第 卷 第 水 生 生 物 学 报 期 年 人 月 盐 泽 螺旋 藻 藻 胆 蛋 白的 分离 特性研 究 刘其芳 张宪孔 王后乐 中 国科 学 院 水生 生 物 研 究 所 武 汉 提 盐 泽 螺 旋藻 介 戚 沥 要 的水 溶 性 色 素 粗 提 物 经过 硫酸 钱沉 淀 径 基 磷 灰 石 柱 层析 后可 以 分 出 两 种藻 胆蛋 白 即 藻蓝 蛋 白 在 可 见 光 部 分的最 大 吸 收 与 般认可的 纯度 标 准 人 中 仅 见 条 色 带 石 夕 处 吸 收 之 比 可 分 别达到 为 纯 化后 的 为 别 藻蓝 蛋 白 它 们 的 纯度 指 其 而 在 聚 丙 烯 酸胺凝胶 电 泳 其 最 大 吸收峰 分别在 其 室温荧光 发 射 峰 分 别 为 通 过十 烷 基 硫 酸 钠 聚 丙 烯 酸 胺 凝 胶 电 泳 肠的 梯 度 中 均 可 分 为 月 两个亚单 位 胆 体 核 亚 结 构 的 组分 类似于 多肤 盐 泽 螺 旋藻 的 弓 种 蓝藻 除 肠 或是 在 召两 个 亚 单 位 外 在 报 道 的 聚 胞藻 月 依 此 推 算该 藻 的 户 产 它 与钝 顶 螺 旋 藻 户 结 合较 紧 密 为 藻 的 亚单 位 分 子 量 分 别 为 无 论 胶 浓 度在 而 左右 的 无 色 多 肤 它 可 能 与 中还偶 见 个 拉 够 梯度 夕 中的 民 的 最 小分 子 量 应 为 相 比 显得稍低 但 略高 于 其 它几 经 等 电 电 泳 法测定 其 蓝藻大 抵 相 当 的 等 电 点分别在 它 与 以 往 报 道 的 些 盐 泽 螺 旋 藻 的 藻胆 蛋 白 占细 胞 干 重 的 关 键词 蓝藻 盐 泽 螺 旋藻 斗 藻胆 蛋 白 左右 可 望成 为 人 类优 良的蛋 白 源 藻 胆 蛋 白 为 蓝 藻 红 藻 隐藻 的 主 要 捕 获 光 能 色 素 蛋 白 们 加 根 据在 可见 光 吸 收 范 围 内 的 最 大 吸 收波 长 位 置 藻 胆 蛋 白被 分 成 工 别藻 蓝 蛋 白 黑 藻 红 蓝蛋 白 蛋 白以 在 本 工 作 承 黎 尚 豪 教 授 关心 宁 年 包括 成 叮 以 盖 黑 弓 此外 兄 中的 隐藻 的 其 中有 还 有藻 红 蓝 中 均 包 含 了 同 样 的 藻 蓝 素发 色 团 外 还 含 有藻 红 素发 色 团 除 含有 有 藻蓝 蛋 白 以及 最 近 报 道 的存 在 于 蓝 色 裸 甲 藻 石 个 主 要大 类! 月 日收 到 爷 特此 致 谢 在 中仅有 在 而在 中
期刘其芳等 盐泽螺旋藻藻胆蛋白的分离特性研究 中还含有藻尿胆素 在藻红蓝蛋白 中更有个未知结构的胆 色素 山 所有已知结构的发色团都是开链的四咄咯环 夕亚单位通过醋键或硫醚键共价相连后便产生了捕获光能的作用 蓝藻红藻普遍包含 或 大部分蓝藻红藻还含有少量的 藻中还存在 E 川 此外 当它们与天然蛋白的 在些蓝藻所有红藻中则含有 在部分缺乏 E 而有异形胞的蓝 藻胆蛋白以近乎 务的高效率把光能优先地传递给光系统 ( S 反应中心叶 绿素 t 其能量传递顺序为叫 或 R E 或 E ( 56 5 c { { ( 的亚单位 R 或 核膜联结多肤七 6 x 七 65 ( x 6 8 ( 沈 x 蓝藻的藻胆蛋白甚至占到细胞可溶性蛋白的 6 外 ( 干重的 多 6 藻胆蛋白随之减少 盐泽螺旋藻生长块 幻 的材料 因而 因此藻胆蛋白可视为蓝藻的氮库 蛋白含量高 [ 火 每当氮饥饿时 作为人类蛋白的直接或间接来源是个很有希望 无论是从探索光合作用光能捕获器的角度还是从寻求人类蛋白新来源的 