食源性病原菌快速检测方法的发展和影响 绪论 : 一 食品中的微生物检测当前, 检测食品中是否存在细菌是确保食品质量和安全的常用方法 然而, 在 20 世纪 以前美国并没有有关食品安全的国家法规, 因此很少实施细菌污染的检测, 消费者只能信赖 厂商对食品卫生盒安全所做出的保证 随着工业化的发展, 城市人口的快速增长增加了对食 品供应量的需求, 城市人口的快速增长增加了对食品供应量的需求, 消费者对食品安全的担 忧也相应增加 比如许多农场的管理和运输能力已经跟不上奶制品产业的迅猛发展, 牛奶成 了白喉 伤寒 猩红热等疾病的传播媒介 一些不法厂商为满足需求量 增加利润而采用掺 假等手段来降低生产成本, 如用水稀释牛奶 在咖啡和可可粉中掺杂碳粉或锯末等 厂商也 时常在黄油和牛奶中加入硼砂和甲醛来延长这类易腐败食品的保质期 由于公众对食品安全的担心日益增加,1906 年美国国会通过了联邦食品药品法, 法案 禁止掺假 假冒伪劣或含有有害物质的食品在州与州之间流通 然而, 检验食品是否掺假或 污染的重任却落在了联邦政府的肩上, 而厂家却并不对此负责, 所以只有联邦法规机构在积 极开发检测食品污染的方法 1938 年食品药品和化妆品法案的通过使这种状况有所改观 法案修改了联邦政府的权利, 重新对食品的安全性做了规定, 并要求厂商不仅要知法还要守 法 据此, 厂商开始对产品进行检测以确保其生产的添加剂和食品是安全的 这种变化激发 了人们对食品中的细菌 毒素和其它污染物检测方法的研究和开发 现在, 对食品标本进行微生物检测已成了惯例, 对食品整个生产链起到安全保障作用 的危险性分析和临界控制点 (HACCP) 观念的引进和逐步推行也将会减少我们对产品终极 检测的依赖 人们普遍认为终极产品检测在保证食品安全上没有多大意义 然而, 当这些分 析在食品生产 HACCP 生产程序的建立和认证以及食品质量监控上仍起着决定性作用的时 候, 人们对微生物检测和更好的测试方法的要求也越来越高 目前, 很多微生物检测方法都可检测出食品中常见的病原菌 这些方法大多为传统的 培养方法, 需要琼脂培养基 生物技术的发展在很大程度上改变了食品检测的方法, 很多公 司都在积极开发比传统检测方法更特异 更快捷 更敏感的检测方法 这些检测方法通常叫 做快速检测方法, 它们使用特殊的荧光或显色酶底物 单抗或多抗 核酸和 PCR 等技术来 开发更为有效的诊断技术, 有些甚至是自动化的 本章节涉及了生物技术对快速检测方法的 影响 食品中病原体检测仍然存在的问题 快速检测方法的主要类型以及采用这些方法之前 进行认证的重要性等问题 鉴于篇幅所限, 本文将主要讨论商品化检测试剂中的技术问题 在本章末尾还列举了一些新的技术, 这些技术将可能被用来开发出更加快速敏感的试剂以检 测食品中的病原体 二 食品检测中存在的问题对食品中微生物的检测, 特别是对特殊病原体的检测仍然是对所有检测方法和技术的 挑战 在某种程度上, 问题应该出自食物中的细菌的不规则分布, 而食品基质的异质性也使 得食品检测变得更为复杂 食物可由多种成分构成, 包括蛋白质 碳水化合物 脂肪 油类 化学品 防腐剂及其它成分 食品的物理形态多种多样, 有粉末状 液态 凝胶状 固体 半固体或其它形态 状态的不同通常由成分的不同所致, 比如, 经过适当的混合脂肪和油就 可融合 这样就导致了成分的不均匀混合, 使之不能重复分析或前后一致地分离特定的病原 1
体 除了基质多样化的问题之外, 食品本身所带有的微生物使食品检验更为复杂 一些未加工的食品, 如芽甘蓝中的微生物含量就高达 10 8 个 / 克 正常微生物对健康一般没有明显的危害, 但它们的存在常常干扰对相对数量较少的致病菌的选择性分离和确认 在检测食品中的志贺氏菌属和大肠杆菌如 O157:H7 等病原菌时, 这种干扰就显得犹为关键, 因为这些病原菌仅需很少的数量就可致病 如果特殊病原体易于受损伤, 那么正常微生物和基质混合所引起的问题就会被进一步加剧 许多食品生产中的加工和处理方法, 如加热 冷却 干燥 冷冻 浸泡 化学品添加 保存以及其它因素都能对一些致病菌造成极大的损伤 受损后的细菌对选择性增菌培养中的许多成分或抗生素很敏感, 所以除非受损后的细菌可以复活, 否则标本中的其它正常细菌的生长会掩盖它们的存在 第二章中将详细论述受损细菌 为解决这些问题, 传统微生物检测不得不频繁并更检验程序来适应对特定细菌或食品的检测 为增强对特定病原菌的检测, 过去几年中所推行的更加有效的方法之一是对食物标本进行分步富集培养 即 : 以一个预富集步骤开始, 把食品接种在非选择性富集培养基中, 使所需的病原体得到生长, 而正常微生物的生长却受到抑制 有时需要增加一个后期富集培养步骤来使病原菌数量进一步增加而达到检测水平 培养 - 富集后的标本接种至选择和 / 或鉴别培养基中, 通过特定的菌落特征就可对生长的菌落做出初步鉴定 确认需通过做进一步的生化试验和血清学试验 尽管上述传统培养分离方法已被常规用来分离和鉴定食品中的病原菌, 但其耗时耗力 一般而言, 传统方法通常需数天时间方能完成对食品中病原菌的分离鉴定, 因此难以满足食品中微生物快速检测的要求 三 快检方法的起源和发展科技的进步带动了一系列检测食源性病原体及其毒素的技术发展 这些检测技术统称 为 快速检测方法, 该名称现已在全球范围内得到了认可 已发表的许多评论文章是有关 检测方法在检验食品 海产品和环境中的病原菌及食源性酵母菌方面的作用 四 快速检测和鉴定的特性由于对 快检 一词解释不同, 因此要准确定义快检方法的构成并不容易 快检方法 是一种能马上得到准确结果的检测方法, 但实际上这样理想化的方法不多见 快检方法也可 以是对检验程序进行修改以缩短检测时间的方法 由于称为 金标准 的传统检测方法往往 需要几天甚至一个星期的时间, 所以任何可以从技术上减少这一检测时间的改进方法均可叫 做 快速检测方法 实际上, 存在于这两种定义之间的所有已经出现的或正在研制的新方 法都可被列为 快速检测方法 因此 快速检测方法 这一定义包含了多样化的技术和检 测形式 需要说明 : 鉴定 和 检测 两术语常常与 快速检测方法 紧密相关 虽然它 们常常在一起使用, 但 鉴定 通常是指对纯培养基的分离菌的确定 ; 而检测是指检测食品 中有无微生物存在, 但无需将该微生物从食品中分离出来 或许有些研究人员对这两条术语 有着不同的解释, 但在本文中将采用上述定义以区别快速检测和快速鉴定的不同应用范围, 二者的主要区分在于鉴定需要一个纯培养的分离菌株 在 20 年前, 文献中并不存在 快速检测方法 这一词, 这是一个新形成的概念 然而 在它定义广泛的概念里, 对这一领域的研发多年来一直在进行中, 因为科学家们找到了更加 简便的方法对微生物进行分析 最明显的实例就是 20 世纪 40 年代后期韦弗和他的同事们完 成的一项工作 它们采用浓缩接种 使用很少量的试剂以加速反应时间, 从而革新了生化鉴 定的概念 这项工作引发了小型生化鉴定试剂盒的出现, 到了 80 年代食品检验也开始用它 2
