健 康 食 品 之 護 肝 保 健 功 效 評 估 方 法 89 年 7 月 31 日 衛 署 食 字 第 0890003826 號 公 告 92 年 8 月 29 日 衛 署 食 字 第 0920401629 號 公 告 修 正 105 年 4 月 25 日 衛 署 食 字 第 1031304063 號 公 告 修 正 肝 臟 是 人 體 最 大 的 器 官, 也 是 機 能 最 複 雜 的 代 謝 器 官 肝 臟 在 醣 類 脂 質 蛋 白 質 維 生 素 激 素 膽 汁 等 物 質 代 謝 中 扮 演 重 要 作 用 ; 除 此 之 外, 肝 臟 還 有 分 泌 排 泄 生 物 轉 化 等 方 面 的 功 能 肝 細 胞 含 有 豐 富 的 胜 肽, 並 合 成 許 多 胜 肽 和 某 些 凝 血 因 子, 儲 存 和 釋 放 造 血 因 子, 參 與 血 液 凝 固 和 造 血 過 程 肝 臟 有 解 毒 功 能, 對 動 物 有 重 要 保 護 作 用 當 肝 功 能 損 傷 時 會 造 成 代 謝 障 礙, 並 影 響 其 他 臟 器 的 功 能, 嚴 重 則 危 及 生 命 肝 臟 具 有 肝 動 脈 和 門 靜 脈 的 雙 重 血 液 供 應, 並 擁 有 大 量 血 竇, 肝 細 胞 膜 能 直 接 與 血 液 接 觸, 同 時 肝 細 胞 膜 的 通 透 性 又 較 大, 故 肝 細 胞 與 血 液 進 行 活 躍 有 效 的 物 質 交 換 很 多 有 毒 物 質 易 引 起 肝 細 胞 損 傷, 肝 臟 具 有 強 大 再 生 和 代 償 能 力, 對 輕 度 或 局 限 性 損 傷 往 往 不 致 造 成 肝 功 能 障 礙 肝 臟 對 各 種 致 病 因 子 的 反 應 方 式, 主 要 是 肝 實 質 細 胞 和 星 狀 細 胞 增 生 與 肝 實 質 細 胞 的 變 性 和 壞 死, 以 及 肝 間 質 的 滲 出 和 增 生 當 肝 細 胞 壞 死, 而 剩 餘 肝 細 胞 再 生 的 情 況 下, 則 發 生 纖 維 增 生 導 致 肝 硬 化 在 肝 硬 化 時 使 靜 脈 血 流 受 阻, 導 致 肝 靜 脈 與 門 靜 脈 壓 上 升, 促 進 肝 內 動 靜 脈 吻 合 支 (arteriovenous anastomosis) 的 形 成, 致 使 肝 細 胞 供 血 減 少, 進 而 發 生 變 性 或 壞 死 纖 維 增 生, 形 成 惡 性 循 環, 肝 硬 化 更 加 嚴 重, 甚 至 變 成 肝 癌 當 肝 嚴 重 損 傷, 且 代 償 能 力 顯 著 減 弱 時, 則 出 現 嚴 重 肝 功 能 障 礙 稱 肝 功 能 不 全, 進 一 步 發 展 則 肝 功 能 衰 竭, 引 起 中 樞 神 經 系 統 功 能 障 礙, 出 現 肝 昏 迷 導 致 肝 功 能 異 常 的 可 能 原 因 包 括 病 毒 酒 精 自 體 免 疫 遺 傳 肝 膽 腫 瘤 或 感 染 藥 物 等 常 見 的 肝 臟 疾 病 類 型 為 脂 肪 肝 (fatty liver) 肝 炎 肝 硬 化 (liver cirrhosis) 及 肝 癌, 嚴 重 者 可 危 及 生 命 根 據 衛 生 福 利 部 資 料 統 計, 肝 癌 是 全 球 第 三 大 致 死 癌 症, 在 台 灣 近 五 年 來 則 是 徘 徊 在 第 一 二 大 之 致 死 癌 症 75-90% 肝 癌 的 發 生 與 慢 性 肝 病 如 肝 硬 化 病 毒 性 肝 炎 及 脂 肪 肝 等 有 極 大 之 關 聯 性 根 據 2005 年 Bataller 和 Brenner 在 臨 床 調 查 期 刊 (Journal of Clinical Investigation) 發 表 之 文 1
獻 回 顧 中 提 及 肝 纖 維 化 (liver fibrosis) 源 自 於 慢 性 肝 損 傷 的 結 果, 且 伴 隨 著 細 胞 外 基 質 (extracellular matrix, ECM) 的 堆 積, 而 ECM 堆 積 為 許 多 不 同 類 型 肝 病 的 共 同 特 徵 在 工 業 化 的 國 家, 引 起 肝 纖 維 化 的 原 因 主 要 有 慢 性 C 型 肝 炎 病 毒 (hepatitis C virus, HCV) 感 染 酗 酒 及 非 酒 精 性 脂 肪 肝 ECM 堆 積 形 成 的 纖 維 傷 疤 造 成 肝 臟 結 構 的 異 常, 而 其 後 肝 細 胞 再 生 衍 生 小 結 節, 即 定 義 為 肝 硬 化 肝 硬 化 因 引 發 肝 細 胞 的 機 能 障 礙 與 肝 臟 組 織 對 血 流 的 抗 阻 而 造 成 肝 功 能 不 全 與 肝 門 脈 高 血 壓 由 於 肝 實 質 組 織 在 崩 解 萎 縮 後, 被 富 含 膠 原 纖 維 組 織 取 代, 所 以 在 組 織 學 上, 肝 纖 維 化 過 去 被 認 為 是 一 種 被 動 而 不 可 逆 的 過 程, 目 前 則 以 損 傷 與 癒 合 模 式 看 待 因 慢 性 肝 損 傷 造 成 的 肝 纖 維 化 早 在 1970 年 代 即 有 臨 床 報 告 指 出 末 期 肝 纖 維 化 具 有 可 逆 的 潛 力 然 而, 直 到 1980 年 代 肝 星 狀 細 胞 (hepatic stellate cell, HSC) 被 發 現 是 肝 臟 中 主 要 產 生 膠 原 纖 維 的 細 胞 後, 肝 纖 維 化 方 才 逐 漸 受 到 關 注 肝 星 狀 細 胞 被 稱 為 肝 脂 肪 細 胞 肝 竇 邊 細 胞 或 Ito 細 胞, 在 慢 性 肝 病 期 間 會 被 活 化 而 獲 得 產 生 纖 維 的 能 力 根 據 台 灣 肝 病 防 治 學 術 基 金 會 調 查 發 現 脂 肪 肝 已 是 台 灣 國 人 普 遍 的 肝 臟 問 題, 罹 患 比 率 高 達 40%, 是 國 人 嚴 重 的 健 康 問 題 脂 肪 肝 的 定 義 為 肝 細 胞 中 脂 肪 含 量 高 於 5%, 以 往 需 應 用 肝 臟 的 切 片 診 斷, 因 而 不 易 發 覺, 近 年 來 由 於 腹 部 超 音 波 為 非 侵 入 性 檢 查, 加 上 以 超 音 波 診 斷 脂 肪 肝 的 準 確 度 高 而 逐 漸 普 及, 現 今 已 有 以 腹 部 超 音 波 診 斷 取 代 肝 臟 切 片 之 趨 勢 臨 床 統 計, 國 人 脂 肪 肝 的 盛 行 率 約 在 21~25% 之 間, 遠 高 於 B 型 肝 炎 的 15 ~ 20% 及 C 型 肝 炎 之 2 ~ 4%, 現 今 已 知 造 成 脂 肪 肝 的 可 能 原 因 包 括 肥 胖 高 三 酸 甘 油 酯 血 症 血 糖 代 謝 異 常 ( 如 糖 尿 病 ) 飲 酒 C 型 肝 炎 及 藥 物 所 導 致 等 六 大 因 素, 前 三 者 皆 與 肥 胖 有 關, 後 三 者 則 屬 於 酒 精 性 病 毒 性 及 化 學 藥 品 所 引 發 的 脂 肪 肝 有 76.3% 體 重 過 重 者 患 有 脂 肪 肝, 且 其 嚴 重 程 度 與 肥 胖 息 息 相 關, 所 有 重 度 脂 肪 肝 的 患 者, 體 重 都 過 重, 中 度 脂 肪 肝 患 者 則 有 近 八 成 體 重 過 重 此 外, 脂 肪 肝 罹 患 率 亦 和 飲 酒 頻 率 具 顯 著 相 關 性 脂 肪 肝 雖 然 不 會 對 生 命 造 成 立 即 危 害, 不 過 卻 是 健 康 的 一 個 重 要 警 訊, 酗 酒 肥 胖 及 高 血 脂 等 都 是 造 成 脂 肪 肝 的 危 險 因 子, 若 未 及 時 改 善 或 治 療, 可 能 進 而 造 成 肝 硬 化 肝 癌 或 引 發 心 臟 或 腦 血 管 等 併 發 症 2
脂 肪 肝, 顧 名 思 義 就 是 肝 臟 有 過 多 的 脂 肪 堆 積 正 常 的 肝 臟 中, 脂 質 所 佔 重 量 應 低 於 肝 臟 總 重 量 之 5%, 可 能 的 機 制 包 括 肝 細 胞 合 成 過 多 的 脂 肪 酸 或 血 液 中 的 脂 肪 酸 運 送 至 肝 臟, 肝 細 胞 無 法 代 謝 三 酸 甘 油 酯 以 及 過 多 醣 類 運 送 至 肝 臟 被 大 量 轉 成 三 酸 甘 油 酯 儲 存 等 而 堆 積 過 多 脂 肪 酸 在 超 音 波 下 常 呈 現 白 亮 的 影 像, 很 容 易 和 正 常 的 肝 臟 或 肝 臟 旁 邊 的 腎 臟 對 比 而 區 分 出 來, 除 超 音 波 外, 電 腦 斷 層 (CT) 也 很 容 易 因 肝 臟 顯 像 度 降 低 而 被 診 斷 出 來 脂 肪 肝 屬 於 慢 性 肝 病, 只 要 針 對 原 因 加 以 控 制 與 治 療, 便 可 使 傷 害 降 到 最 低 或 完 全 痊 癒 肥 胖 而 且 有 脂 肪 肝 的 患 者 若 成 功 予 以 減 肥, 以 超 音 波 掃 描 可 見 其 脂 肪 肝 之 嚴 重 度 明 顯 減 輕, 甚 至 連 aspartate aminotransferase/alanine amino- transferase(ast/alt) 值 也 降 至 正 常 範 圍 內 而 糖 尿 病 與 高 三 酸 甘 油 酯 血 症 之 血 糖 與 血 脂 控 制 亦 能 使 患 者 之 脂 肪 肝 減 輕 酒 精 性 脂 肪 肝 (alcoholic fatty liver disease, AFLD) 則 需 控 制 飲 酒 及 攝 取 均 衡 飲 食 以 減 緩 之 不 同 的 病 因 會 使 肝 臟 發 生 不 同 程 度 的 病 變 或 損 傷, 影 響 的 性 質 與 程 度 也 可 能 有 所 不 同 本 評 估 方 法 列 舉 5 項 不 同 ( 四 氯 化 碳 乙 醯 胺 基 苯 酚 硫 代 乙 醯 胺 酒 精 液 態 飼 料 高 脂 飼 料 ) 誘 導 肝 臟 產 生 病 變 的 動 物 試 驗 模 式, 若 有 食 品 能 減 少 該 病 變 危 害 風 險, 宣 稱 其 功 效 時 需 同 時 註 明 其 誘 導 方 法 與 病 變 型 態, 以 區 別 其 差 異 性 壹 針 對 四 氯 化 碳 誘 導 化 學 性 肝 損 傷 一 前 言 本 評 估 方 法 主 要 是 以 四 氯 化 碳 (CCl 4 ) 誘 導 大 鼠 慢 性 肝 損 傷 的 實 驗 模 式, 探 討 不 同 試 驗 樣 品 之 處 理 對 於 大 鼠 慢 性 肝 損 傷 之 影 響 四 氯 化 碳 誘 導 肝 損 傷 之 原 理, 主 要 是 因 四 氯 化 碳 受 肝 微 粒 酵 素 活 化 成 三 氯 甲 烷 自 由 基, 然 後 與 蛋 白 質 結 合 導 致 蛋 白 質 合 成 受 阻, 並 引 起 脂 質 分 解 代 謝 失 調, 造 成 肝 細 胞 內 三 酸 甘 油 酯 蓄 積, 另 外 三 氯 甲 烷 自 由 基 形 成 過 氧 化 物, 導 致 脂 質 過 氧 化 而 使 得 肝 細 胞 膜 損 傷, 造 成 肝 中 酵 素 滲 出 及 細 胞 病 變 而 壞 死 二 實 驗 項 目 與 實 驗 方 法 ( 一 ) 執 行 單 位 與 執 行 人 : 3
本 評 估 試 驗 原 則 上 應 委 託 具 有 充 分 設 備 之 國 內 外 大 學 食 品 營 養 醫 藥 等 相 關 研 究 所 教 學 醫 院 以 上 之 醫 療 機 構 或 具 公 信 力 之 研 究 機 構 執 行, 以 維 持 客 觀 與 可 靠 性 試 驗 計 畫 主 持 人 必 須 具 備 足 夠 與 肝 臟 生 理 代 謝 相 關 之 專 業 背 景 與 研 究 經 驗 或 著 作 ; 試 驗 必 須 事 先 經 過 執 行 單 位 之 動 物 試 驗 委 員 會 審 查 通 過 ( 二 ) 實 驗 設 計 : 建 議 實 驗 動 物 採 用 雄 性 SD 或 Wistar 大 鼠, 起 始 體 重 約 250 克, 每 組 至 少 8 隻 動 物 必 須 來 自 公 立 研 究 機 構 公 私 立 大 學 或 其 他 中 央 衛 生 主 管 機 關 認 可 之 實 驗 動 物 中 心 動 物 之 飼 養 宜 在 恆 溫 (22 ± 2 ) 亮 暗 各 12 小 時 之 動 物 房 飼 養 或 處 理 時 應 避 免 動 物 驚 嚇, 且 每 次 必 須 前 後 一 致, 避 免 誤 差 值 過 大 本 評 估 試 驗 之 實 驗 組 別 應 包 括 1. 正 常 對 照 組 : 攝 取 正 常 飲 食 ;2. 負 控 制 組 : 動 物 給 予 CCl 4 處 理, 攝 取 正 常 飲 食 ;3. 試 驗 組 : 動 物 給 予 與 負 控 制 組 完 全 相 同 之 CCl 4 處 理, 並 分 別 另 給 予 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品, 其 中 一 組 的 劑 量 必 須 相 當 於 人 體 的 建 議 攝 取 量, 且 於 CCl 4 誘 導 肝 損 傷 前 一 星 期 即 開 始 給 予 試 驗 樣 品 試 驗 原 始 數 據 紀 錄 必 須 保 留 供 查 核 1. 試 驗 方 法 : 本 評 估 方 法 係 採 Lin 等 人 (1993) 之 以 CCl 4 誘 導 大 鼠 產 生 慢 性 肝 損 傷 的 實 驗 模 式, 本 方 法 中 之 CCl 4 使 用 劑 量 僅 供 參 考 實 驗 前 將 大 鼠 依 體 重 以 逢 機 法 平 均 分 配 至 各 組, 動 物 至 少 分 成 4 組, 每 組 至 少 8 隻 : (1) A 組 為 正 常 對 照 組 : 於 腹 腔 (intraperitoneal, I.P.) 注 射 或 經 口 (peroral, per os, P.O.) 管 餵 橄 欖 油 或 玉 米 油 + 去 離 子 水 (P.O.); (2) B 組 為 負 控 制 組 ( 肝 損 傷 組 ): 以 I.P. 注 射 (40% CCl 4 / 橄 欖 油 或 玉 米 油 ) 或 經 口 管 餵 (20% CCl 4 / 橄 欖 油 或 玉 米 油 )+ 去 離 子 水 (P.O.), 劑 量 如 試 驗 步 驟 所 建 議 ; (3) 試 驗 組 至 少 2 組 (C D 組 ), 視 實 驗 設 計 需 要 可 再 增 加 組 別 : I.P. 注 射 (40% CCl 4 / 橄 欖 油 或 玉 米 油 ) 或 P.O. 灌 食 (20% CCl 4 / 橄 欖 油 或 玉 米 油 ) + 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品 (P.O.), 其 中 之 一 劑 量 須 與 換 算 的 人 類 建 4
議 攝 取 量 相 同 2. 試 驗 步 驟 : A 組 腹 腔 注 射 橄 欖 油 或 玉 米 油 (0.1 ml/100 g bw) 或 管 餵 橄 欖 油 或 玉 米 油 (0.5 ml/rat);b~d 組 腹 腔 注 射 40% CCl 4 / 橄 欖 油 或 玉 米 油 (0.1 ml/100 g bw) 或 管 餵 20% CCl 4 / 橄 欖 油 或 玉 米 油 (0.5 ml/rat), 每 週 2 次 ( 相 隔 3-4 天 ), 於 肝 炎 誘 導 1 小 時 後 管 餵 試 驗 樣 品, 以 減 少 藥 物 與 樣 品 互 相 影 響 A B 組 每 日 管 餵 去 離 子 水,C D 組 則 於 CCl 4 誘 導 肝 損 傷 前 1 星 期 開 始 每 日 給 予 試 驗 樣 品 ( 前 後 共 為 期 9 週 ) 所 有 實 驗 動 物 分 別 於 CCl 4 誘 導 肝 損 傷 開 始 的 前 1 週 第 0 週 第 1 3 及 6 週 進 行 採 血, 採 血 前 8~12 小 時 禁 食, 並 於 投 予 試 驗 樣 品 或 去 離 子 水 後 4 小 時, 以 尾 部 採 血 方 式 檢 測 肝 臟 的 生 化 功 能 :AST (GOT) ALT (GPT) 三 酸 甘 油 酯 (TG) 膽 固 醇 白 蛋 白 最 後 於 CCl 4 誘 導 肝 損 傷 第 8 週 結 束 時, 秤 重 後 全 部 犧 牲, 可 從 頸 動 脈 心 臟 或 腹 大 動 脈 採 血 檢 驗 肝 臟 生 化 功 能, 並 剖 腹 取 肝 臟 標 本, 秤 重 後 從 最 大 右 葉 肝 割 取 2-3 塊 l 公 分 見 方 之 組 織 塊, 固 定 於 10% 的 中 性 福 馬 林 (formalin) 液 中, 再 以 石 蠟 包 埋 切 片 貼 附 在 載 玻 片 上 後, 分 別 進 行 蘇 木 紫 - 伊 紅 染 色 (haematoxylin-eosin stain, H&E stain) 膠 原 蛋 白 的 特 殊 染 色, 如 Masson's trichrome 染 色 或 其 他 適 合 之 染 色 方 法 染 色, 以 進 行 病 理 學 觀 察 另 外 將 其 餘 肝 臟 進 行 抗 氧 化 成 分 GSH, 以 及 GPx GRd SOD catalase 等 酵 素 活 性 之 檢 測 3. 實 驗 動 物 與 人 體 間 試 驗 劑 量 之 換 算 : 以 管 灌 (gavage feeding) 方 式 給 予 受 試 樣 品 時, 一 般 的 認 知, 身 體 的 新 陳 代 謝 速 率 與 其 體 表 面 積 的 相 關 性, 明 顯 超 過 與 其 體 重 之 相 關 性 然 而, 要 精 確 測 量 其 體 表 乃 非 常 不 易, 而 即 使 在 同 一 物 種 (species) 內 之 體 表, 其 與 體 重 間 並 沒 有 一 簡 單 正 確 的 公 式 可 換 算, 且 其 關 係 又 會 隨 著 體 重 和 體 型 的 改 變 而 與 體 表 之 關 係 係 數 呈 現 不 規 則 的 變 異, 因 此 在 實 驗 期 間 之 試 驗 劑 量 要 維 持 與 其 代 謝 率 之 固 定 相 關 性 ; 或 人 體 與 動 物 間 之 試 驗 劑 量 要 精 確 的 換 算 有 其 實 際 的 困 難 5
本 評 估 方 法 的 人 體 與 高 等 實 驗 動 物 間 試 驗 劑 量 間 之 換 算, 原 則 上 根 據 2005 年 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 所 公 告 之 實 驗 初 期 估 算 方 法 (Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers), 而 以 60 公 斤 之 成 人 為 基 準 使 用 高 等 實 驗 動 物 進 行 試 驗 時, 其 劑 量 之 換 算 原 則 上 以 人 體 每 日 每 公 斤 體 重 之 建 議 攝 取 量 (/kg bw/d) 的 6.2 倍 作 為 大 鼠 之 1 倍 劑 量, 其 他 動 物 或 更 詳 細 的 換 算 可 參 閱 該 方 法 http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/g uidances/ucm078932.pdf 另 換 算 之 本 換 算 方 法 適 用 於 根 據 每 天 每 隻 動 物 之 個 別 體 重 變 異 而 換 算 出 應 給 予 直 接 管 灌 之 試 驗 樣 品 劑 量 此 劑 量 換 算 方 法 提 供 業 界 參 考, 非 強 制 性 依 據, 但 使 用 其 他 換 算 方 法 時, 應 附 其 明 確 之 資 料 來 源 ( 三 ) 實 驗 測 定 項 目 : 在 進 行 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 之 分 析 方 面 : 測 定 時, 可 參 考 以 下 建 議 之 方 法, 亦 得 使 用 有 學 理 根 據 之 適 當 方 法 或 具 公 信 之 市 售 套 組 進 行 分 析 1. 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 (1)AST (GOT) (2)ALT (GPT) (3)TG (4) 膽 固 醇 (5) 白 蛋 白 2. 肝 臟 : 測 定 各 種 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 (1)Glutathione (GSH) (2)Glutathione peroxidase (GPx) (3)Glutathione reductase (GRd) (4)Superoxide dismutase (SOD) (5)Catalase (CAT) (6)TG 6
