中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 代替 和 进出口食品中大肠菌群 粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法!! 发布!! 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前 言 本标准按照 GB/T1.1 2009 给出的规则起草 本标准代替 SN0169 1992 出口食品中大肠菌群 粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 SN0333 1994 出口食品中大肠杆菌 ( 葡萄糖苷酶荧光 ) 检验方法 和 SN/T1059.2 2002 进出口食品中大肠菌群 大肠杆菌计数滤膜 /MUG 法 本标准与 SN0169 1992 SN0333 1994 和 SN/T1059.2 2002 相比, 主要技术变化如下 : 将原标准名称 出口食品中大肠菌群 粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 出口食品中大肠杆菌 ( 葡萄糖苷酶荧光 ) 检验方法 和 进出口食品中大肠菌群 大肠杆菌计数滤膜 /MUG 法 整合修订为 进出口食品中大肠菌群 粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法 ; SN0169 1992 标准的范围不变, 但 SN0333 1994 和 SN/T1059.2 2002 标准的范围有限, 因此, 本标准将范围进行整合修订 ; 增加了规范性引用文件 ; 增加了术语和定义 ; 在设备和材料中删掉了乳钵和研棒, 稀释瓶中增加了 其他适宜的容器 ; 对液体样品 MPN 法的检测修订为 : 液体样品接种量 1mL 以上者, 用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 ; 接种量 1mL 及 1mL 以下者, 则用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 ; 平板计数法中删去了计算公式 ; MPN 值表增加了 95% 置信区间 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位 : 中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局 中华人民共和国天津出入境检验检疫局 本标准主要起草人 : 付宝莲 刘中学 侯丽萍 高飞 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : SN0169 1992; SN0333 1994; SN/T1059.2 2002 Ⅰ
进出口食品中大肠菌群 粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法 1 范围 本标准规定了进出口食品中大肠菌群 粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法 本标准中 MPN 法适用于进出口食品中大肠菌群 粪大肠菌群和大肠杆菌的检验 ; 平板计数法适用于进出口食品中大肠菌群的检验 ; β 葡萄糖苷酶荧光法适用于进出口食品 ( 不包括贝类 ) 中大肠杆菌的检验 ; 滤膜 /MUG 法适用于进出口方便面 膨化食品 矿泉水 饮料 牛奶 ( 需用蛋白酶处理 ) 单晶糖和椒粒中大肠菌群和大肠杆菌的检验 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本文件 SN/T1538.1 培养基制备指南 第 1 部分 : 实验室培养基制备质量保证通则 SN/T1538.2 培养基制备指南 第 2 部分 : 培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 大肠菌群犮狅犾犻犳狅狉犿需氧及兼性厌氧, 能在 37 48h 分解乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌 