第 卷 第 期 年 月 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版!"#$## %&'& $& 技 术 方 法 研 究 的 构 建 及 鉴 定 冯 珊 珊 杨 博 刘 爱 琴 武 婧 翟 惠 虹 宁 夏 医 科 大 学 总 医 院 外 科 学 研 究 室 消 化 内 科 宁 夏 银 川 % 摘 要 目 的 利 用 小 片 段 干 扰 &'"$()$("'&' 抑 制 + 蛋 白 的 表 达 为 研 究,!-.+/. 核 转 位 机 制 提 供 有 利 的 工 具 方 法 设 计 + 的 &' 序 列 用 脂 质 体 01)$!"$ 将 &' 转 染 至 人 结 肠 癌 +% 细 胞 中 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 转 染 效 率 用 &$$.,& 及 $$(" 1 方 法 检 测 + 在 人 结 肠 癌 +% 细 胞 内 的 &' 和 蛋 白 表 达 结 果 构 建 了 对 +&' 荧 光 显 微 镜 下 检 测 转 染 人 结 肠 癌 +% 细 胞 成 功 &.,& 证 明 了 在 +% 细 胞 内 + 的 &' 表 达 显 著 降 低 $$(" 1 证 明 了 +% 细 胞 内 + 蛋 白 表 达 显 著 降 低 与 ++ 组 相 比 + 组 对 + 的 &' 和 蛋 白 抑 制 效 果 最 明 显 结 论 成 功 构 建 了 +&' 为,!-.+/. 核 转 位 机 制 研 究 提 供 了 有 利 的 工 具 关 键 词 结 肠 癌 +&' 钙 周 期 素 结 合 蛋 白 中 图 分 类 号 & 文 献 标 志 码!"##$%!"%& 2'3+"" 4'3-1 0/5 6" 57"* 89/9#1"* +#(*$(01(1(:$($"1):*$;$:$$3$"$(911) '"*$!5";$(4"!#"%," '$()' )' " " ###$*"* +#,-$.- ## /#/&)'$#"0#(""" #" /###$1%# *#/&1"/*0# /##)*-+)("/$#& $*)'(##"" #"## /###$1%# "##/##&$$/)'"(#/" )*-+)" 1# && #(/$* && +#,-$.-## /#/ "" ##$*)'& ### $)'+#,-$.- 钙 周 期 素 结 合 蛋 白!!!"+""* (1$",!-. 是 年 从 小 鼠 艾 氏 腹 水 瘤 细 胞 中 发 现 的 以 钙 依 赖 方 式 结 合 + 的 蛋 白 年 发 现 一 种 人 + 结 合 蛋 白 +"$(!"* (1$"+/. 与,!-. 序 列 相 同 从 此 命 名 为,!-.+/. 本 课 题 组 前 期 研 究 发 现 钙 周 期 素 结 合 蛋 白,!-.+/. 在 结 肠 癌 组 织 及 结 肠 癌 % +% 细 胞 中 高 表 达 研 究 还 发 现 在 结 肠 癌 细 % 胞 中,!-.+/. 在 细 胞 质 表 达 给 予 胃 泌 素 表 皮 生 长 因 子 前 列 腺 素 2 缺 氧 刺 激 后,!-.+/. 转 位 于 细 胞 核 进 一 步 研 究 发 现,!-. +/. 核 转 位 促 进 了 结 肠 癌 细 胞 的 增 殖 % 且,!-. 收 稿 日 期 修 回 日 期 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 '1% 宁 夏 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 '1'8 宁 夏 医 科 大 学 重 点 资 助 项 目 '18% +#1($ $'1"'#(+!$"!$1#"1"1)," '1%$ '#(+!$"!$1#"1"1)'"* '1 '8"$$&$$(!#"1)'"*$!5";$('18% 通 讯 作 者 翟 惠 虹 2#1"*"$ 优 先 出 版!""$!$&!" #$#!"
