年第 卷第 期 Ｐ Ｖ Ｎ ＧＷ 对果糖诱导非酒精性脂肪肝小鼠的保护作用研究 徐艳娇 贺雯茜 张程亮 李喜平 冯承阳 雷凯 刘东 华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部 武 汉 摘 要 对果糖诱导非酒精性脂肪肝 ＮＡＦＬＤ小鼠的保护作用 方法 小鼠随机分为 模型 目的 研究 ＧＷ 果糖水造模 周后 治疗组灌胃给予 ＧＷ 周后测定各组小鼠血清中葡萄糖 胰岛 组和治疗组 采用 高密度脂蛋白胆固醇 ＨＤＬ 三酰甘油 ＴＧ和胆固醇 ＨＯ水平 观察肝脏病理改变 素 低密度脂蛋白胆固醇 ＬＤＬ 组小鼠空腹血糖及胰岛素含量降低 血清中 ＴＧ ＨＯ和 ＬＤＬ 含量显著降低 ＨＤＬ 结果 与 ＮＡＦＬＤ相比 ＧＷ 能显著降低 ＮＡＦＬＤ小鼠肝脏脂肪变性 明显减轻肝脏损伤程度 结论 采用 果 水平显著升高 病理结果显示 ＧＷ 通过降低脂质沉积和增加胰岛素敏感性来改善 ＮＡＦＬＤ 糖可以成功诱导 ＮＡＦＬＤ模型 ＧＷ 关键词 ＧＷ 非酒精性脂肪肝 果糖 ＦＸＲ受体 脂质代谢 文献标识码 Ａ 中图分类号 Ｒ Ｘ 文章编号 Ｐ Ｅ ＧＷ Ｎ Ｆ Ｌ Ｆ Ｍ ＸＹ ＨＷ Ｚ ＬＸ Ｆ Ｌ Ｋ Ｌ Ｄ Ｄ Ｐ Ｔ Ｈ Ａ ｗ Ｔ Ｍ Ｈ Ｕ Ｓ Ｔ Ｗ ＡＢＳＴＲＡＴ Ｏ Ｔ ＧＷ ＮＡＦＬＤ Ｔ ｗ ＧＷ Ｍ Ｔ ｗ ｗ ＧＷ ｗｗ Ｔ ＴＧ ＨＯ ｗ ＬＤＬ ｗ Ｌ ｗ Ｏ ＨＤＬ ＨＥ Ｒ ｗ ＴＧ ＨＯ ＬＤＬ ｗ ＨＤＬ ｗ ＧＷ Ｐ Ｔ ｗ ｗ ｗ ＧＷ Ｔ ＮＡＦＬＤ ＧＷ ＮＡＦＬＤ Ｔ ｗ ＫＥＹＷＯＲＤＳ ＧＷ Ｎ Ｆ ＦＸＲ Ｌ 非酒精性脂肪肝病 ＮＡＦＬＤ是肝脏最常见的 疾病之一 与肥胖 高脂血症 胰岛素抵抗 糖尿病等 法尼酯衍生物 Ｘ受体 ＦＸＲ是核受体超家族 的重要成员之一 在维持胆汁酸 脂质 糖代谢平衡 相关的发病率在我国呈上升趋势 调查研究表明 在发展中国家 ＮＡＦＬＤ在成人和儿童中的发病率分 中发挥着重要的作用 ＦＸＲ受体的激活可降低 血清中三酰甘油 ＴＧ和胆固醇的含量 增加胆固 根 据 疾 病 发 展 的 不 同 阶 段 别为 和 醇的 逆 转 运 预 防 动 脉 粥 样 硬 化 的 发 生 另 外 ＦＸＲ 可 降 低 肝 脏 中 ＴＧ 的 含 量 可 用 来 预 防 ＮＡＦＬＤ主要分为 单纯性脂肪肝 脂肪性肝炎及脂 肪性肝硬化 ＮＡＦＬＤ是一种进展性疾病 有发展成 肝功能衰竭 甚至肝癌的风险 成为仅次于病毒性肝 炎的第二大肝病 严重地威胁着人类的健康 近来 ＮＡＦＬＤ还被认为是缺血性中风 心肌病和心肌梗死 然 