國 立 中 興 大 學 環 境 工 程 學 系 碩 士 學 位 論 文 探 討 台 灣 女 性 核 酸 修 復 基 因 之 基 因 多 型 性 及 去 鹼 基 核 酸 背 景 值 與 乳 癌 風 險 之 相 關 性 Investigation of the Association of Genetic Polymorphisms in DNA Repair Genes and the Background Levels of Abasic sites with the Risk of Developing Breast Cancer in Taiwanese women 指 導 教 授 : 林 伯 雄 Po-Hsiung Lin 研 究 生 : 王 貞 涵 Jhen-Han Wang 中 華 民 國 一 零 三 年 七 月

誌 謝 本 論 文 之 完 成, 首 先 感 謝 指 導 教 授 林 伯 雄 老 師, 讓 我 兩 年 的 碩 士 生 涯 接 觸 與 傳 統 環 境 工 程 全 然 不 同 的 領 域, 也 讓 我 從 不 會 做 實 驗 到 現 在 在 實 驗 室 學 到 許 多 做 實 驗 的 方 法 感 謝 環 工 系 上 的 行 政 人 員 芃 安 姐 及 海 雲 姐, 每 次 碰 到 報 帳 問 題 時, 總 是 不 厭 其 煩 的 為 我 解 說 或 者 幫 我 想 辦 法 解 決, 我 才 能 通 過 一 個 又 一 個 的 難 關 還 有 實 驗 室 助 理 丁 濡 和 宜 芳 學 弟 書 呈 明 翰 及 家 瑋, 謝 謝 你 們 幫 我 處 理 實 驗 室 的 瑣 事, 讓 我 能 夠 專 心 實 驗 及 撰 寫 論 文, 有 你 們 的 幫 忙 讓 我 輕 鬆 很 多 謝 謝 我 的 家 人 們 總 是 全 力 支 持, 讓 我 能 夠 做 自 己 想 做 的 事 情, 走 自 己 想 走 的 路, 並 且 讓 我 無 後 顧 之 憂 的 完 成 學 業, 尤 其 是 我 的 姐 姐, 總 是 關 心 我 的 生 活, 當 我 心 情 不 好 時 總 是 耐 心 開 導, 當 我 徘 徊 無 助 時 總 是 給 我 方 向, 感 謝 妳 伴 我 走 過 這 兩 年 的 生 活, 讓 我 生 活 中 充 滿 愛 和 快 樂 ; 以 及 總 是 陪 伴 在 我 身 邊 的 朋 友 們 : 采 蓉 凱 閎 世 凱 瑞 呈 馥 萱 權 逸 榆 宸 珮 綺, 很 幸 運 的 是 還 能 將 大 學 時 的 緣 分 延 續 下 去, 也 許 這 緣 分 當 初 只 是 一 份 小 小 的 革 命 情 感, 願 往 後 我 們 依 然 能 伴 隨 這 份 情 感 繼 續 相 互 扶 持 往 前 方 的 路 走 去 ; 沛 喬 總 是 陪 伴 在 我 身 邊 幫 助 我 生 活 上 的 大 小 事, 一 起 認 識 台 中 的 日 子 真 的 很 有 趣, 感 謝 你 讓 我 的 平 凡 生 活 充 滿 歡 樂 ; 三 不 五 時 捎 來 關 心 的 靜 玟 珮 瑜 慧 雯 雅 雯 郁 玲 璇 珊, 每 每 看 到 妳 們 的 問 候 或 寄 來 的 明 信 片, 總 讓 我 知 道 雖 然 見 面 時 間 少 了 距 離 遠 了, 心 的 距 離 卻 不 曾 遠 過 好 的 回 憶 很 多, 感 謝 你 ( 妳 ) 們 兩 年 來 的 並 肩 陪 伴 王 貞 涵 謹 誌 於 中 興 大 學 環 境 工 程 研 究 所 中 華 民 國 一 零 三 年 七 月

摘 要 本 研 究 目 的 主 要 為 探 討 台 灣 女 性 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 之 風 險 因 子 與 乳 癌 的 關 聯 性, 包 括 參 與 DNA 修 復 過 程 之 核 酸 修 復 基 因, 如 :X-ray repair cross-complementing protein 1(XRCC1) 及 Poly [ADP-ribose] polymerase 1(PARP-1) 之 基 因 多 型 性 與 去 鹼 基 核 酸 (abasic sites, AP sites) 背 景 值 之 相 關 性 ; 此 外, 並 研 究 雌 性 激 素 (17β-estradiol, E 2 ) 與 環 境 致 癌 物 質 如 菸 草 致 癌 物 (4-(methylnitro-samino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, NNK) 及 戴 奧 辛 (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD) 於 人 類 乳 腺 細 胞 MCF-7 對 於 DNA 單 股 斷 裂 之 誘 導 本 研 究 之 第 一 部 分 研 究 結 果 指 出, 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 之 核 酸 修 補 基 因 XRCC1 R399Q 之 對 偶 基 因 變 異 頻 率 分 別 為 33.2% 及 38.4% (p>0.05); 而 另 一 核 酸 修 補 基 因 PARP1 之 對 偶 基 因 變 異 頻 率 分 別 為 59.4% 及 57.4% (p >0.05); 此 結 果 可 知, 核 酸 修 補 基 因 XRCC1 及 PARP1 之 基 因 多 型 性 對 於 台 灣 女 性 罹 患 乳 癌 風 險 並 無 明 顯 相 關 本 研 究 之 第 二 部 分 利 用 單 細 胞 凝 膠 電 泳 證 實, 當 人 類 乳 癌 細 胞 株 MCF-7 分 別 單 獨 暴 露 於 雌 性 激 素 (E 2 ) 及 NNK 對 於 MCF-7 細 胞 所 造 成 之 DNA 單 股 斷 裂 數 量 並 無 明 顯 增 加, 而 與 控 制 組 相 比, 當 MCF-7 單 獨 暴 露 於 TCDD 時 造 成 DNA 單 股 斷 裂 數 量 則 明 顯 增 加 (~8 倍 ) 而 同 時 暴 露 於 雌 性 激 素 (E 2 ) 及 TCDD 則 進 一 步 誘 導 細 胞 提 高 其 DNA 損 傷 (~24 倍 ) 同 樣 的, 同 時 暴 露 於 NNK 及 E 2 對 於 DNA 單 股 斷 裂 之 誘 導 亦 呈 顯 著 增 加 (~8 倍 ) 反 之, 當 細 胞 同 時 暴 露 於 TCDD NNK 及 E 2, 所 造 成 之 DNA 損 傷 與 控 制 組 相 比 則 大 幅 度 的 降 低 (~4 倍 ) 由 此 結 果 證 實, 當 MCF-7 細 胞 同 時 暴 露 於 E 2 TCDD 及 NNK 中, 此 三 物 質 之 交 互 作 用 導 致 拮 抗 效 應 I