冯 珊 珊 杨 博 刘 爱 琴 等 +&' 的 构 建 及 鉴 定 +/. 核 转 位 后 可 能 与 核 内 的 细 胞 周 期 调 控 因 子 结 合 细 胞 核 是 细 胞 的 代 谢 生 长 分 化 及 遗 传 物 质 的 调 控 中 心 因 此,!-.+/. 核 转 位 可 能 与 结 肠 癌 的 发 生 发 展 有 关 但,!-.+/. 的 核 转 位 机 制 尚 不 明 确 根 据,!-.+/. 结 构 分 析,!-.+/. 通 过, 可 以 结 合 + 蛋 白 家 族 中 的 +++- +. 我 们 前 期 实 验 发 现 + 可 能 导 致,!-.+/. 发 生 依 赖, 浓 度 方 式 的 核 转 位 因 此 本 研 究 通 过 +&' 的 构 建 及 鉴 定 为,!-. +/. 的 核 转 位 机 制 研 究 提 供 有 利 的 工 具 材 料 与 方 法 材 料 人 结 肠 癌 +% 细 胞 北 京 协 和 细 胞 库 +&' 上 海 吉 玛 公 司 无 内 毒 素 质 粒 小 提 试 剂 盒 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 小 鼠 抗 人 + 单 克 隆 抗 体 9&. 标 记 羊 抗 鼠 二 抗 +" 公 司 +4-& 3($$".,& $(-/ 公 司 逆 转 录!:' 试 剂 盒 $($" 公 司 01)$! "$ (1 美 国 /";(1*$" 公 司 :' 引 物 由 上 海 吉 玛 制 药 技 术 有 限 公 司 合 成 方 法 细 胞 培 养 结 肠 癌 +% 细 胞 用 含 有 00 胎 牛 血 清 50 青 霉 素 和 50 链 霉 素 的 /2 培 养 液 00,< 条 件 下 培 养 % 更 换 次 培 养 液 用 *0 胰 酶 消 化 传 代 细 胞 传 代 % 次 后 进 行 转 染 +&' 引 物 设 计 根 据 3$"-" 提 供 的 + 基 因!:' 序 列 编 号 3/' %% 选 择 + 的 靶 点 序 列 设 计 引 物 表 表 & 序 列 +$6#$"!$1)+&' 3$"$ &'$6#$"!$ (*$$ +$"$=55,5,,3,3535,,35= 阴 性 对 照 组 "$"$=,353,,355,333= + +$"$ =3,35353,3553535= "$"$=55,,,3,,55,3,= + +$"$ =3533,,5,55,,,35= "$"$=,5535333533,,,= % + +$"$ =,,5,5,5335,5,,= "$"$=5335553,5,3333= %% ( 基 因 转 染 取 对 数 生 长 期 的 +% 细 胞 以 > % 孔 细 胞 接 种 于 孔 板 细 胞 达 到?? 融 合 时 进 行 细 胞 转 染 转 染 前 更 换 无 抗 生 素 培 养 基 过 夜 按 照 01)$!"$ 步 骤 转 染 &' 将 0 标 记 荧 光 素 的 阴 性 对 照 &' 转 染 至 +% 细 胞 转 染 后 更 换 无 抗 生 素 的 完 全 培 养 液 % 内 荧 光 显 微 镜 下 检 测 转 染 效 率 )&$$.,& 检 测 +&' 效 率 本 实 验 分 为 空 白 组 阴 性 对 照 组 + 组 + 组 + 组 检 测 转 染 后 各 组 细 胞 + 的 &' 表 达 水 平 以!" 为 内 参 采 用.