3.2 粪大肠菌群犳犲犮犪犾犮狅犾犻犳狅狉犿需氧及兼性厌氧, 能在 44.5 ±0.5,24h 发酵乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌, 该菌又可称耐热大肠菌群 (thermotolerantcoliformorganisms) 3.3 大肠杆菌犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻需氧及兼性厌氧, 能在 44.5 ±0.5 48h 分解乳糖产酸产气, 生化特征 IMViC 为 或 的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌 该菌又可称大肠埃希氏菌 4 检验方法 4.1 原理 4.1.1 最可能近似值 ( 犿狅狊狋狆狉狅犫犪犫犾犲狀狌犿犫犲狉, 犕犘犖 ) 法 MPN 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法 待测样品经系列稀释并培养后, 根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度, 应用统计学概率论推算出大肠菌群 粪大肠菌群或大肠杆菌在 1
待测样品中的最大可能数 4.1.2 平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸, 在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色, 带有或不带有沉淀环的菌落 4.1.3 β 葡萄糖苷酶荧光法大肠杆菌中的 β 葡萄糖苷酶可降解培养基中 4 甲基伞形酮 β D 葡萄糖苷酸 (MUG), 并释放 4 甲基伞形酮荧光物质 (4 MU), 该物质在紫外灯 ( 波长 366nm) 下会显现蓝色荧光特点 4.1.4 滤膜 / 犕犝犌法待测样品通过滤膜过滤时, 样品中的大肠菌群和大肠杆菌被截留于滤膜表面 将滤膜贴附于 LMG 或 BMA 琼脂上培养后, 大肠菌群在 LMG 琼脂上会形成蓝色菌落 ; 而 BMA 琼脂上的大肠杆菌由于葡萄糖苷降解 4 甲基伞形酮 β D 葡萄糖苷酸 (MUG) 并释放 4 甲基伞形酮, 形成紫外光 (366nm) 下为蓝白色荧光的菌落 4.2 培养基与试剂 4.2.1 生理盐水 : 见附录 A.1 4.2.2 Buterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液 : 见附录 A.2 4.2.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 (LST): 见附录 A.3 4.2.4 煌绿乳糖胆盐肉汤 (BGLB): 见附录 A.4 4.2.5 大肠杆菌肉汤 (EC): 见附录第 A.5 4.2.6 伊红美蓝琼脂 (EMB): 见附录 A.6 4.2.7 结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA): 见附录 A.7 4.2.8 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 MUG 肉汤 (LST MUG): 见附录 A.8 4.2.9 Columbia MUG: 见附录 A.9 4.2.10 蛋白胨 吐温 80 稀释液 (PT): 见附录 A.10 4.2.11 乳糖莫能菌素葡萄糖酸琼脂 (LMG): 见附录 A.11 4.2.12 缓冲 MUG 琼脂 (BMA): 见附录 A.12 4.2.13 三 ( 羟甲基 ) 胺甲烷 (Tris) 缓冲剂 : 见附录 A.13 4.2.14 营养琼脂斜面 : 见附录 A.14 4.2.15 色氨酸肉汤 : 见附录 A.15 4.2.16 MR VP 培养基 : 见附录 A.16 4.2.17 Korser 氏枸椽酸盐肉汤 : 见附录 A.17 4.2.18 Kovacs 氏靛基质试剂 : 见附录 A.18 4.2.19 甲基红指示剂 : 见附录 A.19 4.2.20 VP 试剂 (VP): 见附录 A.20 4.2.21 革兰氏染色液 : 见附录 A.21 4.2.22 胰蛋白酶贮存液 : 见附录 A.22 4.3 设备与材料 4.3.1 培养箱 :36 ±1,44.5 ±0.5 4.3.2 水浴箱 :36 ±1,44.5 ±0.5 2
