HEREDITAS (Beijing) 2007 8, 29(8): 934 938 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研 究 报 告 DOI: 10.1360/yc-007-0934 PCR 高 斌 1, 肖 白 1, 邹 起 练 2, 黄 尚 志 3, 王 立 荣 3, 钮 淑 兰 4, 闫 梅 1, 雷 箴 1, 贾 兴 元 1, 王 战 勇 袁 海 昕 1, 吴 燕 1 1, 刘 敬 忠 1., 100020; 2., 350004; 3., 100005; 4., 100034 : 为 了 建 立 一 种 基 于 多 重 实 时 荧 光 相 对 定 量 PCR 技 术 并 应 用 之 于 唐 氏 综 合 征 分 子 诊 断, 选 择 21 号 染 色 体 上 唐 氏 综 合 征 特 异 区 域 基 因 片 段 (DSCR3) 为 目 的 基 因, 以 12 号 染 色 体 上 的 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 基 因 (GAPDH) 为 参 照 基 因, 设 计 合 成 两 对 引 物 以 及 分 别 以 不 同 荧 光 标 记 的 TaqMan 探 针, 在 同 一 个 反 应 管 中 进 行 扩 增 以 相 对 定 量 指 标 CT 值 区 分 唐 氏 综 合 征 患 者 与 正 常 人 采 用 EB 病 毒 转 化 技 术, 把 唐 氏 综 合 征 患 者 外 周 血 B 淋 巴 细 胞 转 化 成 永 生 淋 巴 母 细 胞 系 作 为 标 准 品 通 过 优 化 反 应 条 件, 使 得 目 的 基 因 和 参 照 基 因 的 扩 增 效 率 基 本 一 致, 接 近 100%, 模 板 浓 度 在 3~300 ng/μl 范 围 内, CT 值 的 变 异 系 数 小 于 15%, 浓 度 在 30 ng/μl 时, 变 异 系 数 最 小 (<10%), 以 该 浓 度 的 DNA 作 为 模 板 进 行 批 内 和 批 间 实 验 的 CT 值 重 复 性 好, 变 异 系 数 分 别 为 9.8% 和 13.3% 运 用 建 立 的 方 法 检 测 20 例 唐 氏 综 合 征 患 者 的 血 标 本 和 30 例 正 常 人 的 血 标 本, 正 常 人 CT 值 范 围 是 1.90~ 1.30, 患 者 的 CT 值 范 围 是 2.95~ 2.15, 两 组 之 间 无 交 叉 重 叠, 有 明 显 差 异 (P<0.001) 唐 氏 综 合 征 患 者 永 生 细 胞 系 建 系 成 功, 染 色 体 核 型 和 DNA 分 析 表 明 建 系 前 后 遗 传 是 稳 定 的 因 此, 实 时 荧 光 定 量 PCR 比 较 CT 值 的 相 对 定 量 法 快 速 诊 断 唐 氏 综 合 征 是 可 行 的 : 唐 氏 综 合 征 ; 荧 光 定 量 PCR; 相 对 定 量 ; CT 值 ; 永 生 细 胞 系 1, Rapid diagnosis of Down s syndrome by multiplex real-time fluorescence relative quantitative PCR GAO Bin 1, XIAO Bai 1, ZOU Qi-Lian 2, HUANG Shang-Zhi 3, WANG Li-Rong 3, NIU Shu-Lan 4, YAN Mei 1, LEI Zhen 1, JIA Xing-Yuan 1, WANG Zhan-Yong 1, YUAN Hai-Xin 1, WU Yan 1, LIU Jing-Zhong 1 1. Basic Medical Research Center, Capital Medical University Affiliated Beijing Chaoyang Hospital, Beijing 100020, China; 2. Department of Cell Biology and Genetics, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China; 3. Medical Genetics Laboratory, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005, China; 4. Central Laboratory, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China Abstract: To establish a multiplex real-time fluorescence relative quantitative PCR method for diagnosis of Down s syndrome. The fragment from Down's syndrome critical region gene 3 (DSCR3) on chromosome 21 was used as the target gene, and the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene on chromosome 12 was used as the control gene. The two genes were amplified in the same tube. The relative quantitative index- CT value was used to differentiate trisomy 21 收 稿 日 期 : 2006 11 07; 修 回 日 期 : 2007 06 20 基 金 项 目 : ( : JS96004) [Supported by the Natural Science Foundation of Beijing (No.JS96004)] 作 者 简 介 : (1978 ),,, : E-mail:wenwugao@sina.com 通 讯 作 者 : (1942 ),,,,, : E-mail: liujz@public.bta.net.cn