了 然而除此之外, 快速检测方法 在生物技术取得重大进展之前并未得到快速发展 五 生物技术的影响 特尔斐预言基础科学研究促进了生物技术的发展, 后者继而刺激了包括快速诊断方法在内的许多 领域的发展 有关生物技术进展所带来的变化可参阅生物技术发展金字塔图 ( 图 38.1) 这个 金字塔的塔尖始于 20 世纪 50 年代对 DNA 的研究, 由此引发了对分子生物学研究的狂热 之后的几十年是基础研究的黄金时代, 其间积累了宝贵的知识财富, 包括 70 年代新型检测 试剂和实验技术的开发 DNA 限制性内切酶的发现 制备可识别单一抗原决定簇的高特异 性单克隆抗体技术的出现 适合营养要求很高的细菌和病毒生长的更加完善的组织培养技术 以及能够制备实验研究所需的特殊酶和试剂的更加先进的发酵技术 这一时期的研究和技术 发展在金字塔图中位于最上边三层 ( 图 38.1), 这个时代也造就了大量的诺贝尔奖得主 起 初, 这些新技术仅限在实验研究中使用, 但 80 年代后, 许多技术给食品检验领域带来了惊 人转变 例如, 在 1981 年举行了一次名为 特尔斐预测 的信息调查, 世界上 29 位著名的 微生物学家应邀对未来有可能用于食品微生物学中的诊断技术进行了预测 它们预测通过测 量电导和特异性细菌代谢物来测定细胞密度的自动化菌落计数仪和设备将用于细胞分析领 域 ; 基于特殊底物而制备的小型生化试剂和鉴定系统将用于细菌鉴定 大多数预言 包括开 始的年份, 都已被证明是准确可行的了 许多当年预测的系统和设备今天仍在使用 然而遗 憾的是未能预测到以核酸或抗体位基础而建立的检测方法 因为在进行 特尔斐预测 的年 代里, 很少有人看到它们会在预言结束后的十年中一直主导着病原体检测技术 ( 图 38.1) 快速检测方法的原理 在鉴别和检测食品的病原体上, 快速检测方法往往比微生物检测法更为敏感和特异 商品化的快速检测方法的常见类型有小型化的生化鉴定试剂盒, 传统微生物检测方法的改进型, 抗体检测方法, 核酸检测方法 每一类中都包含有一些自动化的鉴定盒检测方法 由于这些方法的确加快了鉴定或检测过程, 所以在 快速检测 宽泛的定义内, 它们都可以称为 快速检测方法 但从严格意义上讲, 将这些方法统称为快速检测法则有可能引起误解 比如, 在鉴定实验中, 虽然试剂的检测可能很快, 但由于需要得到微生物的纯培养物, 所以仍要花费相当的时间进行分离培养 此外, 食品肢体的复杂性和上述其它一些分析方面的问题也阻碍了多数检测方法在食品标本中的直接应用 所以, 几乎所有针对特定病原体的快检方法在检测之前仍都须对食品标本进行增菌培养 换句话说, 检测本身的速度可能很快, 从几分钟到几个小时不等 ; 但由于需要增菌培养, 因此一种食品标本检验的总时间可能需要几天或者更长 然而尽管需要增菌, 许多快速检测方法采用了简化的增菌过程并且无需采用不同培养基分离菌株 所以与传统方法相比, 快速检测方法所需时间还是明显缩短 以下章节将讨论在快速检测方法中使用的技术和一些独特的设计方案 一 小型生化及其它鉴定试剂从食品分离出的细菌是通过它们的生化特性来鉴别的 典型的生化实验需要耗费大量的 人力和培养基, 要通过一系列的实验来确定细菌各种酶的活性和相关碳水化合物的利用情 况, 以便得到细菌的纯培养物 小型化的生化检测试剂最早出现在 20 世纪 40 年代, 那时开 始采用的小容量瓶极大地减少了培养基的用量, 而密集接种也大大缩减了孵育时间 小型化 的生化检测试剂首先在临床微生物实验中逐渐得到普及 ; 后来在食品检验中也开始使用这些 试剂并取得了明显的效果 3
小型化的生化检验试剂盒用于鉴定食品中分离出的纯细菌菌株 大多数试剂盒都带有一个一次性使用的多孔鉴定板, 内含 15 到 30 种培养基或底物, 可鉴定一组特定的菌属或菌株 除少量试剂盒能在 4 小时内完成检测外, 多数需 18 到 24 小时的孵育时间 一般而言, 小型化的生化鉴定试剂精确率为 90% 到 99%, 与传统检测法相当 尽管多数试剂是为鉴定肠道细菌而设计的, 但也出现了鉴定弯曲杆菌 李斯特菌 厌氧菌 非发酵型革兰氏阴性和阳性细菌的试剂 各种小型化的生化鉴定试剂在检测程序 价格和性能上都很相似, 均比传统方法简便 经济, 但二者在数据库的规模上有所不同 由于传统方法已经被使用了很长时间, 因而其具有更为强大的数据库 小型化生化鉴定试剂的检测方法基本一致, 但新的试剂使用则更加方便 与前期试剂相比, 新的试剂需要手动操作的步骤更少, 且无需其它试剂 表 38.1 中列出了一些小型化的生化鉴定试剂 与简单化的趋势相顺应, 使用小型化鉴定试剂的自动化鉴定仪的开发也取得了明显进展 临床上已经可以见到许多鉴定细菌和判定细菌抗生素敏感性的自动化检测仪器 大多数自动化鉴定仪器是以细菌的生化发应为基础的, 其中一些仪器已经获得了国际分析化学协会 (AOAC) 的认证, 如用于鉴定各种食源性细菌的 Vitek 鉴定仪 Vitek 鉴定仪采用一块信用卡大小的一次性塑料板, 内含 30 中生化试剂, 可接种细胞纯培养基悬液 该仪器对悬液进行孵育并监测生化反应的变化, 而后将反应结果与电脑中的数据库进行对比, 从而得出鉴定结果 其它一些自动化系统是基于细菌成分或代谢特征来鉴定细菌的 Microbial 的鉴定系统采用气相色谱技术分析细菌纯培养悬液中的萃取物, 然后由计算机根据产生的脂肪酸图谱分析计算色谱的峰值数据, 并与数据库对比后得出最佳鉴定结果 Biolog 鉴定系统是基于细菌对 95 种不同碳源的氧化能力来对细菌进行鉴定的 这些碳源中活的细菌的呼吸可以引起氧化还原作用的改变, 这些变化可以用四唑类化合物通过比色进行检测 用分光光度计测量颜色的变化后, 再将结果图与计算机中的参考数据库进行对比得出鉴定结果 表 38.1 中已经列出了部分自动化鉴定系统 表 38.1 部分用于鉴定食源性细菌的小型生化鉴定试剂和自动检测系统 系统 原理 厂商名称 鉴定微生物种类 API 生化 BioMerieux 肠杆菌 李斯特菌 葡萄球菌 弯曲杆菌 非发酵菌 厌氧菌 Cobas IDA 生化 Roche 肠杆菌 Micro-ID 生化 REMEL 肠杆菌 李斯特菌 Enterotube II 生化 Roche 肠杆菌 Spectrum 10 生化 Austin Biological 肠杆菌 Rap ID 生化 Innovative Diag. 肠杆菌 BBL Crystal 生化 BD 肠杆菌 弧菌 非发酵菌 厌氧菌 Minitek 生化 BD 肠杆菌 Microbact 生化 Microgen 肠杆菌 革兰氏阴性菌 非发酵菌 李斯特菌 Vitek 生化 BioMerieux 肠杆菌 革兰氏阴性和阳性菌 Microlog 碳氧化 Biolog 肠杆菌 革兰氏阴性和阳性菌 MIS 脂肪酸 Microbial-ID 肠杆菌 李斯特菌 芽胞杆菌 葡萄球菌 弯曲杆菌 Walk/Away 生化 MicroScan 肠杆菌 李斯特菌 芽胞杆菌 葡萄球菌 弯曲杆菌 Raplianalyzer 生化 Oxoid 肠杆菌 李斯特菌 芽胞杆菌 葡萄球菌 弯曲杆菌 4
