第 卷第 期! 年 月 水 产 学 报!! 文章编号! # $!%! # $ # #! $ %!!! $ 栉孔扇贝 $ 基因的克隆和表达分析 王 丹 李海龙 毕 颖 刘建国 张志峰 中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室 山东青岛 $$ 摘要 为了研究! -! 基因在无脊椎动物生殖过程中的作用 实验从栉孔扇贝转录组数据库中获得一个表达序列标签 采用 # 末端快速扩增技术克隆得到! 条全长为! 的 # 序列 其开放阅读框为 编码 个氨基酸 推测的氨基酸序列含有! #) 特有的 个保守区和! # 的 个酶结构域 且与人等脊椎动物的序列相似性均在 % - 以上 半定量 % 显示 该基因在栉孔扇贝精巢 卵巢 肌肉 外套膜 鳃 肝胰腺和肾脏等各组织中均有表达 其中在肝胰腺和肾脏中表达量明显高于其他组织 对不同发育时期性腺中该基因表达的 5 % 检测发现 其在精卵巢发育周期的表达模式不同 且在生长期和成熟期的精巢中表达量显著性高于同时期的卵巢 由此推测 栉孔扇贝多种组织中均可以合成! # 在精巢的发育和成熟的作用明显高于卵巢 关键词 栉孔扇贝!-! 基因 克隆 序列特征 组织表达中图分类号. %! 文献标志码! #) 通过催化性激素! 位上的醇基和酮基之间的氧化还原反应 使性激素在高 活性形式和低活性形式之间相互转化! 从而调节相应的生物学功能 在动物性别分化 性腺发育和生殖调控中起重要作用! # 位于动物的过氧化物酶体中 它可以催化高活性的雄烯二醇和雌二醇转化成低生物活性脱氢表 雄酮和雌酮 目前发现其广泛分布于动物各 组织中 并在人 小鼠 大鼠 猪等的肝脏的肝细胞 肾脏的近端小管上皮细胞 卵巢的粒层细胞 子宫的管腔和腺上皮 精巢的睾丸间质细胞 前列腺的上皮细胞 骨骼肌的肌细胞 视网膜色素细胞和脑的浦肯野氏细胞中均存在明显 的特异性表达 % 1/ 等发现敲除该基因后 小鼠的精巢支持细胞中大量累积中性脂质 幼鼠出现痉挛症状 成体雌鼠的生殖能力会 降低 雄鼠则完全不育 人类!-! 基因突 变则产生严重的 /8/ / 样综合征 $ 在人前列腺癌的上皮细胞中发现该基因在 和蛋 白水平均出现过表达 性类固醇激素在软体动物中广泛存在 目前已在紫贻贝! 砂海螂 和巨扇贝 % 等双壳动物中检测到孕酮 雌二醇 睾酮等的存在 并发现性激素对巨扇贝的排卵 性腺发育! 和性别决定等有重要的影响 软体动物中有!! 关! #) 家族的研究还较有限 1 等 克隆获得了九孔鲍 *! %!-!! 全长 # 发现该基因在生殖期的性腺中表达量最高 并证明该酶可使雌酮转化为雌二醇 推测其在九孔鲍生殖阶段的类! 固醇合成中起着重要作用 1! 等克隆了九孔鲍的!-!!! 瞬时转染入人的胚肾 细胞后 发现该酶可以降低高活性雄性激素 双氢睾 收稿日期!! 修回日期!! 资助项目 国家 * 八六三 高技术研究发展计划! 青岛市科技计划基础研究项目!!!! 1 山东省自然科学重点基金 # 通信作者 张志峰!! / *
$ 水 产 学 报 卷 酮和睾酮 的水平 最近 在太平洋牡蛎 的基因组中报道了!-! 和!-!! 等序列! 然而贝类中是否还存在其他的! #) 成员 目前我们还知之甚少 这无疑限制了人们对贝类性激素的合成和灭活途径 性激素的运输 靶组织定位以及调控等方面的理解 栉孔扇贝 # 隶属软体动物门 )! 瓣鳃纲! /!* 1! 其肉鲜味美 营养丰富 是我国重要的海水养殖贝类之一 具有较高的经济价值! 本研究克隆了栉孔扇贝!-! 基因的全长 # 序列 进一步对其组织表达以及不同发育时期性腺中的表达进行了分析 旨在为贝类性激素合成以及!-! 在贝类中的作用途径等深入研究提供基础数据! 