而 目 前 关 于 独立 的 心 血 管 风 险 因 素 ＮＡＦＬＤ的确切发病机制尚不十分清楚 且临床缺乏 特效治疗方法 因此 进一步深入研究 ＮＡＦＬＤ的发 病机制 寻找有效的治疗药物和手段是当前基础和 临床研究亟待解决的问题 ＮＡＦＬＤ ＦＸＲ敲除 ＦＸＲ小鼠给予 高胆固醇 饮食喂养后 可发展成 ＮＡＦＬＤ和高 ＴＧ血症 给 大鼠采用 ＦＸＲ受体激动剂 Ｅ ＤＡ治疗后 肝脏中 ＴＧ的含量显著降低 肝细胞的肿胀显著改 善 因此 ＦＸＲ受体对肝脏 ＴＧ平衡的保护作用 表明 ＦＸＲ受体是一个治疗 ＮＡＦＬＤ的潜在靶点 因此 本研究采用果糖诱导的小鼠 ＮＡＦＬＤ 模 对 型 来探讨 ＦＸＲ受体的特异性激动剂 ＧＷ ＮＡＦＬＤ小鼠肝脏的保护作用 以期为临床有效治疗 ＦＡ 基金项目 湖北省自然科学基金重点项目 编号 Ｅ 通讯作者 刘东 Ｔ
研究论文 ｗｗｗ ＮＡＦＬＤ提供理论基础和依据 材料与方法 实验动物 测血清中胰岛素 葡萄糖水平 ｗ等提出的改良稳态模型评价测 采用 Ｍ Ｒ评价胰岛素敏感 量的胰岛素抵抗指数 ＨＯＭＡ Ｒ ＦＰＧ Ｌ Ｆ ＮＳ Ｕ 性 ＨＯＭＡ 小鼠 雄性 周龄 健康 ＳＰＦ级 ＢＬ 饲养于华中科技大学同济医学 体质量 ± Ｌ 因其呈偏态分布 故取其自然对数值 院附 属 同 济 医 院 动 物 医 学 研 究 中 心 许 可 证 号 ＳＹＸＫ 鄂 动 物 合 格 证 号 Ｒ来表示 Ｆ Ｒ 用空腹胰岛素抵抗指数 Ｆ ＨＯＭＡ Ｒ公式中 Ｆ ＮＳ为空腹血清胰岛素浓度 ＦＰＧ为空腹血清葡萄糖浓度 药物及试剂 果糖 江 苏 正 大 丰 海 制 药 有 限 公 司 批 号 生化指标检测 后 小鼠摘眼球取血 取血 末次给药禁食 纯 度 ＧＷ 批号 纯度 胆固醇 ＨＯ 清 严格按照试剂盒说明书操作 采用酶标仪检测血 和 ＨＤＬ 的含量 清中 ＴＧ ＨＯ ＬＤＬ 测试 盒 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 批 号 ＴＧ测试盒 南京建成生物工程研究所 体积 取小鼠部分肝脏 按重量 的比例 加入 倍体积的磷酸缓冲盐 ＰＢＳ溶液 高密度脂蛋白胆固醇 ＨＤＬ 测 批号 试盒 南京建成生物工程研究所 批号 匀浆介质 冰水浴条件下机械匀浆 测试盒 南京建成生 低密度脂蛋白胆固醇 ＬＤＬ 葡萄糖测定试剂盒 物工程研究所 批号 南京建成生物工程研究所 生产批号 小鼠胰岛素酶联免疫定量检测试剂盒 上海西塘生 取上清液 按试剂盒说明书检测其中 离心 ＨＯ ＴＧ和 ＦＦＡ的含量 组织病理学检查 油 红 Ｏ 染 色 取 肝 脏 ＯＴ包 埋 后 