角度对盐泽螺旋藻藻胆蛋白的研究都是颇有意义的 作者另文对盐泽螺碑藻藻胆体的多 肤组分光谱特性作了报道阎 ; 本文则是对其有色多肤部分 ( 即藻胆蛋白 进行了分离 化及其特性研究的结果 纯 材料与方法 藻体培养所用盐泽螺旋藻 (S 行耐 bs r s v 为南京大学赵英华老师赠送生长于修改的 Z r r u k 氏培养基中 ( 其中 N H c K Z H O ; 均减半 冷白荧光灯 连续光照 光强约 产 E 5 温度在 3 左右 通空气培养 般生长 5 天后 对数生长后期离心收获 藻胆蛋白粗提物的制备将离心收集的藻体用蒸馏水离心洗涤两次后 等体积的 / ( H 7 的磷酸盐缓冲液中 持在 5 左右 秒 并辅以显微镜观察 继以超声波破碎细胞 3 (J 超声处理机 并置于液氮中冷冻 振幅 5 于其 重新悬浮于 融化时尽量维 每超声 3 秒间隙 直至几乎全部细胞破碎为止随后离心 ( 斗 x 分钟 取 蓝色上清液其中的 浓度按 藻类学方法手册 圈中的公式计算藻胆蛋白 的分离与纯化先将上述离心所得的蓝色上清液用 5 多 (w / V 饱度的 硫酸钱沉淀 然后离心 ( X 分钟 收集沉淀并溶于少量 / (> H 7 赵英华等 劝 第届藻类学会论文集 水生所第五研究室生化组工作报告
水生生物学报 卷 的磷酸盐缓冲液中 随即对着 / ( H 7 的磷酸盐缓冲液彻底地透析至平衡 ( 约更换缓冲液 3 4 次至少斗小时 当离心 (4 x 分钟 除去变性蛋白后其上清液直接上已用 OO / ( H 7 的磷酸盐缓冲液预平衡了的 H 层析柱 ( I X 4c 液的洗脱液 在洗脱过程中不断增加磷酸盐缓冲液的离子强度 立即进行光谱测定或暂贮于低温冰箱 并分别收集不同离子强度缓冲 所用的磷酸盐缓冲液均含有 / N I ( 以利 H 对蛋白的吸收 疏基乙醇 / 叠氮钠 藻胆蛋白亚单位的 分离 全实验均在弱光低温下进行 白用 7 5 异 G E 作进步电泳鉴定 [4 ]如为条色带 的 SD S G E 分析其亚单位 先将从 H 层析柱洗脱下的已达到吸收光谱纯度的藻胆蛋 再以 5 % 或梯度为 7 5 多 凝胶配制电极缓冲液系统基本按 W b r 习等方法 泳在 下进行并维持在 左右电泳后用考马斯亮蓝 G 5 染色 醋 酸甲醇水褪色 测定分子量的标准蛋白为 牛血清蜜白 (68 过氧化氢酶 (6 卵白蛋白 ( 43 狗铁蛋白单体 ( 8 5 溶菌酶 ( 4 3 等电点测定采用 7 7 多聚丙烯酸胺凝胶等电电泳法 上槽液为 H 范围 4 拓 H Z SO 下槽液为 4 务乙胺 氨基酸分析样品按常规处理用日立 835 5 型氨基酸分析仪测定 光谱分析 吸收光谱用日立 5 分紫外分光光度计测定室温荧光发射光谱用日立 M F 4 型荧光分光光度计测定狭缝 激发波长 58 密度扫描以 r s c 型密度计测定 蛋白测定采用 F 酚试剂法 / 电 结果与讨论 其 盐泽螺旋藻的水溶性粗提物先以 5 界饱度的硫酸按沉淀 c 的纯度分别达到了 7 7 6 5 5 洗脱顺序为 / 在前 在后 ( 磷酸钾缓冲液 ( H 7 经次 H 柱层析后 两者均超过了般认可的纯度圈 两者被洗脱的离子强度分别约为 O5 / ( c 显然 其 盐泽螺旋藻的藻胆蛋白粗提物通 过次硫酸按沉淀次径基磷灰石层析柱是完全可以达到纯化的其成败关键在于选 择大小合适的 H 粒度降低层析柱的洗脱流速并在低温 (< 条件下进行 纯化后的盐泽螺旋藻的 c 的最大吸收峰分别位于 6 65 ( 图 ; 室温荧光发射峰分别位于 6 斗 Z 6 57 ( 图 