动子序列及其分析之前克隆所得到的 & 序列用 表示 潜在的转录起始位点用黑体表示 感兴趣的潜在转录因子结合位点均在序列中用下画线或阴影等标明 +#').&#$/.&,$#$%&& :5 &&$# 94/#0$ /0#' 8 )'.'/'4.0&4/9'/# //'/.'/# 0/'/005. '40' 9'.'/'4.0&4/9'/# 8//3 0/'0.44$/ #405.%
水 产 学 报 卷 讨论 基因启动子中 :: 框决定基因转录起始位点的选择 聚合酶与 :: 框牢固结合之后才能开始转录!: 框的作用主要是控制转录的起始频率 不影响转录起始位点的确定 当这段顺序被改变后 - 的形成量会明显减少 它是强启动子的必要元件 在本文中 我们通过网上转录因子分析系统 : 及其它在线软件分析 发现鲤 启动子中距离转录起始位点 89 处存在 :: 框 但是在其上游并无!: 框的存在 取而代之的是一个 ) 结 合位点 这与在猪中的研究结果一致 在猪 启动子中 :: 框上游也无!: 框的存在 而是包含了 个 ) 的结合位点 已有研究表明 在肝癌细胞中 ) 可以激活 的启动子活性 预示着 ) 在调节 基因转录方面发挥着重要作用 在 启动子中研究没有发现 :: 框的存在 在其紧挨的上游区域也没有!: 框 已有研究表明 在缺少 :: 框的启动子中 个 ) 结合位点对于高效率的转录是必须的 和斑马鱼 启动 子不同的是 研究只发现一个潜在 ) 结合位点 另外在此区域存在几个富含 7(! 的基簇 说明 ) 可能和其它转录因子结合共同调节鲤 的基因表达 在鲤 和 启动子序列中都存在 &;) 应答元件! + 这表明它们的基因表达受第二信使 &;) 的调控 在大鼠! 7$/#-. 细胞中 &;) 能以浓度依存的方式抑制 - 的表达 同时在共同培养的原代肝脏细胞和枯否氏细胞中 &;) 也能以浓度依存的方式抑制 - 的表达 利用原代培养的鲤肝细胞 我们也证实高浓度 &;) 能显著性地刺激鲤 - 的表达 由此可以得出 尽管都存在! + 元件 但是 &;) 对鲤 和 基因表达的调节方式可能不同 具体机制有待进一步深入研究 肝细胞核因子是调节肝脏内基因特异性表达的一类转录因子 在肝脏中表达量较高 对肝脏的正常发育和代谢起着重要作用 家族主要包括!!:( 增强子结合蛋白!(+),,, 结合蛋白和, 等六大 类 在鲤 和 启动子序列中存在着若干个,, 和!(+) 的潜在结合位点 这与!5 * 组织表达中所做的结果相吻合 在组织表达中我们发现 和 - 在肝脏组织中的表达量都较高 这表明它们可能对 和 的基因表达起正调控作用 同时 研究发现在小鼠中!(+) 对卵泡的发育起重要作用 * 鲤 和 启动子中均存在有!(+) 识别位点 表明 7+), 和 可能参与到了鱼类性腺的发育 近几年的研究结果表明 7 主要是通过结合其受体激活相应的信号通路从而达到刺激细胞的增值 分化 阻止凋亡和调节代谢等功能 其中 ;)) 和 :: 信号通路是 个主要的信 号途径 同时 研究发现 7 激活 :: 家族可以调节某些基因的表达 如 # 等也证实了 ::8 可以介导 7 抑制 - 的表达 尽管在 的启动子序列中我们也发现了一个 :: 结合位点 但是 7 调控 - 的表达是不是也需要 :: 介导还需要进一步研究 )/', 转录因子在垂体特异表达 并且指导 7): 等多种垂体特异性基因的表达 在鲤垂体中我们检测到大量 和 - 表达 * 推测 )/', 可能是 和 在垂体中的表达增强子 在鲤 和 启动子序列中均发现大量糖皮质激素受体 3$&#'/&#/ 4&9'#4 7 雌激素受体 0'4#3 4&9'#4 孕激素受体 94#30'4# 4&9'#4) 和性别决定蛋白的结合位点 由肾上腺皮质细胞分泌的糖皮质素与其受体结合形成配体 受体复合物再以二聚体的形式结合在 7 元件从而激活一系列参与糖异生和脂肪代谢过程的基因表达 已有研究表明 可的松可以增加 - 的表达量 这些结果预示着 和 的基因表达也可能受到糖皮质激素的调控 且 7+) 和 可能参与了鱼类糖类和脂肪代谢 和 ) 可以与 和 调控区域结合 表明 7+), 和 的合成与分泌亦受到性类固醇激素的调控 = 结合位点的存在进一步表明了 7+)0 参与了鱼类性腺的分化和发育.D/-4. 等研究发现 斑马鱼 启