Abstract The objectives of this research were to investigate the associations of the risk factors of breast cancer, including polymorphisms of genes involved in DNA repair, e.g. X-ray repair cross-complementing protein 1(XRCC1) and Poly [ADP-ribose] polymerase 1(PARP-1), with the background levels of abasic sites (AP sites) in Taiwanese women with breast cancer and controls. Additionally, we examined the effects of environmental carcinogens, including tobacco carcinogens(4-(methylnitro-samino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, NNK) anddioxin (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD) on the induction of DNA single strand breaks by 17β-estradiol (E 2 ) in human MCF-7breast cells. Results from the first part of this study indicated that the frequencies of variant alleles of DNA repair genes XRCC1 R399Q were estimated to be 33.2% and 38.4% for controls and breast cancer patients, respectively, whereas DNA repair genes PARP1 V762A were estimated to be 59.4% and 57.4% for controls and breast cancer patients, respectively.these findings suggest that variant alleles of XRCC1 R399Q and PARP1 V762A do not associate with the risk of developing breast cancer in Taiwanese women. Results from the second part of this research using the single-cell gel electrophoresis assay confirmed that E 2 and NNK alone did not induce significant increases in the number of DNA strand breaks in MCF-7 cellswhereas significant increases in the number of DNA strand breaks were detected in cells treated with TCDD when compared to control (~8 fold). Co-treatment of E 2 and TCDD further enhance the induction of DNA damage in cells (~24 fold). Similarly, in the presence of NNK, E 2 induced significant increases in the number of II

DNA strand breaks (~8 fold). By contrast, the extent of DNA lesions were dramatically reduced in cells treated with NNK, TCDD, and E 2 when compared to control (~4-fold). Overall, this evidence strongly suggests the presence of antagonistic effect of among these three compounds on the formation of DNA lesions in MCF-7 cells. III

縮 寫 表 8-oxo-dG 8-oxo-guanine DNA glycosylase 1 ADL Aldehydic DNA Lesions AP endonuclease AP site APTX Ala Arg Asn Asp ATP BER BMI BRCA1 BRCA2 BSA CEs COMT CT-DNA Apurinic/apyrimidinic endonuclease Abasic site or Apurinic/apyrimidinic site Aprataxin Alanineacid Arginineacid Asparagine Aspartic acid Adenosine TriPhosphate Base excision repair Body mass index Breast cancer 1, early onset Breast cancer 2, early onset Albumin from bovine serum Catechol estrogens Catechol-O-methyltrasferase Calf-thymus DNA CYP1A1 Cytochrome P450, family 1,subfamily A, polypeptide 1 CYP1B1 Cytochrome P450, family 1,subfamily B, polypeptide 1 Cys DDT DMEM DMSO DNA DSB GG-NER Cysteine Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane Dulbecco s modified Eagle medium Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid Double strand breaks Global genomic nucleotide excision repair IV

E 1 E 2 E 3 EDTA EREs ECL FBS Estrone Estradiol Estriol Ethylenediaminetetraacetic acid ( Estrogen b responsive h l) i elements ] i id Enhanced-chemiluminescence reagent Fetal Bovine Serum FEN1 Flap structure-specific endonuclease 1 FSH Follicle stimulating hormone FRET Fluorescence resonance energy transfer Gly Glycineacid Glu Glutamic acid Gln Glutamineacid GSH Glutathione GST Glutathione-S-transferase HEPES hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid HBSS Hank's Balanced Salt Solution HR Homologous recombination hogg1 Human oh8gua glycosylase 1 hpuf-a human Puf-A, hpuf-a HRP Streptavidin peroxidase label IARC International Agency for Research on Cancer Ile Isoleucine Leu Leucineacid MDL Method detection limit Met Methionine MGMT Methylguanine ethyltransferase MMR Mismatch repair NAD Nicotineamide-Adenine-Dinucleotide V

NC membrane Nitrocellulose membrane NER Nucleotide excision repair NHEJ Non-homologous end joining NNK 4-(methylnitro-samino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone PARP1 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 PBS Phosphate buffered saline PCNA Proliferating cell nuclear antigen PCR Polymerase chain reaction PNKP Polynucleotide kinase 3'-phosphatase Polδ DNA polymerase δ RBC Red blood cell RFC Replication factor C RNase A Ribonuclease A ROS Reactive oxygen species Ser Serine SHBG Sex hormone-binding globulin SNP Single nucleotide polymorphism SSB Single strand breaks SSBR Single strand break repair TCDD 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin TFIIH Transcription factor II Human T-T dimers Thymine dimers TC-NER Transcription couplednucleotide excision repair TEMPO 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yloxy Thr Threonine TLS Translesion DNA synthesis Tween 20 Polyoxyethylenesorbitan monolyaurate Val Valineacid WBC White blood cell WHI Women s Health Initiative VI

XP syndrome Xeroderma pigmentosum syndrome XRCC1 X-ray repair cross-complementing protein 1 VII

目 錄 摘 要... I Abstract... II 縮 寫 表... IV 表 目 錄... XII 圖 目 錄... XIII 第 一 章 前 言... 1 第 二 章 文 獻 回 顧... 3 2.1 乳 癌 風 險 因 子 (Breast Cancer Risk Factors)... 4 2.1.1 年 齡 (Age)... 4 2.1.2 種 族 (Race)... 4 2.1.3 身 體 質 量 指 標 (Body Mass Index, BMI)... 6 2.1.4 家 族 病 史 (Family History)... 7 2.1.5 環 境 致 癌 因 子 (Environmental Carcinogens)... 8 2.2 雌 性 激 素 (Estrogen)... 9 2.2.1 雌 性 激 素 與 乳 癌 風 險 (Estrogen and Risk of Breast Cancer)... 10 2.3 核 酸 損 害 (DNA damage)... 11 2.3.1 去 鹼 基 核 酸 (Apurinic/Apyrimidinic sites, AP sites)... 12 2.4 核 酸 修 復 (DNA repair)... 13 2.4.1 鹼 基 切 除 修 復 (Base excision repair, BER)... 16 2.4.2 核 苷 酸 切 除 修 復 (Nucleotide Excision Repair, NER)... 19 VIII