4.3.3 冰箱 :0 ~5 和 15 ~20 4.3.4 均质器 : 涡旋式或拍击式 4.3.5 吸管 :1mL, 具 0.1mL 刻度 ;5mL 和 10mL, 具 1mL 刻度 4.3.6 平皿 : 直径 90mm 4.3.7 试管 :16mm 160mm 4.3.8 稀释瓶 : 三角烧瓶 广口瓶或其他适宜的容器 4.3.9 玻璃小倒管 : 长度约 20mm 4.3.10 天平 : 感量 0.1g 4.3.11 显微镜 4.3.12 菌落计数器 4.3.13 滤器 : 备预滤器 4.3.14 滤膜 : 有机或水相, 孔径 0.45μm 4.3.15 真空泵 4.3.16 紫外灯 : 波长 366nm 4.4 样品制备 4.4.1 固体或半固体样品 无菌操作称取样品 25g 置于装有 225mL 灭菌稀释剂 (4.2.1/4.2.2) 的适宜容器中, 充分振摇 混 匀 或将剪碎后的试样 25g 置于灭菌的均质杯 / 袋内, 加入 225mL 灭菌稀释剂, 以 8000r/min~ 10000r/min 涡旋式均质 1min, 或以 6 次 /s~9 次 /s 拍击式均质 1min, 制成 1 10 的样品稀释液备用 4.4.2 液体样品 以无菌吸管吸取样品 25mL 置于装有 225mL 灭菌稀释剂的适宜容器中, 以 30cm 幅度于 7s 内振 摇 25 次或机械振荡器中振摇 制成 1 10 的样品稀释液备用 4.4.3 样品稀释 样品稀释液的 ph 值应在 6.5~7.5 之间,pH 值过低或过高时可分别用 1mol/L 氢氧化钠或 1mol/L 盐酸予以调节 根据对样品污染情况的估计, 将 4.4.1 或 4.4.2 制成的 1 10 样品稀释液用 9mL 灭菌稀释剂进行系列十倍递增稀释, 如 10 2,10 3,10 4, 直至最高稀释度的检测结果达到阴 性终点 每一稀释度换用 1 支 1mL 无菌吸管或移液器吸头, 上一稀释度用的吸管或吸头不要触及下 一稀释度的稀释液 从制备样品稀释液至稀释完毕, 全过程不得超过 15min 4.4.4 样品的酶处理 4.4.4.1 一般要求 样品的酶处理可在室温下 (23 ~27 ) 进行 4.4.4.2 固体或半固体样品无菌操作称取样品 25g 置于装有 225mL 灭菌 PT 稀释液 (4.2.10) 的适宜容器中, 充分振摇 混匀 或将剪碎后的试样 25g 置于灭菌的均质杯 / 袋内, 加入 225mL 灭菌稀释剂, 以 8000r/min~ 10000r/min 涡旋式均质 1min, 或以 6 次 /s~9 次 /s 拍击式均质 1min, 制成 1 10 的样品稀释液备用 3
4.4.4.3 液体样品以无菌吸管吸取样品 25mL 置于装有 225mL 灭菌 PT 稀释液的适宜容器中, 以 30cm 幅度于 7s 内振摇 25 次或机械振荡器中振摇 制成 1 10 的样品稀释液备用 4.4.4.4 样品稀释取 1 10 的酶 PT 稀释液 ( 胰蛋白酶贮存液 :PT 稀释液 )10mL 于 4.4.4.1 或 4.4.4.2 制成的 1 10 样品稀释液中并混匀, 置于 36 ±1 水浴中处理 20min~30min 后, 将制成的 1 10 样品酶处理稀释液用 9mL 灭菌 PT 稀释液进行系列十倍递增稀释, 如 10 2,10 3,10 4, 直至最高稀释度的检测结果达到阴性终点 每一稀释度换用 1 支 1mL 无菌吸管或移液器吸头, 上一稀释度用的吸管或吸头不要触及下一稀释度的稀释液 从制备样品稀释液至稀释完毕, 全过程不得超过 45min 4.4.4.5 样品过滤将灭菌过滤装置连接于真空抽滤瓶上, 以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上并固定 无菌操作加入 10mL~20mL 无菌于滤器中, 打开真空泵, 抽吸过滤, 再从 4.4.4.4 中选取适宜的三个连续稀释度的样品稀释液, 每个稀释度分别过滤, 每次 10mL 最后再加入 10mL~15mL 无菌, 