材料与方法 实验材料实验所用 龄栉孔扇贝购自青岛市海德发海产品市场 过滤海水中暂养 1 选择健康的雌雄个体 解剖并获取性腺 肌肉 外套膜 鳃 肝胰腺和肾脏等组织 干液氮中速冻后 存于 # 冰箱中 用于总 提取 部分性腺样本于 * 氏液中固定 1 后 存于 - 酒精中用于组织学观察 以确定性腺的发育时期 总 提取及 第一链的合成采用异硫氰酸胍法提取栉孔扇贝生长期卵巢的总!%!- 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测 的质量和浓度 使用 #! * */ 1 并按照操作指南合成 # 第一链 将生成的 # 模板保存于 # 备用 扩增和全长 序列的获得从,/*!* 数据库获得人类 小鼠 野猪 非洲爪蟾 斑马鱼 底 等物种的! # 蛋白序列 与已经构建的栉孔扇贝转录组数据库中的序列进行!) 比对 筛选出同源性较高的数个基因片段 根据期望值 相似度 得分等参数将基因片段进行筛选 并将最优参数组合的基因片段再次在,/*!* 上进行!) 筛选出最符合栉孔扇贝!-! 基因的片段 根据该片段序列设计 % 引物 %!% 和 引物 % % 表! 采用已获得的 % 模板 以引物组合! % $%!%$% 和! % $% %$% 进行目的基因的 % 和 扩增 % 反应体系为 % 循环参数为 * )$ ) 延伸 * % 个循环! * 扩增产物经! - 琼脂糖凝胶检测 胶回收后与 #! 载体连接 然后转化到大肠杆菌 # % 感受态细胞中 挑取阳性克隆进行菌落 % 和 * 酶切鉴定后 送往华大基因进行测序 序列特征 同源比对及系统进化树构建利用 #)! 软件对所获序列进行全长拼接 通过 的!)% 程序在,/*!* 数据库中进行相似性搜索 #)! 软件预测其蛋白分子质量和等电点 在线软件, )! * %/ 预测该基因糖基化位点 氨基酸多重序列比对由 )! 和 #!* 软件完成 系统发生树采用 )! 和, 程序中的邻接法 / 1 * * 构建 半定量 % 分析根据目的基因全长 # 序列设计! 对特异引物 % 和 %$ 表! 以引物 % 和 % 表! 扩增栉孔扇贝 - 基因,/*!* 登录号 7 %! 的序列片段作为内参 提取生长期栉孔扇贝的肾脏 外套膜 肝胰腺 鳃 闭壳肌 精巢和卵巢的总 并使用 % / /! /* 大连宝生物 并按照说明书反转录获得 # 用做 % 的模板 % 反应体系为 循环参数为 $ 退火 ) 延伸! * 个循环用于扩增!% 的目的基因片段 % 个循环用于扩增 % 的 - 基因片段 8 相对定量 % 分析取保存于 - 酒精中的性腺组织 经系列酒精脱水 二甲苯透明 石蜡包埋 切片 厚度为 % 后 染色 于 * 显微镜下观察 拍照 根据组织学结构特征!$ 将性腺划分为 个时期 图 % 增殖期 滤泡壁由! 层生殖细胞组成 生长期 滤泡壁由多层生殖细胞组成 滤泡腔明显 成熟期 滤泡腔内充满生殖细胞 精巢出现大量精子 卵巢中成熟卵被挤压 呈不规则形状 和休止期 滤泡壁由不成层的细胞组成 滤泡腔极大 每个时期雌雄各取 个个体的性腺样本 根据已获得的栉孔扇贝目的基因 # 全长序列设计! 对特异引物 % 和 %! 表! 依
期王 丹 等 栉孔扇贝!-! 基因的克隆和表达分析 $ 据栉孔扇贝 - 基因序列设计! 对内参引物 %!! 和 %! 表! 以 - 的序列片段 扩增片段长度为! 作为内参 使用 % 型荧光定量 % 仪检测目的基因 扩增片段长度为!% 在栉孔扇贝性腺组织中的相对表达 每个性腺样本做 个平行检测 % 反应体系为 循环参数为 % % *%!% )$! * 个循环 设定栉孔扇贝增殖期卵巢目的基因的表达量为! 采用 # 法计算目的基因的相对表达量 以 %! 软件包中 */8! 进行显著性分析 # *!* 法进行多重比较 * 1 % 为显著水平 用 ) / / 作图 表 实验中所用的引物序列 %# )-!,)!