于 进行冰冻切片 多聚甲醛固定 置 游离脂肪酸 ＮＥ 物科技有限公司 批号 ＦＡ测 试 盒 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 批 号 油红 Ｏ染液室温染色 苏木精复染 于 甘油封片 光学显微镜下观察肝脏脂质聚集 ＢＡ蛋白浓度测定试剂盒 碧云天 批 ＨＥ染色 Ｓ 号 Ｐ 仪器与设备 ＳＹＮＧＥＮＥ型多 功 能 酶 标 仪 美 国 Ｂ Ｔ 公 型正置显微镜 日 本 Ｎ 公 司 司 ＳＷＸ Ｂ型水浴锅 上海新苗医疗器械制造有限 电子分析天平 ＯＨＡＵＳ公司 公司 Ａ 动物模型的建立 将小鼠适应性喂养 周后 随机分为正常对照 组 Ｂ组和 组 Ａ 模型对照组 Ｂ和 ＧＷ 肝脏组织置于 多聚甲醛固定 后 经无水乙醇脱水 二甲苯透 液中固定 明 石蜡包埋 切片 脱蜡 梯度乙醇脱水 常规 ＨＥ 染色和光学树脂封片 光学显微镜下观察肝脏组织 病理学改变 统计学处理 ＰＳＳ 统计分析软件进 所有实验数据采用 Ｓ!ＳＤ 表 行统计学处理 所得结果采用 示 组间比较采用单因素方差分析 两两比较采用 ＬＳ Ｄ 检验 Ｐ 表示差异有统计学意义 组小鼠给予 ｗ 果糖水 Ａ组小鼠给予自 来水 饲养 周 周结束后 组 小 鼠 灌 胃 给 予 结果 ＧＷ Ａ组和 Ｂ组小鼠按照体质 羧 甲 基 纤 维 素 钠 Ｍ 量给 予 相 应 体 积 的 的影响 Ｎ 溶液 每日 次 连续 周 每周测量小鼠体质 量及饮水量 观察小鼠毛发 饮食等情况 灌胃结束 后 处死所有小鼠 取血清 放置于 保存 测量生 化指标 取肝脏 拍照 称量并记录数据 于 保存 待测 小鼠血糖和胰岛素含量测定及胰 岛 素 抵 抗 Ｒ程度评价 后 小鼠摘眼球取血 室温 末次给药禁食 离心 收集上清 检 静置 ＧＷ 对小鼠体质量 肝脏质量及肝脏指数 与相比 模型对照组小鼠的体质量 给 予 肝脏质量 及 肝 脏 指 数 显 著 增 加 Ｐ ＧＷ 后 小鼠的肝脏质量和肝脏指数与模型对 结果见表 照组相比有显著改善 Ｐ 表 ＧＷ对小鼠体质量 肝脏质量及肝脏指数 的影响 珋! ＧＷ 体质量 ± ± ± 肝脏质量 ± ± ± 肝脏指数 ± ± ± 与比较 Ｐ 注 与比较 Ｐ
年第 卷第 期 Ｐ Ｖ Ｎ ＧＷ 对小鼠 ＦＰＧ Ｆ ＮＳ及 Ｆ Ｒ的影响 与相比 模型对照组小鼠空腹血糖 治疗后 显 和空腹胰岛素值显著升高 给予 ＧＷ 本研究采用 Ｆ 著降低了两者的水平 Ｐ Ｒ来评价胰岛素的敏感性 模型对照组小鼠的 Ｆ 及肝脏中 ＴＧ ＨＯ和 ＦＦＡ的含量较 血清中 ＨＤＬ 含量显著降低 显著增加 Ｐ Ｐ 给予 ＧＷ 后 血清及肝脏生化指标 均得到明显改善 差异均有统计学意义 Ｐ ＮＳ及 Ｆ Ｒ的 表 ＧＷ对小鼠 ＦＰＧ Ｆ Ｒ较显著升高 高达 倍 ＧＷ 组 珋! 