(7) 膽 固 醇 ( 四 ) 肝 功 能 生 化 指 數 的 檢 測 : 所 採 之 大 鼠 血 液 樣 品 在 室 溫 下 放 置 約 1 小 時, 使 其 凝 結, 再 利 用 冷 凍 離 心 機 於 4 下 以 14,000 g 離 心 5 分 鐘, 分 離 出 血 清 再 以 血 液 自 動 生 化 分 析 儀 檢 測 肝 功 能 生 化 指 數, 包 括 AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 cholesterol 等, 其 中 AST (GOT) 及 ALT (GPT) 檢 測 原 理 是 依 據 Reitman 與 Frankel(1957) 及 國 際 聯 邦 臨 床 化 學 (IFCC, 1986) 的 標 準 方 法 並 進 行 肝 臟 抗 氧 化 功 能 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 之 分 析 如 下 另 必 須 測 定 肝 臟 TG 膽 固 醇 肝 重 / 體 重 (%) 等 肝 臟 脂 肪 堆 積 指 標 1. 麩 胱 甘 肽 (glutathione, GSH) 濃 度 之 分 析 參 考 Reed 等 人 (1980) 的 方 法 取 肝 組 織 約 0.3 克, 加 入 9 倍 (v/w) 的 50 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 均 質 1 分 鐘, 得 肝 組 織 均 質 液 樣 品 肝 組 織 均 質 後, 迅 速 取 均 質 液 400 L 加 入 等 量 10% 過 氯 酸 (perchloric acid, PCA) 混 合 後, 靜 置 40 分 鐘, 使 PCA 能 將 樣 品 中 還 原 態 麩 胱 甘 肽 (GSH) 充 分 溶 出 後, 於 4 下, 以 1,800 g 離 心 3 分 鐘, 取 上 層 液 待 測 至 於 沉 澱 部 分 則 加 入 1 ml 1N NaOH 溶 解, 再 移 液 至 微 量 離 心 管 中 以 分 析 蛋 白 質 另 取 8.5 mg 之 還 原 態 麩 胱 甘 肽 及 7.2 mg 之 氧 化 態 麩 胱 甘 肽 所 製 備 好 的 標 準 品 與 上 述 所 得 之 樣 品 各 400 L, 加 入 40 L 碘 乙 酸 (iodoacetic acid, IAA: 100 mm), 使 還 原 態 麩 胱 甘 肽 與 IAA 結 合 後, 給 予 還 原 態 麩 胱 甘 肽 多 攜 帶 一 負 電 荷, 以 便 在 高 效 能 液 相 層 析 儀 (HPLC) 分 析 中 能 比 GSSG 早 分 離 出 來 ; 再 緩 慢 加 入 碳 酸 氫 鉀 (KHCO 3 ) 直 到 不 再 起 泡 為 止, 此 時 已 中 和 酸 而 成 微 鹼 性, 以 便 可 在 HPLC 中 分 析 然 後 置 於 暗 處 15 分 鐘 後, 再 加 入 440 L 3% 2,4- 二 硝 基 氟 苯 (2,4-dinitrofluorobenzene, FDNB) 振 盪 混 合 使 與 硫 元 素 反 應 成 黃 色 物 質, 而 此 黃 色 物 質 可 在 紫 外 光 偵 測 器 (UV detector, λ=365 nm) 中 被 偵 測 出 來 之 後 經 8 小 時 的 冷 藏, 再 以 1,800 g 離 心 3 分 鐘, 取 上 層 液 並 以 注 射 筒 過 濾 器 (syringe filter: 4 mm filter unit, 0.45 m Nylon) 濾 除 雜 質 最 後 以 高 效 能 液 相 層 析 儀 進 行 分 析 7
2. 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (glutathione peroxidase, GPx) 活 性 分 析 此 酵 素 之 分 析 主 要 是 依 據 Lawrence 與 Burk(1976) 所 發 表 之 方 法 活 性 測 定 係 以 過 氧 化 氫 (H 2 O 2 ) 為 受 質 還 原 態 麩 胱 甘 肽 (GSH) 經 由 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (GPx) 之 催 化 可 將 過 氧 化 氫 還 原, 而 還 原 態 麩 胱 甘 肽 則 變 成 氧 化 態 麩 胱 甘 肽, 然 後 氧 化 態 麩 胱 甘 肽 則 利 用 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 (GRd) 與 NADPH 將 其 還 原 回 還 原 態 麩 胱 甘 肽 取 肝 組 織 均 質 液 樣 品 5 L 及 95 L 20 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 加 入 0.8 ml 100 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 溶 液 (ph 7.0) 之 反 應 混 合 液 ( 含 1 mm EDTA 1 mm NaN 3 0.2 mm NADPH 1 U/mL GRd 及 1 mm GSH), 在 室 溫 下 靜 置 5 分 鐘, 再 加 入 0.1 ml 2.5 mm 過 氧 化 氫 後, 以 分 光 光 度 計 在 340 nm 下 測 3 分 鐘 (25 ), 計 算 NADPH 減 少 之 速 率, 間 接 求 出 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 的 活 性, 而 以 去 離 子 水 5 L 當 作 空 白 組 本 活 性 (specific activity) 測 定 以 nmol NADPH/min/mg protein 表 示 3. 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 (glutathione reductase, GRd) 活 性 分 析 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 活 性 分 析 是 依 據 Bellomo 等 人 (1987) 的 方 法 分 析 時 取 10 L 肝 組 織 均 質 液 樣 品 及 90 L 20 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0) 加 入 0.9 ml 含 有 1.1 mm MgCl 2 6H 2 O 5.0 mm GSSG 及 0.1 mm NADPH 之 100 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 再 以 分 光 光 度 計 在 340 nm 下 測 5 分 鐘 (25 ), 計 算 NADPH 減 少 的 速 率, 其 中 以 10 L 之 去 離 子 水 作 為 空 白 組 本 活 性 (specific activity) 測 定 以 nmol NADPH/min/mg protein 表 示 4. 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD) 活 性 分 析 實 驗 參 照 Marklund 與 Marklund(1974) 所 描 述 之 方 法 進 行, 將 肝 組 織 用 冰 生 理 食 鹽 水 (ice cold saline) 洗 淨, 在 漏 斗 上 滴 乾 生 理 食 鹽 水, 加 入 適 量 緩 衝 液 (0.32 M sucrose l mm EDTA 10 mm Tris-HCl, ph 7.4) 打 碎 使 成 10% 之 均 質 液 (homogenate) 高 速 離 心 30 分 鐘 (13,600 g), 取 上 清 液 50 L, 再 加 上 Tris cacodylic acid buffer(ph 8.2, 50 mm)100 L 溶 液 再 加 上 超 純 水, 使 體 積 成 為 980 L, 再 加 上 鄰 苯 三 酚 (pyrogallol)20 L(0.2 mm), 劇 烈 搖 盪 混 均, 以 分 光 光 度 計 於 420 nm 測 量 吸 光 值 (A), 每 隔 20 秒 測 量 一 次, 總 共 測 量 8
5 分 鐘, 計 算 A/ T 分 析 過 程 中 以 SOD 標 準 品, 作 出 標 準 曲 線 (standard curve), 再 進 行 分 析 單 位 時 間 內 抑 制 鄰 苯 三 酚 自 動 氧 化 速 率 達 50% 時 之 酵 素 量, 定 為 一 單 位 (U); 肝 組 織 SOD 活 性, 以 每 單 位 蛋 白 質 所 含 SOD 單 位 量 表 示 (U per milligram of protein) 5. 過 氧 化 氫 酶 (catalase, CAT) 活 性 分 析 實 驗 參 照 Aebi(1984) 所 描 述 之 方 法 進 行 將 肝 組 織 用 冰 生 理 食 鹽 水 (ice-cold saline) 洗 淨, 在 漏 斗 上 滴 乾 生 理 食 鹽 水, 加 入 適 量 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液, 打 碎 使 成 10% 之 均 質 液 (homogenate) 離 心 (700 g)10 分 鐘, 取 上 層 液 9 份 加 入 1 份 Triton X-100(1%) 成 為 儲 備 均 質 液 (stock homogenate, S.H.) 取 S.H. 加 入 適 量 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 進 行 稀 釋, 調 整 酸 鹼 值 至 ph 7 成 為 稀 釋 均 質 液 (dilute homogenate, D.H.) 取 D.H. 2 ml 加 入 l ml H 2 O 2 (0.03 M), 劇 烈 搖 盪 混 均, 以 分 光 光 度 計 於 溫 控 25 波 長 240 nm 之 條 件 下 測 量 吸 光 值 (A), 每 隔 15 秒 測 量 一 次, 總 共 測 量 2 次, 計 算 求 得 反 應 速 率 常 數 K K=(2.3/ t)log(al/a2) t: 時 間 間 隔 (15 秒 鐘 ); A1: T1 時 段, 樣 品 之 吸 光 值 - 空 白 吸 光 值 ; A2: T2 時 段, 樣 品 之 吸 光 值 - 空 白 吸 光 值 肝 組 織 CAT 活 性 : 以 每 單 位 蛋 白 質 所 含 反 應 速 率 K 表 示 之 (K/mg protein) 6. 蛋 白 質 濃 度 之 測 定 實 驗 參 照 Lowry 等 人 (1951) 之 方 法 進 行 取 適 量 蛋 白 質 樣 品, 並 以 1 N NaOH 調 整 使 其 最 終 體 積 為 100 L, 加 入 200 L 去 離 子 水 及 100 L 反 應 混 合 液 (25% Na 2 CO 3 : 2% Na-K-tartarate : 1% CuSO 4 = 8 : 1 : 1, v/v/v), 然 後 在 室 溫 下 靜 置 10 分 鐘, 加 入 1 ml Folin reagent (Folin : H 2 O = 1 : 19.5, v/v) 後 於 37 水 浴 20 分 鐘, 並 在 室 溫 下 冷 卻, 最 後 在 分 光 光 度 計 以 660 nm 下 測 其 吸 光 值 (25 ) 然 後 將 標 準 曲 線 做 線 性 回 歸, 得 一 方 程 式, 將 所 得 樣 品 之 吸 光 值 代 入 此 一 元 一 次 方 程 式, 換 算 後 即 可 得 知 樣 品 之 蛋 白 質 含 量 9
( 五 ) 組 織 病 理 切 片 觀 察 : 在 8 星 期 試 驗 結 束 時, 將 所 有 大 鼠 均 予 以 犧 牲, 採 血 後, 將 最 大 右 葉 肝 臟 割 取 一 塊 約 1 公 分 見 方 的 組 織 塊, 放 入 10% 的 中 性 福 馬 林 中 固 定, 做 進 一 步 的 病 理 切 片 與 染 色 進 行 H&E 染 色 以 觀 察 肝 細 胞 的 受 損 脂 肪 變 性 壞 死 纖 維 化 等 慢 性 肝 損 傷 變 化 ; 亦 可 做 膠 原 蛋 白 的 特 殊 染 色, 例 如 Masson s trichrome 染 色 或 其 他 適 合 之 染 色 方 法, 以 便 評 估 肝 纖 維 化 程 度 進 行 慢 性 肝 損 傷 之 組 織 病 理 學 的 比 較 時, 可 採 用 Jonker 等 人 (1992) 的 半 定 量 方 法, 測 定 肝 細 胞 發 炎 的 程 度 脂 質 變 性 肝 細 胞 壞 死 及 膽 管 增 生 等 慢 性 肝 損 傷 評 估 分 數 是 由 0 到 4 分, 其 中 0 代 表 沒 有 (absent); 1 代 表 少 量 (trace); 2 分 代 表 輕 微 (weak); 3 分 代 表 中 等 程 度 (moderate); 4 分 代 表 極 嚴 重 (strong) 而 對 肝 纖 維 化 的 半 定 量 分 析, 則 可 以 依 據 Ruward 等 人 (1989) 及 Gabriele 等 人 (1997) 的 方 法, 將 肝 纖 維 化 區 分 為 以 下 五 個 等 級 : 0 分 代 表 正 常 肝 組 織 沒 有 任 何 肝 纖 維 化 ; 1 分 代 表 有 膠 原 的 增 生, 但 沒 有 形 成 中 隔 ( 在 中 央 靜 脈 或 門 脈 區 有 放 射 狀 纖 維 增 生 ); 2 分 代 表 在 中 央 靜 脈 和 門 脈 區 二 者 間, 形 成 不 完 全 的 中 隔 ( 此 中 隔 彼 此 沒 有 交 會 ); 3 分 代 表 形 成 完 整 的 中 隔, 中 間 彼 此 交 會, 並 將 肝 實 質 分 割 成 許 多 節 片 斷, 但 此 中 隔 尚 很 薄 ; 4 分 代 表 形 成 完 全 的 中 隔, 且 中 隔 變 厚, 亦 即 完 全 的 肝 硬 化 另 外, 為 了 避 免 觀 察 時 主 觀 上 的 偏 差, 所 有 的 組 織 病 理 切 片 都 是 由 最 大 右 葉 肝 的 同 一 位 置 切 取 下 來, 進 行 病 理 染 色 至 於 病 理 的 半 定 量 分 析 之 評 估, 則 應 由 獸 醫 病 理 醫 師, 在 不 清 楚 本 實 驗 設 計 的 情 況 下 進 行 單 盲 判 讀, 對 所 有 切 片 進 行 評 分 比 較, 最 後 再 以 統 計 分 析 方 法 進 行 各 組 差 異 性 的 分 析 病 理 切 片 之 照 片 應 提 供 高 解 析 度 之 彩 色 圖 檔 ; 照 片 應 統 一 以 中 央 靜 脈 (central vein, CV) 或 門 靜 脈 (portal vein, PV) 為 中 心 拍 照, 若 為 各 組 之 間 的 比 較, 顯 微 鏡 的 放 大 倍 率 須 一 致 1. 組 織 包 埋 和 切 片 將 最 大 右 葉 肝 割 取 的 約 1 公 分 見 方 的 組 織 塊, 置 入 10% 的 中 性 福 馬 林 中 固 定 其 組 織 形 態 及 結 構, 接 著 以 不 同 濃 度 之 乙 醇 (30 50 70 95 99.5%) 與 二 甲 苯 (xylene) 進 行 脫 水 與 透 明 化 化 步 驟, 再 以 熱 石 臘 溶 液 取 代 二 甲 苯, 最 10
後 將 組 織 以 石 蠟 溶 液 進 行 包 埋 完 成 的 石 蠟 標 本 利 用 切 片 機 切 成 5 μm 的 連 續 石 蠟 切 片, 將 切 下 來 的 切 片 沾 黏 在 乾 淨 的 載 玻 片 上, 於 37 烘 乾 後 用 做 進 一 步 的 病 理 染 色 2. 蘇 木 紫 - 伊 紅 (haematoxylin-eosin, H&E) 染 色 法 將 肝 臟 組 織 切 片 置 入 二 甲 苯 30 分 鐘 脫 蠟, 再 依 序 置 於 99.5 95 70 50 及 30% 之 乙 醇 各 30 分 鐘 以 進 行 復 水, 最 後 浸 泡 於 蒸 餾 水 10 分 鐘 後 即 可 進 行 染 色 首 先 浸 泡 蘇 木 紫 30 秒 染 細 胞 核, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘, 接 著 使 用 伊 紅 染 色 2-5 分 鐘, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘 完 成 染 色 過 程 後 進 行 脫 水 步 驟, 依 序 放 置 於 50 70 95 及 100% 乙 醇 各 2 次, 每 次 30 秒, 再 以 二 甲 苯 進 行 透 明 化 2 次, 最 後 以 蓋 玻 片 封 存 3. Masson s trichrome 染 色 法 切 片 先 經 二 甲 苯 的 脫 臘 和 酒 精 復 水 後, 將 處 理 過 的 切 片 放 在 Bouin 氏 溶 液 中 固 定 7 分 鐘, 然 後 水 洗 約 10 分 鐘 至 切 片 上 黃 色 消 失, 再 將 切 片 以 Weigert's iron hematoxylin 溶 液 染 色 10 分 鐘, 用 溫 的 流 水 洗 10 分 鐘, 再 用 蒸 餾 水 稍 沖 洗 切 片 ; 再 以 Biebrich scarlet-acid fuchsin solution 染 7 分 鐘, 用 蒸 餾 水 稍 沖 洗 切 片, 用 phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution 染 5 分 鐘, 用 蒸 餾 水 稍 沖 洗, 再 用 aniline blue solution 染 5 分 鐘, 以 作 對 比 染 色, 用 蒸 餾 水 再 稍 沖 洗 之, 置 於 1% acetic acid solution 染 3 分 鐘, 後 用 蒸 餾 水 稍 沖 洗 切 片 完 成 染 色 過 程 後 進 行 脫 水 步 驟, 依 序 放 置 於 50% 乙 醇 中 30 秒 70% 乙 醇 中 30 秒 95% 乙 醇 中 20 秒 100% 乙 醇 中 20 秒 100% 乙 醇 中 30 秒, 再 用 二 甲 苯 進 行 透 明 化 2 次, 最 後 以 蓋 玻 片 封 存 ( 六 ) 實 驗 數 據 統 計 分 析 : 選 擇 適 當 的 生 物 統 計 方 法 分 析, 比 較 試 驗 組 於 試 驗 前 後 上 述 各 指 標 值 ( 即 試 驗 的 起 始 值 結 束 值 ) 之 結 果 變 化, 以 及 試 驗 組 與 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 間 的 比 較 是 否 具 統 計 上 之 顯 著 改 善 (p < 0.05) 本 評 估 方 法 必 須 進 行 組 間 的 統 計 比 較 分 析, 例 如 先 以 ANOVA(analysis of variance) 比 較, 有 明 顯 差 異 時, 再 以 Duncan's 11