2.5 基 因 多 型 性 (Genetic Polymorphism)... 20 2.5.1 XRCC1 之 功 能 及 其 基 因 多 型 性... 21 2.5.2 PARP1 之 功 能 及 其 基 因 多 型 性... 22 2.5.3 APE1 之 功 能 及 其 基 因 多 型 性... 24 第 三 章 實 驗 設 計 架 構 與 假 設... 25 3.1 實 驗 設 計 架 構... 25 3.2 實 驗 假 設... 25 第 四 章 實 驗 材 料 與 方 法... 27 4.1 實 驗 設 備 與 材 料... 27 4.2 研 究 族 群... 31 4.3 實 驗 方 法... 32 4.3.1 全 血 分 離... 32 4.3.2 核 酸 萃 取... 34 4.3.3 核 酸 醛 基 損 害 分 析 方 法 (Aldehyde Reactive Probe-Slot-Blot assay, ASB assay)... 35 4.3.4 Putrescine-cleavage assay... 36 4.3.5 細 胞 培 養... 36 4.3.6 單 細 胞 凝 膠 電 泳 分 析 (Comet assay)... 37 4.4 單 一 核 苷 酸 多 型 性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNPs)... 38 4.4.1 XRCC1 R399Q 與 PARP1 V762A... 38 4.5 統 計 分 析... 42 第 五 章 實 驗 結 果... 43 IX

5.1 方 法 偵 測 極 限 (method detection limit, MDL) 與 變 異 係 數 (coefficient of variation, C.V.)... 43 5.2 Real-Time PCR 之 結 果... 44 5.2.1 XRCC1 R399Q... 44 5.2.2 PARP1... 45 5.3 去 氧 核 醣 核 酸 修 復 基 因 XRCC1 之 基 因 多 型 性... 45 5.4 去 氧 核 醣 核 酸 修 復 基 因 PARP1 之 基 因 多 型 性... 46 第 六 章 討 論... 52 6.1 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 之 AP sites... 52 6.2 AP sites 與 年 齡... 52 6.3 AP sites 與 BMI... 53 6.4 去 氧 核 醣 核 酸 修 復 基 因 之 基 因 多 型 性... 54 6.4.1 APE1 之 基 因 多 型 性... 54 6.4.2 XRCC1 之 基 因 多 型 性... 60 6.4.3 PARP1 之 基 因 多 型 性... 65 6.5 TCDD 及 NNK 對 E 2 於 人 類 乳 癌 細 胞 所 誘 導 核 酸 損 害 之 影 響 ( 共 同 添 加 )... 69 6-6 統 計 分 析... 70 6.6.1 健 康 對 照 組 之 相 關 性 與 多 元 線 性 迴 歸 分 析... 70 6.6.2 乳 癌 病 人 之 相 關 性 與 多 元 線 性 迴 歸 分 析... 72 第 七 章 結 論 與 建 議... 75 7.1 結 論... 75 X

7.2 未 來 研 究 方 向 與 建 議... 76 參 考 文 獻... 78 XI

表 目 錄 表 2-1 台 灣 女 性 乳 癌 發 生 率 之 個 案 數 統 計... 4 表 2-2 穩 定 狀 態 下 細 胞 內 源 性 DNA 損 害 統 計... 13 表 4-1 乳 癌 患 者 之 年 齡 與 BMI 資 料... 31 表 4-2 健 康 對 照 組 之 年 齡 與 BMI 資 料... 31 表 4-3 primers and hybridization probes sequence... 39 表 4-4 Real-Time PCR XRCC1 R399Q 之 反 應 條 件... 40 表 4-5 Real-Time PCR PARP1 V762A 之 反 應 條 件... 41 表 5-1 健 康 對 照 組 XRCC1 Arg399Gln 之 基 因 多 型 性 分 析... 46 表 5-2 乳 癌 病 人 XRCC1 Arg399Gln 之 基 因 多 型 性 分 析... 46 表 5-3 健 康 對 照 組 PARP1V762A 之 基 因 多 型 性 分 析... 47 表 5-4 乳 癌 病 人 PARP1 V762A 之 基 因 多 型 性 分 析... 47 表 6-1 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 APE1 Asp148Glu 勝 算 比 分 析... 59 表 6-2 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 APE1 Asp148Glu 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 59 表 6-3 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 XRCCC1 R399Q 勝 算 比 分 析... 64 表 6-4 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 XRCC1 R399Q 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 64 表 6-5 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 PARP1 V762A 勝 算 比 分 析... 68 表 6-6 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 PARP1 V762A 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 68 表 6-7 健 康 對 照 組 之 Ln (AP sites) 背 景 值 與 風 險 因 子 相 關 性... 71 表 6-8 乳 癌 病 人 之 Ln (AP sites) 背 景 值 與 乳 癌 風 險 因 子 相 關 性... 73 表 6-9 乳 癌 病 人 之 Ln (AP sites) 背 景 值 與 乳 癌 風 險 因 子 相 關 性... 74 XII

圖 目 錄 圖 2-1 國 人 十 大 癌 症 死 因... 3 圖 2-2 不 同 種 族 間 女 性 之 乳 癌 發 生 率... 5 圖 2-3 不 同 種 族 間 女 性 之 乳 癌 死 亡 率... 6 圖 2-4 雌 性 激 素 結 構 式... 10 圖 2-5 DNA 損 害 之 修 復 途 徑... 16 圖 2-6 鹼 基 切 除 修 補 機 制... 18 圖 2-7 核 苷 酸 切 除 修 復 (NER) 之 流 程 圖... 20 圖 2-8 PARP1 之 作 用 機 制... 23 圖 4-1 全 血 分 離 流 程... 34 圖 4-2 ARP 結 構 式... 36 圖 5-1 ASB assay 法 之 最 低 偵 測 極 限... 43 圖 5-2 Real-Time PCR 分 析 XRCC1 R399Q 之 基 因 型... 44 圖 5-3 Real-Time PCR 分 析 PARP1 V762A 之 基 因 型... 45 圖 5-5 單 獨 添 加 TCDD NNK 及 E 2 於 MCF-7 細 胞 中 反 應 5 小 時 誘 導 核 酸 損 害 之 影 響... 49 圖 5-6 單 獨 添 加 TCDD NNK 及 E 2 及 共 同 添 加 TCDD NNK 及 E 2 於 MCF-7 細 胞 中 反 應 5 小 時 誘 導 核 酸 損 害 之 影 響... 50 圖 5-7 共 同 添 加 TCDD NNK 及 E2 於 MCF-7 細 胞 中 反 應 5 小 時 誘 導 核 酸 損 害 之 影 響... 51 圖 6-1 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 之 AP sites 背 景 值... 52 圖 6-2 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 之 AP sites 背 景 值 ( 依 年 齡 區 分 )... 53 圖 6-3 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 之 AP sites 背 景 值 (BMI 區 分 )... 54 圖 6-4 健 康 對 照 組 APE1 Asp148Glu 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 56 圖 6-5 乳 癌 病 人 APE1 Asp148Glu 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 57 XIII