这些般报道的蓝藻诸如 鱼腥藻 ( 召 b 探 s 聚球藻 ( S 夕 c 五 c cc 隐球藻 ( c 口 s 以及 钝顶螺旋藻 ( S r 6 相近似 通过 5 % SD S 聚内烯酸胺凝胶电泳 ( 或在 7 5 % 梯度 sd S 聚丙烯酸胺凝胶板 状电泳中 可见 c 由 夕两个亚单位组成 其分子量分别为 6 9 5 ; 亦由两个亚单位构成它们的分子量分别为 5 5 ( 8 ( 夕 ( 图 3 4 若用 7 5 务 SD S G E 染色后偶见 带着个小分子的无色多肤 分子量约为 4 k D 它可能与 结合较紧密为藻胆体核亚单位组分之类似于 G z r 等山
期刘其芳等盐泽螺旋藻藻胆蛋白的分离特性研究 斗 9 所报道的聚胞藻 ( s y c 人 c 夕了 r 艺 s 6 7 中的 k D q 5 必月 u 璐 斟荟孚蓄之扫门工之 7 8 叫 4 3 6 65 5 6 7 波长 ( W 抑 t ( 多肤 由以上亚单位的分子量推算盐泽螺 旋藻的 c 的最小分子量 分别为 35 5kD 3 5k D 较钝顶螺旋 藻 ( 5 t st s 的 低 ( 它们分别为 44 Ȯ k D 3 8 k D 而 盐泽螺旋藻的 与鱼腥藻 ( b s 然 最小分子量 相 近并高于层理鞭枝藻 (M s t c u 了 而其 的最 - 小分子量却高于鱼腥藻 ( 加 b 召 s 并与聚球藻 ( Sy 己 c c c c 了 s 异多半是种的不同造成 排除实验条件的影响 相近 这些差 当然也不能 经密度扫描染色后的 的 SD S G E 胶片明显可见 c 图 盐泽螺旋藻的藻蓝蛋白 ( 别藻蓝蛋白 ( 的吸收光谱 ( 分别在 O 5 灯 ( H 7 / ( H 7 的磷酸盐缓 冲液中 F 9 b sr t s tr f y cy ( - y y ( st f r s 户爹 r b s 口 吸 爬八曰 \ 6 尸 3 s t / N b u 仃 r ( H 7 补 窃已侧注 翅州 呆似节璐 uu 的 工 J 图 盐泽螺旋藻的藻蓝蛋白 ( 别藻蓝蛋白 ( 的室温荧光发射光谱分别在 s / / ( H 7 三创 的磷酸盐 缓冲液中激发波长 5 8O 狭缝 IO q 厂 9 R f s 占对 沙 u r s c s s s c t r f yy ( s / b u f r / K s t 五 y y ( - / N I b ss 4 5 6 7 波长 ( W v t ( 粉 的夕亚单位 的夕亚单位以及个约 4 k D 的无色多肤 ( 图 5 通过等电电泳法测得盐泽螺旋藻的 c c 的等电点 (IE 分别为来 4 卜山 血
f r s 水生生物学报 卷 图 3 F 3 f r 盐泽螺旋藻的藻蓝蛋白别藻蓝蛋白 SD s G E 图谱粗提物 ; 藻蓝蛋白 ; 4 标准蛋白 ; 5 别藻蓝蛋白 s D s s b tr t r s f t u r f y y y y 了 t 石了 S 4 夕口犷 su b u ts f y c y 吞 su b u ts 户 x 9 印 7654 劝 三忽 冬 已工 三芝 叫佘十 3 4 5 6 迁移率 ( M b ty 8 9 图斗盐泽螺旋藻藻蓝蛋白别藻蓝蛋白立单位的分子量 F 9 4 b r t f r t u r w ts f t y c y su b u ts r t s 占了 了 口 r r r s k V t s f w c 6 ; 产 户 召 t s 奋 G 两者的差别其所含的梭基氨基酸及碱性氨基酸的不同比例相关 所含的竣基氨基酸 ( 天冬氨酸谷氨酸 与碱性氨基酸 ( 赖氨酸 酸 之比略高于 因此其 IE 稍低于 这与鱼腥藻 64 ( 刀 b 由表 可见 精氨酸组氨 口 夕 s 6 4