multiple range test 同 時 比 較 各 組 別 間 之 差 異, 以 評 估 該 試 驗 樣 品 的 最 適 劑 量, 以 及 相 對 於 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 明 確 的 改 善 功 效 然 後 加 以 綜 合 判 斷 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 保 護 肝 臟 或 可 降 低 其 中 某 項 危 險 因 子 之 功 能 三 評 估 方 法 之 測 定 項 目 原 則 ( 一 ) 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 :AST (GOT) ALT (GPT) 選 測 :TG 膽 固 醇 白 蛋 白 ( 二 ) 肝 臟 : 測 定 各 種 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 : Glutathione (GSH) Glutathione peroxidase (GPx) Superoxide dismutase (SOD) Catalase (CAT) TG 膽 固 醇 選 測 :Glutathione reductase (GRd) ( 三 ) 病 理 切 片 觀 察 必 測 :H&E 染 色 下 列 三 染 色 法 選 一 必 測 : 1. Masson s trichrome 染 色 法 2. Sirius red 染 色 法 3. 銀 染 色 法 (silver stain) ( 四 ) 必 測 : 記 錄 慢 性 實 驗 期 間 動 物 每 週 體 重 肝 重 / 體 重 (%) 死 亡 率 及 其 他 相 關 之 測 定 項 目 四 結 果 判 定 之 基 準 由 以 上 血 清 與 肝 臟 之 各 項 測 定 值, 病 理 切 片 觀 察 結 果, 並 加 上 其 他 相 關 測 定 項 目 之 數 據, 經 統 計 分 析 後 所 得 之 客 觀 結 果, 加 以 綜 合 評 估 判 斷 五 宣 稱 廣 告 與 產 品 標 示 受 試 產 品 進 行 以 本 評 估 方 法 推 薦 之 試 驗 方 法, 且 獲 得 明 確 之 有 效 結 果 時, 得 向 12
中 央 衛 生 主 管 機 關 申 請 與 實 驗 結 果 相 符 的 經 動 物 實 驗, 攝 取 本 產 品 有 助 於 延 緩 四 氯 化 碳 誘 導 之 化 學 性 肝 損 傷 或 降 低 其 危 險 因 子 或 其 他 相 近 具 科 學 依 據 的 詞 句 之 宣 稱 廣 告 或 產 品 介 紹 13
貳 針 對 常 用 止 痛 藥 物 乙 醯 胺 基 苯 酚 誘 導 化 學 性 肝 炎 損 傷 一 前 言 乙 醯 胺 基 苯 酚 (N-acetyl-p-aminophenol, APAP), 為 常 見 解 熱 鎮 痛 藥 物 成 分, 過 量 使 用 會 造 成 肝 腎 損 傷 根 據 美 國 1998-2007 年 統 計, 乙 醯 胺 基 苯 酚 使 用 過 量 是 急 性 肝 衰 竭 病 患 最 主 要 病 因, 而 其 代 謝 主 要 是 經 由 肝 臟 解 毒 酵 素 系 統, 主 要 包 括 三 部 分 : (1) 經 由 Phase II 解 毒 酵 素 sulfotransferase 行 sulphation 代 謝 成 APAP-sulfate 的 型 式, 此 作 用 佔 APAP 解 毒 代 謝 30%;(2) 經 由 Phase II 解 毒 酵 素 UDP-glucuronosyltransferase 行 glucuronidation 代 謝 成 APAP-glucuronide 的 型 式, 此 部 分 佔 APAP 解 毒 代 謝 55% APAP-sulfate 與 APAP-glucuronide 親 水 性 較 高, 可 經 由 尿 液 或 膽 汁 排 出 體 外 ;(3) 其 餘 的 15% APAP 經 由 Phase I 解 毒 代 謝, 為 cytochrome P450 酵 素 群 的 氧 化 作 用, 主 要 酵 素 為 CYP2E1, 其 次 為 CYP1A2 CYP2A6 與 CYP3A4 一 般 在 APAP 安 全 劑 量 下,APAP 經 CYP2E1 代 謝 後, 形 成 具 肝 毒 性 之 代 謝 產 物 NAPQI(N-acetyl-para-benzoquinone imine) 只 佔 少 數, 並 且 可 以 利 用 Phase II 解 毒 酵 素 glutathione S-transferase 與 GSH 結 合 形 成 不 具 毒 性 的 代 謝 產 物 APAP-glutathione, 再 代 謝 成 mercapturic acid APAP-cysteine 與 APAP-NAC 等 型 式 由 尿 液 排 除 但 若 服 用 高 劑 量 APAP 時,Phase II 代 謝 路 徑 會 達 飽 和, 增 加 CYP2E1 的 氧 化 作 用, 代 謝 出 大 量 的 NAPQI, 細 胞 內 GSH 耗 盡, 累 積 在 肝 臟 中 的 NAPQI 進 一 步 與 細 胞 質 或 粒 線 體 中 的 蛋 白 質 結 合 或 共 價 修 飾, 而 造 成 mitochondrial permeability transition(mpt), 改 變 滲 透 性 使 粒 線 體 膜 去 極 化, 並 形 成 粒 線 體 內 膜 的 孔 洞, 氧 化 磷 酸 化 受 阻 而 無 法 製 造 能 量 (ATP), 同 時 也 使 得 粒 線 體 內 粒 子 釋 放 出 來, 造 成 粒 線 體 腫 脹 破 裂 因 此, 隨 著 MPT 作 用, 粒 線 體 釋 放 出 超 氧 化 物 (superoxide), 經 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD) 作 用 生 成 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide), 則 會 將 APAP 氧 化 成 semiquinone 自 由 基 的 形 式, 可 能 更 增 加 超 氧 化 物 所 造 成 之 毒 性 作 用 本 評 估 方 法 採 用 400 mg/kg bw 劑 量 之 APAP 誘 導 雄 性 BALB/c 小 鼠 產 生 慢 性 肝 炎 損 傷, 其 第 一 週 血 液 生 化 值 ALT(GPT) 與 AST(GOT) 之 參 考 值 為 150-450 14
IU/L, 且 因 其 肝 臟 組 織 病 理 切 片 符 合 人 類 病 理 進 展, 所 以 此 BALB/c 小 鼠 實 驗 模 式 可 作 為 健 康 食 品 護 肝 保 健 功 效 之 評 估 方 法 BALB/c 小 鼠 血 液 正 常 生 化 數 值 :ALT 為 53.30 ± 3.57 IU/L;AST 為 104.94 ± 20.14 IU/L 二 實 驗 項 目 與 實 驗 方 法 ( 一 ) 執 行 單 位 與 執 行 人 : 本 評 估 試 驗 原 則 上 應 委 託 具 有 充 分 設 備 之 國 內 外 大 學 食 品 營 養 醫 藥 等 相 關 研 究 所 教 學 醫 院 以 上 之 醫 療 機 構 或 具 公 信 力 之 研 究 機 構 執 行, 以 維 持 客 觀 與 可 靠 性 試 驗 計 畫 主 持 人 必 須 具 備 足 夠 與 肝 臟 生 理 代 謝 相 關 之 專 業 背 景 與 研 究 經 驗 或 著 作 ; 試 驗 必 須 事 先 經 過 執 行 單 位 之 動 物 試 驗 委 員 會 審 查 通 過 ( 二 ) 實 驗 設 計 : 建 議 實 驗 動 物 採 用 雄 性 BALB/c 小 鼠, 起 始 體 重 約 20~25 克, 每 組 至 少 10 隻 動 物 必 須 來 自 公 立 研 究 機 構 公 私 立 大 學 或 其 他 中 央 衛 生 主 管 機 關 認 可 之 實 驗 動 物 中 心 動 物 之 飼 養 宜 在 恆 溫 (22 ± 2 ) 亮 暗 各 12 小 時 之 動 物 房 飼 養 或 處 理 時 應 避 免 動 物 驚 嚇, 且 每 次 必 須 前 後 一 致, 避 免 誤 差 值 過 大 本 評 估 試 驗 之 實 驗 組 別 應 包 括 :1. 正 常 對 照 組 : 攝 取 正 常 飲 食 ;2. 負 控 制 組 : 動 物 給 予 APAP 處 理, 攝 取 正 常 飲 食 ;3. 正 控 制 組 : 同 負 控 制 組, 並 另 加 N-acetylcysteine(NAC) 治 療 處 理 ;4. 試 驗 組 : 動 物 給 予 與 負 控 制 組 完 全 相 同 之 APAP 處 理, 並 分 別 另 給 予 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品, 其 中 一 組 的 劑 量 必 須 相 當 於 人 體 的 建 議 攝 取 量, 且 於 APAP 誘 導 肝 損 傷 前 一 星 期 即 開 始 給 予 試 驗 樣 品 試 驗 原 始 數 據 紀 錄 必 須 保 留 供 查 核 1. 試 驗 方 法 : 本 評 估 方 法 係 採 以 APAP 誘 導 小 鼠 產 生 慢 性 肝 損 傷 的 實 驗 模 式, 本 方 法 中 之 APAP 使 用 劑 量 僅 供 參 考 實 驗 前 將 小 鼠 依 體 重 以 逢 機 法 平 均 分 配 至 各 組, 動 物 至 少 分 成 5 組, 每 組 至 少 10 隻 : (1)A 組 為 正 常 對 照 組 : 腹 腔 (intraperitoneal, I.P.) 注 射 生 理 食 鹽 水 + 經 口 15
(peroral, per os, P.O.) 管 餵 去 離 子 水 ; (2) B 組 為 負 控 制 組 ( 肝 損 傷 組 ):400 mg APAP/kg bw(i.p.)+ 去 離 子 水 (P.O.); (3) C 組 為 正 控 制 組 :400 mg APAP/kg bw(i.p.)+ 600 mg NAC/kg bw(p.o.); (4) 試 驗 組 至 少 2 組 ( D E 組 ), 視 實 驗 設 計 需 要 可 再 增 加 組 別 :400 mg APAP/kg bw(i.p.)+ 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品 (P.O.), 其 中 之 一 劑 量 須 與 換 算 的 人 類 建 議 攝 取 量 相 同 2. 試 驗 步 驟 : A 組 腹 腔 注 射 生 理 食 鹽 水 (0.6 ml/30 g bw);b~e 組 腹 腔 注 射 400 mg APAP/kg bw(0.6 ml/30 g bw), 每 週 2 次 ( 相 隔 3-4 天 ), 於 肝 炎 誘 導 1 小 時 後 管 餵 試 驗 樣 品 或 NAC, 以 減 少 藥 物 與 樣 品 互 相 影 響 A B 組 每 日 管 餵 去 離 子 水 ;C 組 每 日 管 餵 NAC(600 mg/kg bw), 在 D E 組 則 於 APAP 誘 導 肝 損 傷 前 1 星 期 開 始 每 日 給 予 試 驗 樣 品 ( 前 後 共 為 期 9 週 ) 所 有 實 驗 動 物 於 APAP 誘 導 肝 損 傷 開 始 的 前 1 週 第 0 週 第 1 3 及 6 週 進 行 採 血, 採 血 前 8~12 小 時 禁 食, 並 於 投 予 試 驗 樣 品 或 去 離 子 水 NAC 後 4 小 時, 以 眼 窩 或 臉 頰 採 血 方 式 檢 測 肝 臟 的 生 化 功 能 :AST (GOT) ALT (GPT) 三 酸 甘 油 酯 (TG) 膽 固 醇 最 後 於 APAP 誘 導 肝 損 傷 第 8 週 結 束 時, 秤 重 後 全 部 犧 牲, 可 從 心 臟 或 腹 大 動 脈 採 血 檢 驗 肝 臟 生 化 功 能, 並 剖 腹 取 肝 臟 標 本, 秤 重 後 將 最 大 右 葉 肝 割 取 約 0.5 公 分 見 方 之 組 織 塊, 固 定 於 10% 的 中 性 福 馬 林 (formalin) 液 中, 以 石 蠟 包 埋 切 片 貼 附 在 載 玻 片 上 後, 分 別 作 蘇 木 紫 - 伊 紅 染 色 (haematoxylin-eosin stain, H&E stain) 以 進 行 病 理 學 觀 察 另 將 其 餘 肝 臟 分 別 進 行 抗 氧 化 成 分 GSH, 以 及 GPx GRd GST SOD catalase 等 酵 素 活 性 之 檢 測 3. 實 驗 動 物 與 人 體 間 試 驗 劑 量 之 換 算 : 以 管 灌 (gavage feeding) 方 式 給 予 受 試 樣 品 時, 一 般 的 認 知, 身 體 的 新 陳 代 謝 速 率 與 其 體 表 面 積 的 相 關 性, 明 顯 超 過 與 其 體 重 之 相 關 性 然 而, 要 精 確 測 量 其 體 表 乃 非 常 不 易, 而 即 使 在 同 一 物 種 (species) 內 之 體 表, 其 與 體 重 間 16
並 沒 有 一 簡 單 正 確 的 公 式 可 換 算, 且 其 關 係 又 會 隨 著 體 重 和 體 型 的 改 變 而 與 體 表 之 關 係 係 數 呈 現 不 規 則 的 變 異, 因 此 在 實 驗 期 間 之 試 驗 劑 量 要 維 持 與 其 代 謝 率 之 固 定 相 關 性 ; 或 人 體 與 動 物 間 之 試 驗 劑 量 要 精 確 的 換 算 有 其 實 際 的 困 難 本 評 估 方 法 的 人 體 與 高 等 實 驗 動 物 間 試 驗 劑 量 間 之 換 算, 原 則 上 根 據 2005 年 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 所 公 告 之 實 驗 初 期 估 算 方 法 (Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers), 而 以 60 公 斤 之 成 人 為 基 準 使 用 高 等 實 驗 動 物 進 行 試 驗 時, 其 劑 量 之 換 算 原 則 上 以 人 體 每 日 每 公 斤 體 重 之 建 議 攝 取 量 (/kg bw/d) 的 12.3 倍 作 為 小 鼠 之 1 倍 劑 量, 其 他 動 物 或 更 詳 細 的 換 算 可 參 閱 該 方 法 http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/g uidances/ucm078932.pdf 另 換 算 之 本 換 算 方 法 適 用 於 根 據 每 天 每 隻 動 物 之 個 別 體 重 變 異 而 換 算 出 應 給 予 直 接 管 灌 之 試 驗 樣 品 劑 量 此 劑 量 換 算 方 法 提 供 業 界 參 考, 非 強 制 性 依 據, 但 使 用 其 他 換 算 方 法 時, 應 附 其 明 確 之 資 料 來 源 ( 三 ) 實 驗 測 定 項 目 : 在 進 行 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 之 分 析 方 面 : 測 定 時, 可 參 考 以 下 建 議 之 方 法, 亦 得 使 用 有 學 理 根 據 之 適 當 方 法 或 具 公 信 之 市 售 套 組 進 行 分 析 1. 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 (1)AST (GOT) (2)ALT (GPT) (3)TG (4) 膽 固 醇 2. 肝 臟 : 測 定 各 種 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 (1)Glutathione (GSH) (2)Glutathione peroxidase (GPx) (3)Glutathione reductase (GRd) (4)Glutathione S-transferase (GST) 17
(5)Superoxide dismutase (SOD) (6)Catalase (CAT) (7)TG (8) 膽 固 醇 ( 四 ) 肝 功 能 生 化 指 數 的 檢 測 : 所 採 之 小 鼠 血 液 樣 品 在 室 溫 下 放 置 約 1 小 時, 使 其 凝 結, 再 利 用 冷 凍 離 心 機 於 4 下 以 14,000 g 離 心 5 分 鐘, 分 離 出 血 清 再 以 血 液 自 動 生 化 分 析 儀 檢 測 肝 功 能 之 生 化 指 數, 包 括 AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 等, 其 中 AST (GOT) 及 ALT (GPT) 檢 測 原 理 是 依 據 Reitman 與 Frankel(1957) 及 國 際 聯 邦 臨 床 化 學 (IFCC, 1986) 的 標 準 方 法 並 進 行 肝 臟 抗 氧 化 功 能 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 之 分 析 如 下 另 必 須 測 定 肝 臟 TG 膽 固 醇 肝 重 / 體 重 (%) 等 肝 臟 脂 肪 堆 積 指 標 1. 麩 胱 甘 肽 (glutathione, GSH) 濃 度 之 分 析 參 考 Reed 等 人 (1980) 的 方 法 肝 組 織 精 秤 0.5 克, 加 入 9 倍 (v/w) 的 50 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 均 質 1 分 鐘, 得 肝 組 織 均 質 液 樣 品 肝 組 織 均 質 後, 迅 速 取 均 質 液 400 L 加 入 等 量 10% 過 氯 酸 (perchloric acid, PCA) 混 合 後, 靜 置 40 分 鐘, 使 PCA 能 將 樣 品 中 還 原 態 麩 胱 甘 肽 (GSH) 充 分 溶 出 後, 於 4 下, 以 1,800 g 離 心 3 分 鐘, 取 上 層 液 待 測 至 於 沉 澱 部 分 則 加 入 1 ml 1 N NaOH 溶 解, 再 移 液 至 微 量 離 心 管 中 以 分 析 蛋 白 質 另 取 8.5 mg 之 還 原 態 麩 胱 甘 肽 及 7.2 mg 之 氧 化 態 麩 胱 甘 肽 所 製 備 好 的 標 準 品 與 上 述 所 得 之 樣 品 各 400 L, 加 入 40 L 碘 乙 酸 (iodoacetic acid, IAA: 100 mm), 使 還 原 態 麩 胱 甘 肽 與 IAA 結 合 後, 給 予 還 原 態 麩 胱 甘 肽 多 攜 帶 一 負 電 荷, 以 便 在 高 效 能 液 相 層 析 儀 (HPLC) 分 析 中 能 比 GSSG 早 分 離 出 來 ; 再 緩 慢 加 入 碳 酸 氫 鉀 (KHCO 3 ) 直 到 不 再 起 泡 為 止, 此 時 已 中 和 酸 而 成 微 鹼 性, 以 便 可 在 HPLC 中 分 析 然 後 置 於 暗 處 15 分 鐘 後, 再 加 入 440 L 3% 2,4- 二 硝 基 氟 苯 (2,4-dinitrofluorobenzene, FDNB) 振 盪 混 合, 使 與 硫 元 素 反 應 成 黃 色 物 質, 而 此 黃 色 物 質 可 在 紫 外 光 偵 測 器 (UV detector, 18