圖 6-6 健 康 對 照 組 與 乳 癌 病 人 APE1 Asp148Glu 與 AP sites... 58 圖 6-7 健 康 對 照 組 XRCC1 R399Q 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 62 圖 6-8 乳 癌 病 人 XRCC1 R399Q 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 61 圖 6-9 健 康 對 照 組 XRCC1 R399Q 與 AP sites... 63 圖 6-10 乳 癌 病 人 XRCC1 R399Q 與 AP sites... 63 圖 6-11 健 康 對 照 組 PARP1 V762A 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 66 圖 6-12 乳 癌 病 人 PARP1 V762A 對 偶 基 因 變 異 頻 率... 66 圖 6-13 健 康 對 照 組 PARP1 V762A 與 AP sites... 67 圖 6-14 乳 癌 病 人 PARP1 V762A 與 AP sites... 67 XIV

第 一 章 前 言 乳 癌 為 世 界 女 性 最 常 見 的 癌 症 之 一, 台 灣 從 民 國 71 年 起, 癌 症 就 躍 居 十 大 死 亡 原 因 的 第 一 位, 而 乳 癌 是 台 灣 地 區 發 生 率 最 快 速 增 加 的 女 性 癌 症 之 一, 根 據 國 民 健 康 局 統 計 資 料 發 現, 且 在 台 灣 女 性 中 乳 癌 發 生 率 及 死 亡 率 均 有 上 升 的 趨 勢, 好 發 年 齡 為 40~50 歲 乳 癌 主 要 致 癌 機 轉 是 女 性 荷 爾 蒙 對 乳 癌 細 胞 的 促 進 增 生 作 用 上, 因 此 西 化 的 生 活 飲 食 習 慣, 包 括 營 養 的 改 善 所 進 一 步 造 成 婦 女 初 經 年 齡 的 提 前 停 經 年 齡 的 延 後 停 經 後 肥 胖 人 口 的 增 加, 均 會 使 得 現 代 婦 女 相 較 於 從 前 有 更 多 的 機 會 暴 露 在 荷 爾 蒙 的 影 響 下 ( 中 央 研 究 院 生 物 醫 學 研 究 所,2010) DNA 的 損 傷 可 分 為 外 源 性 及 內 源 性 損 傷, 外 源 性 損 傷 包 括 來 自 太 陽 的 紫 外 射 線 [UV 200-300nm] 人 造 的 化 學 物 質, 如 吸 煙 產 生 的 某 些 烴 類 以 及 其 他 頻 率 的 輻 射 等, 內 源 性 損 傷 則 包 括 如 被 正 常 代 謝 的 副 產 物 活 性 氧 化 物 種 (Reactive oxygen species, ROS) 的 ( 自 由 基 ) 攻 擊 導 致 的 損 傷 及 鹼 基 修 復 過 程 (Base excision repair, BER) 中 所 造 成 的 損 傷, 這 些 損 傷 均 會 對 DNA 結 構 造 成 明 顯 影 響, 若 未 及 時 修 復 可 能 造 成 病 變 產 生 癌 症 其 中 DNA 內 源 性 損 傷 中 以 去 鹼 基 核 酸 (Abasic site or Apurinic/apyrimidinic site,ap sites) 為 最 常 見 的 損 害 形 式, 其 形 成 的 原 因 有 : 氧 化 壓 力 化 學 脫 嘌 呤 以 烷 基 化 等 本 研 究 主 要 目 的 是 探 討 台 灣 女 性 之 乳 癌 風 險 因 子, 包 括 年 齡 身 體 質 量 指 標 (Body mass index, BMI) 及 基 因 多 型 性 ( 鹼 基 切 除 修 復 基 因 X-ray repair cross-complementing protein 1 (XRCC1) Poly [ADP-ribose] polymerase 1(PARP1)) 與 去 鹼 基 核 酸 背 景 值 之 關 係, 並 與 本 實 驗 室 先 前 研 究 之 結 果 Apurinic/apyrimidinic endonuclease(ape1) 進 行 探 討, 希 冀 能 找 出 乳 癌 與 乳 癌 風 險 因 子 及 AP sites 之 關 聯 性 1

第 二 個 目 的 為 藉 由 將 人 類 乳 癌 細 胞 株 MCF-7 暴 露 於 不 同 的 環 境 致 癌 物 ( 雌 性 激 素 (17β-estradiol,E 2 ) 戴 奧 辛 (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD) 及 菸 草 致 癌 物 (4-(methylnitro-samino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, NNK)), 探 討 其 單 獨 暴 露 於 各 致 癌 物 質 及 同 時 暴 露 於 多 種 致 癌 物 質 時, 對 誘 導 細 胞 之 DNA 單 股 斷 裂 程 度, 進 而 探 討 其 作 用 機 制 2