/ /,1 % 引物 /*! / * $ )1 $ % 序列 % /)/5 /* /,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, %!,,,,,,,, %,,,,, % %,,,,,,,,,,, %,,,,, %$,,,,,, %,, % %,,,,,,,,,,, %!,,,,, %!!,,,,, %!,,,,,,, 结果 目的基因全长 的克隆 序列特征和系统进化分析利用 #)! 软件去除测序结果的载体序列后对其进行拼接 获得的栉孔扇贝目的基因的 # 序列全长为!,/*!* 登录号 $! 其中 % 非编码区为! 非编码区为!% 含有 的 尾巴 该序列开放阅读框为 可编码 个氨基酸 预测其蛋白分子质量为 等电点为 该氨基酸序列含有 个! # 家族保守区 同时 还含有!! 个 糖基化位点 图! 选择哺乳类 鸟类 两栖类 鱼类和双壳贝类等物种的! # 氨基酸序列进行比对 结果显示栉孔扇贝的! # 与人 原鸡 非洲爪蟾和亚东鲑等物种在 端短链脱氢酶结构域 # 中心水解酶结构域 # 和 端固醇载体蛋白结构域 % 的相似性分别为 $ - -%$- $ -%- %$- 在全长氨基酸序列的相似性分别为 % -$ - % - 和 $! - 图 系统进化树显示 根据本实验所获得的栉孔扇贝目的基因推导的氨基酸序列首先与太平洋牡蛎聚类 之后与斑马
/ 水产学报 / 卷 鱼 底 和 亚 东 鲑 聚 类 然 后 与 原 鸡 非 洲 爪 蟾 期的精卵巢中 均 有 表 达并 且 随 着 性 腺 成 熟 其 表 蜥蜴和东 部 菱 背 响 尾 蛇 聚 类最 后 依 次 与 鸭 嘴 达量均有升高%其 中 生 长 期 和 成 熟 期 精 巢 中 目 的 兽 野 猪 小 鼠 和 人 类 聚 类 # 图 / $ 基因的表 达 量 显 著 性 高 于 增 殖 期 和 休 止 期 精 巢 % $!6 #, 基因的时空表达 # B17 $ % 然 而 卵 巢 中 的 表 达 量 在 各 发 育 时 期 半定 量 $N8 7-$ 结 果 显 示!E *9 $% 之间无 显 著 性 差 异 # 17 $ % 在 生 长 期 和 成 熟 分布广泛在所 检 测 的 栉 孔 扇 贝 各 组 织 中 均 有 表 期精巢的表达 量 显 著 性 高 于 同 时 期 的 卵 巢均 为 达且 以 肾 脏 和 肝 胰 腺 中 表 达 量 最 高 # 图 9 $ / 倍# B1 7$ # 图 6$ S$N8 7-$结果显示!E *9 $%在 各 发 育 时 图 $栉孔扇贝 $!6 #, 全长 )*序列及推导的氨基酸序列 小写字母代表 #N$序列大写字母代表编码区序列%双下划线代表翻译的起点和 终 点%括 号 区 域 代 表 预 测 的 %8 糖 基 化 位 点 方 框 区域代表 $8 *5家族保守区由 %端向 -端依次为 NDXXXDXD辅 酶 结 合 位 点%%D结 构 性 保 守 序 列%* N 酶 活 性 中 心和 7D>>>N S $)< D5DD D< D5E 5 D < FF < B J $!6 #, )*,B 1 NI /V BJ I#N$ S< B /!E *9 VI I<MM BJ I B /J BL S< B 1NI /J/B # ND$ BJ I /M /J/B# N$ J/<R <BJ B J17/ B %8 L / /B M B I Q J1-/B T J L /B /$8 *5 R/> J BJ BL # / %8 BJ / -8 BJ $ / BQ R BJ BL /NDXXXDXD1%D < < /B T J S< B 1,BQ T B /* N BJ 7D>>>N1! #!!$$$% )*, -%.