抽吸过滤后, 关闭真空泵, 用无菌镊子将滤膜取出于 4.5.3 中备用 4.5 大肠菌群的测定 4.5.1 犕犘犖法 4.5.1.1 从 4.4.3 中选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液, 每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST) 肉汤, 每管接种 1mL 液体样品接种量 1mL 以上者, 用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 ; 接种量 1mL 及 1mL 以下者, 则用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 36 ±1 培养 24h~48h 后, 观察倒管内是否有气泡产生, 并记录 24h 和 48h 内产气的 LST 肉汤管数 对未产气管有疑问时, 可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出, 如所有 LST 肉汤管均未产气, 可按 4.8.1 报告结果 ; 如 LST 肉汤管有产气, 则按 4.5.1.2 作证实试验 4.5.1.2 证实试验 用直径 3mm 的接种环从 4.5.1.1 中所有 24h 和 48h 内发酵产气的 LST 肉汤管中分别挑取培养液 1 环, 分别移种于煌绿乳糖胆盐 (BGLB) 肉汤管中, 于 36 ±1 培养 48h±2h, 记录所有 BGLB 肉汤管的产气管数, 根据 BGLB 肉汤的产气管数查 MPN 表 ( 见附录 B.1) 并按 4.8.1 报告结果 4.5.2 平板计数法 4.5.2.1 从 4.4.3 中选取适宜的三个连续稀释度的样品稀释液, 每个稀释度接种两个灭菌平皿, 每皿 1mL 另取 1mL 稀释剂加入一灭菌平皿中, 作空白对照 将冷至 46 的结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA) 约 15mL 倾注于每个平皿中, 小心旋转平皿, 使培养基与样液充分混匀 待琼脂凝固后, 再加 3mL~4mL 的 VRBA 均匀覆盖于平板表层, 凝固后翻转平皿,36 ±1 培养 18h~24h 4.5.2.2 选取菌落数在 25 个 ~250 个之间的平板, 计数平板上出现的典型大肠菌群菌落 典型大肠菌群菌落为紫红色, 菌落周围有红色的胆盐沉淀环, 菌落直径约 0.5 mm 或更大 典型和可疑菌落按 4.5.2.3 作证实试验 4.5.2.3 证实试验 用接种环从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型或可疑菌落, 移种于 BGLB 肉汤管内,36 ±1 培养 24h~48h 后观察产气情况 对 BGLB 肉汤产气者按 4.5.2.4 计算 ; 对形成 4
菌膜的阳性管则应进行革兰氏染色, 以便排除革兰氏阳性杆菌 4.5.2.4 将 4.5.2.3 中证实为大肠菌群阳性的菌落数相加, 再乘以稀释倍数, 按 4.8.2 报告结果 4.5.3 滤膜 / 犕犝犌法以无菌操作将 4.4.4.5 样品过滤后的滤膜贴放于预先干燥的 LMG 琼脂平板表面上, 滤膜与琼脂表面之间应无气泡 于 36 ±1 培养 24h±2h 后, 选取菌落数在 25 个 ~250 个之间的平板, 计数所有蓝色 ( 包括深蓝或浅蓝色 ) 菌落 将滤膜上的菌落数相加, 再乘以其稀释倍数, 按 4.8.4 报告结果 4.6 粪大肠菌群犕犘犖法的测定用直径为 3mm 的接种环从 4.5.1.1 中所有 48h±2h 内发酵产气的 LST 肉汤管中分别挑取培养液 1 环, 转种于 EC 肉汤管中并放置于带盖的 44.5 ±0.5 恒温水浴箱内, 培养 24h±2h 水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面 记录 EC 肉汤管的产气情况, 产气管为粪大肠菌群阳性 ; 不产气为粪大肠菌群阴性 根据粪大肠菌群的阳性管数查 MPN 表 ( 见附录 B.1) 并按 4.8.1 报告结果 4.7 大肠杆菌的测定 4.7.1 犕犘犖法 