($(% 软 件 设 计 引 物 表 分 别 提 取 各 组 细 胞 总 &' 以 总 &' 为 模 板 反 转 录 为!:' 用 +4-& 3($$" 荧 光 染 料 进 行.,& 扩 增.,& 扩 增 反 应 条 件 为 预 变 性 "% 变 性 退 火 延 伸 % 个 循 环 采 用 &$$.,& 中 相 对 定 量 比 较, 值 法 计 算 各 组 +&' 的 相 对 表 达 水 平 并 根 据 各 组 表 达 倍 数 差 异 得 出 抑 制 率 表 &.,& 引 物 序 列 和 长 度 +$6#$"!$"$"*1)+&' 3$"$ +$6#$"!$ 0$"* +!" 1((=3333333,3,,,= &$;$($=3,,33,,3333= 1((=,3333,33,= &$;$($=33333,333= * $$(" 1 方 法 检 测 各 组 细 胞 中 + 蛋 白 的 表 达 实 验 分 组 及 转 染 步 骤 同 上 转 染 后 分 别 提 取 各 组 总 蛋 白 用 -, 蛋 白 分 析 试 剂 测 定 蛋 白 浓 度 取 * 总 蛋 白 进 行 *0+:+.32 凝 胶 电 泳 转 至.@: 膜 进 行 免 疫 印 迹 以 3.:9 为 内 参 检 测 + 的 蛋 白 表 达 水 平 ( 统 计 学 方 法 计 量 资 料 表 示 为 平 均 数 A 标 准 差 A 利 用 +.++ 统 计 软 件 分 析 多 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 <"$'<@ 组 间 两 两 比 较 采 用 0+: 检 验 认 为 差 异 具 有 统 计 学 意 义 结 果 + 阴 性 对 照 转 染 结 肠 癌 ), 细 胞 用 &' 阴 性 对 照 片 段 标 记 荧 光 素 摸 索 转 染 条 件 组 +&' 按 阴 性 对 照 条 件 进 行 转 染 经 检 测 转 染 后 转 染 效 率? 荧 光 镜 下 细 胞 数 光 镜 下 细 胞 数 转 染 效 果 较 理 想 可 进 行 后 续 实 验 图 + 结 肠 癌 ), 细 胞 总 的 表 达 各 组 转 染 +% 细 胞 提 取 总 &' 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 发 现 + 和 + 特 征 性 条 带 证 明 细 胞 总 &' 完 整 性 较 好 无 明 显 降 解 发 生 图 +( 结 肠 癌 ), 细 胞 - 的 表 达 采 用 &$$.,& 法 观 察 + 在 结 肠 癌 +% 细 胞 内 的 &' 表 达!" 为 内 参 得 到 扩 增 曲 线!" #$#!"
西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版 第 卷 和 熔 解 曲 线 图 熔 解 曲 线 为 单 峰 扩 增 产 物 特 异 性 好 无 引 物 二 聚 体 形 成 实 验 结 果 可 靠 + 的 个 实 验 组 相 比 + 组 抑 制 效 果 最 好 抑 制 率 达 到? 空 白 组 与 阴 性 对 照 组 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 表 图 % 提 示 从 &' 水 平 上 证 明 了 +&' 明 显 抑 制 了 +% 细 胞 内 + 的 表 达 表 ( 各 组 间 - 的 表 达 倍 数 &'$($1"$;$1)+&'")$( $"*(1# 组 别, 值, 倍 数 B, 图 对 照 转 染 人 结 肠 癌 ), 细 胞 *,1"(1(")$!$"+%!$>% 光 镜 下 细 胞 数 - 荧 光 镜 下 细 胞 数 空 白 组 A%% A%% 阴 性 对 照 组 A A + 组 A A + 组 A A + 组 A A % 图 ), 细 胞 总 的 电 泳 结 果 *1&'$;$1)+%!$ 空 白 组 对 照 组 +%++ 图 ) 在 结 肠 癌 ), 细 胞 中 的 - 表 达 *% &'$($1"$;$1)+"!11"+%!