λ=365 nm) 中 被 偵 測 出 來 之 後 經 8 小 時 的 冷 藏, 再 以 1,800 g 離 心 3 分 鐘, 取 上 層 液 並 以 注 射 筒 過 濾 器 (syringe filter: 4 mm filter unit, 0.45 m Nylon) 濾 除 雜 質, 最 後 以 HPLC 進 行 分 析 2. 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (glutathione peroxidase, GPx) 活 性 分 析 此 酵 素 之 分 析 主 要 是 依 據 Lawrence 與 Burk(1976) 所 報 告 之 方 法, 活 性 測 定 係 以 過 氧 化 氫 (H 2 O 2 ) 為 受 質 還 原 態 麩 胱 甘 肽 (GSH) 經 由 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (GPx) 之 催 化 可 將 過 氧 化 氫 還 原, 而 還 原 態 麩 胱 甘 肽 則 變 成 氧 化 態 麩 胱 甘 肽, 然 後 氧 化 態 麩 胱 甘 肽 則 利 用 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 (GRd) 與 NADPH 將 其 還 原 回 還 原 態 麩 胱 甘 肽 取 肝 組 織 均 質 液 樣 品 5 L 及 95 L 20 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 加 入 0.8 ml 100 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 溶 液 (ph 7.0) 之 反 應 混 合 液 ( 含 1 mm EDTA 1 mm NaN 3 0.2 mm NADPH 1 U/mL GRd 及 1 mm GSH), 在 室 溫 下 靜 置 5 分 鐘, 再 加 入 0.1 ml 2.5 mm 過 氧 化 氫 後, 以 分 光 光 度 計 在 340 nm 下 測 3 分 鐘 (25 ), 計 算 NADPH 減 少 之 速 率, 間 接 求 出 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 的 活 性, 而 以 去 離 子 水 5 L 當 作 空 白 組 本 活 性 (specific activity) 測 定 以 nmol NADPH/min/mg protein 表 示 3. 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 (glutathione reductase, GRd) 活 性 分 析 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 活 性 分 析 是 依 據 Bellomo 等 人 (1987) 的 方 法 分 析 時 取 10 L 肝 組 織 均 質 液 樣 品 及 90 L 20 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0) 加 入 0.9 ml 含 有 1.1 mm MgCl 2 6H 2 O 5.0 mm GSSG 及 0.1 mm NADPH 之 100 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 再 以 分 光 光 度 計 在 340 nm 下 測 5 分 鐘 (25 ), 計 算 NADPH 減 少 的 速 率, 其 中 以 10 L 之 去 離 子 水 作 為 空 白 組 本 活 性 (specific activity) 測 定 以 nmol NADPH/min/mg protein 表 示 4. 麩 胱 甘 肽 硫 轉 移 酶 (glutathione S-transferase, GST) 活 性 分 析 麩 胱 甘 肽 硫 轉 移 酶 活 性 分 析 是 依 據 Habig 等 人 (1974) 的 方 法 分 析 時 取 5 μl 肝 組 織 均 質 液 樣 品 及 880 μl 的 反 應 試 劑 含 有 ph 7.0 的 100 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 及 100 mm GSH, 加 入 95 μl 的 20 mm PPB(pH 7.0), 最 後 加 20 μl 的 50 mm CDNB 利 用 分 光 光 度 計 以 340 nm 於 25 C 測 定 5 分 鐘 內 之 GSH-CDNB conjugate form 合 成 速 率, 其 中 以 10 L 之 去 離 子 水 作 為 空 白 組 本 活 性 (specific activity) 測 定 以 19
nmol GSH-CDNB conjugate formed /min/mg protein 表 示 5. 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD) 活 性 分 析 實 驗 參 照 Marklund 與 Marklund(1974) 所 描 述 之 方 法 進 行, 將 肝 組 織 用 冰 生 理 食 鹽 水 (ice cold saline) 洗 淨, 在 漏 斗 上 滴 乾 生 理 食 鹽 水, 加 入 適 量 緩 衝 液 (0.32 M sucrose l mm EDTA 10 nm Tris-HCl, ph 7.4), 均 質 使 成 10% 之 均 質 液 (homogenate) 高 速 (13,600 g) 離 心 30 分 鐘, 取 上 清 液 50 l, 再 加 上 tris cacodylic acid buffer(ph 8.2, 50 mm)100 L 溶 液 再 加 上 超 純 水, 使 體 積 成 為 980 L, 再 加 上 鄰 苯 三 酚 (pyrogallol)20 L(0.2 mm), 劇 烈 搖 盪 混 均, 以 分 光 光 度 計 於 420 nm 測 量 吸 光 值 (A), 每 隔 20 秒 測 量 一 次, 總 共 測 量 5 分 鐘, 計 算 A/ T 分 析 過 程 中 以 SOD 標 準 品, 作 出 標 準 曲 線 (standard curve), 再 進 行 分 析 單 位 時 間 內 抑 制 鄰 苯 三 酚 自 動 氧 化 速 率 達 50% 時 之 酵 素 量, 定 為 一 單 位 (U); 肝 組 織 SOD 活 性, 以 每 單 位 蛋 白 質 所 含 SOD 單 位 量 表 示 (U/mg protein) 6. 過 氧 化 氫 酶 (catalase, CAT) 活 性 分 析 實 驗 參 照 Aebi(1984) 所 描 述 之 方 法 進 行 將 肝 組 織 用 冰 生 理 食 鹽 水 (ice-cold saline) 洗 淨, 在 漏 斗 上 滴 乾 生 理 食 鹽 水, 加 入 適 量 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液, 均 質 使 成 10% 之 均 質 液 (homogenate) 離 心 (700 g)10 分 鐘, 取 上 層 液 9 份 加 入 1 份 Triton X-100(1%) 成 為 儲 備 均 質 液 (stock homogenate, S.H.) 取 S.H. 加 入 適 量 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 進 行 稀 釋, 調 整 酸 鹼 值 至 ph 7 成 為 稀 釋 均 質 液 (dilute homogenate, D.H.) 取 D.H. 2 ml 加 入 l ml H 2 O 2 (0.03 M), 劇 烈 搖 盪 混 均, 以 分 光 光 度 計 於 溫 控 25 C 波 長 240 nm 之 條 件 下 測 量 吸 光 值 (A), 每 隔 15 秒 測 量 一 次, 總 共 測 量 2 次, 計 算 求 得 反 應 速 率 常 數 K K=(2.3/ t)log(al/a2) t: 時 間 間 隔 15 秒 鐘 ; A1: T1 時 段, 樣 品 之 吸 光 值 - 空 白 吸 光 值 ; A2: T2 時 段, 樣 品 之 吸 光 值 - 空 白 吸 光 值 肝 組 織 CAT 活 性, 以 每 單 位 蛋 白 質 所 含 反 應 速 率 K 表 示 之 (K/mg protein) 20
7. 蛋 白 質 濃 度 之 測 定 : 實 驗 參 照 Lowry 等 人 (1951) 之 方 法 進 行 取 適 量 蛋 白 質 樣 品, 並 以 1 N NaOH 調 整 使 其 最 終 體 積 為 100 L, 加 入 200 L 去 離 子 水 及 100 L 反 應 混 合 液 (25% Na 2 CO 3 : 2% Na-K-tartarate : 1% CuSO 4 = 8 : 1 : 1, v/v/v), 然 後 在 室 溫 下 靜 置 10 分 鐘, 加 入 1 ml Folin reagent(folin : H 2 O = 1 : 19.5, v/v) 後 於 37 C 水 浴 20 分 鐘, 並 在 室 溫 下 冷 卻, 最 後 在 分 光 光 度 計 以 660 nm 下 測 其 吸 光 值 (25 ) 將 標 準 曲 線 做 線 性 回 歸, 得 一 方 程 式, 將 所 得 樣 品 之 吸 光 值 代 入 此 一 元 一 次 方 程 式, 換 算 後 即 可 得 知 樣 品 之 蛋 白 質 含 量 ( 五 ) 組 織 病 理 切 片 觀 察 在 8 星 期 試 驗 結 束 時, 將 所 有 小 鼠 均 予 以 犧 牲, 採 血 後, 將 最 大 右 葉 肝 臟 割 取 約 0.5 公 分 見 方 的 組 織 塊, 放 入 10% 的 中 性 福 馬 林 中 固 定, 做 進 一 步 的 病 理 切 片 與 染 色 進 行 H&E 染 色 以 觀 察 肝 細 胞 的 受 損 脂 肪 變 性 壞 死 等 慢 性 肝 損 傷 變 化 進 行 慢 性 肝 損 傷 之 組 織 病 理 學 的 比 較 時, 可 採 用 Jonker 等 人 (1992) 的 半 定 量 方 法, 測 定 肝 細 胞 發 炎 的 程 度 脂 質 變 性 肝 細 胞 壞 死 及 膽 管 增 生 等 評 估 分 數 是 由 0 到 4 分, 其 中 0 分 代 表 沒 有 (absent); 1 分 代 表 少 量 (trace); 2 分 代 表 輕 微 (weak); 3 分 代 表 中 等 程 度 (moderate); 4 分 代 表 極 嚴 重 (strong) 另 外, 為 了 避 免 觀 察 時 主 觀 上 的 偏 差, 所 有 的 組 織 病 理 切 片 都 是 由 最 大 右 葉 肝 的 同 一 位 置 切 取 下 來, 進 行 病 理 染 色 至 於 病 理 的 半 定 量 分 析 之 評 估, 則 應 由 獸 醫 病 理 醫 師, 在 不 清 楚 本 實 驗 設 計 的 情 況 下 進 行 單 盲 判 讀, 對 所 有 切 片 進 行 評 分 比 較, 最 後 再 以 統 計 分 析 方 法 進 行 各 組 差 異 性 的 分 析 病 理 切 片 之 照 片 應 提 供 高 解 析 度 之 彩 色 圖 檔 ; 照 片 應 統 一 以 中 央 靜 脈 (central vein, CV) 或 門 靜 脈 (portal vein, PV) 為 中 心 拍 照, 若 為 各 組 之 間 的 比 較, 顯 微 鏡 的 放 大 倍 率 須 一 致 1. 組 織 包 埋 和 切 片 將 最 大 右 葉 肝 割 取 的 約 0.5 公 分 見 方 的 組 織 塊, 置 入 10% 的 中 性 福 馬 林 中 固 定 其 組 織 形 態 及 結 構, 接 著 以 不 同 濃 度 之 乙 醇 (30 50 70 95 99.5%) 與 二 甲 苯 (xylene) 進 行 脫 水 與 透 明 化 化 步 驟, 再 以 熱 石 臘 溶 液 取 代 二 甲 苯, 最 後 將 組 織 21
以 石 蠟 溶 液 進 行 包 埋 完 成 的 石 蠟 標 本 利 用 切 片 機 切 成 5 μm 的 連 續 石 蠟 切 片, 將 切 下 來 的 切 片 沾 黏 在 乾 淨 的 載 玻 片 上, 於 37 烘 乾 後 用 做 進 一 步 的 病 理 染 色 2. 蘇 木 紫 - 伊 紅 (haematoxylin-eosin, H&E) 染 色 法 將 肝 臟 組 織 切 片 置 入 二 甲 苯 30 分 鐘 脫 蠟, 再 依 序 置 於 99.5 95 70 50 及 30% 之 乙 醇 各 30 分 鐘 以 進 行 復 水, 最 後 浸 泡 於 蒸 餾 水 10 分 鐘 後 即 可 進 行 染 色 首 先 浸 泡 蘇 木 紫 30 秒 染 細 胞 核, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘, 接 著 使 用 伊 紅 染 色 2-5 分 鐘, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘 完 成 染 色 過 程 後 進 行 脫 水 步 驟, 依 序 放 置 於 50 70 95 及 100% 乙 醇 各 2 次, 每 次 30 秒, 再 以 二 甲 苯 進 行 透 明 化 2 次, 最 後 以 蓋 玻 片 封 存 ( 六 ) 實 驗 數 據 統 計 分 析 : 選 擇 適 當 的 生 物 統 計 方 法 分 析, 比 較 試 驗 組 於 試 驗 前 後 上 述 各 指 標 值 ( 即 試 驗 的 起 始 值 結 束 值 ) 之 結 果 變 化, 以 及 試 驗 組 與 正 常 對 照 組 及 負 正 控 制 組 間 的 比 較 是 否 具 統 計 上 之 顯 著 改 善 (p < 0.05) 本 評 估 方 法 必 須 進 行 組 間 的 統 計 比 較 分 析, 例 如 先 以 ANOVA (analysis of variance) 比 較, 有 明 顯 差 異 時, 再 以 Duncan's multiple range test 同 時 比 較 各 組 別 間 之 差 異, 以 評 估 該 試 驗 樣 品 的 最 適 劑 量, 以 及 相 對 於 正 常 對 照 組 及 負 正 控 制 組 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 明 確 的 改 善 功 效 然 後 加 以 綜 合 判 斷 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 保 護 肝 臟 或 可 降 低 其 中 某 項 危 險 因 子 之 功 能 三 評 估 方 法 之 測 定 項 目 原 則 ( 一 ) 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 :AST (GOT) ALT (GPT) 選 測 :TG 膽 固 醇 ( 二 ) 肝 臟 : 測 定 各 種 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 : Glutathione (GSH) Glutathione peroxidase (GPx) Superoxide dismutase (SOD) Catalase (CAT) 22
選 測 :Glutathione reductase (GRd) Glutathione S-transferase (GST) TG 膽 固 醇 ( 三 ) 病 理 切 片 觀 察 必 測 :H&E 染 色 選 測 : 冷 凍 切 片 Oil-Red 染 色 ( 四 ) 必 測 : 記 錄 慢 性 實 驗 期 間 動 物 每 週 體 重 肝 重 / 體 重 (%) 死 亡 率 及 其 他 相 關 之 測 定 項 目 四 結 果 判 定 之 基 準 由 以 上 血 清 與 肝 臟 之 各 項 測 定 值, 病 理 切 片 觀 察 結 果, 並 加 上 其 他 相 關 測 定 項 目 之 數 據, 經 統 計 分 析 後 所 得 之 客 觀 結 果, 加 以 綜 合 評 估 判 斷 五 宣 稱 廣 告 與 產 品 標 示 受 試 產 品 進 行 以 本 評 估 方 法 推 薦 之 試 驗 方 法, 且 獲 得 明 確 之 有 效 結 果 時, 得 向 中 央 衛 生 主 管 機 關 申 請 與 實 驗 結 果 相 符 的 經 動 物 實 驗, 攝 取 本 產 品 有 助 於 延 緩 乙 醯 胺 基 苯 酚 誘 導 之 化 學 性 肝 炎 損 傷 或 降 低 其 危 險 因 子 或 其 他 相 近 具 科 學 依 據 的 詞 句 之 宣 稱 廣 告 或 產 品 介 紹 23
參 針 對 應 用 硫 代 乙 醯 胺 誘 導 肝 纖 維 化 之 慢 性 肝 損 傷 一 前 言 在 1950 年 代 即 有 以 硫 代 乙 醯 胺 (thioacetamide, TAA) 餵 飼 大 鼠 誘 導 肝 損 傷 之 報 告, 而 且 TAA 在 大 ( 小 ) 鼠 所 誘 導 肝 損 傷 之 病 理 變 化 類 似 人 類 的 肝 損 傷 病 變, 因 此, 得 以 TAA 誘 導 肝 纖 維 化 作 為 化 學 性 肝 損 傷 動 物 模 式 TAA 是 一 種 可 以 用 不 同 方 式 造 成 急 性 或 慢 性 肝 損 傷 的 選 擇 性 毒 性 物 質, 所 造 成 的 病 變 處 於 肝 臟 的 小 葉 中 心, 這 與 許 多 毒 性 物 質 在 人 所 造 成 的 肝 損 傷 區 域 相 同 另 外, 並 非 TAA 本 身 直 接 造 成 之 肝 損 傷, 而 是 因 其 在 體 內 的 代 謝 產 物 攻 擊 肝 臟 所 造 成 使 用 TAA 的 優 點 有 很 多, 如 TAA 因 其 半 衰 期 短, 所 以 可 以 很 快 造 成 急 性 的 肝 臟 毒 性, 但 是 TAA 所 造 成 的 急 性 致 死 性 與 一 些 較 傳 統 之 肝 毒 性 物 質 如 : 四 氯 化 碳 乙 醯 胺 基 苯 酚 和 三 氯 甲 烷 有 所 區 別,TAA 從 給 予 動 物 到 致 死 約 有 3.5 到 7 天 的 時 間, 可 以 觀 察 肝 細 胞 壞 死 到 肝 衰 竭 死 亡 的 病 變 過 程, 而 其 他 較 傳 統 之 肝 毒 性 物 質, 若 是 給 予 致 死 劑 量, 則 在 12~24 小 時 左 右 的 時 間 即 會 造 成 動 物 死 亡, 因 此 不 利 觀 察 此 外,TAA 具 有 高 度 肝 特 異 性 的 毒 性, 除 非 在 一 超 高 之 劑 量 才 會 也 造 成 腎 臟 傷 害, 否 則 TAA 僅 會 造 成 肝 臟 損 傷 TAA 進 入 動 物 體 中 經 由 混 合 功 能 氧 化 酶 系 統 (mixed function oxidase system) 可 代 謝 產 生 acetamide 與 TAA-S-oxide( 圖 一 ), TAA-S-oxide 再 經 由 cytochrome P450 monoxygenase 轉 變 為 一 具 高 活 性 化 學 物 質 TAA-S-dioxide,TAA-S-dioxide 會 與 組 織 大 分 子 作 共 價 鍵 結, 進 而 破 壞 肝 細 胞, 並 造 成 氧 化 壓 力 (oxidative stress) 與 肝 壞 死 因 氧 化 壓 力 造 成 肝 星 狀 細 胞 活 化 與 形 態 改 變, 這 些 活 化 和 形 態 改 變 包 括 有 促 進 增 生 之 能 力 促 進 生 成 和 降 解 細 胞 外 基 質 促 進 化 學 趨 向 性 與 促 發 炎 的 能 力, 最 後 若 TAA 所 造 成 的 肝 細 胞 壞 死 持 續 進 行, 則 會 演 變 成 肝 纖 維 化, 甚 至 出 現 節 結 24
圖 一 TAA 在 肝 臟 的 代 謝 路 徑 研 究 指 出, 給 予 SD 大 鼠 不 同 劑 量 (50, 150, 300 或 600 mg/kg bw) 之 TAA, 之 後 於 0~96 小 時 內 觀 察 其 肝 損 傷 與 修 復 之 情 況, 他 們 以 血 清 中 ALT 之 濃 度 判 斷 肝 損 傷 程 度, 發 現 前 3 個 較 小 劑 量 (50, 150, 300 mg/kg) 之 肝 損 傷 程 度 並 沒 有 劑 量 上 的 差 異, 而 且 老 鼠 也 不 會 死 亡 給 予 600 mg/kg 的 老 鼠 一 開 始, 其 肝 損 傷 之 程 度 反 而 明 顯 低 於 其 他 三 組, 但 隨 時 間 之 增 加 (> 48 小 時 ), 給 予 600 mg/kg 的 老 鼠 其 肝 損 傷 程 度 也 隨 之 增 加, 而 且 給 予 600 mg/kg 的 老 鼠 死 亡 率 達 90% 另 外 1995 年 也 有 報 導 指 出 TAA 所 造 成 血 清 學 中 脂 肪 酸 變 化 與 肝 硬 化 病 人 相 似, 皆 會 因 肝 臟 合 成 脂 肪 酸 能 力 下 降 而 造 成 血 清 中 脂 肪 酸 含 量 減 少 TAA 造 成 肝 損 傷 於 1951 年 即 有 學 者 研 究, 至 今 已 有 許 多 TAA 誘 導 不 同 肝 損 傷 之 動 物 研 究, 其 中 有 極 大 部 分 是 用 以 評 估 預 防 或 治 療 肝 損 傷 之 討 論, 因 此 以 TAA 誘 導 肝 損 傷 用 以 評 估 健 康 食 品 之 護 肝 功 能 是 極 為 有 效 之 方 法 二 實 驗 項 目 與 實 驗 方 法 ( 一 ) 執 行 單 位 與 執 行 人 : 本 評 估 試 驗 原 則 上 應 委 託 具 有 充 分 設 備 之 國 內 外 大 學 食 品 營 養 醫 藥 等 相 關 研 究 所 教 學 醫 院 以 上 之 醫 療 機 構 或 具 公 信 力 之 研 究 機 構 執 行, 以 維 持 客 觀 與 可 靠 性 試 驗 計 畫 主 持 人 必 須 具 備 足 夠 與 肝 臟 生 理 代 謝 相 關 之 專 業 背 景 與 研 究 經 驗 或 著 作 ; 試 驗 必 須 事 先 經 過 執 行 單 位 之 動 物 試 驗 委 員 會 審 查 通 過 25