影响 Ｒ 显 著 降 低 差 异 均 有 统 计 学 意 义 Ｐ 小鼠 Ｆ 结果见表 Ｆ Ｒ ＦＰＧ Ｌ Ｆ ＮＳ Ｌ ± ± ± ± ± ± ＧＷ ± ± ± ＧＷ 对小鼠血清及肝脏生化指标的影响 如表 所示 模型对照组血清中 ＴＧ ＨＯ ＬＤＬ 与比较 Ｐ 注 与比较 Ｐ 表 ＧＷ对小鼠血清及肝脏生化指标的影响 珋! ＧＷ ＴＧ Ｌ ± ± ± 血清 ＨＯ ＬＤＬ Ｌ Ｌ ± ± ± ± ± ± ＨＤＬ Ｌ ± ± ± ＴＧ ± ± ± 肝脏 ＨＯ ± ± ± ＦＦＡ ± ± ± 与比较 Ｐ 注 与比较 Ｐ ＧＷ 对小鼠肝脏组织病理学的影响 油红 Ｏ染色 小鼠肝细胞结构 正常 胞浆呈淡蓝色 未见红色脂滴 模型对照组小 鼠肝细胞内可见大量大小不等的红色脂滴 出现明 治疗后 小鼠 显的肝细胞变性及脂质沉积 ＧＷ 肝细胞脂肪变性较模型对照组显著减轻 胞浆内红 色脂滴数量显著减少 见图 ＨＥ染色 正常组大鼠肝组织光镜下结构 完整清晰 肝细胞索排列整齐 肝细胞大小均匀 细 胞核清晰可见 未见脂滴空泡 模型对照组小鼠肝 组织出现了大面积的脂肪变性 可见弥漫性大小不 干 预 等的圆形脂滴 细胞核被 挤 向 边 缘 ＧＷ 后 小鼠肝细胞脂肪变性较显著减轻 病理结 构基本与正常组相近 结果见图 讨论 越来越多的研究表明 ＮＡＦＬＤ的发病率与西方 饮食结构与方式密切相关 尤其是果糖摄入量的增 加 大量的果糖摄入是直接 通过肝细胞损伤或间 接 通 过 代 谢 负 反 馈 诱 发 ＮＡＦＬＤ 形 成 的 关 键 因 果糖在体内经小肠吸收后 可通过门静脉进 入肝脏 绝大多数果糖被肝脏摄取 与葡萄糖不同的 素 是 肝脏果糖的摄取和代谢并没有受到负反馈机制的 限制 因此过多的果糖摄入量会导致果糖代谢紊乱 从而造成肝脏脂肪酸合成和 ＴＧ的增加 诱导脂肪变 性 ＮＡＦＬＤ常常伴随有胰岛素抵抗 脂质堆积等 症状 而高果糖诱导的小鼠模型与 ＮＡＦＬＤ临床症状 极为相似 成为一种经典的 ＮＡＦＬＤ动物模型 因 的果糖水建立小鼠 ＮＡＦＬＤ模型 此本研究采用 结果显示小鼠体质量及肝脏指数 空腹血糖 胰岛素 Ａ Ｂ模型对照组 ＧＷ 组 图 小鼠肝脏油红 Ｏ染色