期陈文波 等 鲤胰岛素样生长因子结合蛋白 和 基因启动子克隆与序列分析 动子上存在着一个功能性的厌氧诱导因子 59#>/./&/8$6.&'#4 结合位点 在厌氧状态下刺激斑马鱼胚胎和成体肝脏中 - 的表达 同时 人 基因在厌氧状 态下也被 直接调控 且为正调控 这些结果表明 7+), 与厌氧状态下细胞的生长和代谢有关 然而 本文在鲤 和 启动子中没有发现潜在的 结合位点 这表明 7+)0 尽管结构类似 但其基因表达可能受到不同的方式调控 从而发挥特异的功能 本文克隆并分析了鲤 和 基因上游启动子的序列 结果表明鲤 和 基因可能存在基础和激素应答表达 尽管存在这些保守的应答元件 但具体功能还需要进一步的研究 参考文献 #0!$--#0%0$/,$/234#1'5 6.&'#40. '5/48//3 94#'/0 8/#$#3/&.$.&'/#0 % #&4 %.!!$--#0%/64'/.$>940/#. 8/#$#3/&.$6&'0 #6 /0$/,$/2 34#1'5 6.&'#4, 8//3 94#'/. /.0&$.40-##'5-0&$&$0 %+/#$!5- * * *% /4'5 ; +.>'4!%!$$.4.&'/#0 #6 '5 /0$/,$/2 34#1'5 6.&'#48//3 94#'/0 % #&4* *% 1." 5 = #06$ 7%:5 /0$/,$/2 34#1'5 6.&'#4,8//3 94#'/ 7+) 0946.-/$ %#&4 *%.!%9&/6/3 '5&$$.4409#00'# 7 0/3.$0 4#$0 #6 7,8//3 94#'/0 % #&4/#$ % /&2;!# $'!%:595$#3 #6'5/0$/, $/234#1'5 6.&'#40%'!'#$** %!$--#0%0$/,$/234#1'5 6.&'#48//3 94#'/0. '5/44#$/ &#'4# $/3 7.&'/#0%!'#2/74#1'5.&'#4* % *!5 + / / %!#--# &.49 /0$/,$/234#1'5 6.&'#48//3 94#'/, 7+), ;#$&$.4&$#/3 >940/# 94#6/$0. 5#4-#.$43$.'/# / 59.'#&'0% 7!#-9 #&4/#$ %!5 =!5# ; 7#3 =$'%!$#/3. 8/#$#3/&.$..$0/0#6'5E84.6/05 /0$/,$/2 34#1'5 6.&'#4 8//3 94#'/ 94#>/-.$94#-#'443/#%!$+/#$ *% 王镜岩 朱对庚 徐长法 % 生物化学 ;% 版 % 北京 高等教育出版社 % 朱玉贤 李毅 % 现代分子生物学 ;% 北京 高等教育出版社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郑洁 李进 于树娜 等 % 肝细胞核因子的研究进展 % 医学综述 * % *74.3:#> /3. 7$'%!$,'909&/6/&.&'//' #6'1# 3$&#'/&#/ 409#0//'0#64.' '4#0/.-/#'4.064.0 3 /0.0#&/.' 1/'5 -$'/9$8//3 0/'06#4!(+)..#$$/4 09&/6/&&$.46.&'#4 %&$/&&/00.4&5 % 5#8.1-. ;/ $'%=. /5/8/'#4#695#095.'/$/#0/'#$,2/.0 /5/8/'0 7,-/.' >940/# #6'57, 3/ 4.' 59.'#&'0 % #&4/#$ * *%