Riboprinter 核酸 Qualicon 沙门氏菌 葡萄球菌 李斯特菌 大肠埃希氏菌 Cobas Micro-ID 生化 BD 肠杆菌 革兰氏阴性菌 非发酵菌 Malthus 电导 Malthus 沙门氏菌 李斯特菌 弯曲杆菌 大肠杆菌 假单胞菌 其它大肠菌群 Bactometer 阻抗 BioMerieux 沙门氏菌 二 改良和特定培养基另一类快速检测方法种类繁多, 包括从特殊培养基到传统方法的简单改良等等, 其目的 都是为了节省人力 时间和材料 如 Petrifilm, 这种检测方法使用含有干粉培养基的一次性 纸板为材料, 用于总的细菌 特定细菌 霉菌和酵母菌的计数 这一检测方法无需制备培养 基和琼脂平板, 从而节省了储存和培养空间, 也简化了废弃材料的处理过程 Isogrid 检测 方法使用了特殊设计的疏水格式膜过滤器 (HGMF), 可以滤过高浓度细胞悬液, 从而减少 了过滤前悬液稀释的次数 与常规使用的滤膜 80CFU/ml 的技术能力相比,HGMF 的技术能 力达到了 1600CFU/ml 另外还有两项方法对这一领域的发展也起了较大影响, 一种是在培 养基中加入特殊底物使其能够快速检测酶活性的变化 ; 另外一种是基于细菌 ATP 活性变化 来计算总的细菌数 多年来,pH 指示剂一直用在培养基中以测定因细菌新陈代谢活动引起的酸度变化 然 而, 显色和荧光底物可以用来快速检测特异性酶的活性 有些底物只针对一定的细菌或菌属, 因此可以对特定的微生物进行快速的初步鉴定 ONPC 和 X-Gal 等一些显色底物已被加入培 养基中用来检测肠道细菌中的 β- 半乳糖苷酶 (GAL) 的活性 ; 类似的还有被添加到各种培 养基中对大肠杆菌 β- 葡糖苷酸酶 (GUD) 活性进行特异性检测的荧光底物 MUG 现在, 许 多特殊显色培养基, 包括浸有底物的圆盘型纸片培养基, 均加有 MUG 或其它显色的 GUD 底物用来检测大肠杆菌 其中较为突出的是用来初步分离大肠杆菌 O157:H7 或其它肠出血 性大肠杆菌 (EHEC) 的特殊显色培养基 这些培养基通常混合有检测 GAL GUD 或山梨 醇发酵的不同显色底物, 这样当不同的细菌在这些培养基上生长时可以形成颜色各不相同的 菌落 表 38.2 列出了部分这类显色培养基 检测细菌 ATP 活性的生物发光技术也已在食品检测中得到了广泛应用 这些检测方法 的关键组分在于荧光素酶 虫荧光素盒镁离子 在 ATP 的作用下, 虫荧光素被氧化成氧化 虫荧光素, 同时释放出光子 光子释放的数量可以用发光仪进行定量检测 当采用 ATP 作 为限制性试剂时, 光子释放的数量就与原始标本中估计的细菌数目成直接正比关系 荧光素 酶反应速度很快, 并且它不像其它方法一样需要增菌培养,ATP 检测方法可在不增菌的情况 下 在 5 到 10 分钟之内检出 10 4 CFU/ml 的细菌 这些方法对监测食品或食品加工中的卫生 质量十分有效 ; 然而由于所有有生命的生物体都可产生 ATP, 所以这些分析方法只能用来估 算总的细菌数, 而不能判定是否有特定细菌或病原菌存在 表 38.2 部分商品化的检测食源性细菌的快速方法和显色培养基 有机生物名称 商品名 原理 制造商 细菌 Redigel 培养基 RCR Scientific Isogrid HGMF QA Labs Enliten ATP Promega Profile-1 ATP New Horizon Biotrace ATP Biotrace Lightning ATP Idexx 5
Petrifilm 纸片培养基 3M SimPlate 培养基 Idexx 大肠杆菌 Isogrid HGMF/MUG QA Labs Petrifilm 纸片培养基 3M SimPlate 培养基 Idexx Redigel 培养基 RCR Scientific ColiQuik MUG/ONPG Hach ColiBlue 培养基 Hach Colilert MUG/ONPG Idexx LST-MUG MPN 培养基 Difco, GIBCO ColiComplete MUG-X-Gal BioControl Colitrak MPN-MUG BioControl ColiGel, E*Colite MUG-X-Gal Charm Sciences CHROMagar 培养基 CHROMagar 大肠杆菌 MUG disc MUG REMEL CHROMagar 培养基 CHROMagar EHEC Rainbow Agar 培养基 Biolog BCMO157:H7 培养基 Biosynth Fluorocult O157:H7 培养基 Merck 产单核细胞李斯特菌 BCM 培养基 Biosynth 沙门氏菌属 Isogrid HGMF QA Labs OSRT 培养基 / 动力 Unipath(Oxoid) Rambach 培养基 CHAROMagar MUCAP C8 酯酶 Biolife XLT-4 培养基 Difco MSRV 培养基 耶尔森氏菌属 Crystal violet 染色 Polysciences 三 核酸检测方法核酸检测方法有很多种, 但商品化的用于检测食源性病原菌的方法只有 DNA 探针 PCR 和噬菌体技术三种 近来,DNA 分子记录方法得到了长足的发展, 这些方法包括脉冲凝胶 电泳 限制片断长度多态性和核糖记录 (ribotyping) 等 记录法对流行病学调查和了解食 源性病原菌的特征及 指纹 识别对应病原菌具有很高的应用价值 但由于分子记录法不在 本章所涉及的范围之内, 所以在此不做详细论述 1.DNA 探针技术用于检测食品中病原菌的 DNA 探针技术最早出现于 20 世纪 80 年代 1987 年, 在一个关于诊断领域未来市场机遇的会议上, 许多专家都乐观地认为 DNA 探针技术将在全球范围内成为食品工业中占主导地位的诊断工具 但实际上探针技术的商业化发展却出奇地缓慢, 究其原因可能是最初在探针技术上使用了放射性标记物 虽然 DNA 探针检测技术已经被开发出来用于主要的食源性病原菌的检测, 但只有少数几家公司在积极推广这种用于食品检测的技术 探针技术检测的对象主要为 rrna, 这是因为细菌 rrna 的高复制量为探针检测提 6
供了一个天然的扩增对象, 探针检测 rrna 也因此具有了更高的灵敏度 GENE-TRAK 检测试剂将 DNA 杂交技术和酶免疫检测技术 (EIA) 结合在一起对食源性病原菌进行检测 它主要由带有多聚腺嘌呤核甘尾部捕捉探针和荧光素标记的测定探针构成, 二者可与目标 rrna 的邻近区域发生特异性结合 ( 见图 38.2A) 食品标本通过增菌和细胞化学溶解后, 目标 rrna 就会同时与两种探针进行杂交, 然后杂交体固定在包被有多聚胸腺嘧啶核甘的测定仪上 将未结合或非特异性结合的杂交物洗去, 然后用过氧化酶标记的抗荧光素抗体和一种比色过氧化酶底物构成的 EIA 方法检测结合物 ( 图 38.2) 图 38.2 上图说明了 GENE-TRAK 试剂的 DNA 探针检测原理 ( A ) 捕捉探针和测定探针与目标 rrna 杂交 ( B ) 测定仪捕捉杂交体 GEN-PROBE 的 AccuProbe 检测试剂是一种杂交保护试剂 它采用一个化学发光吖啶酶标记的单链探针, 与 16S rrna 的特定序列进行杂交 由于不同的水解作用可使未结合的探针失活, 所以杂交保护了探针和标记物 随后加入的碱性 H 2 O 2 可以激活标记物使其在 430nm 处发光, 并由发光计定量测定 AccuProbe 试剂主要用于细菌纯培养基分离物的鉴定, 但也试验性地用于食品增菌标本中的病原菌检测 