研究论文 ｗｗｗ 降低了棕榈酸诱 体外细胞实验也表明 ＷＡＹ Ｇ细胞中脂质的沉积 ＧＷ 同样是合 导的 Ｈ 成的 ＦＸＲ 受 体 激 动 剂 本 研 究 中 造 模 结 束 给 予 ＧＷ 治疗后 ＮＡＦＬＤ小鼠体质量 肝脏指数显著 胰岛素的含量 降低 血清及肝脏中 ＴＧ ＨＯ ＬＤＬ Ｒ显 著 降 低 ＨＤＬ 的 含 量 显 著 增 加 表 明 及 Ｆ ＧＷ 可通过促进脂质代谢和增加胰岛素敏感性 研究发现 来改 善 果 糖 诱 导 的 ＮＡＦＬＤ Ｍ等 ＧＷ 可显著降低肝脏中由高脂饮食诱导的三酰 甘油 胆固醇和游离脂肪酸的含量 与本研究结果相 一致 有研究表明 ＦＸＲ可通过调节脂蛋白酯酶活性 ＨＰ抑制肝 Ｘ受体 ＬＸＲ 激活小异二聚体伴侣 Ｓ ＬＲＨ 介 导 转 录 激 活 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 Ｓ ＲＥＢＰ 表达来调节肝脂质代谢 此外 ＦＸＲ ＲＥＢＰ 还可通过改变细胞胆固醇含量间接调节 Ｓ ＲＥＢＰ 是脂质基因关键转录因子 可 表达 活性 Ｓ 调节肝内脂质从头合成 脂肪酸合成 然而 这一假 ＨＰ 在小鼠中进行人 Ｓ 说受到了多方面的质疑 首先 ＲＥＢＰ 和 ＴＧ 的 表 转基 因 的 表 达 可 同 时 增 加 Ｓ 达 第二 给予 Ｓ 小鼠高脂饮食后 肝脏中 ＴＧ 小鼠中敲除 Ｓ 可预防肝 浓度降低 第三 ＲＥＢＰ 尽管 ＦＸＲ可以抑制 Ｓ 脏 ＴＧ的增加 最后 的表达 但是 ＦＸＲ并没有抑制 Ｓ ＲＥＢＰ 靶基因 比如脂肪酸合成酶的表达 因此 关于 ＦＸＲ维持 肝脏脂质代谢平衡的机制仍待进一步考察 的 果 糖 水 可 成 功 诱 导 小 鼠 综上 所 述 Ａ Ｂ模型对照组 ＧＷ 组 图 小鼠肝脏 ＨＥ染色 同时血清及肝脏 及胰岛素指数显著增加 Ｐ 生化指标检测表明 与相比 小鼠 血清及肝脏中 ＴＧ和 ＨＯ的含量显著增加 血清中 ＬＤＬ 的含量显著增加 ＨＤＬ 的含量显著降低 差 之后肝脏病理学 异均具有统计学意义 Ｐ 小鼠肝脏中肝细胞变性 胞质内出 研究表明 现了大量脂滴 进一步证明了果糖可成功诱导小鼠 ＮＡＦＬＤ模型 ＦＸＲ受体可以调控包含脂质 胆汁酸与葡萄糖 ＦＸＲ受体 合成及代谢等相关基因的表达 研究表明 可保护肝脏避免脂质堆积 相比之下在先天缺失 ＦＸＲ 受体的小鼠中则缺少此保护作用 同时缺乏 ＦＸＲ 受体的小鼠在正常饮食状况下也可出现血糖升高及 等 研究发现给 胰岛素抵抗等症状 另外 Ｌ 予果糖诱导的 ＮＡＦＬＤ小鼠灌胃 ＦＸＲ的激动剂 ＷＡＹ 后 可以显著降低小鼠肝脏 ＴＧ的堆积 另外 ＮＡＦＬＤ模型 ＦＸＲ受体激动剂 ＧＷ 可通过降低 脂质沉积 增加胰岛素敏感性来改善 ＮＡＦＬＤ 对肝脏 具有保护作用 相关机制有待阐明 参 考 文 献 Ｓ ｗ Ｊ Ｂ Ｄ Ｒ Ｋ Ｔ Ｐ Ｐ Ｇ Ａ Ｄ Ａ Ｋ Ｎ Ｐ ｗ ＮＡＦＬＤ Ｔ Ｇ Ｇ Ｖ ＭＪ Ｎ Ｙ Ｅ 张丹丹 但汉雄 黄慧辉 等火麻仁油对高脂血症大鼠血脂代谢 及保肝作用研究 ＬＹ Ｊ Ｋ Ｚ ＹＢ Ｂ Ｐ Ｐ Ｇ Ｇ Ｂ Ｐ ｗ Ｊ Ｔ ＦＸＲ Ｅ Ｚ Ｙ Ｙ Ｌ Ａ Ｊ ｗ Ｘ Ｊ Ｂ Ｓ Ｊ Ｋ Ｂ Ｂ Ｐ Ｘ