8 : PCR 935 patient from normal person. The peripheral blood sample from a Down s syndrome patient was collected and the B-lymphocytes were transformed by Epstein-Barr virus to establish the immortalized cell lines as standard material. The reaction conditions were optimized to obtain an equal amplification efficiency from both the target and the control genes. The slopes of both genes were almost 3.32, indicating that the efficiencies of the two amplifications were approximately equal. Among a certain range from 3 300 ng/pcr, the variation of detected CT value were less than 15%, and amplification showed the highest reproducibility when the concentration of DNA template was 30 ng/μl. Then, the variation of CT value with inter- and intra-assay were 9.8% and 13.3% at this DNA concentration of the templates. Clinical samples, including 20 blood samples from patients and 30 blood samples from normal persons, were detected using the established method. The CT value from Down s syndrome group were dramatically different from normal group (P<0.001). The trisomy 21 immortalized cell lines were established and the genetic integrity of the cell lines was stable as evaluated by karyotype and DNA analysis. The relative quantitative PCR with CT value could be used to rapidly diagnose Down s syndrome. Keywords: Down s syndrome; fluorescence quantitative PCR; CT value; immortalized cell line (Down s syndrome) 21,, 1/600 1/800,,,,,,, (FISH) (STR), [1, 2], PCR, CT, CT, 1 1.1 30,, 1 ml 20 DNA, G, 21,,, 1.2 21 2 2 2 DSCR3 (Down s syndrome critical region gene3, DSCR3), 121 bp : Forward: 5 -TAG- CAAGTCAGAGGTTTCCTT-3 ; Reverse: 5 -AACAT- TGACTGTGGCTCTTGC-3 TaqMan : 5 -FAM-CACTCTCCAGCAAGCTCAAACTGC-TA- MRA-3 12 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 150 bp : Forward: 5 -CTGTCCAGTTAATTT- CTGACC-3 ; Reverse: 5 -CTTTGTACATGGTATTC- ACCAC-3 TaqMan : 5 -VIC- AATGCT- TGCTGCTGCCTAGCTCAG-TAMRA-3, ABI 1.3 PCR PCR ABI Prism 7000 PCR ( ABI ) 25 μl, DNA 1 μl, 200 nmol/l, TaqMan 100 nmol/l, 2 TaqMan Universal PCR Master Mix( ABI )12.5 μl : 50 2 min, 95 10 min, 95 15 s, 60 1 min, 40,, 0.2; 6,, CT 3 CT, CT
936 HEREDITAS (Beijing) 2007 29 CT 1.4 CT (mean) ; (CV) ; t 1.5 EB (EBV), B [3], 2 2.1 2 DNA PCR ABI Prism 7000,, CT, 1 ABI Prism 7000, R 2 0.991144 0.990221, 0.99,, 3.321623 3.294112, 3.32, 100% PCR,, CT 2.2 PCR DNA, 10, 5, 300 ng/μl 30 ng/μl 3 ng/μl 0.3 ng/μl 0.03 ng/μl 2, 3, 6 CT,, CT, DNA 300 ng/μl 30 ng/μl 3 ng/μl 0.3 ng/μl,,,, DNA 图 1 目 的 基 因 参 照 基 因 的 扩 增 曲 线 和 标 准 曲 线 A: DSCR3 ; B: DSCR3 ; C: GAPDH ; D: GAPDH Fig.1 Amplification and standard curves of target and control genes A: Amplification curves of the target gene DSCR3; B: Standard curve of the target gene DSCR3; C: Amplification curves of the control gene GAPDH; D: Standard curve of the control gene GAPDH.