$ 与 对 照 组 比 较 与 + 比 较 +* 结 肠 癌 ), 细 胞 中 蛋 白 的 表 达 免 疫 印 迹 结 果 证 明 +&' 实 验 组 的 蛋 白 表 达 明 显 降 低 图 +&' 实 验 组 与 对 照 组 相 比 有 统 计 学 差 异 + 组 与 ++ 组 比 较 有 统 计 学 差 异 提 示 + 组 抑 制 效 果 最 好 抑 制 率 达 到? 空 白 组 与 阴 性 对 照 组 之 间 的 差 异 无 统 计 学 意 义 提 示 从 蛋 白 水 平 证 明 了 + 在 结 肠 癌 +% 细 胞 内 的 表 达 受 抑 制 图 ( 扩 增 曲 线 和 熔 解 曲 线 *)!1"!#(;$"$!#(;$ 扩 增 曲 线 - 熔 解 曲 线 +) - 的 相 对 定 量 结 果 采 用 &$ $.,& 中 相 对 定 量 比 较, 值 法 比 较 目 的 基 因 &' 的 相 对 含 量 结 果 显 示 &'+ 实 验 组 与 阴 性 对 照 组 相 比 &' 的 表 达 明 显 降 低 ( 讨 论 在 胃 癌 细 胞 中 发 现 胃 癌 的 多 药 耐 药 性 与,!-.+/. 上 调 有 关 并 且,!-.+/. 可 以 调 控 胃 癌 细 胞 对 化 疗 药 物 的 应 答 反 应 首 次 发 现,!-.+/. 可 能 是 胃 癌 多 药 耐 药 治 疗 的 潜 在 靶 点 本 课 题 组 早 期 制 备 了,!-.+/. 的 单 克 隆 抗 体 随 后 研 究 了,!-.+/. 在 正 常 组 织 及 肿 瘤 组 织 中 的!" #$#!"
冯 珊 珊 杨 博 刘 爱 琴 等 +&' 的 构 建 及 鉴 定 配 体 形 式 发 现,!-.+/. 本 课 题 组 前 期 研 究 发 现 在 结 肠 癌 +% 细 胞 中 给 予, 刺 激 + 可 以 与,!-.+/. 结 合 + 是 分 子 量 为 # 的 小 分 子 钙 离 子 结 合 蛋 白 它 可 以 以 被 动 转 运 方 式 通 过 核 膜 进 入 细 胞 核 + 在 上 皮 细 胞 纤 维 细 胞 及 不 同 的 肿 瘤 细 胞 中 高 表 达 功 能 研 究 中 发 现 + 参 与 细 胞 增 殖 细 胞 骨 架 动 力 学 和 肿 瘤 形 成 综 上 提 示 + 可 能 是 在 结 肠 癌 细 胞 中 引 起,!-.+/. 核 转 位 的 靶 蛋 白 在 本 课 题 中 抑 制 + 与,!-.+/. 结 合 的 方 法 有 两 种 在,!-.+/. 的 + 结 合 区 图 * 在 结 肠 癌 ), 细 胞 中 的 蛋 白 表 达 *.(1$"$($1"$;$1)+"!11"+%!$ + 转 染 结 肠 癌 +% 细 胞 的 相 对 蛋 白 表 达 量 空 白 组 对 照 组 +%++- 不 同 转 染 组 +3.:9 的 相 对 表 达 比 较 与 对 照 组 比 较 与 + 比 较 表 达 发 现,!-.+/. 在 正 常 结 肠 黏 膜 组 织 不 表 达 在 结 肠 癌 组 织 中 高 表 达 进 一 步 研 究 了,!-.+/. 在 不 同 大 肠 组 织 中 的 表 达 发 现,!-. +/. 在 大 肠 增 生 性 息 肉 中 不 表 达 在 大 肠 腺 瘤 组 织 大 肠 癌 组 织 中 高 表 达 提 示,!-.+/. 可 能 参 与 了 大 肠 癌 的 发 生 发 展 研 究 还 发 现,!-.+/. 在 结 肠 癌 +% 细 胞 中 亦 高 表 达 /0/.2 % 5 在 小 鼠 神 经 母 细 胞 瘤 '- 细 胞 和 人 神 经 母 细 胞 瘤 +9+44 细 胞 中 发 现,!-.+/. 具 有, 依 赖 的 核 转 位 现 象 本 课 题 组 在 结 肠 癌 +% 细 胞 中 发 现,!-.+/. 