年第 卷第 期 Ｐ Ｖ Ｎ ＦＸＲ ＦＸＲ ＦＧＦ Ｌ Ｓ Ｍ Ａ Ｐ Ｇ ＦＸＲ Ｚ ＪＬ Ｒ Ａ Ｌ Ｐ Ｍ ＤＦ Ｘ Ｄ Ｄ Ｔ ＭＹ Ｈ Ｙ Ｙ Ｌ Ｓ ＦＸＲ ＧＷ Ｐ Ｒ Ｊ Ｐ Ｒ ＡＳ Ｈ Ｍ ｗｄｒ Ｈ Ｄ Ｏ Ｘ Ｐ Ｙ Ｆ ＪＨ Ｈ ＰＪ Ｄ Ｎ Ｒ ＫＦ Ｒ Ａ Ａ Ｎ Ｒ Ｐ Ｓ ＭＫ ＰＫ Ｌ Ｆ Ｘ Ｊ Ｌ Ｘ Ｘ Ｒ Ｊ Ｌ Ａ Ｘ ＦＸＲ Ｂ Ｂ Ｒ ＡＤＲＰ Ｙ ＺＸ Ｗ ＨＥ ＦＸＲ ｗ Ｈ Ｎ Ｂ Ｋ Ｒ Ｂ Ｋ Ｋ ｗ Ｓ ＨＰ ＥＭＢＯ Ｊ Ｗ Ｌ Ｌ Ｊ Ｐ Ｔ Ｓ ＨＰ ＰＧ ｗ Ｍ Ｈ Ｊ ｑ Ｊ ＰＫ Ｍ Ｈ 收稿 修回 ＨＰＬ ＭＳ测定替加环素脑脊液浓度及临床应用 梅升辉 罗旭颖 李倩 杨莉 赵志刚 石广志 朱乐亭 首都医科大学附属北京天坛医院 药学部 Ｕ 北京 摘 要 目的 建立测定人脑脊液中替加环素 ＴＧ浓度的液质联用方法 验证后应用于临床样本的 ＴＧ浓度测定 方法 μ色谱柱 使用含 三氟乙酸的水和乙腈为流动相梯度洗脱 流速为 使用 Ｋ 柱温 ＴＧ和内标 Ｓ在正离子电喷雾电离模式下的定量离子对分别为 和 替加环素 结果 ＴＧ浓度在 范围内线性良好 ＴＧ在低 中 高浓度的回收率在 之间 所有质控样品在考察的条件下均稳定 结论 本研究建立 之间 内标归一化的基质效应在 的使用液质联用测定 ＴＧ脑脊液浓度的方法准确并且稳定 可用于 ＴＧ的药动学研究 关键词 液质联用 替加环素 脑脊液 临床应用 文献标识码 Ａ 中图分类号 Ｒ Ｘ 文章编号 Ｄ Ｔ Ｈ Ｆ ＨＰＬ ＭＳ Ａ Ｍ Ｓ Ｌ Ｘ ＬＱ Ｙ Ｌ Ｚ Ｚ Ｇ Ｚ Ｌ Ｄ Ｐ Ｄ Ｕ Ｂ Ｔ Ｈ Ｍ Ｕ Ｂ ＡＢＳＴＲＡＴ Ｏ Ｔ ＨＰＬ ＭＳ ＴＧ Ｍ ＴＧｗ Ｋ μ Ａ ｗ ｗ ｗ Ｔ ｗ ｗ ｗ Ｔ ｗ ＥＳ ｗ ＴＧ ＴＧ ＳＲ Ｔ ＴＧ ｗ ｗ Ｔ ＴＧｗ ｗ Ｓ ｗ ｗ ＴＧｗ ｑ Ｔ ＨＰＬ ＭＳ ＴＧ ｗ ＴＧ ＫＥＹＷＯＲＤＳ ＨＰＬ ＭＳ Ｔ 替加环素 ＴＧ是具有甘氨酰类结构的广谱四 Ｓ亚基结合 环素类抗菌药物 通过与细菌核糖体 多肽及小分子药物北京市重点实验室开放课题 编号 ＤＴＹＷ 首都医科大学本 基金项目 国家自然科学基金项目 编号 ＫＹ 科生科研创新项目 编号 ＸＳ Ｅ 通讯作者 朱乐亭 Ｔ