表 38.3 列举了 AccuProbe 和 GENE-TRAK 及其它一些商品化的核酸检测试剂 表 38.3 部分商品化的检测食源性病原菌的核酸检测试剂 有机生物名称 商品名 原理 制造商 肉毒梭菌 Probelia PCR BioControl 弯曲杆菌属 AccuProbe Probe GEN-PROBE GENE-TRAK Probe GEN-TRAK 大肠埃希氏菌 GENE-TRAK Probe GRN-TRAK 大肠杆菌 0157:H7 BAX PCR Qualicon Probelia PCR BioControl 李斯特菌属 GENE-TRAK Probe GENE-TRAK AccuProbe Probe GEN-PROBE BAX PCR Qualicon Probelia PCR BioControl 沙门氏菌属 GENE-TRAK Probe GENE-TRAK BAX PCR Qualicon BIND Phage BioControl Probelia PCR BioControl 金黄色葡萄球菌 AccuProbe Probe GEN-PROBE GENE-TRAK Probe GENE-TRAK 小肠结肠耶尔森氏菌 GENE-TRAK Probe GENE-TRAK 2.PCR 虽然 DNA 探针在食品检测中并未取得预期的商业主导地位, 但在探针技术中使用的杂交基本原理却在其它技术中得到了应用 PCR 实验中,DNA( 探针 ) 或引物与特定靶序列或模板进行杂交, 然后在 Taq 聚合酶作用下在热循环中进行扩增 PCR 是一种用途极为广泛的技术, 可以在很短的时间内将一段特定序列进行大量扩增 PCR 可以同时检测多个目 7
标 检测食源性病原菌 PCR 试剂的开发工作已有许多综述给予了讲述 理论上,PCR 可在两个小时之内把一个单拷贝 DNA 扩增一百万倍, 所以它可以消除或大大降低对增菌培养的依赖性 然而尽管发表了大量有关 PCR 在食源性病原菌检测中的应用方面的文章, 但商品化的试剂盒却寥寥无几 ( 表 38.3) 这也许部分归咎于这样一个事实, 象其它方法一样,PCR 试剂也受到了食品结构复杂的影响 由于 PCR 技术具有极高的敏感性, 所以并不需要每次都使用细菌纯培养物, 但在 PCR 实验前进行增菌培养仍然是需要的 食品中的抑制剂是干扰 PCR 结果的主要原因, 抑制剂可以影响引物的结合 扩增效果或出现假阴性结果 在临床试验中, 粪便 血便和血液标本中 PCR 抑制剂的出现已得到了充分认定 此外, 在对环境标本的检测中发现, 土壤中的腐殖质和铁类化合物的存在也可影响引物的结合或抑制 PCR 的扩增 在应用 PCR 检测食源性的过程中, 富含高蛋白和脂肪成分的食品, 如鸡 肉类 软奶酪和牡蛎等, 可在很大程度上干扰 PCR 的扩增 其原因可能在于这些食品标本有蛋白酶存在, 蛋白酶可降低 Taq 酶的活性 但也有一些例外, 比如豆芽中脂肪很少, 但它也抑制 PCR 的扩增 除食品成分外, 在增菌和培养基中过量使用的一些原料和从食品标本中抽提 DNA 时使用的化合物也可干扰 PCR 所以食品标本和增菌培养后的标本常常需经过处理或抽提, 使其成为适合 PCR 实验的 DNA 模板 另外, 由于食品本身的复杂性, 针对一种特定食品的准备方法对其它食品可能并不适合 例如, 在碱性条件下和使用去垢剂进行抽提可以降低高脂肪和高蛋白食品对 PCR 的抑制效应 ; 但其它食品可能需要采取稀释 洗涤 过滤或离心等步骤来消除抑制效应 兰茨等人总结了一些有效的预处理方法, 这些方法可以用于经过选择的食品 土壤和临床标本使其适合 PCR 此外, 采用抗体捕捉和浓缩特定细菌的免疫磁分离技术可有效降低食品对 PCR 的抑制效应, 从而推动 PCR 技术在检测食品 环境和临床标本中的应用 除 PCR 外, 还有正在开发的其它一些检测食源性病原体的 DNA 扩增方法, 如连接酶链反应和自我序列复制 (3SR) 技术等 3. 噬菌体技术 噬菌体与宿主细菌间的高特异性相互作用使其可以被用来检测食品中对应的病原菌 最典型的就是生物发光和冰核技术 如上所述, 检测 ATP 的方法并不能区分细菌种类, 它 们主要用来测定食品或卫生设施中的细菌总数 但是如果在生物发光试验中采用基因工程技 术构建的携带有检测标记的特异性噬菌体, 那么就可以用生物体发光技术鉴定细菌 互生单 细胞菌属 发光菌属核弧菌属中的几个菌种携带有 Lux 操纵子, 可以编码细菌荧光素酶而 自然发光 例如研究人员将来自 fischeri 弧菌的 Lux 基因克隆道 Charon30 噬菌体中并以此 开发出了特异性检测大肠杆菌的试剂 由于噬菌体本身并没有基因表达的机制, 所以 Lux 基因是静止基因 但一旦重组的噬菌体感染其诉诸, 插入的 Lux 基因就会在很短的时间内 表达, 从而使宿主发光 发光量可用发光仪进行测定并校准以反映标本中原始杆菌的总数 在不需要增菌的条件下, 重组的 Charon 噬菌体可在感染后 100 分钟内检测出 10 个左右的大肠杆菌, 在 1 小时内从牛奶或尿液中检测出 10 2 到 10 3 个细胞 利用 Lux 重组噬菌体检测沙 门氏菌纯培养悬液也取得了类似的敏感性结果 但由于所要求的沙门氏菌检测极限为 25 克 食品中有一个细菌, 所以在生物发光试验中仍需要做一个短暂的增菌培养 另一种噬菌体检测方法是用于沙门氏菌属检测的细菌冰成核诊断 (BIND) 技术 该方 法基于结冰的物理特性, 采用 ina 基因使冰成核 将少量 均一体积的水超冷却至 -40 并 保持液态不变 ; 当有成核剂存在时, 会在 -2 时形成冰晶体 多数冰核是无机分子, 但有些 植物性致病菌如欧文氏菌属 假单细胞菌属和嗜麦芽黄单胞菌属, 可产生形成冰核的蛋白质 ina 基因编码的冰成核蛋白似乎可以结合水分子冰模拟冰晶体的结构, 促使结冰现象的发 生 把 ina 基因克隆到对沙门氏菌特异的噬菌体中, 这样当食品中有沙门氏菌存在时, 就可 8
以用一种结冰指示染料进行检测 据试验报告称,BIND 方法检测灵敏度最低可达 20CFU/ml, 但一般在 10 2 和 10 4 CFU/ml 之间, 它取决于所检测的沙门氏菌血清型的不同 所以要获得理想的检测, 仍需要增菌 冰成核技术除了用于检测分析之外, 许多工厂也在对这一技术进行研究以使其能够提高食品的冷冻温度, 减少冷冻所需时间以提高冷冻食品的质量 口感等 四 抗体检测方法抗体多年来一直被用来对细菌进行血清学分型 最早的抗体分型出现在 1920 到 1930 年之间, 用来鉴定沙门氏菌血清型 反射免疫技术的发展扩大了抗体的使用范围, 使其可以 对抗原进行定量测定 但直到酶联免疫吸附试验 (ELISA) 等高敏感度检验方法问世后, 抗 体在检测分析技术中的潜力才得到确认 抗体 特别是单克隆抗体的高特异性结合能力, 抗 原抗体反应的简便性和用途多样性等特性促使了各种检测方法的建立 一般而言, 抗体检测 方法有五中类型, 在食品检验中使用的快速检测方法主要是由这些方法构成的 1. 