在 细 胞 质 表 % 达 给 予 胃 泌 素 细 胞 外 刺 激 因 子 如 表 皮 生 长 因 子 前 列 腺 素 2 缺 氧 刺 激 可 以 诱 导,!-. +/. 转 位 至 细 胞 核 研 究 还 发 现 在 胃 癌 细 胞 和 结 肠 癌 细 胞 中,!-.+/. 转 位 至 细 胞 核 后 可 以 促 进 细 胞 增 殖 使 3 期 缩 短 提 示,!-.+/. 通 过 核 转 位 参 与 了 细 胞 周 期 调 控 我 们 进 一 步 筛 选 并 验 证 了 结 肠 癌 核 转 位 后 的 下 游 信 号 分 子 但 是,!-.+/. 的 核 转 位 机 制 尚 不 明 确 根 据,!-.+/. 的 结 构 分 析,!-.+/. 可 以 和 + 蛋 白 家 族 +# #" 及 2& 四 个 靶 蛋 白 结 合 而 + 蛋 白 是 唯 一 依 赖, 结 合,!-.+/. 的 靶 蛋 白 因 此 + 蛋 白 可 能 调 控,!-.+/. 依 赖, 浓 度 的 核 转 位 现 象 /0/.2 最 早 在 小 鼠 艾 氏 腹 水 瘤 细 胞 中 以 + 的 构 建 缺 失 突 变 体,!-.+ 利 用 & ' 沉 默 + 的 表 达 为 排 除 因,!-.+/. 结 构 改 变 而 影 响 其 核 转 位 的 情 况 本 研 究 选 择 沉 默 + 构 建 &'&' 可 以 被 诱 导 小 于 个 碱 基 片 段 的 &' 称 为 小 干 扰 &'&' 载 入 到 &' 诱 导 的 沉 默 复 合 物 &/+, 中 使 &' 双 链 特 异 性 被 降 解 导 致 相 应 的 基 因 沉 默 是 目 前 用 于 沉 默 同 源 基 因 转 录 后 表 达 的 分 子 技 术 这 种 由 个 碱 基 合 成 的 &' 可 以 在 细 胞 内 触 发 基 因 沉 默 并 发 现 比 长 片 段 如 &' 的 沉 默 效 率 更 高 尤 其 是 将 &' 导 入 触 发 基 因 沉 默 的 细 胞 中 效 果 更 明 显 原 因 是 在 :!$( 酶 表 达 量 低 的 细 胞 中 &' 的 基 因 沉 默 功 能 会 受 到 削 弱 但 是 &' 不 会 受 到 影 响 本 实 验 针 对 人 + 的 &' 选 择 了 条 特 异 性 &' 靶 序 列 分 别 构 建 了 组 &' 转 染 至 人 结 肠 癌 +% 细 胞 转 染 + 组 抑 制 &' 和 蛋 白 的 表 达 效 果 最 好 表 明 +&' 构 建 成 功 本 研 究 将 +&' 转 染 至 结 肠 癌 +% 细 胞 从 &' 和 蛋 白 水 平 鉴 定 了 +&' 沉 默 了 + 的 表 达 为,!-.+/. 核 转 位 机 制 研 究 提 供 了 有 利 的 工 具 参 考 文 献..- '.+.&!##" /#'#"#* ##&'#/!$1$)+&$*$.-"# ( *#""2" &!+ 3.33$3.4.' 3&###*"* $*#/" / ///#/# & 3* #/ +#/ % 翟 惠 虹 &+#,-$.- 核 转 位 在 结 肠 癌 中 的 意 义 & 第 四 军 医 大 学 下 转 第 页!" #$#!"
符 川 陈 跃 武 张 建 辉 等 经 胸 及 经 食 道 超 声 在 房 间 隔 缺 损 封 堵 术 中 的 应 用 较 2 更 接 近 实 际 考 虑 原 因 可 能 是 2 容 易 受 体 型 肺 气 胸 壁 畸 形 等 因 素 影 响 超 声 图 像 清 晰 度 较 差 其 测 值 精 确 度 易 受 影 响 而 22 探 头 是 放 置 在 紧 邻 左 房 的 食 道 内 图 像 显 示 清 晰 不 受 胸 壁 和 肺 气 干 扰 且 22 探 头 频 率 较 2 高 对 细 微 结 构 分 辨 能 力 更 强 可 清 晰 显 示 房 间 隔 缺 损 的 位 置 数 目 及 大 小 因 此 22 评 价 +: 较 2 