8 : PCR 937 0.03 ng/μl, CT 14.1% 9.9% 14.9% 17.6%, 30 ng/μl, 2.3 PCR CT DNA, 30 ng/μl 10, CT 1.58, (SD) 0.16, (CV) 9.8%,, 3, 10, CT 1.67, SD 0.22, CV 13.3%,, 2.4 DNA 5 10, PCR, CT 30 CT 1.6, SD 0.15, 1.90 1.30, 9.4%, CT 20 CT 2.55, SD 0.20, 2.95 2.15, 7.9%, CT, 2, CT, (P=0.000 0.001 ) CT, CT 3, SD Cut off, CT 2.05 21,, 图 2 30 例 正 常 人 和 20 例 患 者 的 CT 值 Fig. 2 The delta CT values from 30 normal persons and 20 Down syndrome patients 2.5 21,, 10 DNA,, 3, 21q22.1 21q22.2 21q22, 21q22 21 [4], 21q22, (Down Syndrome Critical Region, DSCR), DSCR3, DNA,, Freeman [5], GAPDH PCR, PCR, : (1)GC 40% 60%; (2), G; (3) 5 G, G, C G; (4) 15 25, ; (5) Tm Tm 10,, 3,, PCR PCR [6],,, CT, CT CT, 21,,, CT, DNA CT DNA CT, FAM VIC,, CT [6],,
938 HEREDITAS (Beijing) 2007 29 [7] CT, PCR, 100% PCR, 3.32, 0.99, 3.32; 0.99,, 100%,, CT,,, CT 9.8% 13.3%, 15%, Chan [8],, CT, 3 300 ng/μl, CT 15 30, CT, 30 ng/μl,,, PCR 20 30, CT 2.95 2.15, CT 1.90 1.30,,, 3, 21,,,, EBV B, A T,,, 10 DNA, EBV A,,, PCR,,,, (References): [1] Bryndorf T, Christensen B, Xiang Y, Lind AM, Philip J. Rapid detection of numerical aberrations of chromosomes 13, 18 and 21 in chorionic mesenchymal cells. Prenat Diagn, 1993, 13(9): 815 823. [2] CHEN Zhen-Bin, ZHU Jin-Ling, YAN Mei, LIANG Yan, ZHOU Yan, TAN Shu-Zhen, XIAO Bai, LIU Jing-Zhong. Genetic polymorphisms of five STR loci on chromosome 21 in Chinese Han population. Hereditas(Beijing), 2004, 26(4): 432 436.,,,,,,,. 21 5 STR., 2004, 26(4): 432 436. [3] HUANG Xiao-Yi, LIU An, YU Yang, MA Lin-Lin,SHI Rong-Qian, LV Fu-Qu, JIANG Yan, SUN Wen-Jing, XUE Ya-Li, FU Song-Bin, LI Pu. Establishment and preservation of immortal lymphoblastoid cell lines of the 10 ethnic groups in China. Hereditas(Beijing), 2002, 24(6): 643 645.,, 旸,,,,,,,,. 10., 2002, 24(6): 643 645. [4] Park J, Wurster-Hill DH, Andrews PA, Cooley WC, Graham JMJr. Free proximal trisomy 21 without the Down syndrome. Clin Genet, 1987, 32(5): 342 348. [5] Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques, 1999, 26(1): 112 122, 124 125. [6] ZHENG Ming-Ming, HU Ya-Li, XU Zheng-Feng, WANG Zhi-Qun, SHI Ting-Qi, YE Xiao-Dong, CUI Heng-Mi. Application of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction techniques for prenatal diagnosis of Down syndrome. Chin J Obstet Gynecol, 2004, 39(10): 678 681.,,,,,,.., 2004, 39(10): 678 681. [7] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods, 2001, 25(4): 402 408. [8] Chan V, Yip B, Lam YH, Tse HY, Wong HS, Chan TK. Quantitative polymerase chain reaction for the rapid prenatal diagnosis of homozygous alpha-thanlassaemia (Hb Barts hydrops fetalis). Br J Haematol, 2001, 115(2): 341 346.