乳凝集和反向被动胶乳凝集最简单的抗体检测方法是胶乳凝集 (LA) 在胶乳凝集试验中, 采用包被有抗体的彩色胶乳颗粒或胶体金颗粒家测细菌细胞悬液 如果悬液中有特异性抗原存在, 就可形成肉眼可见的凝集或沉淀 ( 图 38.3) 虽然凝集反应非常简便快速, 但灵敏度不高, 反应约需要 10 7 CFU 但即便如此, 它的灵敏度也比传统的血凝或细胞凝集试验提高了 10 到 100 倍 用于细菌毒素分析的方法叫做方向被动胶乳凝集 (RPLA), 反应通常在酶标板内进行 LA 和 RPLA 的主要区别是前者检测的抗原 ( 细菌细胞 ) 是不溶性的, 而后者的抗原 ( 毒素 ) 是可溶性的, 所以二者的阳性结果判断是不一样的 食品分析中, 虽然用 LA 检测沙门氏菌属已得到了认可, 但检测前需要进行多步骤的增菌, 而且有时候悬浮的食品颗粒也会影响对凝集结果的判断 LA 主要用于对从食品中分离出的菌落进行快速血清学鉴定或确定, 而 RPLA 则多用于对食品萃取物中的毒素或纯培养菌株产生的毒素进行测定 ( 图 38.3) 图 38.3: 上图所示为胶乳凝集原理, 即通过特异性抗原抗体胶乳凝集原理, 即通过特异性抗原抗体胶乳的相互作用, 形成了凝集或凝块 2. 免疫扩散免疫扩散是另一种简便的检测食品中病原菌的抗体检测方法, 目前使用这种方法的商品化试剂只有沙门氏菌 1-2 检测方法, 它是 Ouchterlony 试剂的改进型 它不使用凝胶载体, 而是采用一个两舱 L 形的装置 ( 见图 38.4) 垂直舱 ( 活动舱 ) 内含有半固体琼脂, 舱的顶部接种有一种抗沙门氏菌鞭毛抗原的特异性抗体 水平舱 ( 接种舱 ) 含有选择性增菌培养基, 可以相等比例接种前增菌肉汤 如果有能运动的沙门氏菌存在, 它们就会在有选择性增菌培养基的水平舱中扩增, 然后移往活动舱中 当扩散的抗体接触到鞭毛抗原时, 就会形成一条肉眼可见的沉淀带 这种方法不能检测出不能运动的沙门氏菌 ( 图 38.4) 图 38.4: 上图所示为沙门氏菌 1-2 检测方法, 它采用免疫扩散法检测抗原抗体反应 3. 酶联免疫吸附试验 (ELISA) ELISA 是最早或许也是最普遍的用于检测食品中病原菌的抗体检测方法 商品化的 ELISA 试剂通常为 夹心法, 即用包被在固相载体上的抗体捕捉增菌培养基中的抗原 ( 细菌或毒素 ), 然后加入酶标记的另一抗体, 从而形成一个 抗体 - 抗原 - 酶标抗体 的 夹心 复合物 一般使用的是碱性磷酸酶或辣根过氧化酶 反应最后加入显色底物, 经酶解和 9
终止反应后, 可用肉眼或分光光度计 酶标仪判定结果 ( 见图 38.5) ELISA 最常使用的固相载体为微孔板, 但其它一些固相载体如试管 微孔滤膜等也在不同的 ELISA 中得以使用 ELISA 对细菌的检测灵敏度为 104 到 105CFU/ml, 对毒素或蛋白质为每毫升几纳克或更低, 所以在检测之前必须进行增菌培养或萃取 有些 ELISA 方法经过信号放大等改进后提高了灵敏度, 如检测肉毒梭菌毒素的 ELISA ELCA( 酶联凝集试验 ) 它通过凝集放大来检测结合后的毒素 抗体复合物 有些 ELISA 采用自动化的分析仪进行, 从而减少了手工操作的时间 这些商业化的全自动酶免分析仪多数仍采用 夹心法 原理 有些分析仪, 如酶联荧光试验 (ELFA), 经改进后使用荧光底物来增强敏感性 增菌后, 自动化分析系统可在 45 分钟内完成一次酶免分析, 而手工操作完成一次酶免分析则一般需要几个小时 表 38.4 列出了部分免疫试剂和自动化分析系统 ( 图 38.5) 表 38.4 部分检测食源性病原菌和毒素的商品化的抗体检测方法 病原菌 / 毒素 商品名 原理 制造商 腊样芽孢杆菌腹泻毒素 TECRA ELISA TECRA BCET RPLA unipath 弯曲菌属 Campyslide LA BD Meritec-campy LA Meridian MicroScreen LA Mercia VIDAS ELFA Biomerieux EiaFOSS ELISA Foss TECRA ELISA TECRA 肉毒梭菌毒素 ELCA ELISA Elcatech 产气荚膜梭菌肠毒素 PET RPLA Unipath EHEC O157 RIM O157&H7 LA REMEL E.coli O157 LA unipath Prolex LA PRO-LAB EcolexO157 LA Orion Diagnostica Wellcolex O157 LA Murex E.coli O157 LA TechLab O157&H7 Sera Difco PetrifilmHEC Ab-blot 3M WEZ COLI Tube-EIA Difco Dynabeads Ab-beads Dynal EHEC-TEK ELISA Organon-Teknika Assurance ELISA BioControl HECO157 ELISA 3M Canda TECRA ELISA TECRA E.coli O157 ELISA LMD Lab Premier O157 ELISA MERIDIAN E.coli O157 ELISA Binax E.coli Rapitest ELISA Microgen Transia card ELISA Transia 10
E.coli O157 EIA/capture TECRA VIP Ab-ppt BioControl Reveal Ab-ppt Neogen NOW Ab-ppt Binax Quix Rapid O157 Ab-ppt Universal Health Watch ImmunoCardSTAT Ab-ppt Meridian VIDAS ELFA BioMerieux EiaFOSS ELISA Foss 志贺毒素 (Stx) VEROTEST ELISA MicroCarb Premier EHEC ELISA Meridian Verotox-F RPLA Denka Seiken ETEC 不耐热毒素 (LT) VET-RPLA RPLA Oxiod 耐热毒素 (ST) E.coli ST ELISA Oxiod 李斯特菌属 Microscreen LA Microgen Listeria Latex LA Microgen Listeria-TEK ELISA Organon Teknika TECRA ELISA TECRA Assurance ELISA BioControl Transia Listeria ELISA Transia Pathalert ELISA Merck Listertest Ab-beads VICAM Dynabeads Ab-beads Dynal VIP Ab-ppt BioControl Clearview Ab-ppt Unipath RAPIDTEST Ab-ppt Unipath VIDAS ELFA BioMerieux EiaFOSS ELISA Foss UNIQUE Capture-EIA TECRA 沙门氏菌属 Bactigen LA Wampole Labs Spectate LA Rhone-Poulenc Microscreen LA Mercia Wellcolex LA Laboratoire Wellcome Serobact LA REMEL RAPIDTEST LA Unipath Dynabeads Ab-beads Dynal Screen Ab-beads VICAM CHECKPOINT Ab-blot KPL 1-2 Test Diffusion BioControl Salmonella TEK ELISA Organon Teknika TECRA ELISA TECRA EQUATE ELISA Binax 11