4.7.1.1 培养将 4.6 中 EC 肉汤管在 44.5 ±0.5 恒温水浴箱内继续培养 24h±2h 后, 从产气管中挑取培养液划线接种于伊红美蓝 (EMB) 平板,36 ±1 培养 24h±2h 4.7.1.2 检查检查平板上有无黑色中心 有光泽或无光泽的可疑菌落 用接种针蘸取菌落中心部位并转种于营养琼脂斜面上,36 ±1 培养 18h~24h 4.7.1.3 试验 4.7.1.3.1 将营养琼脂斜面培养物转种于下列生化培养基中进行试验 4.7.1.3.2 色氨酸肉汤 :36 ±1 培养 24h±2h 后, 加 Kovacs 氏试剂 0.2mL~0.3mL, 上层出现红色者为靛基质试验阳性 4.7.1.3.3 MR VP 培养基 :36 ±1 培养 48h±2h 后, 无菌操作移取培养物 1mL 至 13mm 100mm 试管中, 加 5%α 萘酚乙醇溶液 0.6mL,40% 氢氧化钾溶液 0.2mL 和少许肌酸结晶, 振摇试管后静置 2h, 如出现伊红色, 为 VP 试验阳性 将 MR VP 培养物的剩余部分继续培养 48h 后滴加 5 滴甲基红溶液, 如培养物变红则表示甲基红试验阳性 ; 若变黄则甲基红试验阴性 4.7.1.3.4 Kovser 氏柠檬酸盐肉汤 :36 ±1 培养 96h 后, 观察其生长情况 4.7.1.3.5 LST 肉汤 :36 ±1 培养 48h±2h 后, 观察其产气情况 4.7.1.3.6 革兰氏染色 : 取营养琼脂斜面培养物进行革兰氏染色 大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌 4.7.1.3.7 大肠杆菌和非大肠杆菌生化鉴别如下表 1, 如出现表中以外的生化反应类型, 表明培养物可能不纯, 应重新划线分离, 必要时做重复试验 5
表 1 大肠杆菌和非大肠杆菌生化鉴别表 靛基质 MR VP 柠檬酸盐鉴定 ( 型别 ) 典型大肠杆菌 非典型大肠杆菌 典型中间型 非典型中间型 典型产气肠杆菌 非典型产气肠杆菌 4.7.1.3.8 大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌, 发酵乳糖产酸产气,IMViC 试验为 或 根据 LST 肉汤阳性管数查 MPN 表 ( 见附录 B.1) 并按 4.8.1 报告结果 4.7.2 β 葡萄糖苷酶荧光法 4.7.2.1 从 4.4.3 中选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液, 每个稀释度均接种三管 LST MUG 肉汤, 每管 1mL 于 30min 内置于 36 ±1 水浴或培养箱内培养 24h±2h 将培养后的 LST MUG 肉汤管拿至暗室, 在长波紫外光灯 ( 波长 366nm) 下观察 产气显蓝色荧光的为大肠杆菌阳性 ; 产气不显蓝色荧光的按 4.7.2.2 作证实试验 4.7.2.2 证实试验 : 从 4.7.2.1 中产气不显蓝色荧光的 LST MUG 肉汤管中挑取培养物, 划线接种于 Columbia MUG 琼脂平板, 于 36 ±1 培养 24h±2h 将培养后的 Columbia MUG 平板拿至暗室, 在长波紫外光灯 ( 波长 366nm) 下观察, 凡显蓝色荧光的菌落均为大肠杆菌阳性菌落 4.7.2.3 根据 4.7.2.1 中 LST MUG 肉汤阳性管数, 和 4.7.2.2 中 Columbia MUG 琼脂平板证实为大肠杆菌阳性的 LST MUG 肉汤阳性管数查 MPN 表 ( 见附录 B.1) 并按 4.8.3 报告结果 4.7.3 滤膜 / 犕犝犌法以无菌操作将 4.4.4.5 样品过滤后的滤膜贴放于预先干燥的 BMA 琼脂平板表面上, 滤膜与琼脂表面之间应无气泡 放入 36 ±1 培养箱中培养 2h, 在暗室或紫外操作室内用波长 366nm UV 灯观察滤膜上的菌落是否有蓝白色荧光 选用菌落数范围在 25 个 ~250 个之间的平板, 计算蓝白色荧光的菌落数并相加, 再乘以其稀释倍数后, 按 4.8.4 报告结果 4.8 报告结果 4.8.1 犕犘犖法每克 ( 毫升 ) 样品中大肠菌群 粪大肠菌群或大肠杆菌的 MPN 值 (MPN/g 或 MPN/mL) 4.8.2 平板计数法每克 ( 毫升 ) 样品中大肠菌群数 (CFU/g 或 CFU/mL) 4.8.3 葡萄糖苷酶荧光法每克 ( 毫升 ) 样品中大肠杆菌的 MPN 值 (MPN/g 或 MPN/mL) 4.8.4 滤膜 / 犕犝犌法每克 ( 毫升 ) 样品中大肠菌群或大肠杆菌数 (CFU/g 或 CFU/mL) 6