水 产 学 报 卷./3!.4'4,!%&'..&0 / 34#1'5 5#4-#0/3.$/3 % #&4;'.8 /0#4 % $01.4.9 7 < /.3 %74#1'5 5#4-# 43$.'/# #6 /0$/,$/2 34#1'5 6.&'#4, 3 >940/# -. 8-/.' 8 -$'/9$/0'.$0/3.$ '4.0&4..&'/.'#4#6'4.0&4/9'/# 8//3 0/'0%#&4/#$* % # ;!5/. ;4/#,;.4'/E $'%/3.$ '4.0&4..&'/.'#4#6'4.0&4/9'/# '.' 8, -/.' /5/8/'/# #6 /0$/,$/2 34#1'5 6.&'#4 8//3 94#'/, 3'4.0&4/9'/#.-&5./0-6#4 4940/# #63>940/# 8 34#1'5 5#4-# %;#$ #&4/#$ % /!.2. ; '.052# ; $'%:4.0, &'/.'/#. 4940/# 94#94'/0#6'5 #$ #0'4#/ 3$&#'/&#/ 4&9'#4 $/3., /54#,,54#>,,-'5#>,,'4/-'5$,,,-'5$&&$#5>,,,,8E#94.#,6 C/#$/. /'06#40'4#/0#-40 %;#$)5.4-.&#$ % $ ;./31## : )4E; $'%4- /0$/,$/234#1'5 6.&'#48//3 94#'/0 7+)0.0-.42406#4..8#$/&(&.'.8#$/&&#/'/# / 6/050 %!#-9 +/#&5- )50/#$++/#&5- ;#$+/#$ %.D/-4. /..!% 40'./3 59#>/.,/& 3 >940/# /.4$ $#9-' "$. ""..$0/0#659#>/., /&/8$6.&'#4,43$.' E84.6/05 /0$/,$/2 34#1'5 6.&'#48//3 94#'/ 3>940/# % ;#$!$+/#$ % :.E2;.E4;3.1.4.$'%9#>/. 0'/-$.'0/0$/,$/234#1'5 6.&'#48//3 94#'/ 7+), 3 >940/# / 97 &$0. 9# 0/8$ -#$6#47+), >940/# / 6'.$ 59#>/. %)4#&.'$&. &/ * ** % )#9#/&/; ; +5.'/. $'%9#>/. 43$.'0/0$/,$/234#1'5 6.&'#4,8//3 94#'/ / 5-. 6'.$59.'#&'0 / 94/-.4 &$'4 0330'/-#$&$.4-&5./0-06#4/ '4# 6'.$ 34#1'5 40'4/&'/# &.0 8 '4#9$.&'.$ /0 6/&/& %!$/ #&4/#$;'.8* %
期陈文波 等 鲤胰岛素样生长因子结合蛋白 和 基因启动子克隆与序列分析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�:: 8#> 89 B'# '50'.4'0/'#6 '4.0&4/9'/# / 94#-#'415/$/ '590'4.-'541.0.) 8//3 0/'/0'. #6!:8#>% /'54::8#> #4!:8#> 1.06# / '594#-#'4#6 #$.) 8//3 0/'. 4/&5 -#'/6/ '5/043/#%:5040$'005#1 '5.''594#-#'40#6&#--# &.49. / #' &#'./ '5&5.4.&'4/0'/&0#6&$.0/&94#-#'4%4'54-#4 0#-#'54'4.0&4/9'/# 8//3 0/'014 #804 / '5'1# 94#-#'400&5.0! +)/',&',7 )=. 0# #15/$ '5:: 0/3.$'4.0&4..&'/.'#4#6'4.0&4/9'/# 1.0#$ 6# / %:5040$'0 0330' '5.''54148.0/&. 5#4-#,/&/8$>940/# 9.'40#6. 30% #14'543$.'/# -&5./0-014#'�/0''8'1 '5'1# 30%, $ /0$/,$/234#1'5 6.&'#48//3 94#'/0 94#-#'4 0C&..$0/0 0$#'.,053.#,4.%,-./$$0$10-./$%00%%&