BacTrace ELISA KPL LOCATE ELISA Rhone-Poulenc Assurance ELISA BioControl Salmonella ELISA GEM Biomedical Transia ELISA Transia Bioline ELISA Bioline VIDAS ELFA BioMerieux OPUS ELISA TECRA PATH-STIK Ab-ppt LUMAC Reveal Ab-ppt Neogen Clearview Ab-ppt Unipath UNIQUE Capture-EIA TECRA 肠道沙门氏菌肠炎型 1-2 Test Diffusion BIOcONTROL 志贺菌属 Bactigen LA Wampole Labs Wellcolex LA Laboratoire Wellcome 金黄色葡萄球菌 Staphyloslide LA BD AureusTest LA Trisum Staph Latex LA Difco S. aureus VIA ELISA TECRA 肠毒素 SET-EIA ELISA Toxin Technology SET-RPLA RPLA Unipath TECRA ELISA TECRA Transia SE ELISA Transia RIDASCREEN ELISA R-Biopharm VIDAS ELFA BioMerieux OPUS ELISA TECRA 霍乱弧菌 CholeraSMART Ab-ppt New Horizon BengalSMART Ab-ppt New Horizon CholeraScreen Agglutination New Horizon BengalScreen Agglutination New Horizon 肠毒素 VET-RPLA RPLA Unipath 4. 免疫磁性分离除用于检测外, 食品分析中也可使用抗体来选择性的捕获细菌及缩短增菌培养的时间 在免疫磁性分离 (IMS) 技术中, 特异性抗体与磁性颗粒或微珠偶联后可用来捕捉前增菌培养基中的目标菌 IMS 的原理类似于选择性增菌培养, 即只允许目标菌生长, 而其它细菌的生长受到抑制 但两者的不同之处在于选择性增菌培养需要添加化学试剂或抗生素来选择病原菌, 而 IMS 采用抗体对细菌进行有选择地捕获 由于试剂本身带有一定的刺激性, 因此可能对细胞造成损害,IMS 对目标菌而言则较为温和 ; 同时, 选择性增菌步骤的减少也缩短了样品分析的时间 通过 IMS 纯化的细菌可以转种到选择培养基上进一步检测, 也可以通过血清学 基因学或其它方法进行鉴定 IMS 已经被用于李斯特菌属 O157:H7 血清型的 EHEC 沙门氏菌属以及其它来自于食品 环境和临床标本中的病原菌的选择 12
5. 免疫沉淀进年来免疫沉淀或免疫层析技术已开始用于食品中病原菌的检测 这些检测技术开始是针对临床诊断的需要而开发出来的, 并且已在家庭妊娠检测中得到了广泛应用 本质上这些技术的原理仍然是夹心抗体检测法, 所不同的是它们不使用酶标抗体, 而是采用标记有彩色胶乳颗粒或胶体金的抗体作为检测抗体 多数试验装置都包括一个一次性使用的小塑料盒 盒上有一个加样孔 一个检测孔和一个对照孔用来判定结果 增菌后, 将 0.1ml 的标本加入加样孔中, 几分钟后标本通过毛细作用到达检测孔和对照空中并得出结果 理论上, 这一装置是由一系列浸透了抗体的吸水垫按顺序组成, 加样孔中的胶乳标记抗体和检测孔中的捕捉抗体都是特异性针对目标抗原的 在对照孔中还有另外一种捕捉抗体, 但它不针对抗原, 而特异性针对检测抗体 所以, 在标本通过吸水垫时, 如标本中有对应抗原存在, 则首先与标记抗体发生反应 所形成的抗原抗体复合物再与检测孔中的捕捉抗体结合形成肉眼可见的沉淀带 过量的复合物扩散至对照孔时被第二个捕捉抗体拦截并形成另一条沉淀带 ( 如图 38.6) 对照孔的作用在于保证标本流过整个装置, 因此检测孔和对照孔均出现沉淀带表明阳性结果有效 免疫沉淀反应及其简单, 不需任何洗涤过程或特殊处理, 培养增菌后十分钟内就可完成检测 现在许多检测食源性病原菌的抗体检测方法都采用这一原理 ( 图 38.6) 图 38.6: 上图所示为免疫沉淀或免疫层析试验原理, 即标本通过毛细作用流过一系列含有特异性试剂的膜 局限性和影响 用于检测食品钟细菌病原体和毒素的快速检测方法的数目是相当客观的 但如前所述, 由于食物成分的多样性常常会干扰包括快速方法在内的微生物检测法, 所以食品分析依然面临着挑战 因此, 尽管快速检测法已经对食品检测产生了巨大的影响, 但它也同样存在着局限性 一 局限性 1. 增菌 多数快速检测方法一般再几分钟到几个小时内完成, 所以它们远比传统微生物检测方 法快捷 但在食品分析中, 由于食品检测本身的特殊性致使难以采用快速方法直接对食品 中的病原菌进行检测 所以常规的做法是, 检测前样品需先在增菌培养基中进行增菌培养 这种对培养的依赖延长了检测时间, 因而在某种程度上降低了快检方法的作用 增菌虽然从 形式上讲延长了检测时间, 但它对快检试剂还是具有重要的帮助作用的 比如可以降低抑制 剂的干扰作用 区分活细胞和死亡细胞以及修复受损细胞 2. 确认快速检测方法的优势在于快速筛查出食品中存在的某一特定病原菌活毒素 通过 AOAC 国际认证的快速检测方法大多用于初步筛查, 即可以确认阴性结果, 而阳性结果尚需通过标准的微生物检测方法予以确认 传统培养方法通常可以分离出肉眼可见的菌落, 与之不同的是快速检测方法需要通过细胞溶解活热变性的方法使待检测的抗原或目标物暴露出来 所以活的细胞只能通过培养技术对原始增菌培养基中的微生物进行重复分离来获得 虽然这样一来需要几天时间才能得到确认结果, 但由于食物标本检测结果以阴性为主, 只有少数的阳性结果需要进一步确认, 因此这点对快检方法并未构成明显的限制 13