附录犃 ( 规范性附录 ) 培养基与试剂 犃.1 一般要求 为保证培养基的质量, 应按 SN/T1538.1 和 SN/T1538.2 进行培养基的制备与性能测试 若使 用商售的脱水合成培养基, 应选用通过 ISO9000 质量体系认证的国内外生产厂商的产品并按其说明进 行制备和使用 犃.2 生理盐水 氯化钠 8.5g 将氯化钠溶于中,121 高压灭菌 15min 犃.3 犅狌狋犲狉犳犻犲犾犱氏磷酸盐缓冲稀释液 犃.3.1 贮存液 磷酸二氢钾 (KH 2PO 4 ) 34.0g 500.0mL 将磷酸二氢钾溶于中, 用 1mol/L 氢氧化钠约 175mL 调至 ph7.2 用加至 1000mL 贮存于冰箱 犃.3.2 稀释液 取贮存液 1.25mL, 用稀释至 1000mL, 分装于合适的容器后,121 高压灭菌 15min 犃.4 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 ( 犔犛犜 ) 胰蛋白胨或胰酪胨 (Trypticase) 20g 氯化钠 5.0g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾 (K 2HPO 4 ) 2.75g 磷酸二氢钾 (KH 2PO 4 ) 2.75g 月桂基硫酸钠 0.1g 将各成分溶解于中 分装到有倒立发酵管的 20mm 150mm 试管中, 每管 10mL 121 高压灭菌 15min 最终 ph6.8±0.2 双料培养基除不变外, 其余成分加倍 7
犃.5 煌绿乳糖胆盐肉汤 ( 犅犌犔犅 ) 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 牛胆粉 (oxgal 或 oxbile) 溶液 200.0mL 0.1% 煌绿水溶液 13.3mL 将蛋白胨乳糖溶于约 500mL 中, 加入牛胆粉溶液 200mL( 将 20.0g 脱水牛胆粉溶于 200mL 中 ), 用稀释到 975mL, 调 ph7.4 再加入 0.1% 煌绿水溶液 13.3mL, 用补足到 1000mL, 用棉花过滤后, 分装到 20mm 150mm 试管 ( 管内有倒立的小发酵管 ) 中, 每管 10mL 121 高压灭菌 15min 最终 ph7.2±0.1 犃.6 犈犆肉汤 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g 3 号胆盐或混合胆盐 1.5g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾 (K 2HPO 4 ) 4.0g 磷酸二氢钾 (KH 2PO 4 ) 1.5g 氯化钠 5.0g 将以上成分溶解于中, 分装 16mm 150mm 试管 ( 管内有倒立的小发酵管 ), 每管 8mL 121 高压灭菌 15min, 最终 ph6.9±0.1 犃.7 伊红美蓝琼脂 ( 犈犕犅 ) 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氢二钾 (K 2HPO 4 ) 2.0g 琼脂 15.0g 伊红 ( 水溶性 ) 0.4g 或 2% 水溶液 20mL 美蓝 0.065g 或 0.5% 水溶液 13mL 在 1000mL 中煮沸溶解蛋白胨 磷酸盐和琼脂, 加水补足至原量 分装于三角烧瓶中 每 瓶 100mL 或 200mL,121 高压灭菌 15min 最终 ph7.1±0.2 使用前将琼脂融化, 于每 100mL 琼脂中加 5mL 灭菌的 20% 乳糖水溶液 2mL2% 伊红水溶液和 1.3mL0.5% 美蓝水溶液, 摇匀, 冷至 45 ~50 倾注平皿 犃.8 结晶紫中性红胆盐琼脂 ( 犞犚犅犃 ) 8 蛋白胨 7.0g 酵母膏 3.0g