第 二 章 文 獻 回 顧 乳 癌 對 於 台 灣 地 區 的 女 性 而 言, 一 直 是 非 常 重 要 的 公 共 衛 生 問 題, 其 發 生 率 及 死 亡 率 在 近 年 來 均 有 上 升 的 趨 勢, 全 球 在 過 去 十 幾 年 中, 乳 癌 的 發 病 率 均 有 增 加 的 趨 勢, 其 中 以 亞 洲 國 家 的 增 加 趨 勢 最 為 明 顯, 且 罹 患 乳 癌 的 亞 洲 婦 女 當 中, 四 十 多 歲 的 患 者 為 癌 症 發 病 高 峰, 而 在 美 國 及 歐 洲 之 乳 癌 發 病 高 峰 為 六 十 多 歲 這 樣 的 差 異 性 可 能 由 許 多 因 素 所 造 成, 包 括 地 理 位 置 的 差 異 種 族 的 不 同 遺 傳 變 異 生 活 習 慣 及 環 境 因 素 等 (Stanley P. L. Leong, 2010) 根 據 國 民 健 康 局 統 計 資 料 發 現, 國 人 十 大 癌 症 死 因 當 中, 男 性 的 第 一 名 為 前 列 腺 癌, 而 女 性 的 則 為 乳 癌 ( 圖 2-1), 且 乳 癌 病 人 發 病 率 及 致 死 率 在 近 年 來 有 顯 著 上 升 趨 勢, 其 中 發 生 率 由 2008 年 的 每 十 萬 人 中 的 57.32 增 加 至 2012 年 的 每 十 萬 人 的 70.76, 發 生 人 數 更 由 2008 年 的 8320 人 攀 升 至 2012 年 的 11, 479 人 ( 表 2-1) 因 此 我 們 可 以 知 道, 乳 癌 不 管 是 在 台 灣 亦 或 是 其 他 全 球 各 地, 均 是 當 前 必 須 注 意 的 公 共 衛 生 問 題 圖 2-1 國 人 十 大 癌 症 死 因 (Bureau of Health Promotion, 2008-2012) 3

表 2-1 台 灣 女 性 乳 癌 發 生 率 之 個 案 數 統 計 (Bureau of Health Promotion, 2008-2012) Breast cancer incidence of Taiwanese women Years Case Age (mean) Standardized incidence ratio Percentage 2008 8,320 52.82 57.32 23.45% 2009 9,041 53.38 60.69 23.27% 2010 9,655 53.57 63.16 24.29% 2011 10,603 53.57 67.11 25.87% 2012 11,479 53.59 70.76 27.33% 2.1 乳 癌 風 險 因 子 (Breast Cancer Risk Factors) 2.1.1 年 齡 (Age) 目 前 發 現 與 乳 癌 相 關 的 風 險 因 子 有 非 常 多, 其 中 年 齡 是 一 大 乳 癌 風 險 因 子, 有 研 究 指 出, 在 西 方 國 家 罹 患 乳 癌 之 婦 女 年 齡 集 中 於 60-70 歲, 而 在 亞 洲 婦 女 年 齡 則 集 中 在 40-50 歲, 且 發 生 率 及 死 亡 率 均 有 上 升 趨 勢 (Stanley et al., 2010) 此 原 因 目 前 尚 無 法 確 定, 但 有 研 究 指 出, 隨 著 年 齡 的 增 加, 女 性 體 內 之 動 情 素 會 隨 之 減 少, 直 至 進 入 更 年 期 後 卵 巢 不 再 有 功 能, 不 再 產 生 動 情 激 素, 而 體 內 缺 少 動 情 激 素 則 會 增 加 乳 癌 的 風 險 (Chen et al.,2013) 亦 有 研 究 指 出, 年 齡 的 增 加 會 造 成 基 因 Ras association domain-containing protein 1 (RASSF1A) 甲 基 化 (Methylation) 的 增 加, 且 與 乳 癌 也 有 高 度 相 關 性 (OR=5.28 ; p=0.001) (Euhus et al., 2008) 2.1.2 種 族 (Race) 不 同 的 種 族 之 婦 女 其 乳 癌 的 發 生 率 及 死 亡 率 也 有 所 不 同, 根 據 資 料 統 計, 白 人 婦 女 乳 癌 的 發 生 率 由 1999 年 的 140 人 ( 每 十 萬 女 性 ) 下 降 至 2010 年 時 4

約 為 130 人 ( 每 十 萬 女 性 ), 雖 有 些 微 的 下 降 趨 勢, 不 過 白 人 婦 女 乳 癌 的 發 生 率 一 直 是 所 有 種 族 當 中 最 高 的, 推 測 是 由 於 飲 食 習 慣 的 不 同 所 導 致 此 外 亞 洲 女 性 當 中, 乳 癌 的 發 生 率 雖 不 及 白 人 女 性, 但 亦 有 上 升 的 趨 勢, 約 為 90 人 ( 每 十 萬 女 性 )( 圖 2-1) 而 白 人 女 性 雖 然 乳 癌 的 發 生 率 為 最 高, 死 亡 率 在 2010 年 約 有 23 人 ( 每 十 萬 女 性 ), 比 黑 人 女 性 的 33 人 ( 每 十 萬 女 性 ) 來 的 低 許 多, 即 白 人 女 性 雖 然 罹 患 乳 癌 的 機 率 比 黑 人 女 性 來 得 高, 但 黑 人 女 性 死 於 乳 癌 的 機 率 較 高, 推 測 是 因 為 黑 人 女 性 的 腫 瘤 細 胞 生 長 速 度 較 快 (American Cancer Society, 2008) 而 亞 洲 女 性 乳 癌 的 死 亡 率 約 為 14 人 ( 每 十 萬 女 性 ), 與 其 他 種 族 相 對 較 低 ( 圖 2-2) 但 亞 洲 女 性 乳 癌 發 生 率 及 死 亡 率 均 有 上 升 的 趨 勢, 因 此 早 期 發 現 及 治 療 乳 癌 顯 得 相 當 重 要 所 有 種 族 白 種 人 黑 人 美 洲 印 第 安 人 / 阿 拉 斯 加 原 住 民 亞 洲 / 太 平 洋 島 民 西 班 牙 裔 圖 2-2 不 同 種 族 間 女 性 之 乳 癌 發 生 率 (Centers for Disease Control and Prevention, 2010) 5