3. 干扰对快速检测方法的评价显示某些检测方法在某些食品中的检测效果可能好于其它食品, 造成这种现象的主要原因是食品成分的干扰 比如, 某些蔬菜中的成分和内在的过氧化酶可能会引起使用过氧化酶的 ELISA 试剂的假阴性反应 样品检测过程中操作上的不规范 ( 如微孔板洗涤不充分 ), 会对 ELISA 结果造成影响, 这点在含有 高粘性 成分的食品中表现的尤为突出 通过干扰抗原抗体反应从而对以抗体微基础建立的试剂造成影响的食物中的某种成分不会影响以 DNA 为基础的检测, 同样抑制 DNA 杂交或 Taq 聚合酶的成分对抗体也并无影响 由于快速方法的检测效果对食品本身的依赖性较强, 所以需要开展一些对比实验来选择针对不同食品的有效检测方法 4. 基因表达以 DNA 为基础的检测方法具有高度特异性, 这种特异性常常取决于寡核苷酸 所以采用针对某种毒素基因特异的探针或 PCR 引物得到的阳性结果只表示带有这些基因序列的细菌的存在和潜在的产毒性, 但它并不表明一定有活的细胞存在 或基因已被表达 或已经产生了毒素 因为基因突变或生理因素可能致使携带了基因序列的细菌无法表达 同样, 梭菌或葡萄球菌引起的食物中毒是由于摄取了细菌产生的毒素所造成的,DNA 探针和 PCR 方法虽然可以用来检测细菌的存在, 但它们并不适合检测食物中已经产生的毒素 5. 单一目标设计几乎所有的快速检测方法都是为检测单一目标而设计的, 适合在质量控制过程中对食品进行筛查以发现有无目标检测物的存在 但在食品质量监督过程中, 对一种食品可能会同时进行多种病原菌检测 同样道理, 在食物中毒的调查中, 可以基于临床症状怀疑是某种病原菌引起的, 但实际上是哪种病原菌我们并不知道 在这种情况下, 就需要多种病原菌联检试剂, 否则使用几个单一目标检测试剂不仅会使检测程序变得复杂化, 而且也使成本提高 6. 检测方法的过滥目前, 至少有 30 种不同的商品化检测方法用于沙门氏菌属或 EHEC O157:H7 的检测 这么多的方法不仅给使用者在选择上带来了诸多不便, 也使得有关部门难以对这些检测方法进行有效地评估和认证 ( 以下章节将对此详细论述 ) 二 对管理的影响食品的微生物安全性是公共卫生首要考虑的问题, 食品行业和管理机构也已经采取了措 施对食品中病原菌和毒素的存在进行监控 目前许多在强制 监管和质控程序中使用的方法 都是非常耗时的微生物学方法, 加之食品标本中微生物检测的结果多为阴性, 因此有一个理 想的解决方案是采用快速检测方法对大量标本进行筛查以剔除阴性结果, 从而提高这些程序 的执行效果 在采用上述方案之前, 应对快速检测方法进行认真地评估及认证, 以确保其可 以有效地检测出食品中的病原菌 另一个需要考虑的问题是, 目前快速检测方法得出的阳性 结果被认为是初步结果, 需要进一步的确认, 而阴性结果通常会被接受而无需做进一步的确 认 这样可能出现的就是, 假阳性结果可以在后续的确认实验中得到纠正, 但假阴性结果却 可能未被发现, 除非同时使用了其它的检测方法 因其可能导致食源性细菌感染, 所以假阴 性结果是食品安全最为关注的问题 随着检测方法的不断改进, 其灵敏度也在相应提高 这对消费者来说是一个好消息, 但 同时更强的检测灵敏度也向食品行业和管理机构提出了更具吸引力的挑战 例如, 目前方便 14
食品对沙门氏菌的检测标准是 零检出或不存在 ; 同样, 食品中不允许存在微生物毒素, 因为食品中任何剂量此类毒素的存在都被视为食物品质受到破坏 但是, 由于不同检测方法的敏感性不同, 这类 零检出 的底限并不是固定不变的, 不存在 实际上也可能意味着 未能检查 以前由传统方法检测并符合 不存在 标准的食品, 如果采用了敏感性更强的方法来检测就可能不再符合同等规格的要求 检测方法灵敏度的提高可能使这种情况增加, 而实际上这种情况已经出现了, 例如传统方法不能检测出罐头食品中低剂量的细菌毒素的污染, 但快速检测方法却能检出 这种情况下, 为了顺应灵敏度更高的检测, 食品生产厂商是要更改加工设备还是去改进质控程序呢? 而所检出的低数目的病原菌贺低剂量的毒素对健康的威胁到底有多大? 有必要在每次引入敏感性更强的检测方法时都变更现行标准或规程吗? 既然方法知道方针, 那么随着检测方法敏感性的日渐提高, 无菌食品会成为极限吗? 快速检测方法的批准和认证 所有为检测食源性病原菌或毒素而研制的新的检测方法在常规用于食品检测之前都必须与标准化的微生物检测方法进行对比实验以确认其有效性 在美国, 用于检测临床标本的检测方法都需要经过美国食品药品管理局 (FDA) 的评价和批准 然而, 在食品检测中却没有类似的政府认证批准的要求 虽然 FDA 的食品安全和应用营养中心和美国农业部 (USDA) 食品安全检查机构 (FSIS) 等管理食品安全的联邦机构的确拥有评估食品检测方法的内在程序, 单对有关这类检测方法的认证却大多来自外部的独立机构 目前已有许多国内和国际组织可以对食品检测方法进行认证 在美国, 主要机构是 AOAC, 通过 AOAC 认证的方法一般都被视为是 权威或标准 的方法 国际标准化组织 (ISO) 和国际奶制品联盟是受理认证事物的知名机构, 联合国 Codex Alimentarius 承认上述所有机构的认证 一 FDA 的 BAM 和 USDA 的 MLG AOAC 出版的 FDA 细菌分析手册 (BAM) 从 1965 年起以活页文档的形式发行, 其 意图是在 FDA 的检测实验范围内将方法内部标准化 但 BAM 在食品分析中的名声和实用 性却由此快速传遍各地, 受到广泛认同 BAM 已经修订了八次, 现行的第八版出版于 1998 年, 共计 500 多页, 收录了 FDA 推荐的检测细菌性病原体 毒素和其它食品和化妆品中的 污染物的培养基和方法 BAM 中的很多方法都是 AOAC 已经认证了的方法, 同时也包括一 些已经过 FDA 研究人员复查评估 但尚未经过相关机构充分确认的方法 BAM 常被引用, 也已被国内外的食品行业所采用 它已被翻译成了多种文字, 其中包括中文和西班牙文 另外,USDA 的 FSIS 出版的 微生物学实验指导 (MLG) 也是一本检测方法的实用 手册, 主要用于 USDA 管理的肉 蛋 禽类制品的微生物检测 现行的 1998 年出版的 MLG 第三版收录了许多已经内部评估过的, 用于这类产品中微生物病原菌和其它污染物检测的方 法 BAM 和 MLG 都收录了一些其常规范围内的商业性检测法和有特殊用途的方法, 但它 们均明确表示不承认这些检测的保证或官方认证 二 AOAC 国际认证项目美国国内普遍承认的这些检测方法的认证项目是 AOAC 国际认证 它目前有三个认证 项目 : 协作研究和同等核查项目由 AOAC 国际认证机构管理 ; 试剂盒性能检测项目由 AOAC 的分支机构 AOAC 研究所管理 多年以来,AOAC 一直仅采用协作研究来对用于检测食品的微生物和化学检测方法进 15
行认证 这是一项严格 多步骤的过程, 首先是严格的测试, 以决定参数的最小变化对试验效果的影响 ; 其次是先期协作研究, 以建立检测方法在多种食品或经选择的食品中应用的可能性 ; 最后是一个协作研究, 即通过 15 个相关实验室采用标准化方法进行对比实验, 使用的多种食品标本中已经分别接种了三种不同浓度 ( 即未接种 低浓度和高浓度 ) 的特定病原菌 每个标本需检测五次, 以便对每种方法都可形成 1000 多个数据点 这个过程由一个助理仲裁人管理, 并受一个总仲裁人 一个方法管理委员会和有权对实验设计和操作规程进行评审批准并对最终结果复查的统计和安全顾问委员会的密切监督 在 AOAC 方法委员会批准之前, 应将已经通过了详细审查的方法作为初次运用方法提交 经科学机构使用三年, 如果这些方法没有大的问题 或有问题但能在总仲裁人和方法管理委员会检查之前妥善解决, 那么这些方法就可被表决确定其最终地位 只有通过了协作研究过程的方法才被认为是标准化的检测方法, 这些方法可以被列入 AOAC 国际认证官方分析方法 中 AOAC 的同等核查项目建立于 1993 年, 与协同研究项目相比, 该项认证较为宽松 