/期 / 王丹等!栉孔扇贝!E *9 基因的克隆和表达分析 图 不同物种的 $ ]P, 同源蛋白序列比对 阴影区显示同源性的氨基酸其中黑色区代表氨基酸同源性为 E深灰色区代表氨基酸的同源性 为 7 E 以 上浅 灰 色 区 代 表 氨 基酸的同源性为 7E 黑框示 $8 *59 氨基酸序列中的 / 个催化活性区域!%端短链脱氢酶结构域# *-5 >$ 中心水解酶结 构域# 5,>$ 与 -端固醇载体蛋白结构域# *-71 >$ B.8. %7!人# %7D97 $ % O% 1->% 1!原鸡# %7D8819 $ % M.71- % /!非洲爪蟾# %7D66/ $ % <% 8. 1 % 5 %.!亚 东鲑# -%661$ % $* %8, -5 %!栉孔扇贝#! X61 $ S *E 5 D < 5 BE F$ ]P, 5EB D F F > C *I J J L /B BJ J< I BL I// /LR P L /B E I// /L/< S< B L L /B 7 E LIL L /B 7E1NI T L /B R/> J1*-5! I/ I B /I/J IJ /L B % 5,! IJ 8 J IJ /L B M % *-71! / M / B 11! #!!$$$% )*, -%.
/1 水产学报 / 卷 图 基于 $ ]P, 氨基酸序列绘制的进化树 S -JI B > F$ ]P, 85 D JJE B<F J5E 5 D B.8. %7!人类 # %7D 97 1 $ % <1-).5 %! 野 猪 # %7D 8889 1 $ % 1-81) 1 1! 小 鼠 # -617 1 $ % *. *, ) *1!鸭 嘴 兽 # X7D7177 11 $ % M.71- % /! 非 洲 爪 蟾 # %7D66/ 1 $ % O% 1->% 1! 原 鸡 # %7D8819 1 $ %!. %% 1! 蜥 蜴 # X7D /11/71 $ % $. % 1-%%8% 1! 东 部 菱 背 响 尾 蛇 #! 781 1 $ % D11 1-*.) 1!底 ) %. # 9998 1 $ % <% 8. 1 %5 %.!亚东鲑# -%661 1 $ % 9%..!斑马鱼# 67897 1 $ % <.>,.). 1-71 71 % 1!紫海 胆# X7D66611 / $ % $* %8, -5 %!栉孔扇贝#! X61 $ % $ %. % > >%-太平洋牡蛎#,O-91/99 1 $ % 7 >% *.-% %.!印 $ % $1 1 1 5 %) % 1!库蚊# X7D6 1 $ 度跳蚁#,%81 1 图,$!6 #, E.)* 在生长期栉孔扇贝组织中的半定量表达 151 分子量标准% 1水% 11肾脏% /1外套膜% 9 1肝胰腺% 7 1鳃% 6 1闭 壳 肌% 1生 长 期 精 巢% 1生 长 期 精 巢% 8 1生 长 期 卵 巢% 1生长期卵巢 S,RUC> F$!6 #, E.)* D D8I.7 -#. < F,B 1 5B> O B 5B 151 P % 1V % 1 1P JB % / 1 B % 9 1I M /M B % 7 1L % 6 1 JJ< /< % 1 L /V BL L % 8 1 /T L /V BL L 1 图 /栉孔扇贝不同发育时期的性腺组织学观察 1卵巢# 增殖期$ % 11卵巢# 生长期$ % /1卵巢# 成熟期$ % 91卵巢# 休止期$ % 71精巢# 增殖期$ % 61精巢# 生长期$ % 1精巢# 成熟期$ % 1 精巢# 休止期$ L1卵原细胞% 1卵母细胞% 1成熟卵% *L1精原细胞% * 1精母细胞% * 1精细胞% *Q 1精子 标尺 7! S /] B 58 > 5 B5DF,B 1 D F F > D CE 5CJ5 1/T # 7 / T L $ % 1 1/T # D /V BL L $ % / 1/T # < L $ % 9 1/T # $ BL L $ % 7 1 # 7 / T L $% 6 1 # D /V BL L$ % 1 # < L$ % 1 # $ BL L$ 1L1//L/B <% 1// % 1 < // % *L1 M /L/B <% * 1 M / % * 1 M J% *Q 1 M 19 7!1! #!!$$$% )*, -%.