更 精 确 更 接 近 实 际 这 与 美 国 超 声 心 动 图 协 会 推 荐 22 应 用 于 +: 封 堵 术 前 检 查 的 意 见 是 相 一 致 的 综 上 所 述 在 房 间 隔 缺 损 介 入 封 堵 术 中 2 与 22 对 +: 的 评 估 各 有 优 缺 点 22 对 +: 缺 损 口 大 小 残 缘 软 硬 度 的 评 估 优 于 2 但 22 对 整 体 评 价 存 在 不 足 在 房 间 隔 伸 展 径 的 评 估 中 2 优 于 22 因 此 房 间 隔 缺 损 介 入 封 堵 术 前 应 尽 可 能 行 22 作 为 2 的 有 效 补 充 参 考 文 献 $3.!-5 3355))45!&## #"/"#&6#+"#$ % 53).!1.+$5.$&)*/*"* /##" ( #"/"##/(#* #&/$###"%%%*%&,.51$.)15,$'.!&+ "##" /7 "#/& 3.%* & % 张 晓 红 陈 颖 朱 丹 茹 等 & 超 声 心 动 图 评 价 房 间 隔 缺 损 封 堵 术 后 左 右 心 形 态 及 功 能 的 改 变 & 中 国 实 用 医 刊 %..8$3.')&-##* "##(/7##""#* "#0"(#/* / #"/ "#&2 " %% )! $).$ 4, +&## ##"#"#"##* "##"""&.+"#./* 中 国 医 师 协 会 心 血 管 内 科 医 师 分 会 & 常 见 先 天 性 心 脏 病 介 入 治 疗 中 国 专 家 共 识 房 间 隔 缺 损 介 入 治 疗 & 介 入 放 射 学 杂 志!!) ).364 )&###* "/ $5###*'"# //##* " &.+",34!!)5!3'&/ *"/##" #* #"#&##" % 编 辑 邱 芬 上 接 第 页 & 翟 惠 虹 陈 雄 卢 媛 媛 等 & 结 肠 癌 细 胞 中 +#,-$.- 的 表 达 及 %..- $),$,'515'4!&+ * 核 转 位 现 象 & 世 界 华 人 消 化 杂 志 ""####*"* 谢 福 利 仇 长 青 翟 惠 虹 等 & 二 氯 化 钴 致 人 结 肠 癌 细 胞 系 +* "/ ',*#&,+/ #,-$.- 核 转 位 & 基 础 与 临 床 谢 福 利 翟 惠 虹 & 缺 氧 对 结 肠 癌 细 胞 +#,-$.- 核 转 位 的 影 响 1' -'6 &#"* & 重 庆 医 学 % ### " "# #"** 谢 福 利 翟 惠 虹 & 表 皮 生 长 因 子 对 +#,-$.- 过 表 达 慢 病 毒 载 "#""/$3*$44# 体 转 染 的 结 肠 癌 细 胞 +#,-$.- 核 转 位 的 影 响 & 山 东 医 &,#/!,% 药 *%& 3.33!'61'6,&+#,-$.-# 王 安 萍 赵 盈 盈 翟 惠 虹 等 & 人 结 肠 癌 细 胞 中 +#,-$.- 核 转 #"#" /#### 位 差 异 表 达 基 因 的 验 证 & 天 津 医 药 %%%*%& & 1" 6%*..-!.+351$.1'.+.&./ & $ ###""#* $+3'.) 6..- &$""$* (&"7 /)%* *# +#,-$.- $3.493 134.'&)"* "##&/#"% #### /###*",55!'!)'4 +$!4)'.$.& +#,-&6#+#% "###/ &+$# 3.33$3.44&/"##* -% 7###" +#,-/#* 5'5 )+''5',)$5)+.6&# " &3 "/#/*%& $&+!!"% 翟 惠 虹 冯 珊 珊 仇 长 青 等 &+#,-$.- 在 不 同 大 肠 组 织 中 的 编 辑 卓 选 鹏 表 达 及 临 床 意 义 & 世 界 华 人 消 化 杂 志 %*!" #$#!"