乳糖 10.0g 氯化钠 5.0g 胆盐或 3 号胆盐 1.5g 中性红 0.03g 结晶紫 0.002g 琼脂 15.0g~18.0g 无需高压灭菌 将上述成分溶于中, 静置几分钟, 充分搅拌, 调至 ph 7.4±0.1 煮沸 2min, 将培养基冷至 45 ~50 倾注平板 临用时制备, 不得超过 3h 犃.9 犔犛犜 犕犝犌肉汤 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g 氯化钠 5.0g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾 (K 2HPO 4 ) 2.75g 磷酸二氢钾 (KH 2PO 4 ) 2.75g 月桂基硫酸钠 0.1g MUG 0.1g 将各成分溶于中, 分装试管 ( 内装倒立小发酵管 ), 每管 10mL 121 高压灭菌 15min 最 终 ph6.8±0.2 犃.10 犆狅犾狌犿犫犻犪 犕犝犌琼脂培养基 胰酪胨 13.0g 水解蛋白 6.0g 酵母浸膏 3.0g 牛肉浸膏 3.0g 可溶性淀粉 1.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 13.0g 将各成分溶于水中, 无需调 ph 值 121 高压灭菌 15min 冷却至 55 ~60, 倾注平板 犃.11 蛋白胨 吐温 80 稀释液 ( 犘犜 ) 蛋白胨 1.0g 吐温 80 10.0g 将上述成分加热溶解分装 90mL 于三角瓶中,121 高压灭菌 15min 9
犃.12 乳糖莫能霉素葡萄糖醛酸琼脂 ( 犔犕犌 ) 胰蛋白胨 10.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 乳糖 12.5g 莫能霉素 0.038g( 于 95% 酒精 10mL 溶解 ) 苯胺蓝 0.1g 葡萄糖醛酸钠盐 0.5g 硫酸十七烷基钠盐 0.25mL 琼脂 15.0g 无需高压灭菌 加热煮沸, 温度冷至 45 ~50 无菌操作, 调整 ph 最终为 7.2±0.1 倾注平板, 打开皿盖在 35 ±1 温箱,15min~20min 烘干备用 犃.13 缓冲犕犝犌琼脂 ( 犅犕犃 ) 磷酸氢二钠 (Na 2HPO 4 ) 8.23g 磷酸二氢钠 (NaH 2PO 4 ) 1.20g 4 甲基伞形酮 β D 葡萄糖苷酸 (MUG) 0.1g 琼脂 15.0g 溶解加热煮沸, 调整 ph7.2~7.6,121 高压灭菌 15min 温度冷至 45 ~50, 倾注平板 犃.14 犜狉犻狊缓冲剂 (1.0 犿狅犾 / 犔 ) 溶解 121.1g 三 ( 羧甲基 ) 胺甲烷于 500mL 水中, 用浓盐酸调节溶液至所需 ph 值 用水稀释至 1L 于 4 ~6 保存 犃.15 营养琼脂斜面 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 5.0g 琼脂 15.0g 将各成分于中煮沸溶解 分装合适的试管 121 高压灭菌 15 min 最终 ph7.3±0.1 灭菌后摆成斜面备用 犃.16 色氨酸肉汤 胰胨或胰酪胨 10.0g 10
加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于中 分装试管, 每管 5mL 121 高压灭菌 15min 最终 ph6.9±0.2 犃.17 犕犚 犞犘培养基 胨 7.0g 葡萄糖 5.0g 磷酸氢二钾 (K 2HPO 4 ) 5.0g 将各成分溶于中, 分装试管,121 高压灭菌 15min, 最终 ph6.9±0.2 犃.18 犓狅狊犲狉氏柠檬酸盐肉汤 磷酸氢铵钠 (NaNH 4HPO 4 4H 2O) 1.5g 磷酸氢二钾 (K 2HPO 4 ) 1.0g 硫酸镁 (MgSO 4 7H 2O) 0.2g 柠檬酸钠 ( 含 2H 2O) 3.0g 将各成分溶解于中, 分装试管, 每管 10mL,121 高压灭菌 15min 最终 ph6.7±0.2 犃.19 犓狅狏犪犮狊氏靛基质试剂 对二甲氨基苯甲醛 5.0g 戊醇 75.0mL 盐酸 ( 浓 ) 25.0mL 将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中, 然后慢慢加入浓盐酸即可 犃.20 甲基红指示剂 甲基红 0.1g 95% 乙醇 300mL 将甲基红溶解于 300mL 乙醇中, 加水稀释至 500mL 犃.21 犞狅犵犲狊 犘狉狅狊犽犪狌犲狉 ( 犞 犘 ) 试剂 甲液 α 萘酚 5.0g 无水乙醇 100.0mL 乙液 氢氧化钾 40.0g 用加至 100.0mL 11