( 二 ) 實 驗 設 計 : 建 議 實 驗 動 物 採 用 雄 性 SD 或 Wistar 大 鼠, 起 始 體 重 約 250 克, 每 組 至 少 8 隻 動 物 必 須 來 自 公 立 研 究 機 構 公 私 立 大 學 或 其 他 中 央 衛 生 主 管 機 關 認 可 之 實 驗 動 物 中 心 動 物 之 飼 養 宜 在 恆 溫 (22 ± 2 ) 亮 暗 各 12 小 時 之 動 物 房 飼 養 或 處 理 時 應 避 免 動 物 驚 嚇, 且 每 次 必 須 前 後 一 致, 避 免 誤 差 值 過 大 本 評 估 試 驗 之 實 驗 組 別 應 包 括 1. 正 常 對 照 組 : 攝 取 正 常 飲 食 ;2. 負 控 制 組 : 動 物 給 予 TAA 處 理, 攝 取 正 常 飲 食 ;3. 試 驗 組 : 動 物 給 予 與 負 控 制 組 完 全 相 同 之 TAA 處 理, 並 分 別 另 給 予 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品, 其 中 一 組 的 劑 量 必 須 相 當 於 人 體 的 建 議 攝 取 量, 且 於 TAA 誘 導 肝 損 傷 前 一 星 期 即 開 始 給 予 試 驗 樣 品 試 驗 原 始 數 據 紀 錄 必 須 保 留 供 查 核 1. 試 驗 方 法 : 本 評 估 方 法 係 採 以 TAA 誘 導 大 鼠 產 生 慢 性 肝 損 傷 的 實 驗 模 式, 本 方 法 中 之 TAA 使 用 劑 量 僅 供 參 考 實 驗 前 將 大 鼠 依 體 重 以 逢 機 法 平 均 分 配 至 各 組, 動 物 至 少 分 成 4 組, 每 組 至 少 8 隻 : (1)A 組 為 正 常 對 照 組 : 腹 腔 (intraperitoneal, I.P.) 注 射 生 理 食 鹽 水 + 經 口 (peroral, per os, P.O.) 管 餵 去 離 子 水 ; (2) B 組 為 負 控 制 組 ( 肝 損 傷 組 ):100 mg TAA/kg bw (I.P.)+ 去 離 子 水 (P.O.); (3) 試 驗 組 至 少 2 組 ( C D 組 ), 視 實 驗 設 計 需 要 可 再 增 加 組 別 :100 mg TAA/kg bw(i.p.)+ 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品 (P.O.), 其 中 之 一 劑 量 須 與 換 算 的 人 類 建 議 攝 取 量 相 同 2. 試 驗 步 驟 : A 組 腹 腔 注 射 0.5 ml 生 理 食 鹽 水 ;B~D 組 腹 腔 注 射 100 mg TAA/kg bw (0.5 ml/30 g bw), 每 週 3 次 ( 可 分 別 在 週 1 週 3 及 週 5 注 射 ), 於 肝 炎 誘 導 1 小 時 後 管 餵 試 驗 樣 品, 以 減 少 藥 物 與 樣 品 互 相 影 響 A B 組 每 日 管 餵 0.5 ml 去 離 子 水 ;C D 組 則 於 TAA 誘 導 肝 損 傷 前 1 星 期 開 始 每 日 給 予 試 驗 樣 品 ( 前 後 共 為 期 9 週 ) 26
所 有 實 驗 動 物 於 TAA 誘 導 肝 損 傷 開 始 的 前 1 週 第 0 週 第 1 3 6 週 進 行 採 血, 採 血 前 8~12 小 時 禁 食, 並 於 投 予 試 驗 樣 品 或 去 離 子 水 後 4 小 時, 以 尾 部 採 血 方 式 檢 測 肝 臟 的 生 化 功 能 :AST (GOT) ALT (GPT) 三 酸 甘 油 酯 (TG) 膽 固 醇 白 蛋 白 最 後 於 TAA 誘 導 肝 損 傷 第 8 週 結 束 時, 秤 重 後 全 部 犧 牲, 從 心 臟 或 腹 大 動 脈 採 血 檢 驗 肝 臟 生 化 功 能, 並 剖 腹 取 肝 臟 標 本, 秤 重 後 將 最 大 右 葉 肝 割 取 2-3 塊 1 公 分 見 方 之 組 織 塊, 固 定 於 10% 的 中 性 福 馬 林 (formalin) 液 中, 再 以 石 蠟 包 埋 切 片 貼 附 在 載 玻 片 上 後, 分 別 進 行 蘇 木 紫 伊 紅 染 色 (haematoxylin-eosin stain, H&E stain) 膠 原 纖 維 的 特 殊 染 色, 如 Masson's trichrome 染 色 或 其 他 適 合 之 染 色 方 法 來 進 行 病 理 學 觀 察 3. 實 驗 動 物 與 人 體 間 試 驗 劑 量 之 換 算 : 以 管 灌 (gavage feeding) 方 式 給 予 受 試 樣 品 時, 一 般 的 認 知, 身 體 的 新 陳 代 謝 速 率 與 其 體 表 面 積 的 相 關 性, 明 顯 超 過 與 其 體 重 之 相 關 性 然 而, 要 精 確 測 量 其 體 表 乃 非 常 不 易, 而 即 使 在 同 一 物 種 (species) 內 之 體 表, 其 與 體 重 間 並 沒 有 一 簡 單 正 確 的 公 式 可 換 算, 且 其 關 係 又 會 隨 著 體 重 和 體 型 的 改 變 而 與 體 表 之 關 係 係 數 呈 現 不 規 則 的 變 異, 因 此 在 實 驗 期 間 之 試 驗 劑 量 要 維 持 與 其 代 謝 率 之 固 定 相 關 性 ; 或 人 體 與 動 物 間 之 試 驗 劑 量 要 精 確 的 換 算 有 其 實 際 的 困 難 本 評 估 方 法 的 人 體 與 高 等 實 驗 動 物 間 試 驗 劑 量 間 之 換 算, 原 則 上 根 據 2005 年 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 所 公 告 之 實 驗 初 期 估 算 方 法 (Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers), 而 以 60 公 斤 之 成 人 為 基 準 使 用 高 等 實 驗 動 物 進 行 試 驗 時, 其 劑 量 之 換 算 原 則 上 以 人 體 每 日 每 公 斤 體 重 之 建 議 攝 取 量 (/kg bw/d) 的 6.2 倍 作 為 大 鼠 之 1 倍 劑 量, 其 他 動 物 或 更 詳 細 的 換 算 可 參 閱 該 方 法 http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation /Guidances/ucm078932.pdf 另 換 算 之 本 換 算 方 法 適 用 於 根 據 每 天 每 隻 動 物 之 個 別 體 重 變 異 而 換 算 出 應 給 予 直 接 管 灌 之 試 驗 樣 品 劑 量 此 劑 量 換 算 方 法 提 供 業 界 參 考, 非 強 制 性 依 據, 但 使 用 其 他 換 算 方 法 時, 應 附 其 明 確 之 資 料 來 27
源 ( 三 ) 實 驗 測 定 項 目 : 在 進 行 相 關 成 分 測 定 時, 可 參 考 以 下 建 議 之 方 法, 亦 得 使 用 有 學 理 根 據 之 適 當 方 法 或 具 公 信 之 市 售 套 組 進 行 分 析 1. 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 (1)AST (GOT) (2)ALT (GPT) (3)TG (4) 膽 固 醇 (5) 白 蛋 白 所 採 之 大 鼠 血 液 樣 品 在 室 溫 下 放 置 約 1 小 時, 使 其 凝 結, 再 利 用 冷 凍 離 心 機 於 4 下, 以 14,000 g 離 心 5 分 鐘, 分 離 出 血 清 再 以 血 液 自 動 生 化 分 析 儀 檢 測 肝 功 能 生 化 指 數, 包 括 AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 等, 其 中 AST (GOT) 及 ALT (GPT) 檢 測 原 理 是 依 據 Reitman 與 Frankel(1957) 及 國 際 聯 邦 臨 床 化 學 (IFCC, 1986) 的 標 準 方 法 另 必 須 測 定 肝 重 / 體 重 (%) 等 指 標 ( 四 ) 組 織 病 理 切 片 觀 察 : 在 8 星 期 試 驗 期 結 束 時, 將 所 有 大 鼠 均 予 以 犧 牲, 採 血 後, 將 最 大 右 葉 肝 臟 割 取 約 1 公 分 見 方 的 組 織 塊, 放 入 10% 的 中 性 福 馬 林 中 固 定,, 做 進 一 步 的 病 理 切 片 與 染 色 進 行 H&E 染 色, 以 觀 察 肝 細 胞 的 受 損 壞 死 纖 維 化 等 慢 性 肝 損 傷 變 化, 並 進 行 膠 原 蛋 白 的 特 殊 染 色, 例 如 Masson s trichrome 染 色 或 其 他 適 合 之 染 色 方 法, 以 便 評 估 纖 維 化 程 度 肝 炎 與 肝 硬 化 的 評 估 可 依 國 際 通 用 的 肝 炎 組 織 學 活 動 性 指 數 (histology activity index, HAI score) 分 析, 把 肝 炎 活 性 依 門 脈 區, 門 脈 周 邊, 及 肝 小 葉 區 各 別 分 析, 給 予 0~10 分 的 評 估 分 數, 其 總 和 代 表 肝 炎 活 性 ( 表 一 ) 肝 纖 維 化 28
則 依 Metavir score 分 為 5 級 ( 圖 二 ), 包 括 :F0: 沒 有 肝 纖 維 化,F1: 門 脈 纖 維 化,F2: 少 量 纖 維 間 壁,F3: 許 多 纖 維 間 壁,F4: 肝 硬 化 為 了 避 免 觀 察 時 主 觀 上 的 偏 差, 所 有 的 組 織 病 理 切 片 都 由 最 大 右 葉 肝 的 同 一 位 置 切 取 下 來, 進 行 病 理 染 色 至 於 病 理 的 半 定 量 分 析 之 評 估, 則 應 由 獸 醫 病 理 醫 師, 在 不 清 楚 本 實 驗 設 計 的 情 況 下 進 行 單 盲 判 讀, 對 所 有 切 片 進 行 評 分 比 較, 最 後 再 以 統 計 分 析 方 法 進 行 各 組 差 異 性 的 分 析 病 理 切 片 之 照 片 應 提 供 高 解 析 度 之 彩 色 圖 檔 ; 照 片 應 統 一 以 中 央 靜 脈 (central vein, CV) 或 門 靜 脈 (portal vein, PV) 為 中 心 拍 照, 若 為 各 組 之 間 的 比 較, 顯 微 鏡 的 放 大 倍 率 須 一 致 表 一 肝 炎 組 織 學 活 動 性 指 數 門 脈 發 炎 分 數 沒 有 門 脈 發 炎 0 輕 微 門 脈 發 炎 (<1/3) 1 中 度 門 脈 發 炎 (1/3~2/3) 3 重 度 門 脈 發 炎 (>2/3) 4 肝 小 葉 區 發 炎 沒 有 肝 小 葉 區 發 炎 0 輕 微 肝 小 葉 區 發 炎 ( 佔 肝 小 葉 區 <1/3) 1 中 度 肝 小 葉 區 發 炎 ( 佔 肝 小 葉 區 1/3~2/3) 3 重 度 肝 小 葉 區 發 炎 ( 佔 肝 小 葉 區 >2/3) 4 門 脈 周 邊 發 炎 沒 有 門 脈 周 邊 發 炎 0 輕 微 零 碎 性 壞 死 ( 小 於 門 脈 周 邊 10%) 1 中 度 零 碎 性 壞 死 ( 小 於 門 脈 周 邊 50%) 3 重 度 零 碎 性 壞 死 ( 大 於 門 脈 周 邊 50%) 4 中 度 零 碎 性 壞 死 加 上 橋 狀 壞 死 5 重 度 零 碎 性 壞 死 加 上 橋 狀 壞 死 6 多 小 葉 壞 死 10 29
F3 F4 圖 二 Metavire score 分 析 肝 纖 維 化 F0: 沒 有 肝 纖 維 化,F1: 門 脈 纖 維 化,F2: 少 量 纖 維 間 壁,F3: 許 多 纖 維 間 壁,F4: 肝 硬 化 1. 組 織 包 埋 和 切 片 將 最 大 右 葉 肝 割 取 的 約 l 公 分 見 方 的 組 織 塊, 置 入 10% 的 中 性 福 馬 林 中 固 定 其 組 織 形 態 及 結 構, 接 著 以 不 同 濃 度 之 乙 醇 (30 50 70 95 99.5%) 與 二 甲 苯 (xylene) 進 行 脫 水 與 透 明 化 步 驟, 再 以 熱 石 臘 溶 液 取 代 二 甲 苯, 最 後 將 組 織 以 石 蠟 溶 液 進 行 包 埋 完 成 的 石 蠟 標 本 利 用 切 片 機 切 成 5 μm 的 連 續 石 蠟 切 片, 將 切 下 來 的 切 片 沾 黏 在 乾 淨 的 載 玻 片 上, 於 37 C 烘 乾 後 可 做 進 一 步 的 病 理 染 色 2. 蘇 木 紫 - 伊 紅 (haematoxylin-eosin, H&E) 染 色 法 將 肝 臟 組 織 切 片 置 入 二 甲 苯 30 分 鐘 脫 蠟, 再 依 序 置 於 99.5 95 70 50 及 30% 之 乙 醇 各 30 分 鐘 以 進 行 復 水, 最 後 浸 泡 於 蒸 餾 水 10 分 鐘 後 即 可 進 行 染 色 首 先 浸 泡 蘇 木 紫 30 秒 染 細 胞 核, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘, 接 著 使 用 伊 紅 染 色 2-5 分 鐘, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘 完 成 染 色 過 程 後 進 行 脫 水 步 驟, 依 序 放 置 於 50 70 95 及 100% 乙 醇 各 2 次, 每 次 30 秒, 再 以 二 甲 苯 進 行 透 明 化 2 次, 最 後 以 蓋 玻 片 封 存 3. Masson s trichrome 染 色 法 切 片 先 經 二 甲 苯 的 脫 臘 和 乙 醇 復 水 後, 將 處 理 過 的 切 片 放 在 Bouin 氏 溶 液 中 固 定 7 分 鐘, 然 後 水 洗 約 10 分 鐘 至 切 片 上 黃 色 消 失, 再 將 切 片 以 Weigert's 30
iron hematoxylin 溶 液 染 色 10 分 鐘, 用 溫 的 流 水 洗 10 分 鐘, 再 用 蒸 餾 水 稍 沖 洗 切 片 ; 再 以 Biebrich scarlet-acid fuchsin solution 染 7 分 鐘, 用 蒸 餾 水 稍 沖 洗 切 片, 用 phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution 染 5 分 鐘, 用 蒸 餾 水 稍 沖 洗, 再 用 aniline blue solution 染 5 分 鐘, 以 作 對 比 染 色, 用 蒸 餾 水 再 稍 沖 洗 之, 置 於 1% acetic acid solution 染 3 分 鐘, 後 用 蒸 餾 水 稍 沖 洗 切 片 完 成 染 色 過 程 後 進 行 脫 水 步 驟, 依 序 放 置 於 50% 乙 醇 中 30 秒 70% 乙 醇 中 30 秒 95% 乙 醇 中 20 秒 100% 乙 醇 中 20 秒 100% 乙 醇 中 30 秒, 再 用 二 甲 苯 進 行 透 明 化 2 次, 最 後 以 蓋 玻 片 封 存 4. Gomori 網 狀 纖 維 染 色 法 (1) 試 劑 的 配 製 : 取 10% 硝 酸 銀 3 份, 加 入 10% 的 氫 氧 化 鉀 1 份, 混 合 後 產 生 大 量 的 黑 色 沉 澱 物, 倒 去 表 面 的 液 體, 保 留 下 沉 澱 物, 加 入 0-20 倍 或 更 多 的 蒸 餾 水 進 行 沖 洗, 連 續 沖 洗 3 次 待 沉 澱 物 清 晰 則 可 用 濃 氨 水 逐 滴 加 到 溶 液 中 使 沉 澱 物 逐 步 溶 解 待 見 沉 澱 物 剩 少 數 幾 顆 時, 再 取 10% 的 硝 酸 銀 液 加 入 數 滴, 至 溶 液 再 現 渾 濁 為 止 再 用 氨 水 將 其 溶 解, 然 後 稀 釋 10-15 倍, 即 可 使 用 平 時 保 存 於 4 冰 箱 中 (2) 操 作 步 驟 : 首 先 將 切 片 脫 蠟, 以 蒸 餾 水 沖 洗 後, 用 0.5% 高 錳 酸 鉀 溶 液 氧 化 5 分 鐘, 再 以 自 來 水 沖 洗, 繼 用 蒸 餾 水 洗, 用 2% 草 酸 漂 白 切 片 2 分 鐘, 自 來 水 洗, 蒸 餾 水 洗, 接 著 用 2% 硫 酸 鐵 銨 媒 染 5 分 鐘, 水 洗, 蒸 餾 水 洗, 滴 入 氨 性 銀 溶 液 浸 染 3-5 分 鐘, 蒸 餾 水 洗 數 次, 再 以 10% 甲 醛 液 還 原 5-10 分 鐘, 水 洗 2 分 鐘, 用 核 固 紅 染 色 10-15 分 鐘, 水 洗 10 分 鐘 後, 以 不 同 級 酒 精 與 二 甲 苯 逐 次 脫 水, 最 後 以 中 性 樹 膠 封 片 此 染 色 法 結 果 會 顯 示 網 狀 纖 維 為 黑 色, 膠 原 纖 維 為 黃 棕 色, 而 核 為 紅 色 ( 五 ) 肝 臟 膠 原 蛋 白 的 定 量 : 因 為 每 7.46 克 膠 原 蛋 白 中 含 有 1 克 之 hydroxyproline, 因 此 測 量 31
hydroxyproline 的 含 量, 即 可 求 得 膠 原 蛋 白 試 樣 的 原 始 濃 度 先 以 chloramine T 將 hydroxyproline 氧 化 成 pyrrole, 並 進 一 步 與 Erlich's reagent 反 應 呈 色, 藉 由 分 析 試 樣 中 hydroxyproline 含 量 即 可 推 算 試 樣 中 膠 原 蛋 白 的 含 量 首 先 將 hydroxyproline 酸 解, 使 樣 品 最 後 溶 於 6N HCl, 並 置 於 長 玻 璃 管 中, 於 110 恆 溫 烘 箱 中 反 應 24 小 時, 室 溫 下 冷 卻 後, 將 長 玻 璃 管 蓋 子 打 開, 進 行 真 空 乾 燥, 約 需 時 5-7 天, 待 試 樣 完 全 乾 燥, 加 入 citric phosphate buffer 回 溶 後, 分 裝 於 96 孔 免 疫 酵 素 分 析 測 定 盤 (96 well ELISA plate) 中, 於 55 烘 箱 中 反 應 60 分 鐘 再 將 待 測 試 樣 及 不 同 濃 度 的 標 準 液 各 取 80 μl 加 入 96 孔 免 疫 酵 素 分 析 測 定 盤 中, 再 加 入 125 μl chloramine T solution, 室 溫 下 混 合 均 勻 後, 靜 置 反 應 20 分 鐘, 在 每 個 孔 中 加 入 Erlich's reagent 125 μl, 混 合 均 勻 後, 以 矽 膠 片 包 覆 96 孔 免 疫 酵 素 分 析 測 定 盤 並 固 定 之 在 75 水 浴 槽 中 反 應 16 分 鐘 後, 小 心 取 出 測 定 盤, 迅 速 置 入 冰 水 浴 中 5 秒 鐘, 將 盤 外 冰 水 拭 去, 立 刻 移 至 自 動 免 疫 酵 素 分 析 儀 (ELISA reader), 測 定 550 nm 吸 光 值 以 所 測 得 標 準 液 的 吸 光 值 對 濃 度 作 標 準 曲 線 後 反 推 計 算 試 樣 中 hydroxyproline 濃 度 膠 原 蛋 白 濃 度 = Hydroxyproline 濃 度 7.46 ( 六 ) 實 驗 數 據 統 計 分 析 : 選 擇 適 當 的 生 物 統 計 方 法 分 析, 比 較 試 驗 組 於 試 驗 前 後 上 述 各 指 標 值 ( 即 試 驗 的 起 始 值 結 束 值 ) 之 結 果 變 化, 以 及 試 驗 組 與 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 間 的 比 較 是 否 具 統 計 上 之 顯 著 改 善 (p < 0.05) 本 評 估 方 法 必 須 進 行 組 間 的 統 計 比 較, 例 如 先 以 ANOVA(analysis of variance) 比 較, 有 明 顯 差 異 時, 再 以 Duncan's multiple range test 同 時 比 較 各 組 別 間 之 差 異, 以 評 估 該 試 驗 樣 品 的 最 適 劑 量, 以 及 相 對 於 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 明 確 的 改 善 功 效 然 後 加 以 綜 合 判 斷 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 保 護 肝 臟 或 可 降 低 其 中 某 項 危 險 因 子 之 功 能 選 擇 適 當 的 生 物 統 計 方 法 分 析, 比 較 試 驗 組 於 試 驗 前 後 上 述 各 指 標 值 ( 即 試 驗 的 起 始 值 結 束 值 ) 之 變 化 結 果, 以 及 試 驗 組 與 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 間 的 比 較 是 否 具 統 計 上 之 顯 著 改 善 (p < 0.05) 本 評 估 方 法 必 須 進 行 組 間 的 統 計 比 較 32