期王 丹 等 栉孔扇贝!-! 基因的克隆和表达分析 图 8$ 在栉孔扇贝不同发育周期性腺中的定量表达 不同的字母表示基因表达差异显著 * 1% 5)*87 )!.$ -,/ /,1 % )!/ * *!#,, )!*, /) 1 # //*//) *!/) *!* //* * 1% 讨论 栉孔扇贝 序列结构及同源性分析! #) 是一类参与类固醇激素合成和代谢活动的酶 目前 已经从脊椎动物中发现了!% 种! #) 除了! #% 属于醛酮还原酶! / /!)/ 超家族外 其它成员均属于短链脱氢酶 $ 还原酶 )1 1! * /1 /*!)/)$/!)/) # 超家族 尽管它们都有保守的超二级结构 ))!* 折叠 辅酶结合位点和催化位点 但是各种! #) 之间的序列同源性较低 %- - 尤其是 末端的序列多样性可使! #) 分别催化不同的底物!! # 为该家族中一类 # 依赖的氧化酶类 它是! #) 中最长的基因 参与脂肪酸的 氧化和雌二醇的灭活 //* /)! 等首次从猪的肾脏 # 文库中分离出!-! 的 # 全长 之后陆续从人 * % 小鼠 蜥蜴 斑胸草雀 % 亚东鲑 # 紫海胆 %% 和库蚊 ))# 等多种物种中克隆获得该基因的 # 并且对其表达和相关的功能进行研究! 本实验从栉孔扇贝卵巢中获得一个全长为! 的 # 序列 该序列不仅含有! #) 共有的保守区,,, 辅酶结合位点, 结构性保守序列 / ) 酶活性中心和 %, 还具有! # 特有的催化活性区域 端短链脱氢酶结构域 中心水解酶结构域和 端固醇载体蛋白结构域 系统进化分析表明 该序列与太平洋牡蛎的! # 处于同一枝 鉴于上述特点 实验认为本研究所获得的目的序列为栉孔扇贝!-! 全长 # 序列 栉孔扇贝 $ 的时空表达分析!-! 广泛分布于动物各组织中 人类在肝脏中表达量最高 其次是心脏 前列腺和精巢 在肺 骨骼肌 肾脏 胰腺和卵巢中适量表达 猪和小鼠等脊椎动物在肝脏和肾脏中表达量最高 并认为这与此类器官中该酶催化长链脂肪酸的 氧化! 本实验首次报道了贝类中!-! 基因的基因克隆和发育表达图式 栉孔扇贝中该基因也是在肝胰腺和肾脏中表达量最高 所以推测该酶在栉孔扇贝的肝胰腺和肾脏中可能也参与脂肪酸的代谢过程 并且精巢 卵巢 鳃 外套膜和肌肉等多种组织检测到其存在 说明栉孔扇贝多种组织均可以合成! # 大鼠肝脏研究表明 过氧化物酶体增殖因子可以增强!-! 的 表达 且其对雄鼠的诱导作用明显高于雌鼠 栉孔扇贝 5 % 显示该基因在精巢中整体表达高于卵巢 我们推测类似的诱导作用可能同样存在于栉孔扇贝精巢中 进一步研究发现 该基因敲除的小鼠出生! 细精管开始大量积累脂滴 出生 个月后雄鼠睾丸完全萎缩 % 个月后生精上皮萎缩 生精作用完全停止 丧失生育能力 % 本实验发现在精巢的成熟过程中该基因表达量迅速升高 我们推测! # 在精巢的成熟过程中也具有一定的作用 但具体作用机理及重要程度 我们还不能确定 目前贝类中关于! #) 的研究还很有限 并且激素的合成 灭活和运输以及生殖过程的进行是多基因共同调控的结果 所以! # 在这些过程中的具体作用机制还需要更多的实验证据支持 参考文献! )1 / /1/*) 6/!*! ) ) 1/ )*!!! //!/ 1!* /) * 1/ / /)) * )/ )//* /* /)!* )/ )/ / / ) * 1/!/!1! )