犃.22 革兰氏染色液 犃.22.1 结晶紫染色液 结晶紫 1.0g 95% 乙醇 20.0mL 1% 草酸铵水溶液 80.0mL 将结晶紫完全溶解于乙醇中, 然后与草酸铵溶液混合 犃.22.2 革兰氏碘液 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 300.0mL 将碘与碘化钾先行混合, 加入少许充分振摇, 待完全溶解后, 再加至 300mL 犃.22.3 沙黄复染液 沙黄 0.25g 95% 乙醇 10.0mL 90.0mL 将沙黄溶解于乙醇中, 然后用稀释 犃.22.4 染色步骤 染色步骤如下 : a) 将涂片在火焰上固定, 滴加结晶紫染液 1min 后水洗 ; b) 滴加革兰氏碘液作用 1min 后水洗 ; c) 滴加 95% 乙醇脱色约 15s~30s, 直至染色液被洗掉, 但不要过分脱色, 水洗 ; d) 滴加复染液复染 1min 后水洗 待干 镜检 犃.22.5 结果 革兰氏阳性菌呈紫色, 革兰氏阴性菌呈红色 犃.23 胰蛋白酶贮存液 用 Tris 缓冲稀释剂 10g 胰蛋白酶 (DoifcoNo.0153 或等效品 ) 至 100mL,pH7.6. 如需要加热至 35 以助溶, 通过滤纸 (WhatmanNo.1 或等效品 ) 过滤以除去不溶物质, 再用 0.45μm 滤膜过滤除 菌 于 4 ~6 保存 1 周或 18 保存 3 个月 12
附录犅 ( 规范性附录 ) 检样中最大可能数 ( 犕犘犖 ) 表 表犅.1 1 犵 ( 犿犔 ) 检样中最大可能数 ( 犕犘犖 ) 阳性管数 0.10 0.01 0.001 MPN 95% 置信区间 低 高 阳性管数 0.10 0.01 0.001 MPN 95% 置信区间 低 高 0 0 0 <3.0 9.5 0 0 1 3.0 0.15 9.6 0 1 0 3.0 0.15 11 0 1 1 6.1 1.2 18 0 2 0 6.2 1.2 18 0 3 0 9.4 3.6 38 1 0 0 3.6 0.17 18 1 0 1 7.2 1.3 18 1 0 2 11 3.6 38 1 1 0 7.4 1.3 20 1 1 1 11 3.6 38 1 2 0 11 3.6 42 1 2 1 15 4.5 42 1 3 0 16 4.5 42 2 0 0 9.2 1.4 38 2 0 1 14 3.6 42 2 0 2 20 4.5 42 2 1 0 15 3.7 42 2 1 1 20 4.5 42 2 1 2 27 8.7 94 2 2 0 21 4.5 42 2 2 1 28 8.7 94 2 2 2 35 8.7 94 2 3 0 29 8.7 94 2 3 1 36 8.7 94 3 0 0 23 4.6 94 3 0 1 38 8.7 110 3 0 2 64 17 180 3 1 0 43 9 180 3 1 1 75 17 200 3 1 2 120 37 420 3 1 3 160 40 420 3 2 0 93 18 420 3 2 1 150 37 420 3 2 2 210 40 430 3 2 3 290 90 1000 3 3 0 240 42 1000 3 3 1 460 90 2000 3 3 2 1100 180 4100 3 3 3 >1100 420 注 1: 本表采用 3 个稀释度 [0.1g(mL) 0.01g(mL) 和 0.001g(mL)], 每个稀释度接种 3 管 注 2: 表内所列检样量如改用 1g(mL) 0.1g(mL) 和 0.01g(mL) 时, 表内数字应相应降低 10 倍 ; 如改用 0.01g(mL) 0.001g(mL) 和 0.0001g(mL) 时, 表内数字则应相应增加 10 倍, 其余类推 注 3: 采用三管法, 接种量分别为 0.1g(mL) 0.01g(mL) 0.001g(mL) 13