分 析, 例 如 先 以 ANOVA(analysis of variance) 比 較, 有 明 顯 差 異 時, 再 以 Duncan's multiple range test 同 時 比 較 各 組 別 間 之 差 異, 以 評 估 該 試 驗 樣 品 的 最 適 劑 量, 以 及 該 試 驗 樣 品 與 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 間 的 功 效 比 較 然 後 加 以 綜 合 判 斷 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 保 護 肝 臟 或 可 降 低 其 中 某 項 危 險 因 子 之 功 能 三 評 估 方 法 之 測 定 項 目 原 則 ( 一 ) 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 :AST (GOT) ALT (GPT) 選 測 :TG 膽 固 醇 白 蛋 白 ( 二 ) 病 理 切 片 觀 察 必 測 :H&E 染 色 且 下 列 三 染 色 法 選 一 必 測 : 1. Masson s trichrome 染 色 法 2. Gomori 網 狀 纖 維 染 色 法 3. Sirius red 染 色 法 ( 三 ) 肝 臟 組 織 選 測 : 肝 臟 膠 原 蛋 白 (collagen) 定 量 分 析 ( 四 ) 必 測 : 記 錄 慢 性 實 驗 期 間 動 物 每 週 體 重 肝 重 / 體 重 (%) 死 亡 率 及 其 他 相 關 之 測 定 項 目 ( 五 ) 得 增 加 測 定 其 他 適 當 的 肝 纖 維 化 指 標, 例 如 MMP-2 TIMP-1 等 項 目 四 結 果 判 定 之 基 準 由 以 上 血 清 與 肝 臟 之 各 項 測 定 值 病 理 切 片 觀 察 結 果, 並 加 上 其 他 相 關 測 定 項 目 之 數 據, 經 統 計 分 析 後 所 得 之 客 觀 結 果, 加 以 綜 合 評 估 判 斷 五 宣 稱 廣 告 與 產 品 標 示 受 試 產 品 進 行 以 本 評 估 方 法 推 薦 之 試 驗 方 法, 且 獲 得 明 確 之 有 效 結 果 時, 得 33
向 中 央 衛 生 主 管 機 關 申 請 與 實 驗 結 果 相 符 的 宣 稱 廣 告 或 產 品 介 紹, 例 如 僅 降 低 ALT 或 AST 者, 不 得 廣 泛 宣 稱 能 預 防 或 改 善 肝 纖 維 化, 或 誤 導 以 為 亦 可 改 善 肝 硬 化 或 肝 癌 之 功 效 凡 能 降 低 血 清 ALT AST 及 減 少 組 織 切 片 肝 纖 維 化 狀 況 的 產 品, 得 宣 稱 廣 告 或 介 紹 經 動 物 實 驗, 攝 取 本 產 品 有 助 於 延 緩 硫 代 乙 醯 胺 誘 導 之 肝 纖 維 化 或 降 低 其 危 險 因 子 或 其 他 相 近 具 科 學 依 據 的 詞 句 34
肆 針 對 應 用 酒 精 液 態 飼 料 誘 導 酒 精 性 脂 肪 肝 一 前 言 飲 酒 是 人 類 共 通 的 行 為, 各 種 族 雖 有 不 同 的 飲 酒 文 化, 卻 同 樣 會 因 飲 酒 過 量 而 產 生 各 種 併 發 症, 在 許 多 國 家 裡 酗 酒 已 成 為 重 大 的 問 題 致 於, 每 日 要 喝 多 少 酒 才 會 對 肝 臟 造 成 傷 害 呢? 一 般 而 言, 長 期 每 日 攝 取 80 克 酒 精 即 可 能 造 成 肝 臟 損 傷 ; 而 對 病 毒 性 肝 炎 ( 例 如 慢 性 B 型 肝 炎 ) 患 者, 酒 精 會 加 劇 肝 臟 的 傷 害 酒 精 性 肝 病 變 可 分 成 酒 精 性 脂 肪 肝 酒 精 性 肝 炎 及 酒 精 性 肝 硬 化 臨 床 上, 酒 精 性 脂 肪 肝 患 者 之 肝 功 能 檢 查 ( 例 如 AST ALT) 可 能 仍 正 常 或 僅 輕 度 異 常 急 性 酒 精 性 肝 炎, 臨 床 上 並 不 常 見, 它 的 症 狀 包 括 發 燒 疲 倦 厭 食 體 重 減 輕 肝 臟 腫 大 且 壓 痛 黃 疸 白 血 球 升 高 營 養 不 良 等 現 象, 實 驗 室 血 液 生 化 檢 查 可 發 現 明 顯 肝 臟 發 炎 現 象 (AST/ALT 值 上 升 ) 酒 精 性 肝 硬 化 的 特 點 是 小 結 節 性 肝 硬 化, 病 人 可 出 現 門 脈 高 壓, 食 道 與 / 或 胃 靜 脈 瘤 出 血, 甚 至 腹 水 之 情 形 脂 肪 肝 在 臨 床 上, 一 般 區 分 為 酒 精 性 與 非 酒 精 性 脂 肪 肝, 而 酒 精 性 肝 病 變 (alcoholic liver disease, ALD) 一 直 是 臨 床 上 經 常 發 現 的 典 型 脂 肪 肝 形 成 病 因, 就 至 今 研 究 文 獻 尚 未 完 全 瞭 解 酒 精 導 致 肝 臟 病 變 的 病 理 機 制, 因 此 酒 精 性 肝 病 變 的 動 物 模 式 的 開 發 與 建 立 對 於 此 領 域 研 究 發 展 更 顯 重 要 性 ROS 可 經 由 許 多 路 徑 造 成 肝 臟 損 傷, 一 項 應 用 小 鼠 實 驗 模 式 的 研 究 發 現 短 時 間 攝 入 大 量 酒 精 會 導 致 肝 細 胞 損 傷, 主 要 是 由 於 粒 線 體 DNA 耗 損 及 脂 質 過 氧 化 而 啟 動 肝 細 胞 凋 亡 與 壞 死, 尤 以 單 一 劑 量 5 g/kg bw 的 酒 精 劑 量 攝 入, 會 造 成 單 股 DNA 的 裂 解, 此 現 象 會 自 酒 精 攝 入 後 1 小 時 持 續 上 升 至 6 小 時 達 到 最 高 點 其 機 制 為 粒 線 體 內 脂 質 過 氧 化 氫 的 形 成 而 造 成 粒 線 體 氧 化 功 能 損 傷, 進 而 導 致 還 原 態 麩 胱 甘 肽 (GSH) 耗 損, 以 致 使 得 肝 臟 對 過 氧 化 傷 害 的 保 護 功 能 降 低 但 大 量 急 性 的 酒 精 攝 取 較 不 符 合 人 類 對 於 酒 精 攝 取 的 行 為, 因 此 慢 性 酒 精 攝 入 的 實 驗 動 物 模 式 則 較 類 似 人 類 的 酒 精 攝 取 行 為 C57BL/6 為 C57 black 6, 通 常 會 被 簡 稱 為 C57 或 B6, 毛 色 為 黑 色, 屬 於 近 交 品 系 的 實 驗 小 鼠, 此 種 小 鼠 被 廣 泛 使 用 是 因 其 具 有 易 配 種 生 育 且 強 健, 經 常 應 35
用 於 一 般 研 究 飲 食 誘 發 性 研 究 基 因 剔 除 動 物 模 式 研 究 安 全 試 驗 研 究 及 免 疫 相 關 研 究 此 品 系 於 1921 年 由 Dr. Little 取 自 Miss Lathrop 的 種 原, 利 用 57 系 母 鼠 與 52 系 公 鼠 配 種 而 來 ;1937 年 育 成 旁 系 (6 系 與 10 系 ) 目 前 最 廣 為 研 究 人 員 使 用 的 品 系 C57BL/6, 而 C57BL/6(B6) 在 國 內 是 使 用 量 第 二 的 近 交 品 系 鼠, 在 美 國 其 使 用 量 則 為 第 一 位 ( 佔 14%), 常 用 被 當 作 標 準 的 近 交 品 系 使 用, 可 避 免 遠 交 品 系 的 個 體 差 異 性, 且 其 易 造 成 具 有 酒 精 成 癮 性 與 飲 食 誘 導 疾 病 的 應 用 根 據 相 關 研 究 指 出, 給 予 C57BL/6(B6) 小 鼠 酒 精 液 態 飼 料 4 週 後 觀 察 其 肝 損 傷 之 情 況, 其 肝 臟 重 與 體 重 比 例 顯 著 性 增 加, 且 其 血 液 生 化 值 中 AST (GOT) ALT (GPT) 三 酸 甘 油 酯 (TG) 及 膽 固 醇 都 明 顯 高 於 控 制 組, 而 肝 臟 組 織 切 片 亦 呈 現 嚴 重 脂 質 堆 積 現 像, 現 今 已 知 酒 精 造 成 肝 臟 脂 肪 堆 積 之 機 制 主 要 起 因 於 乙 醇 經 轉 化 為 乙 醛 再 轉 變 為 乙 酸 過 程 中, 一 連 串 的 反 應 抑 制 了 粒 線 體 功 能 造 成 脂 質 代 謝 紊 亂, 延 緩 TG 的 輸 出 而 在 肝 細 胞 堆 積 此 外 肝 細 胞 的 脂 質 變 性 亦 可 引 發 相 關 免 疫 反 應, 而 酒 精 代 謝 所 造 成 的 毒 性 則 會 破 壞 肝 細 胞 存 活 而 造 成 死 亡, 繼 而 造 成 肝 炎 發 生 酒 精 對 肝 臟 慢 性 傷 害 的 研 究 文 獻 中 所 使 用 的 實 驗 動 物 模 式 主 要 是 長 期 餵 飼 Lieber-DeCarli Diet 來 誘 導 酒 精 性 肝 病 變 (Lieber 與 DeCarli 是 首 先 以 動 物 模 式 證 實 酒 精 對 於 肝 臟 的 毒 性 效 果 而 命 名 ), 他 們 是 應 用 飼 料 成 分 中 原 由 碳 水 化 合 物 提 供 動 物 所 需 總 能 量 之 36% 的 部 份, 以 酒 精 取 代 而 成 之 液 態 飼 料 來 誘 導 慢 性 酒 精 性 肝 臟 損 傷 試 驗 結 果 顯 示 實 驗 動 物 發 展 為 脂 肪 肝, 且 伴 有 肝 臟 之 三 酸 甘 油 酯 與 膽 固 醇 含 量 上 升, 而 控 制 組 動 物 則 仍 保 有 正 常 的 肝 臟 ( 即 非 因 年 齡 等 因 素 造 成 脂 肪 肝 ) 此 一 應 用 Lieber-DeCarli Diet 誘 導 肝 病 變 之 實 驗 動 物 模 式, 已 成 為 主 要 的 誘 發 酒 精 性 脂 肪 肝 動 物 模 式, 且 沿 用 至 今 二 實 驗 項 目 與 實 驗 方 法 ( 一 ) 執 行 單 位 與 執 行 人 : 本 評 估 試 驗 原 則 上 應 委 託 具 有 充 分 設 備 之 國 內 外 大 學 食 品 營 養 醫 藥 等 相 關 研 究 所 教 學 醫 院 以 上 之 醫 療 機 構 或 具 公 信 力 之 研 究 機 構 執 行, 以 維 持 客 36
觀 與 可 靠 性 試 驗 計 畫 主 持 人 必 須 具 備 足 夠 與 肝 臟 生 理 代 謝 相 關 之 專 業 背 景 與 研 究 經 驗 或 著 作 ; 試 驗 必 須 事 先 經 過 執 行 單 位 之 動 物 試 驗 委 員 會 審 查 通 過 ( 二 ) 實 驗 設 計 : 建 議 實 驗 動 物 採 用 雄 性 8-10 週 齡 之 C57BL/6 (B6) 小 鼠, 起 始 體 重 約 20 克, 每 組 至 少 10 隻 動 物 必 須 來 自 公 立 研 究 機 構 公 私 立 大 學 或 其 他 中 央 衛 生 主 管 機 關 認 可 之 實 驗 動 物 中 心 動 物 之 飼 養 宜 在 恆 溫 (22 ± 2 ) 亮 暗 各 12 小 時 之 動 物 房 飼 養 或 處 理 時 應 避 免 動 物 驚 嚇, 且 每 次 必 須 前 後 一 致, 避 免 誤 差 值 過 大 本 評 估 試 驗 之 實 驗 組 別 應 包 括 1. 正 常 對 照 組 : 攝 取 正 常 飲 食 ;2. 負 控 制 組 : 攝 取 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 ;3. 試 驗 組 : 動 物 給 予 與 負 控 制 組 完 全 相 同 之 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 處 理, 並 分 別 另 給 予 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品, 其 中 一 組 的 劑 量 必 須 相 當 於 人 體 的 建 議 攝 取 量, 且 於 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 誘 導 肝 損 傷 前 一 星 期 即 開 始 給 予 試 驗 樣 品 試 驗 原 始 數 據 紀 錄 必 須 保 留 供 查 核 1. 試 驗 方 法 : 本 評 估 方 法 係 採 以 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 誘 導 C57BL/6 (B6) 小 鼠 酒 精 性 脂 肪 肝 損 傷 的 實 驗 模 式, 本 方 法 中 之 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 配 方 僅 供 參 考 ( 表 一 ), 亦 可 選 擇 其 他 適 當 市 售 流 質 酒 精 飼 料 37
表 一 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 配 方 ( 僅 供 參 考 ) 實 驗 前 將 性 成 熟 C57BL/6 (B6) 小 鼠 依 體 重 以 逢 機 法 平 均 分 配 至 各 組, 動 物 至 少 分 成 4 組, 每 組 至 少 10 隻 : (1)A 組 為 正 常 對 照 組 : 自 由 進 食 正 常 飼 料 + 經 口 (peroral, per os, P.O.) 管 餵 去 離 子 水 (2)B 組 為 負 控 制 組 ( 肝 損 傷 組 ): 自 由 進 食 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 + 經 口 (P.O.) 管 餵 去 離 子 水 (3) 試 驗 組 至 少 2 組 (C D 組 ), 視 實 驗 設 計 需 要 可 再 增 加 組 別 : 自 由 進 食 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 + 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品 (P.O.), 其 中 之 一 劑 量 須 與 換 算 的 人 類 建 議 攝 取 量 相 同 2. 試 驗 步 驟 : A 組 ( 正 常 對 照 組 ) 自 由 進 食 正 常 飼 料 ;B~D 組 動 物 自 由 進 食 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料, 以 誘 導 肝 損 傷 ( 試 驗 前 1 週 需 逐 步 增 加 酒 精 飼 料 中 酒 精 含 量 讓 實 驗 動 物 適 應 含 酒 精 之 液 態 飼 料 ) A B 組 每 日 管 餵 去 離 子 水 ;C D 組 則 於 Lieber-DeCarli 流 質 酒 精 飼 料 誘 導 肝 損 傷 前 1 星 期 開 始 每 日 給 予 試 驗 樣 品 ( 前 後 共 為 期 5~7 週 ) 38
所 有 實 驗 動 物 於 餵 食 酒 精 飼 料 的 前 1 週 與 第 0 週, 採 血 前 8~12 小 時 禁 食, 並 於 投 予 試 驗 樣 品 或 去 離 子 水 後 4 小 時, 以 眼 窩 或 臉 頰 採 血 方 式 檢 測 肝 臟 的 生 化 功 能 :AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 葡 萄 糖 最 後 於 酒 精 飼 料 誘 導 肝 損 傷 第 4~6 週 結 束 時, 秤 重 後 全 部 犧 牲, 可 從 心 臟 或 腹 大 動 脈 採 血 檢 驗 肝 臟 生 化 功 能, 並 剖 腹 取 肝 臟 標 本, 秤 重 後 比 較 其 肝 重 / 體 重 比, 並 將 最 大 右 葉 肝 割 取 約 0.5 公 分 見 方 之 組 織 塊, 固 定 於 10% 的 中 性 福 馬 林 (formalin) 液 中, 石 蠟 包 封 切 片 後 分 別 作 蘇 木 紫 - 伊 紅 染 色 (haematoxylin-eosin stain, H&E stain) 來 進 行 組 織 病 理 學 觀 察 另 外, 利 用 其 餘 肝 臟 進 行 檢 測 抗 氧 化 成 分 GSH 與 GPx GRd SOD catalase 等 酵 素 活 性 及 肝 臟 TG 膽 固 醇 含 量 變 化 3. 實 驗 動 物 與 人 體 間 試 驗 劑 量 之 換 算 : 以 管 灌 (gavage feeding) 方 式 給 予 受 試 樣 品 時, 一 般 的 認 知, 身 體 的 新 陳 代 謝 速 率 與 其 體 表 面 積 的 相 關 性, 明 顯 超 過 與 其 體 重 之 相 關 性 然 而, 要 精 確 測 量 其 體 表 乃 非 常 不 易, 而 即 使 在 同 一 物 種 (species) 內 之 體 表, 其 與 體 重 間 並 沒 有 一 簡 單 正 確 的 公 式 可 換 算, 且 其 關 係 又 會 隨 著 體 重 和 體 型 的 改 變 而 與 體 表 之 關 係 係 數 呈 現 不 規 則 的 變 異, 因 此 在 實 驗 期 間 之 試 驗 劑 量 要 維 持 與 其 代 謝 率 之 固 定 相 關 性 ; 或 人 體 與 動 物 間 之 試 驗 劑 量 要 精 確 的 換 算 有 其 實 際 的 困 難 本 評 估 方 法 的 人 體 與 高 等 實 驗 動 物 間 試 驗 劑 量 間 之 換 算, 原 則 上 根 據 2005 年 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 所 公 告 之 實 驗 初 期 估 算 方 法 (Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers), 而 以 60 公 斤 之 成 人 為 基 準 使 用 高 等 實 驗 動 物 進 行 試 驗 時, 其 劑 量 之 換 算 原 則 上 以 人 體 每 日 每 公 斤 體 重 之 建 議 攝 取 量 (/kg bw/d) 的 12.3 倍 作 為 小 鼠 之 1 倍 劑 量, 其 他 動 物 或 更 詳 細 的 換 算 可 參 閱 該 方 法 http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/ Guidances/ucm078932.pdf 另 換 算 之 本 換 算 方 法 適 用 於 根 據 每 天 每 隻 動 物 之 個 別 體 重 變 異 而 換 算 出 應 給 予 直 接 管 灌 之 試 驗 樣 品 劑 量 此 劑 量 換 算 方 法 提 供 業 界 參 考, 非 強 制 性 依 據, 但 使 用 其 他 換 算 方 法 時, 應 附 其 明 確 之 資 料 來 源 39