I D 3 9 9 5 7 3 4 6 8 3 9 8 6 { { 5 ; 期 刘其芳等 盐泽螺旋藻藻胆蛋白的分离特性研究 5 J 书 尸 门 q 已 >[ 的卫 忆工之纽叠毛从籍 -刃 刀 乃 I j 八 I! I ṭ 口 口 刀 4 k D _ 图 5 盐泽螺旋藻的藻蓝蛋白 ( F 5 D t 迁移距离 M rt s t r r s f 别藻蓝蛋白 ( 的 SD S ( - ( 少 G E 人 G E 胶片的密度扫描 su b u b 表 盐泽螺旋藻筑蓝蛋白 ( c 别燕蓝蛋白 ( 的氨基酸组成 r b f r 5 了 u b 了 石 岁 V u s b t f r t r y s s v r v u s f r 4 y r y s t s s % f r c v r c 戛基酸 天冬氨酸 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酸 甘氨酸 丙氨酸 耽氨酸 撷氨酸 蛋 氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 酩氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 组氨酸 精氨酸 脯氨酸 色氨酸 S T r Sr G u G y 人 G y s V M t u T y r y s H 5 r ro T r y c 3 3 3 3 4 5 5 6 6 什产 O 八入 J 份介 j 了了内吕 未测 { 3 5 斗 c 7 月
N t c N 介 5 5 水生生物学报 卷 多变鱼腥藻 ( ; b 的情况类似 即 的 IE 高于 但盐泽螺旋藻 的 的等电点低于以上两种鱼腥藻 它们分别为 4 9 5 8 以及 4 76 4 9 若同聚球藻 ( Sy cus s 隐球藻 ( 入 c 比较 盐泽螺旋 藻 的 IE 显得较高 而其 的 IE 却低于上述两 它们分别为 4 4 6 种藻 ( 分别为 4 7 6 4 盐泽螺旋藻的 c 的氨基酸组成列于表 两者的苯丙氨酸蛋氨酸均 较高在 中未测出脯氨酸酪氨酸在 中未测出脯氨酸 酪氨酸 精氨酸 组氨酸很可能是含量较低所致 在 中缺乏组氨酸与般报道相致 盐泽螺旋藻所含藻胆蛋白占细胞干重的 8 4 多与般蓝藻相比是较高的 人类新兴的蛋白源 c 可望成为 参考文献 此抖绍 4 f 5 了 { { { 胡鸿钧俞敏娟张宪 孔蓝裸甲藻藻胆素的发现意义 张宪孔刘梅刘其芳王 后乐黎尚豪 7 刘其芳 tt 王后乐 c 了 t 邢 r 夕 r 张宪孔 仍 5 F E S uss b ryt 3634 亡 r 五 S r t 叮月了 f s 盐泽螺旋藻藻胆体的研究 6 r c 人 M 介 r 吞 r b rt s f 对占 s 科学通报 蓝裸甲藻藻蓝素的初步分离光谱特性 厂 5 5 植物生理学报 b u 59 宜 汉 r 幼材 c r 吞 6 7 工 y t 介 tur 硫 f y t r b z r y t strutur f y b tr yc b s s 廿 了 3 3 7 刃 待发表 b u r c 人 653 科学通报 M c r b r r b r t s M 了 t 心 c u 五邪 y fr t 五 b u 五 z r r c 人 M 玄 c r b r t b Z ts I t 五 y f u 85 r k r y s s U v r s t y f f r z r 厂 