所 有 種 族 白 種 人 黑 人 美 洲 印 第 安 人 / 阿 拉 斯 加 原 住 民 亞 洲 / 太 平 洋 島 民 西 班 牙 裔 圖 2-3 不 同 種 族 間 女 性 之 乳 癌 死 亡 率 (Centers for Disease Control and Prevention, 2010) 2.1.3 身 體 質 量 指 標 (Body Mass Index, BMI) 身 體 質 量 指 數 (BMI) 也 和 乳 癌 有 關, 然 而 在 停 經 前 和 停 經 後 的 婦 女, BMI 對 於 乳 癌 發 生 率 有 著 不 同 的 影 響 停 經 後 婦 女 罹 患 乳 癌 的 機 率 隨 著 BMI 的 增 加 而 增 高, 在 一 個 研 究 中 顯 示,BMI 在 前 四 分 之 一 婦 女, 乳 癌 機 率 較 最 低 四 分 之 一 的 婦 女 增 加 了 百 分 之 四 十, 這 現 象 一 般 認 為 脂 肪 組 織 能 合 成 雌 激 素 有 關 然 而 在 停 經 前 婦 女, 較 高 的 BMI 對 於 乳 癌 的 危 險 性 反 而 有 較 低 BMI 相 差 8 的 情 況 下, 乳 癌 的 相 對 危 險 率 為 0.7 這 可 能 和 在 體 重 較 輕 的 婦 女 中, 常 有 排 卵 不 正 常, 導 致 體 內 荷 爾 蒙 不 正 常 相 關 (Chang et al., 2008) 6

2.1.4 家 族 病 史 (Family History) 家 族 病 史 在 乳 癌 當 中 是 重 要 且 確 切 的 風 險 因 子, 根 據 美 國 國 家 衛 生 研 究 院 以 及 臨 床 研 究 指 出, 家 族 病 史 確 實 會 增 加 乳 癌 的 風 險 有 一 等 親 乳 癌 家 族 史 的 女 性, 乳 癌 風 險 會 是 一 般 女 性 的 兩 倍, 而 且 這 個 風 險 會 隨 著 有 乳 癌 家 族 史 的 親 戚 人 數 增 多 或 這 些 親 戚 越 早 發 病 或 有 兩 側 性 乳 癌, 風 險 還 會 更 高 以 西 方 國 家 的 一 項 統 計 為 例, 沒 有 乳 癌 家 族 史 的 女 性, 終 其 一 生 發 生 乳 癌 的 機 率 是 7.8%, 有 一 個 乳 癌 親 戚, 則 機 率 上 升 至 13.3%, 若 有 兩 個 乳 癌 親 戚, 則 機 率 21.1% 而 以 一 個 20 歲 的 年 輕 女 性 為 例, 在 50 歲 以 前 發 生 乳 癌 的 機 會, 沒 有 乳 癌 家 族 史 的 機 率 僅 為 1.7%, 有 一 個 一 等 親 乳 癌 親 戚 則 機 率 上 升 至 3.7%, 有 兩 個 一 等 親 乳 癌 親 戚, 則 機 率 上 升 至 8.0% 而 乳 癌 家 族 史 中 所 指 的 親 戚 也 絕 不 只 限 於 一 等 親 一 般 而 言, 家 族 遺 傳 型 乳 癌 的 特 點 包 括 :1. 同 一 血 緣 家 族 有 多 位 乳 癌 病 例 ( 如 大 於 三 位 ) 2. 年 輕 乳 癌 ( 如 小 於 35 歲 ) 3. 雙 側 乳 癌 4. 合 併 卵 巢 癌 5. 男 性 乳 癌 此 外 若 家 族 成 員 罹 患 其 他 癌 症, 則 該 家 族 女 性 在 年 輕 時 即 被 診 斷 出 乳 癌 或 者 患 乳 癌 的 機 率 也 會 進 一 步 增 加 (Cancer Research UK, 2013 ; Taiwan Clinical Oncology Research Foundation, 2011) 乳 癌 家 庭 史 為 何 是 罹 患 乳 癌 重 要 的 危 險 因 子, 原 因 目 前 只 了 解 一 部 份 在 所 有 的 乳 癌 病 患 中, 有 約 5-10% 的 病 患 可 查 出 具 有 特 定 的 基 因 缺 陷, 這 個 基 因 缺 陷 並 非 指 僅 在 乳 癌 細 胞 上 所 發 現, 而 是 指 在 身 體 各 組 織 的 正 常 細 胞 也 會 發 現 到 的 而 這 些 特 定 的 基 因 缺 陷 也 不 見 得 在 有 乳 癌 家 族 史 的 病 患 可 以 發 現 到 目 前 這 些 被 發 現 的 基 因 可 分 為 高 危 險 度 基 因 與 中 低 危 險 度 基 因 ; 其 中 高 危 險 度 基 因 包 括 Breast cancer 1, early onset(brca1) Breast cancer 2, early onset(brca2) 等, 造 成 的 危 險 性 超 過 4 倍 高 危 險 度 基 因 確 實 是 乳 癌 家 族 史 使 乳 癌 危 險 提 高 的 主 因, 但 中 低 危 險 度 基 因 則 不 易 找 出 如 此 的 關 連 性 但 高 危 險 度 基 因 缺 陷 在 人 類 發 生 率 很 低, 大 都 小 於 1%, 相 反 的, 中 低 危 險 度 基 因 缺 陷 則 發 生 機 率 較 高, 常 是 1-5% 或 5% 以 上 7