( 三 ) 實 驗 測 定 項 目 : 在 進 行 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 之 分 析 方 面 : 測 定 時, 可 參 考 以 下 建 議 之 方 法, 亦 得 使 用 有 學 理 根 據 之 適 當 方 法 或 具 公 信 之 市 售 套 組 進 行 分 析 1. 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 (1)AST (GOT) (2)ALT (GPT) (3)TG (4) 膽 固 醇 (5) 葡 萄 糖 2. 肝 臟 : 測 定 各 種 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 (1)Glutathione (GSH) (2)Glutathione peroxidase (GPx) (3)Glutathione reductase (GRd) (4)Superoxide dismutase (SOD) (5)Catalase (CAT) (6)TG (7) 膽 固 醇 ( 四 ) 肝 功 能 生 化 指 數 的 檢 測 : 所 採 之 小 鼠 血 液 樣 品 在 室 溫 下 放 置 約 1 小 時, 使 其 凝 結, 再 利 用 冷 凍 離 心 機 於 4 下 以 14,000 x g 離 心 5 分 鐘, 分 離 出 血 清, 再 以 自 動 生 化 分 析 儀 檢 測 肝 功 能 生 化 指 數, 如 AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 等, 其 中 AST (GOT) 及 ALT (GPT) 檢 測 原 理 是 依 據 Reitman 與 Frankel(1957) 及 國 際 聯 邦 臨 床 化 學 (IFCC, 1986) 的 標 準 方 法 並 進 行 肝 臟 抗 氧 化 功 能 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 之 分 析 如 下 另 必 須 測 定 肝 臟 TG 膽 固 醇 肝 重 / 體 重 (%) 等 肝 臟 脂 肪 堆 積 指 標 40
1. 麩 胱 甘 肽 (glutathione, GSH) 濃 度 之 分 析 參 考 Reed 等 人 (1980) 的 方 法 取 肝 組 織 約 0.3 克, 加 入 9 倍 (w/w) 的 50 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 均 質 1 分 鐘, 得 肝 組 織 均 質 液 樣 品 肝 組 織 均 質 後, 迅 速 取 均 質 液 400 L 加 入 等 量 10% 過 氯 酸 (perchloric acid, PCA) 混 合 後, 靜 置 40 分 鐘, 使 PCA 能 將 樣 品 中 還 原 態 麩 胱 甘 肽 (GSH) 充 分 溶 出 後, 於 4 下, 以 1,800 g 離 心 3 分 鐘, 取 上 層 液 待 測 至 於 沉 澱 部 分 則 加 入 1 ml 1 N NaOH 溶 解, 再 移 液 至 微 量 離 心 管 中 以 分 析 蛋 白 質 另 取 8.5 mg 之 還 原 態 麩 胱 甘 肽 及 7.2 mg 之 氧 化 態 麩 胱 甘 肽 所 製 備 好 的 標 準 品 與 上 述 所 得 之 樣 品 各 400 L, 加 入 40 L 碘 乙 酸 (iodoacetic acid, IAA: 100 mm), 使 還 原 態 麩 胱 甘 肽 與 IAA 結 合 後, 給 予 還 原 態 麩 胱 甘 肽 多 攜 帶 一 負 電 荷, 以 便 在 HPLC 分 析 中 能 比 GSSG 早 分 離 出 來 ; 再 緩 慢 加 入 碳 酸 氫 鉀 (KHCO 3 ) 直 到 不 再 起 泡 為 止, 此 時 已 中 和 酸 而 成 微 鹼 性, 以 便 可 在 高 效 能 液 相 層 析 儀 (HPLC) 中 分 析 然 後 置 於 暗 處 15 分 鐘 後, 再 加 入 440 L 3% 2,4- 二 硝 基 氟 苯 (2,4-dinitrofluorobenzene, FDNB) 振 盪 混 合 使 與 硫 元 素 反 應 成 黃 色 物 質, 而 此 黃 色 物 質 可 在 紫 外 光 偵 測 器 (UV detector: λ=365 nm) 中 被 偵 測 出 來 之 後 經 8 小 時 的 冷 藏, 再 以 1,800 g 離 心 3 分 鐘, 取 上 層 液 並 以 注 射 筒 過 濾 器 (syringe filter: 4 mm filter unit, 0.45 m Nylon) 濾 除 雜 質 最 後 以 HPLC 進 行 分 析 2. 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (glutathione peroxidase, GPx) 活 性 分 析 此 酵 素 之 分 析 主 要 是 依 據 Lawrence 與 Burk(1976) 所 報 告 之 方 法 活 性 測 定 係 以 過 氧 化 氫 (H 2 O 2 ) 為 受 質 還 原 態 麩 胱 甘 肽 (GSH) 經 由 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (GPx) 之 催 化 可 將 過 氧 化 氫 還 原, 而 還 原 態 麩 胱 甘 肽 則 變 成 氧 化 態 麩 胱 甘 肽, 然 後 氧 化 態 麩 胱 甘 肽 則 利 用 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 (GRd) 與 NADPH 將 其 還 原 回 還 原 態 麩 胱 甘 肽 取 肝 組 織 均 質 液 樣 品 5 L 及 95 L 20 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 加 入 0.8 ml 100 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 溶 液 (ph 7.0) 之 反 應 混 合 液 ( 含 1 mm EDTA 1 mm NaN 3 0.2 mm NADPH 1 U/mL GRd 及 1 mm GSH), 在 室 溫 下 靜 置 5 分 鐘, 再 加 入 0.1 ml 2.5 mm 過 氧 化 氫 後, 以 分 光 光 度 計 在 340 nm 下 測 3 分 鐘 (25 ), 計 算 NADPH 減 少 之 速 率, 間 接 求 出 麩 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 的 41
活 性, 而 以 去 離 子 水 5 L 當 作 空 白 組 本 活 性 (specific activity) 測 定 以 nmol NADPH/min/mg protein 表 示 3. 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 (glutathione reductase, GRd) 活 性 分 析 麩 胱 甘 肽 還 原 酶 活 性 分 析 是 依 據 Bellomo 等 人 (1987) 的 方 法 分 析 時 取 10 L 肝 組 織 均 質 液 樣 品 及 90 L 20 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0) 加 入 0.9 ml 含 有 1.1 mm MgCl 2 6H 2 O 5.0 mm GSSG 及 0.1 mm NADPH 之 100 mm 磷 酸 鉀 緩 衝 液 (ph 7.0), 再 以 分 光 光 度 計 在 340 nm 下 測 5 分 鐘 (25 ), 計 算 NADPH 減 少 的 速 率, 其 中 以 10 L 之 去 離 子 水 作 為 空 白 組 本 活 性 (specific activity) 測 定 以 nmol NADPH/min/mg protein 表 示 4. 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD) 活 性 分 析 實 驗 參 照 Marklund 與 Marklund(1974) 所 描 述 之 方 法 進 行, 將 肝 組 織 用 冰 生 理 食 鹽 水 (ice-cold saline) 洗 淨, 在 漏 斗 上 滴 乾 生 理 食 鹽 水, 加 入 適 量 緩 衝 液 (0.32 M sucrose l mm EDTA 10 mm Tris-HCl, ph 7.4) 打 碎 使 成 10% 之 均 質 液 (homogenate) 高 速 離 心 30 分 鐘 (13,600 g), 取 上 清 液 50 L, 再 加 上 Tris cacodylic acid buffer(ph 8.2, 50 mm)100 L 溶 液 再 加 上 超 純 水, 使 體 積 成 為 980 L, 再 加 上 鄰 苯 三 酚 (pyrogallol)20 L(0.2 mm), 劇 烈 搖 盪 混 均, 以 分 光 光 度 計 於 420 nm 測 量 吸 光 值 (A), 每 隔 20 秒 測 量 一 次, 總 共 測 量 5 分 鐘, 計 算 A/ T 分 析 過 程 中 以 SOD 標 準 品, 作 出 標 準 曲 線 (standard curve), 再 進 行 分 析 單 位 時 間 內 抑 制 鄰 苯 三 酚 自 動 氧 化 速 率 達 50% 時 之 酵 素 量, 定 為 一 單 位 (U); 肝 組 織 SOD 活 性, 以 每 單 位 蛋 白 質 所 含 SOD 單 位 量 表 示 (U per milligram of protein) 5. 過 氧 化 氫 酶 (catalase, CAT) 活 性 分 析 實 驗 參 照 Aebi(1984) 所 描 述 之 方 法 進 行 將 肝 組 織 用 生 理 食 鹽 水 (ice-cold saline) 洗 淨, 在 漏 斗 上 滴 生 理 食 鹽 水, 加 入 適 量 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液, 打 碎 使 成 10% 之 均 質 液 (homogenate) 離 心 (700 g)10 分 鐘, 取 上 層 液 9 份 加 入 1 份 Triton X-100 (1%) 成 為 儲 備 均 質 液 (stock homogenate, S.H.) 取 S.H. 加 入 42
適 量 之 磷 酸 緩 衝 溶 液 進 行 稀 釋, 調 整 酸 鹼 值 至 ph 7 成 為 稀 釋 均 質 液 (dilute homogenate, D.H.) 取 D.H. 2 ml 加 入 l ml H 2 O 2 (0.03 M), 劇 烈 搖 盪 混 均, 以 分 光 光 度 計 於 溫 控 25 波 長 240 nm 之 條 件 下 測 量 吸 光 值 (A), 每 隔 15 秒 測 量 一 次, 總 共 測 量 2 次, 計 算 求 得 反 應 速 率 常 數 K K=(2.3/ t)log(al/a2) t: 時 間 間 隔 (15 秒 鐘 ); A1: T1 時 段, 樣 品 之 吸 光 值 - 空 白 吸 光 值 ; A2: T2 時 段, 樣 品 之 吸 光 值 - 空 白 吸 光 值 肝 組 織 CAT 活 性, 以 每 單 位 蛋 白 質 所 含 反 應 速 率 K 表 示 之 (K/mg protein) 6. 蛋 白 質 濃 度 之 測 定 實 驗 參 照 Lowry 等 人 (1951) 之 方 法 進 行 取 適 量 蛋 白 質 樣 品, 並 以 1 N NaOH 調 整 使 其 最 終 體 積 為 100 L, 加 入 200 L 去 離 子 水 及 100 L 反 應 混 合 液 (25% Na 2 CO 3 : 2% Na-K-tartarate : 1% CuSO 4 = 8 : 1 : 1, v/v/v), 然 後 在 室 溫 下 靜 置 10 分 鐘, 加 入 1 ml Folin reagent(folin : H 2 O = 1 : 19.5, v/v) 後 於 37 水 浴 20 分 鐘, 並 在 室 溫 下 冷 卻, 最 後 在 分 光 光 度 計 以 660 nm 下 測 其 吸 光 值 (25 ) 將 標 準 曲 線 做 線 性 回 歸, 得 一 方 程 式, 將 所 得 樣 品 之 吸 光 值 代 入 此 一 元 一 次 方 程 式, 換 算 後 即 可 得 知 樣 品 之 蛋 白 質 含 量 ( 五 ) 組 織 病 理 切 片 觀 察 : 1. 組 織 包 埋 和 切 片 從 最 大 右 葉 肝 割 取 的 約 0.5 公 分 見 方 之 組 織 塊, 置 入 10% 的 中 性 福 馬 林 中 固 定 其 組 織 形 態 及 結 構, 接 著 以 不 同 濃 度 之 乙 醇 (30 50 70 95 99.5%) 與 二 甲 苯 (xylene) 進 行 脫 水 與 透 明 化 化 步 驟, 再 以 熱 石 臘 溶 液 取 代 二 甲 苯, 最 後 將 組 織 以 石 蠟 溶 液 進 行 包 埋 完 成 的 石 蠟 標 本 利 用 切 片 機 切 成 5 μm 的 連 續 石 蠟 切 片, 將 切 下 來 的 切 片 沾 黏 在 乾 淨 的 載 玻 片 上, 於 37 烘 乾 後 用 做 進 一 步 的 病 理 染 色 43
2. 蘇 木 紫 - 伊 紅 (haematoxylin-eosin, H&E) 染 色 法 將 肝 臟 組 織 切 片 置 入 二 甲 苯 30 分 鐘 脫 蠟, 再 依 序 置 於 99.5 95 70 50 及 30% 之 乙 醇 各 30 分 鐘 以 進 行 復 水, 最 後 浸 泡 於 蒸 餾 水 10 分 鐘 後 即 可 進 行 染 色 首 先 浸 泡 蘇 木 紫 30 秒 染 細 胞 核, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘, 接 著 使 用 伊 紅 染 色 2-5 分 鐘, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘 完 成 染 色 過 程 後 進 行 脫 水 步 驟, 依 序 放 置 於 50 70 95 及 100% 乙 醇 各 2 次, 每 次 30 秒, 再 以 二 甲 苯 進 行 透 明 化 2 次, 最 後 以 蓋 玻 片 封 存 3. 病 理 切 片 之 判 讀 本 評 估 方 法 將 肝 組 織 進 行 H&E 染 色, 以 方 便 觀 察 肝 細 胞 的 受 損 脂 肪 堆 積 壞 死 等 慢 性 肝 損 傷 之 變 化 ; 或 以 冷 凍 切 片 Oil-Red 染 色 觀 察 肝 細 胞 脂 肪 油 滴 的 堆 積 程 度 為 了 避 免 觀 察 主 觀 上 的 偏 差, 所 有 的 組 織 病 理 切 片 都 是 由 最 大 右 葉 肝 的 同 一 位 置 切 取 下 來, 進 行 病 理 染 色 至 於 病 理 的 半 定 量 分 析 評 估, 則 應 由 獸 醫 病 理 醫 師, 在 不 清 楚 本 實 驗 設 計 的 情 況 下 進 行 單 盲 判 讀, 對 所 有 切 片 進 行 評 分 比 較 ( 評 分 表 如 表 二 ), 最 後 再 以 統 計 分 析 方 法 進 行 各 組 差 異 性 的 分 析 病 理 切 片 之 照 片 應 提 供 高 解 析 度 之 彩 色 圖 檔 ; 照 片 應 統 一 以 中 央 靜 脈 (central vein, CV) 或 門 靜 脈 (portal vein, PV) 為 中 心 拍 照, 若 為 各 組 之 間 的 比 較, 顯 微 鏡 的 放 大 倍 率 須 一 致 ( 六 ) 實 驗 數 據 統 計 分 析 : 選 擇 適 當 的 生 物 統 計 方 法 分 析, 比 較 試 驗 組 於 試 驗 前 後 上 述 各 指 標 值 ( 即 試 驗 的 起 始 值 結 束 值 ) 之 結 果 變 化, 以 及 試 驗 組 與 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 間 的 比 較 是 否 具 統 計 上 之 顯 著 改 善 (p < 0.05) 本 評 估 方 法 必 須 進 行 組 間 的 統 計 比 較, 例 如 先 以 ANOVA(analysis of variance) 比 較, 有 明 顯 差 異 時, 再 以 Duncan's multiple range test 同 時 比 較 各 組 別 間 之 差 異, 以 評 估 該 試 驗 樣 品 的 最 適 劑 量, 以 及 相 對 於 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 明 確 的 改 善 功 效 然 後 加 以 綜 合 判 斷 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 保 護 肝 臟 或 可 降 低 其 中 某 項 危 險 因 子 之 功 能 選 擇 適 當 的 生 物 統 計 方 法 分 析, 比 較 試 驗 組 於 試 驗 前 後 上 述 各 指 標 值 ( 亦 即 試 44
驗 的 起 始 值 結 束 值 ) 之 變 化 結 果, 以 及 試 驗 組 與 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 間 的 比 較 是 否 具 統 計 上 之 顯 著 改 善 (p < 0.05) 本 評 估 方 法 必 須 進 行 組 間 的 統 計 比 較, 例 如 先 以 ANOVA(analysis of variance) 比 較, 有 明 顯 差 異 時, 再 以 Duncan's multiple range test 同 時 比 較 各 組 別 間 之 差 異, 以 評 估 該 試 驗 樣 品 的 最 適 劑 量, 以 及 相 對 於 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 明 確 的 改 善 功 效 然 後 加 以 綜 合 判 斷 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 保 護 肝 臟 或 可 降 低 其 中 某 項 危 險 因 子 之 功 能 三 評 估 方 法 之 測 定 項 目 原 則 ( 一 ) 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 :AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 選 測 : 葡 萄 糖 ( 二 ) 肝 臟 : 測 定 各 種 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 : Glutathione (GSH) Glutathione peroxidase (GPx) Superoxide dismutase (SOD) Catalase (CAT) TG 膽 固 醇 選 測 :Glutathione reductase (GRd) ( 三 ) 病 理 切 片 觀 察 必 測 :H&E 染 色 選 測 : 冷 凍 切 片 Oil-Red 染 色 ( 四 ) 必 測 : 記 錄 實 驗 期 間 動 物 每 週 體 重 肝 重 / 體 重 (%) 死 亡 率 及 其 他 相 關 之 測 定 項 目 四 結 果 判 定 之 基 準 由 以 上 血 清 與 肝 臟 之 各 項 測 定 值 病 理 切 片 觀 察 結 果 ( 參 考 表 二 ), 並 加 上 其 他 相 關 測 定 項 目 之 數 據, 經 統 計 分 析 後 所 得 之 客 觀 結 果, 加 以 綜 合 評 估 判 斷 45