水 产 学 报 卷 * *!!%!! %% #% $ //* /)# / / / / 1/ /*/ 1/ 1!*!/!1 )/ /1 /*!)/ /!!!*,/* /!!! $ #!! 赵刚!% 型! 羟化类固醇脱氢酶和! 型 % 还原酶在乳腺癌和癌旁组织中的表达 # 长春 吉林大学! 1/!**!/), %!/) %/ )! * *! / * 1//* / 1/! /*)!* 1/* )/ / 1! 1 )!! /!*/) $!$! # % 1/ 1! 1,/* # %/ )! * *! / * )/))/*! 1 / )!) ) * / /)!*!// * / * * $! % # $ $ *!**!/1! # * *! / * / /*!))!/ 8 1 /) )!* *!* /)!) )! * #/6/ /*! %! #%!)!1,! */,! /* %!! #! 6// /)) *!* * / /* /*!/! /*/ * )!/!* / /!!* /! * *!! # #$!*/, % / / )/ )!* /*! / 1!* ) ) * * /* /* */ ) * * *6//!/)!$!!% #!$,! 1 / / %// *! )!!/!!* /) )/ */ * /*! *) *!/!* /!/ )! 6!6! * 1/ / 6/ /,/*/!!*!! 6/ * * $!%! #!!!* % ) /* * * ) /) * 1/)/! )! 1!! /! *!* )) / *6 6/ /* * / 6/ /! *!! 6/ 1/ )!* %1 )%! 1/ )!* /!! #!!! 1,! 7 /*! *!* * *! 1!! /! *!! 6/!/! 1 )/ /1 /*!)/! *!! */ *!% /!!* /! 1/ )!! %! #! #!! 1! 1! * * 1!! /! *!* / /)) *!*! ) )!! 6/! /!1 )/ /1 /*!)/!! *!! */ *!% 1/ *! / 1/ )!* /!!!! # % #$! 1!*,!* # 1/ )/ /* / /6/!))/))!!! *!* / )1/! *! /!! #%! 杨凤影 张弼 不同地理种群栉孔扇贝营养成分的比较分析 安徽农业科学 # %!%! ))/# 分子克隆实验指南 北京 科学出版社 %! #%!!$ 廖承义 徐应馥 王远隆 栉孔扇贝的生殖周期 水产学报!!! #!!! %!6!*! 1 /!** /!* * * 1!*!/!1 )/ /1 /*!)/) /!!* /! * * $! # $! #!! //* /)! ) )/* /! * *!*! *! )/5 /* / 1/ */! /!/)! /1 /*!)/ /!* *! 1/ )!!! #!!) 1! 1/! 1 )/ /1 /*!)/,/* /) /!* )/!) *! /*// /)) * * 1/ 6/ 8* #!! 6/ 1/ )!* %1 )%! 1/ )!* /!!%!% #!$ * ) /* %/ ) / /! )!/ 1/ / /)) * /) /* /! * /* /) 1 /! #!%! #!$
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