由于有些实验分析人员或试剂开发人员希望能对一种新的检测方法进行快速评估或对一种已通过认证的方法进行修改以扩大其应用范围或提高性能, 因此该认证的设立就是为了满足上述要求 该项程序要求分析人员提供实验运行数据, 撰写一份送交 AOAC 审查批准的实验草案, 然后再选择一个独立的实验室重复实验操作程序 AOAC 技术仲裁机构会在其所挑选的技术人员对两组实验数据复查后, 决定是否批准该方法 虽然这一程序简单得多, 但通过其认证的方法并不能被看作是官方的或标准的检测方法 试剂盒性能检测项目由 AOAC 研究所 (AOAC RI) 管理 AOAC RI 始建于 1992 年, 是 AOAC 的一个分支机构, 主要对已经出品的试剂盒的性能进行第三方复查 所以它唯一的目的就是批准商业化的快速检测试剂 在这一过程中, 生产商向 AOAC RI 提交试剂盒性能声明和支持这些性能的实验数据 AOAC RI 聘请的两位专家会对提交的材料进行复查, 看这些性能是否可由实验数据证明 如果是的话, 复查人员将起草一份报告并在一个独立的实验室里进行附加的性能测试 如果新的实验数据与厂商提供的数据一致, 则试剂盒会被授予通过性能检测的认证 与同等核查认证一样, 该认证同样不能被看做是官方的或标准的检测方法 由于在执行上 AOAC RI 的性能检测认证常常与 AOAC 的协作研究认证相混淆, 加之两项认证间也存在着相互竞争 所以 AOAC 最近修改了认证过程, 将性能检测认证合并到了协作研究认证中, 以便所有具有专有技术的试剂盒必须首先提交 AOAC RI 认证 一旦通过了性能检测, 则试剂盒可保留此认证 ; 但如果厂商希望获得官方认证, 则性能检测认证可等同于先期协作研究, 使其可直接进入官方认证程序的协作研究阶段 表 38.1 到 38.4 中已列出了获得 AOAC 官方初步认证和最终认证的方法 但由于这些方法在不断的修正, 所示信息可能不完全准确 未来的发展 技术专家们在 1981 年的特尔斐预测中对食品检测的预言都已变成了现实, 并且新一代的技术专家们正将它们实际用于食品检测中 有些技术如生物传感器和 DNA 芯片 (chips), 在开发具有极高灵敏度的多种类型的检测试剂方面有着巨大的应用潜力 一 免疫传感器或生物传感器生物传感器最早出现在 20 世纪 70 年代, 含有一个生物或生物样感应成分, 如抗体 酶 或受体配对成分 这类生物样成分被结合到一个理想化传感器上, 传感器可以将不同的生物 信号, 如光信号 电化学信号 热信号等转换成可测量的数码电子读数 临床应用上,80 16
年代就出现了简洁小巧的用于检测糖尿病人体内葡萄糖水平的生物传感器 生物传感器在食品检测中的应用也已经从实验阶段进入了发展阶段 一种把抗体与结晶体结合在一起的免疫传感器可以从培养液中快速检测出 10 6 /ml 的大肠杆菌 其它传感器也有相似的灵敏度, 有些甚至可检测出 10 4 /ml 的沙门氏菌 遗憾的是由于食物成分的干扰作用, 这些传感器的灵敏度在检测食品时会大大降低 但如果把生物传感器与 IMS 捕捉法结合在一起, 检测敏感性就可提高 一个 IMS 电化学发光生物传感器可在一小时内检测出培养液中 10 2 到 10 3 CFU/ml 的大肠杆菌 O157 或肠道沙门氏菌和接种在牛奶 果汁 地表水以及各种牛肉 鸡肉和鱼的悬液中 浓度为 2 10 2 CFU/ml 的这类病原菌 其它一些类型的生物传感器, 包括基于挥发性有机成分, 通过散发来检测和区分产品或污染物的电子鼻 ; 及根据所结合的特定分析物的不同而改变颜色的人造膜 有一种感应膜由已经与多种细菌毒素的神经节苷脂受体结合起来的聚乙炔酸聚合物组成 膜本身呈一种特定的蓝色, 当有毒素结合时会变为红色 这一反应快色特异, 颜色的改变可通过分光光度计定量测定 生物传感器技术在食品检测中的潜在应用能力呈现几种诱人的特征 这些系统多数是袖珍型的, 所以可用于现场检测 而且它们中多数属于快速检测, 可在一个小时内完成测试, 并且能够同时对多种测试物进行检测 然而, 标本的缺乏 标本准备技术的不足和食物成分的干扰作用阻碍了这些检测在食品分析中的应用 如果这些问题可以解决, 生物传感器在检测食品中的病原菌时, 可发挥近乎实时检测的作用, 并且有可能对食品加工实施网上监控 二 DNA 芯片伴随 DNA 芯片技术的发展, 在 DNA 探针检测中使用的互补杂交的基础概念正在经历着复兴的过程 另外还有使用平板照相术的基因芯片, 它是由电脑芯片制造商们开发的将小型集成电路嵌入硅片中并适当的嵌入 DNA 寡核苷酸的一种技术 基因芯片可以在玻璃或尼龙薄膜上制作, 带有两个基本的变异体 一种是目标 DNA 经 PCR 放大后以斑点状附着在一片薄膜上, 然后由单个或数百个标记过的探针与之进行特异性杂交 另一种是一组排列的寡核苷酸或直接在一玻璃芯片上合成, 或是合成之后嵌入上去, 然后曝光给标记的目标 DNA 基因芯片中常用的是荧光标记, 但有些系统在分辨背景信号和弱的荧光信号时会出现问题, 所以, 用于取代荧光信号检测特异性杂交的电子信号正在开发之中 有些基因芯片上可以带有多达 40 万个或更多的不同检测斑点, 它就像一个小型化的分子生物学实验室可以同时对数千个目标或分析物进行检测 芯片分析可以用于研究基因表达 基因突变或其多样性以及基因测序和绘图 它们在诊断学上潜在的应用优势在于它们不仅可以进行多种病原菌检测, 而且可以对每个被检测的病原菌的毒力基因进行测定, 以提供病原菌的毒力图谱 通过将 rrna 特异性寡核苷酸固定在玻璃片上的聚丙烯酰胺凝胶垫上所开发出的一种基因芯片可以对土壤中的硝化细菌进行检测 用荧光素异硫氰酸盐标记目标 DNA 或 RNA, 通过荧光反应检测特异性杂交反应 采用多色检测系统可以将这种方法进行修改使其能用来计算个体数目 虽然芯片技术有着巨大的潜能, 但目前真正开发出来的产品却很少, 尚未有用于检测食源性病原菌的产品 究其原因, 除了食品检测本身固有的问题外, 另一个阻碍其应用的因素可能是在设计 DNA 芯片时所涉及到的基因专利 专有技术或许可证使用等方面的问题 总结 从传统意义上讲, 检测食源性病原菌的方法主要依赖于培养基对存活的细胞进行选择 分离和传代 虽然这种方法很有效, 但却耗时耗力, 完成一次检测通常需要几天时间 伴随 17
生物技术的进步, 在食品检测领域里也出现了许多比传统方法更加快捷 敏感性更强的新技术, 这些方法统称为快速检测方法 快速检测方法的范围非常广泛, 包括小型化的生化检测试剂 特殊培养基和底物 以及以 DNA 和抗体技术建立起来的检测方法 为了加快检测速度, 多数检测都针对单一目标, 所以它们很适合对大量食品标本进行初步筛选以确定一种特定病原菌是否存在 但由于这些检测方法较易受正常菌群和食品基质复杂性的影响, 所以在用于常规检测之前, 对它们的性能要进行全面评估, 看其是否经过对比实验或官方认证, 这点是十分必要的 一般来讲, 快速检测方法比传统微生物检测方法更加敏感, 但敏感性的增加也给食品行业和管理机构带来了新的挑战 科技的进步是日新月异的, 目前正在研究开发的新一代的检测方法有可能实现对多种病原菌进行实时和在线监控 作者简介 :Peter Feng,PhD 美国食品药品管理局 (FDA) 微生物专家 18