r N w u r rt s f y y s r c 入入了 c r b 弓 38 D v s z r c S c E r 五 r 47 G 7 r z r r s s I 卯 r 五 万 主 主 s srru ru r s r I N G rr 9 生 t t 五 u r sr u r r s 理刀 口 r t ss 巴 b ] y 主 r s s 界 b 主 s s f R f 艺 c tr r s b c y ss f yc y y r ts rc 左 r 占 53 G tt r v s t t x s c 己月 c 亡 s 787 G tt 五界 b j s s 才 rc 人尸亡夕 I 探 z 了 左夕 347 G zr z r r r c 岔交 U 5 才 8 zr 界 cy s f u c u r f tu 台 b u r 邵 J 了 汤沙邢 4 8 6 6 3 6 7 G zr 刀 亡粉 R c 份 5 5 57 G zr 工 r x t z r f t r y t r s r f c 无私 N y
w r s u r I H b k f 五界 期刘其芳等 盐泽螺旋藻藻胆蛋白的分离特性研究 53 rf f 砚 r 孟 内 自 仲 J j 幼 c 亡 f 户 夕了 c 才 c 之 zr y b s b 冬 J 了人夕 r S c c 亡 3 5 7 W b r K O s b r y 45 5 b r t s M r r r s s J 弓 亏 4 全 9 7 8 u r 刀 几邢 b 如 rt 主 困 t s f t s y t 下 c c u r 斗 6 44 多 K t s f r y 之 M t E t t t s y s t M c t r t b y s u y s u f t y c r - _ u Q f W H u 刀了了 了 z f H 夕了 夕 泞 f c v t y s f y b r t s y r x y t t u r T w t t r t y f 7 r f u r s c 是 s t t S D S c W t ur f 于 y r y u r f 5 5 y s b t s w 7 ( 6 / 8 6 4 飞 从 匕 5 v t s r t r t ( ( t t s w s s s s b s r t x ; t w t u r t y f 6 丫 4 c 6 5 ss t 而 657 U r t u r t r u r 7 5% SD S J yry s b s u r w t s f 6 8 k D f r t s 尽 subu ts t v y y t b w t y b s s u r w t f 4 9 S t ( b y G E s f 三 % y 5 k D f r t 尽 subu ts s r s s ( k D w c w s r b b y r u s s v G z r 9 8 5 f r s y 九 c c y 6 7 沙 r r s r r t s t r T t s f t t t r w f r r 夕 了 s t r T 飞 c 卜 r r s w s st t r 8 4 % f t w - - t f r t t s t 了 s t 5 - f r y w t f 5 5 b ; 刀 r j f b T 飞 } u s t 5 r t t t r u r T b v r s u t s s w t t r 刀 ; 况 b 夕 r 5 S s u r f r b r t 户 s 占 z G E