BRCA1 及 BRCA2 產 生 突 變 最 常 見 的 影 響 就 是 乳 癌 及 卵 巢 癌 之 發 生 率 的 增 高 有 BRCA1 突 變 的 女 性, 在 70 歲 之 前, 有 46%~85% 的 機 率 發 生 乳 癌 ( 比 例 依 不 同 研 究 及 種 族 而 有 不 同 ), 有 39%~63% 的 機 率 發 生 卵 巢 癌 有 BRCA2 突 變 的 女 性, 在 70 歲 之 前, 有 43%~84% 的 機 率 發 生 乳 癌, 而 有 11%~27% 的 機 率 發 生 卵 巢 癌 其 實, 其 他 部 位 的 癌 症 發 生 機 率 也 會 提 高, 例 如 BCRA1 突 變 和 大 腸 癌 子 宮 頸 癌 子 宮 體 癌 胰 臟 癌 攝 護 腺 癌 有 關, 而 BRCA2 突 變 則 和 男 性 乳 癌 膽 囊 及 膽 道 癌 胃 癌 黑 色 素 癌 胰 臟 癌 攝 護 腺 癌 骨 癌 及 咽 癌 相 關 依 目 前 國 外 大 致 的 估 計,BRCA1 及 BRCA2 突 變 可 以 在 25% 的 家 族 遺 傳 型 乳 癌 病 患 中 被 發 現, 所 以 BRCA1 及 BRCA2 僅 能 解 釋 一 部 分 的 家 族 遺 傳 型 乳 癌 (Taiwan Clinical Oncology Research Foundation, 2011) 2.1.5 環 境 致 癌 因 子 (Environmental Carcinogens) 環 境 中 的 污 染 物 質 雖 與 乳 癌 沒 有 直 接 關 係, 不 過 環 境 汙 染 物 有 潛 在 影 響 乳 癌 的 風 險 據 聯 合 國 環 境 署 和 世 界 衛 生 組 織 所 提 出 的 報 告 中 指 出, 家 用 產 品 和 工 業 產 品 中 所 含 的 環 境 荷 爾 蒙 與 全 球 乳 癌 卵 巢 癌 前 列 腺 癌 睪 丸 癌, 甲 狀 腺 癌 的 高 罹 患 率 相 關 (National Environmental Health Research Center,2012) 而 在 美 國 芬 蘭 加 拿 大 及 墨 西 哥 等 國 研 究 發 現, 暴 露 於 有 機 氯 如 Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane (DDT) 確 實 會 增 加 乳 癌 風 險 此 外, 環 境 污 染 物 可 能 會 直 接 或 間 接 影 響 生 殖 系 統, 並 由 此 影 響 腫 瘤 產 生 的 過 程 (Wolff, 1997) 現 在 已 知 或 可 能 影 響 荷 爾 蒙 受 體 的 化 學 物 質 約 有 800 種, 但 只 有 其 中 一 小 部 份 經 過 實 驗 檢 測, 大 部 分 目 前 在 商 業 中 使 用 的 化 學 物 質 都 尚 未 接 受 檢 測 環 境 荷 爾 蒙 從 工 業 和 城 市 的 排 放 農 業 排 水 和 燃 燒 及 排 放 廢 棄 物 等 方 式 進 入 環 境 當 中, 人 類 在 攝 入 被 污 染 的 食 物 灰 塵 水 及 吸 入 的 空 氣 中 的 氣 體 或 粒 子 或 者 是 皮 膚 接 觸 到 受 污 染 的 物 質 均 會 使 環 境 賀 爾 蒙 進 入 體 內, 8

進 而 影 響 人 體 健 康 人 體 健 康 一 靠 正 常 運 作 的 內 分 泌 系 統 來 釋 放 特 定 的 賀 爾 蒙, 這 些 荷 爾 蒙 對 代 謝 成 長 發 展 睡 眠 和 情 緒 等 作 用 來 說 是 必 須 的 環 境 荷 爾 蒙 會 改 變 這 些 內 分 泌 系 統 的 運 作, 增 加 罹 癌 風 險 (National Environmental Health Research Center,2012) 2.2 雌 性 激 素 (Estrogen) 存 在 女 性 的 天 然 雌 性 激 素 有 雌 酮 (estrone, E1) 雌 二 醇 (estradiol, E2) 雌 三 醇 (estriol, E3), 在 循 環 系 統 分 別 佔 有 10-20% 10-30% 60-80% 雖 然 雌 三 醇 是 含 量 最 豐 富 的, 但 卻 是 作 用 最 弱 的 雌 性 激 素, 雌 二 醇 的 效 力 約 是 雌 三 醇 的 80 倍 對 於 處 在 月 經 初 潮 到 更 年 期 前 這 段 期 間 的 未 懷 孕 女 性, 雌 二 醇 是 最 重 要 的 雌 性 激 素 然 而, 對 於 懷 孕 女 性, 重 要 角 色 就 轉 換 到 雌 三 醇 ; 而 雌 酮 是 更 年 期 女 性 體 內 雌 性 激 素 的 主 要 形 式 所 有 不 同 型 態 的 雌 性 激 素 都 是 芳 香 酶 (aromatase) 轉 換 雄 性 激 素 而 成, 特 別 是 睪 酮 (testosterone) 和 雄 烯 二 酮 (androstenedione) 雌 性 激 素 主 要 是 由 卵 巢 黃 體 及 胎 盤 製 造 濾 泡 刺 激 激 素 (Follicle stimulating hormone, FSH) 刺 激 卵 巢 的 顆 粒 性 細 胞 (Granulosa cells) 合 成 雌 性 激 素 少 量 的 雌 性 激 素 也 經 由 其 他 組 織 合 成, 如 肝 腎 上 腺 乳 房, 這 些 少 量 的 雌 性 激 素 對 於 更 年 期 女 性 尤 其 重 要 另 外, 脂 肪 細 胞 也 生 產 雌 性 激 素 合 成 雌 性 激 素 是 從 卵 巢 內 膜 細 胞 開 始, 將 膽 固 醇 合 成 雄 烯 二 醇 雄 烯 二 醇 有 中 等 的 雌 激 素 活 性, 會 穿 透 基 底 膜 到 達 顆 粒 性 細 胞, 接 著 會 被 轉 換 成 雌 酮 或 雌 二 醇 雌 二 醇 的 濃 度 隨 著 月 經 週 期 而 有 高 低 起 伏, 只 有 在 排 卵 前 才 會 有 高 濃 度 9