表 二 病 理 切 片 評 估 脂 肪 肝 脂 肪 ( 脂 質 油 滴 ) 堆 積 於 肝 臟 中 比 例 正 常 0% 輕 微 < 10% 中 度 10~33% 嚴 重 33~66% 極 嚴 重 66~100% 五 宣 稱 廣 告 與 產 品 標 示 受 試 產 品 進 行 以 本 評 估 方 法 推 薦 之 試 驗 方 法, 且 獲 得 明 確 之 有 效 結 果 時, 得 向 中 央 衛 生 主 管 機 關 申 請 與 實 驗 結 果 相 符 的 宣 稱 廣 告 或 產 品 介 紹 凡 能 降 低 血 清 ALT AST, 並 能 減 少 組 織 切 片 之 肝 脂 肪 堆 積 的 產 品, 得 宣 稱 廣 告 或 介 紹 經 動 物 實 驗, 攝 取 本 產 品 有 助 於 延 緩 經 酒 精 誘 導 所 引 起 之 脂 肪 肝 或 降 低 其 危 險 因 子 或 其 他 相 近 具 科 學 依 據 的 詞 句 ; 但 僅 降 低 ALT/AST 者, 不 得 廣 泛 宣 稱 能 預 防 或 改 善 脂 肪 肝 本 方 法 之 試 驗 產 品 不 得 宣 稱 或 擴 大 解 釋 其 具 有 解 酒 之 功 效 46
伍 針 對 高 脂 飼 料 誘 導 非 酒 精 性 脂 肪 肝 一 前 言 近 年 來 許 多 研 究 指 出, 給 予 C57BL/6(B6) 小 鼠 高 脂 飼 料 並 監 測 其 體 重 變 化 於 12 週 後 其 體 重 即 有 明 顯 之 差 異, 並 於 17 週 後 觀 察 其 肝 損 傷 之 情 況, 其 肝 臟 重 與 體 重 比 例 顯 著 性 增 加, 且 其 血 液 生 化 值 中 AST (GOT) ALT (GPT) 三 酸 甘 油 酯 (TG) 及 膽 固 醇 都 明 顯 高 於 控 制 組, 而 肝 臟 組 織 切 片 亦 呈 現 嚴 重 脂 質 堆 積 現 像, 且 肝 臟 組 織 中 的 GPx 及 SOD 亦 呈 現 顯 著 性 差 異, 現 今 已 知 高 脂 飼 料 造 成 肝 臟 脂 肪 堆 積 之 機 制 主 要 起 因 於 過 多 的 游 離 脂 肪 酸 持 續 被 腸 道 吸 收 後 運 送 至 肝 臟 儲 存 與 堆 積, 一 連 串 的 脂 質 代 謝 反 應 抑 制 了 粒 線 體 功 能 造 成 脂 質 代 謝 紊 亂, 肝 臟 細 胞 脂 質 氧 化 能 力 下 降 且 延 緩 TG 的 輸 出 而 在 肝 細 胞 堆 積, 而 胰 島 素 抗 阻 之 作 用 亦 伴 隨 之 產 生 此 外, 肝 細 胞 的 脂 質 變 性 使 相 關 氧 化 傷 害 之 酵 素 活 性 增 加 以 去 除 多 於 自 由 基 產 生, 若 引 發 相 關 免 疫 反 應 便 會 破 壞 肝 細 胞 存 活 而 造 成 死 亡, 繼 而 造 成 脂 性 肝 炎 產 生 二 實 驗 項 目 與 實 驗 方 法 ( 一 ) 執 行 單 位 與 執 行 人 : 本 評 估 試 驗 原 則 上 應 委 託 具 有 充 分 設 備 之 國 內 外 大 學 食 品 營 養 醫 藥 等 相 關 研 究 所 教 學 醫 院 以 上 之 醫 療 機 構 或 具 公 信 力 之 研 究 機 構 執 行, 以 維 持 客 觀 與 可 靠 性 試 驗 計 畫 主 持 人 必 須 具 備 足 夠 與 肝 臟 生 理 代 謝 相 關 之 專 業 背 景 與 研 究 經 驗 或 著 作 ; 試 驗 必 須 事 先 經 過 執 行 單 位 之 動 物 試 驗 委 員 會 審 查 通 過 ( 二 ) 實 驗 設 計 : 建 議 實 驗 動 物 採 用 雄 性 8-10 週 齡 之 C57BL/6 (B6) 小 鼠, 起 始 體 重 約 20 克, 每 組 至 少 10 隻 動 物 必 須 來 自 公 立 研 究 機 構 公 私 立 大 學 或 其 他 中 央 衛 生 主 管 機 關 認 可 之 實 驗 動 物 中 心 動 物 之 飼 養 宜 在 恆 溫 (22 ± 2 ) 亮 暗 各 12 小 時 之 動 物 房 飼 養 或 處 理 時 應 避 免 動 物 驚 嚇, 且 每 次 必 須 前 後 一 致, 避 免 誤 47
差 值 過 大 本 評 估 試 驗 之 實 驗 組 別 應 包 括 1. 正 常 對 照 組 : 攝 取 正 常 飲 食 ;2. 負 控 制 組 : 攝 取 高 脂 飼 料 ;3. 試 驗 組 : 動 物 給 予 與 負 控 制 組 完 全 相 同 之 高 脂 飼 料 處 理, 並 分 別 另 給 予 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品, 其 中 一 組 的 劑 量 必 須 相 當 於 人 體 的 建 議 攝 取 量, 且 於 高 脂 飼 料 誘 導 肝 損 傷 前 一 星 期 即 開 始 給 予 試 驗 樣 品 試 驗 原 始 數 據 紀 錄 必 須 保 留 供 查 核 1. 試 驗 方 法 : 本 評 估 方 法 係 採 以 高 脂 飼 料 誘 導 C57BL/6 (B6) 小 鼠 產 生 非 酒 精 性 脂 肪 肝 損 傷 的 實 驗 模 式, 本 方 法 中 之 高 脂 飼 料 僅 供 參 考 ( 表 一 ), 亦 可 選 擇 其 他 適 當 市 售 高 脂 飼 料 實 驗 前 將 C57BL/6 (B6) 小 鼠 依 體 重 以 逢 機 法 平 均 分 配 至 各 組, 動 物 至 少 分 成 4 組, 每 組 至 少 10 隻 : (1)A 組 為 正 常 對 照 組 : 自 由 進 食 正 常 飼 料 ( 脂 肪 含 量 5-6%) + 經 口 (peroral, per os, P.O.) 管 餵 去 離 子 水 ; (2)B 組 為 負 控 制 組 ( 肝 損 傷 組 ): 自 由 進 食 高 脂 飼 料 ( 建 議 脂 肪 熱 量 百 分 比 45~60%) + 去 離 子 水 (P.O.); (3) 試 驗 組 至 少 2 組 (C D 組 ), 視 實 驗 設 計 需 要 可 再 增 加 組 別 : 自 由 進 食 高 脂 飼 料 ( 脂 肪 含 量 必 須 與 控 制 組 同 ) + 2 種 以 上 不 同 劑 量 之 試 驗 樣 品 (P.O.), 其 中 之 一 劑 量 須 與 換 算 的 人 類 建 議 攝 取 量 相 同 2. 試 驗 步 驟 : A 組 ( 正 常 對 照 組 ) 自 由 進 食 正 常 飼 料 ( 例 如 AIN-93 或 適 當 之 市 售 飼 料 ); B~D 組 動 物 自 由 進 食 高 脂 飼 料, 以 誘 導 肝 損 傷 A B 組 每 日 管 餵 去 離 子 水 ; C D 組 則 於 高 脂 飼 料 誘 導 肝 損 傷 前 1 星 期 開 始 每 日 給 予 試 驗 樣 品 ( 前 後 共 為 期 18 週 或 有 可 信 賴 之 期 刊 文 獻 所 建 議 之 期 限 申 請 時, 須 附 參 考 資 料 ) 所 有 實 驗 動 物 於 餵 食 高 脂 飼 料 的 前 1 週 與 第 0 週 及 餵 食 高 脂 飼 料 期 間 ( 如 第 8 11 及 14 週 ) 須 定 期 進 行 採 血, 採 血 前 8~12 小 時 禁 食, 並 於 投 予 試 驗 樣 品 或 去 離 子 水 後 4 小 時, 以 眼 窩 或 臉 頰 採 血 方 式 檢 測 肝 臟 的 生 化 功 能 :AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 葡 萄 糖 最 後 試 驗 於 預 期 可 誘 導 肝 損 傷 成 功 時 結 束, 秤 重 後 全 部 犧 牲, 並 可 從 腹 大 動 脈 或 心 臟 採 血, 以 供 檢 驗 肝 臟 生 化 48
功 能, 並 剖 腹 取 肝 臟 標 本, 秤 重 後 比 較 其 肝 重 / 體 重 %, 並 將 最 大 右 葉 肝 割 取 約 0.5 公 分 見 方 之 組 織 塊, 固 定 於 10% 的 中 性 福 馬 林 (formalin) 液 中, 然 後 以 石 蠟 包 埋 切 片 貼 附 在 載 玻 片 上 後, 分 別 以 蘇 木 紫 - 伊 紅 染 色 (haematoxylin-eosin stain, H&E stain) 來 進 行 組 織 病 理 學 觀 察 另 外, 利 用 其 餘 肝 臟 進 行 TG 與 膽 固 醇 含 量 變 化 之 檢 測 表 一 誘 發 肥 胖 或 脂 肪 肝 之 高 脂 肪 飼 料 配 方 ( 僅 供 參 考 ) 3. 實 驗 動 物 與 人 體 間 試 驗 劑 量 之 換 算 : 如 欲 以 管 灌 (gavage feeding) 方 式 給 予 受 試 樣 品 時, 一 般 的 認 知, 身 體 的 新 陳 代 謝 速 率 與 其 體 表 面 積 的 相 關 性, 明 顯 超 過 與 其 體 重 之 相 關 性 然 而, 要 精 確 測 量 其 體 表 乃 非 常 不 易, 而 即 使 在 同 一 物 種 (species) 內 之 體 表, 其 與 體 重 間 並 沒 有 一 簡 單 正 確 的 公 式 可 換 算, 且 其 關 係 又 會 隨 著 體 重 和 體 型 的 改 49
變 而 與 體 表 之 關 係 係 數 呈 現 不 規 則 的 變 異, 因 此 在 實 驗 期 間 之 試 驗 劑 量 要 維 持 與 其 代 謝 率 之 固 定 相 關 性 ; 或 人 體 與 動 物 間 之 試 驗 劑 量 要 精 確 的 換 算 有 其 實 際 的 困 難 本 評 估 方 法 的 人 體 與 高 等 實 驗 動 物 間 試 驗 劑 量 間 之 換 算, 原 則 上 根 據 2005 年 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 所 公 告 之 實 驗 初 期 估 算 方 法 (Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers), 而 以 60 公 斤 之 成 人 為 基 準 使 用 高 等 實 驗 動 物 進 行 試 驗 時, 其 劑 量 之 換 算 原 則 上 以 人 體 每 日 每 公 斤 體 重 之 建 議 攝 取 量 (/kg bw/d) 的 12.3 倍 作 為 小 鼠 之 1 倍 劑 量, 其 他 動 物 或 更 詳 細 的 換 算 可 參 閱 該 方 法 http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation /Guidances/ucm078932.pdf 另 換 算 之 本 換 算 方 法 適 用 於 根 據 每 天 每 隻 動 物 之 個 別 體 重 變 異 而 換 算 出 應 給 予 直 接 管 灌 之 試 驗 樣 品 劑 量 此 劑 量 換 算 方 法 提 供 業 界 參 考, 非 強 制 性 依 據, 但 使 用 其 他 換 算 方 法 時, 應 附 其 明 確 之 資 料 來 源 ( 三 ) 實 驗 測 定 項 目 : 在 進 行 相 關 成 分 測 定 時, 可 參 考 以 下 建 議 之 方 法, 亦 得 使 用 有 學 理 根 據 之 適 當 方 法 或 具 公 信 之 市 售 套 組 進 行 分 析 1. 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 (1)AST (GOT) (2)ALT (GPT) (3)TG (4) 膽 固 醇 (5) 葡 萄 糖 2. 肝 功 能 生 化 指 數 及 血 脂 的 檢 測 所 採 之 小 鼠 血 液 樣 品 在 室 溫 下 放 置 約 1 小 時, 使 其 凝 結, 再 利 用 冷 凍 離 心 機 於 4 下 以 15,700 g 離 心 5 分 鐘, 分 離 出 血 清 再 以 血 液 自 動 生 化 分 析 50
儀 檢 測 肝 功 能 生 化 指 數, 如 血 清 AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 等, 其 中 AST (GOT) 及 ALT (GPT) 檢 測 原 理 是 依 據 Reitman 與 Frankel(1957) 及 國 際 聯 邦 臨 床 化 學 (IFCC, 1986) 的 標 準 方 法 另 必 須 測 定 肝 臟 TG 膽 固 醇 肝 重 / 體 重 (%) 等 肝 臟 脂 肪 堆 積 指 標 ( 四 ) 組 織 病 理 切 片 觀 察 : 試 驗 結 束 時, 將 所 有 小 鼠 均 予 以 犧 牲, 採 血 後, 將 最 大 右 葉 肝 臟 割 取 約 0.5 公 分 見 方 的 組 織 塊, 置 入 10% 的 中 性 福 馬 林 中 固 定 其 組 織 形 態 及 結 構, 接 著 以 不 同 濃 度 之 乙 醇 (30 50 70 95 99.5%) 以 及 二 甲 苯 (xylene) 進 行 脫 水 與 透 明 化 步 驟, 然 後 以 熱 石 臘 溶 液 取 代 二 甲 苯, 最 後 將 組 織 以 石 蠟 溶 液 進 行 包 埋 完 成 的 石 蠟 標 本 利 用 切 片 機 切 成 5 μm 的 連 續 石 蠟 切 片, 將 切 下 來 的 切 片 沾 黏 在 乾 淨 的 載 玻 片 上, 於 37 C 烘 乾 後 用 做 進 一 步 的 病 理 染 色 1. 蘇 木 紫 - 伊 紅 (haematoxylin-eosin, H&E) 染 色 法 將 肝 臟 組 織 切 片 置 入 二 甲 苯 30 分 鐘 脫 蠟, 再 依 序 置 於 99.5 95 70 50 及 30% 之 乙 醇 各 30 分 鐘 以 進 行 復 水, 最 後 浸 泡 於 蒸 餾 水 10 分 鐘 後 即 可 進 行 染 色 首 先 浸 泡 蘇 木 紫 30 秒 染 細 胞 核, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘, 接 著 使 用 伊 紅 染 色 2-5 分 鐘, 再 用 蒸 餾 水 清 洗 數 分 鐘 完 成 染 色 過 程 後 進 行 脫 水 步 驟, 依 序 放 置 於 50 70 95 及 100% 乙 醇 各 2 次, 每 次 30 秒, 再 以 二 甲 苯 進 行 透 明 化 2 次, 最 後 以 蓋 玻 片 封 存 2. 組 織 病 理 學 的 觀 察 : 本 評 估 方 法 將 肝 組 織 進 行 H&E 染 色, 以 方 便 觀 察 肝 細 胞 的 受 損 脂 肪 堆 積 壞 死 等 慢 性 肝 損 傷 之 變 化 ; 或 以 冷 凍 切 片 Oil-Red 染 色 觀 察 肝 細 胞 脂 肪 油 滴 的 堆 積 程 度 為 了 避 免 觀 察 主 觀 上 的 偏 差, 所 有 的 組 織 病 理 切 片 都 是 由 最 大 右 葉 肝 的 同 一 位 置 切 取 下 來, 進 行 病 理 染 色 至 於 病 理 的 半 定 量 分 析 評 估, 則 應 由 獸 醫 病 理 醫 師, 在 不 清 楚 本 實 驗 設 計 的 情 況 下 進 行 單 盲 判 讀, 對 所 有 切 片 進 行 評 分 比 較 ( 評 分 表 如 表 二 ), 最 後 再 以 統 計 分 析 方 法 進 行 各 組 差 異 性 的 分 析 病 理 切 片 之 照 片 應 提 供 高 解 析 度 之 彩 色 圖 檔 ; 照 片 應 統 一 以 51
中 央 靜 脈 (central vein, CV) 或 門 靜 脈 (portal vein, PV) 為 中 心 拍 照, 若 為 各 組 之 間 的 比 較, 顯 微 鏡 的 放 大 倍 率 須 一 致 ( 五 ) 實 驗 數 據 統 計 分 析 : 選 擇 適 當 的 生 物 統 計 方 法 分 析, 比 較 試 驗 組 於 試 驗 前 後 上 述 各 指 標 值 ( 即 試 驗 的 起 始 值 結 束 值 ) 之 結 果 變 化, 以 及 試 驗 組 與 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 間 的 比 較 是 否 具 統 計 上 之 顯 著 改 善 (p < 0.05) 本 評 估 方 法 必 須 進 行 組 間 的 統 計 比 較, 例 如 先 以 ANOVA(analysis of variance) 比 較, 有 明 顯 差 異 時, 再 以 Duncan's multiple range test 同 時 比 較 各 組 別 間 之 差 異, 以 評 估 該 試 驗 樣 品 的 最 適 劑 量, 以 及 相 對 於 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 明 確 的 改 善 功 效 然 後 加 以 綜 合 判 斷 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 保 護 肝 臟 或 可 降 低 其 中 某 項 危 險 因 子 之 功 能 選 擇 適 當 的 生 物 統 計 方 法 分 析, 比 較 試 驗 組 於 試 驗 前 後 上 述 各 指 標 值 ( 亦 即 試 驗 的 起 始 值 結 束 值 ) 之 結 果 變 化, 以 及 試 驗 組 與 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 間 的 比 較 是 否 具 統 計 上 之 顯 著 改 善 (p < 0.05) 本 評 估 方 法 必 須 進 行 組 間 的 統 計 比 較, 例 如 先 以 ANOVA(analysis of variance) 比 較, 有 明 顯 差 異 時, 再 以 Duncan's multiple range test 同 時 比 較 各 組 別 間 之 差 異, 以 評 估 該 試 驗 樣 品 的 最 適 劑 量, 以 及 相 對 於 正 常 對 照 組 及 負 控 制 組 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 明 確 的 改 善 功 效 然 後 加 以 綜 合 判 斷 該 試 驗 樣 品 是 否 具 有 保 護 肝 臟 或 可 降 低 其 中 某 項 危 險 因 子 之 功 能 三 評 估 方 法 之 測 定 項 目 原 則 ( 一 ) 血 清 或 血 漿 : 測 定 與 肝 傷 害 相 關 之 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 :AST (GOT) ALT (GPT) TG 膽 固 醇 葡 萄 糖 ( 二 ) 肝 臟 : 測 定 各 種 相 關 成 分 或 酵 素 活 性 必 測 : TG 膽 固 醇 選 測 : Glutathione (GSH) Glutathione peroxidase (GPx) Superoxide dismutase (SOD) Catalase (CAT) Glutathione reductase (GRd) ( 三 ) 病 理 切 片 觀 察 52
必 測 :H&E 染 色 選 測 : 冷 凍 切 片 Oil-Red 染 色 ( 四 ) 必 測 : 記 錄 慢 性 實 驗 期 間 動 物 每 週 體 重 肝 重 / 體 重 (%) 死 亡 率 及 其 他 相 關 之 測 定 項 目 ( 五 ) 其 他 相 關 之 測 定 項 目 由 送 審 單 位 自 行 評 估 是 否 需 要 執 行 四 結 果 判 定 之 基 準 由 以 上 血 清 與 肝 臟 之 各 項 測 定 值 病 理 切 片 觀 察 結 果 ( 參 考 表 二 ), 並 加 上 其 他 相 關 測 定 項 目 之 數 據, 經 統 計 分 析 後 所 得 之 客 觀 結 果, 加 以 綜 合 評 估 判 斷 表 二 脂 肪 肝 的 評 估 脂 肪 肝 脂 肪 ( 脂 質 油 滴 ) 堆 積 於 肝 臟 中 比 例 正 常 0% 輕 微 <10% 中 度 10~33% 嚴 重 33~66% 極 嚴 重 66~100% 五 宣 稱 廣 告 與 產 品 標 示 受 試 產 品 進 行 以 本 評 估 方 法 推 薦 之 試 驗 方 法, 且 獲 得 明 確 之 有 效 結 果 時, 得 向 中 央 衛 生 主 管 機 關 申 請 與 實 驗 結 果 相 符 的 宣 稱 廣 告 或 產 品 介 紹, 凡 能 降 低 血 清 ALT AST, 並 能 減 少 組 織 切 片 之 肝 脂 肪 堆 積 的 產 品, 得 宣 稱 廣 告 或 介 紹 經 動 物 實 驗, 攝 取 本 產 品 有 助 於 延 緩 經 高 脂 飼 料 誘 導 所 引 起 之 脂 肪 肝 或 降 低 其 危 險 因 子 或 其 他 相 近 具 科 學 依 據 的 詞 句 但 若 僅 降 低 ALT/AST 者, 不 得 廣 泛 宣 稱 能 預 防 或 改 善 脂 肪 肝, 本 方 法 之 試 驗 產 品 不 得 宣 稱 或 擴 大 解 釋 具 有 減 肥 之 功 效 53