雌 素 酮 (estrone) 雌 二 醇 (estradiol) 雌 三 醇 (estriol) 圖 2-4 雌 性 激 素 結 構 式 2.2.1 雌 性 激 素 與 乳 癌 風 險 (Estrogen and Risk of Breast Cancer) 雌 性 激 素 會 增 加 乳 癌 風 險 的 觀 念 一 開 始 由 Bittner 等 學 者 提 出, 其 研 究 指 出, 在 無 外 界 誘 發 物 如 化 學 致 癌 物 質 放 射 線 等 影 響 下, 由 於 雌 性 激 素 的 過 度 刺 激, 導 致 接 受 這 些 雌 性 激 素 的 器 官 如 乳 房 之 乳 腺 細 胞 與 纖 維 組 織 的 增 生, 嚴 重 者 會 有 乳 管 擴 張 囊 腫 化 乳 管 通 道 受 到 擠 壓 或 堵 塞 的 情 形 出 現, 甚 或 是 產 生 腫 瘤 大 約 有 80% 的 乳 癌 患 者, 體 內 的 乳 癌 細 胞 需 要 靠 雌 性 激 素 才 得 以 生 長, 例 如 體 內 已 突 變 之 乳 房 管 道 上 皮 細 胞 (initiated cells), 會 經 由 雌 性 激 素 過 度 增 生, 導 致 風 險 上 升, 因 此 雌 性 激 素 被 認 為 在 乳 癌 的 致 病 機 制 上 扮 演 促 進 因 子 (promoter) 的 角 色, 且 雌 性 激 素 被 國 際 癌 症 研 究 機 構 (International Agency for Research on Cancer,IARC) 歸 類 為 人 類 確 定 致 癌 物, 因 此 有 許 多 關 於 雌 性 激 素 與 癌 症 的 研 究 證 實, 過 量 之 雌 性 激 素 可 能 誘 發 疾 病 與 癌 症 的 發 生, 例 如 乳 癌 肺 癌 子 宮 頸 癌 (Chlebowski et al., 2010; Eliassen et al., 2012; Mori et al., 2011) 在 世 界 各 個 不 同 的 地 區 統 計 中, 發 現 乳 癌 最 常 見 的 致 病 危 險 因 子 有 四 項 : 初 經 早 停 經 晚 頭 胎 生 產 的 年 齡 大 及 體 重 高 根 據 研 究 顯 示 的 研 究 顯 示, 初 經 早 於 14 歲 的 婦 女 相 對 於 晚 於 17 歲 者, 乳 癌 的 機 率 為 兩 倍 第 一 胎 生 產 在 22 歲 之 前 相 對 於 25 歲 之 後 的 婦 女, 乳 癌 機 率 顯 著 地 降 低 (Wu et al,2006) 在 臨 床 研 究 中 也 指 出 規 則 而 排 卵 的 週 期 可 增 加 乳 癌 發 生 的 危 險 性 ; 同 時 在 正 常 有 排 卵 週 期 的 黃 體 期 中, 子 宮 內 膜 所 接 受 的 雌 激 素 量 比 不 排 卵 週 期 較 高, 所 以 排 卵 週 期 的 頻 率 可 做 為 雌 激 素 累 積 的 一 項 指 標 一 些 跨 國 性 的 研 究 也 證 實 此 觀 念 : 排 卵 週 期 的 累 積 就 是 雌 激 素 暴 露 的 累 積, 也 就 是 乳 癌 的 主 要 成 因 (Kotsopouloset al., 2012) 10

併 用 動 情 素 與 黃 體 素 的 停 經 婦 女 乳 癌 風 險 增 加, 而 這 影 響 會 隨 著 治 療 終 止 的 時 間 增 長 而 降 低 最 常 提 到 的 研 究 為 Women s Health Initiative (WHI) 所 報 導 的 研 究, 婦 女 在 接 受 雌 激 素 和 黃 體 素 合 併 的 荷 爾 蒙 療 法 後, 荷 爾 蒙 療 法 可 以 降 低 髖 關 節 骨 折 的 機 率, 然 而 在 乳 癌 罹 患 率 再 使 用 四 年 後 為 增 加 百 分 之 二 十 六, 而 且 這 個 比 率 有 隨 著 時 間 的 增 加 而 增 高 的 趨 勢 同 時 在 其 他 如 心 臟 血 管 血 栓 阻 塞 及 腦 中 風 等 疾 病 也 有 增 加 的 現 象 在 其 他 的 研 究 如 Million Women Study 及 Estrogen/progestin Replacement Study (HERS) 也 證 實 荷 爾 蒙 補 充 療 法 會 增 加 乳 癌 的 機 率, 所 以 外 源 性 的 荷 爾 蒙 是 乳 癌 的 危 險 因 子 (Chang et al., 2008) 2.3 核 酸 損 害 (DNA damage) 人 類 細 胞 和 絕 大 多 數 的 真 核 細 胞 的 DNA 定 位 於 細 胞 內 的 兩 個 地 方 : 細 胞 核 內 和 線 粒 體 內 細 胞 核 DNA(nDNA) 大 量 聚 集 於 染 色 體 ; 染 色 體 是 由 DNA 和 纏 繞 其 上 的 稱 為 組 蛋 白 的 珠 狀 蛋 白 質 組 成 的 只 要 細 胞 要 表 達 其 ndna 編 碼 的 遺 傳 信 息, 其 相 應 的 染 色 體 區 域 就 要 拆 開, 則 在 此 處 的 基 因 才 被 表 達, 之 後 這 一 區 域 又 固 縮 回 原 來 的 靜 態 構 造 線 粒 體 DNA(mtDNA) 位 於 細 胞 器 線 粒 體 內, mtdna 會 與 許 多 相 同 的 蛋 白 質 緊 密 結 合 以 形 成 一 種 叫 做 類 核 的 複 合 體, 並 且 在 線 粒 體 裡 面, 生 成 三 磷 酸 腺 苷 (ATP) 以 提 供 細 胞 所 需 能 量, 而 其 氧 化 磷 酸 化 反 應 的 副 產 物 - 活 性 含 氧 物 種 (ROS), 或 稱 自 由 基, 會 使 線 粒 體 內 形 成 一 種 高 度 氧 化 的 環 境, 而 這 種 環 境 能 對 mtdna 造 成 傷 害 細 胞 內 正 常 的 代 謝 活 動 與 環 境 因 素 所 引 起 的 DNA 損 傷 的 發 生 速 率 約 為 每 個 細 胞 每 天 有 1,000 至 1,000,000 處 分 子 損 害 但 是 許 多 別 的 因 素 能 使 之 達 到 更 高 的 速 率 一 個 關 鍵 的 癌 相 關 基 因 ( 如 腫 瘤 抑 制 基 因 ) 的 一 處 未 修 復 的 損 害 就 能 對 個 體 產 生 災 難 性 的 後 果, 而 這 類 基 因 只 佔 人 類 基 因 組 中 的 0.000165% DNA 損 害 可 能 造 成 細 胞 停 止 生 長 細 胞 凋 亡 或 轉 型 成 癌 細 胞, 而 對 於 生 物 個 體 當 然 不 可 避 免 的 會 導 致 對 應 的 症 狀, 即 老 化 死 亡, 或 者 腫 瘤 的 11

形 成, 這 些 現 象 與 源 自 細 胞 內 產 生 的 DNA 損 害 無 法 順 利 透 過 DNA 修 復 機 制 進 行 處 理 有 很 大 的 關 連 DNA 損 害 可 分 為 內 源 性 損 害 及 內 源 性 損 害, 內 源 性 損 害 如 被 正 常 代 謝 的 副 產 物 活 性 氧 分 子 攻 擊 導 致 的 損 害 外 源 性 損 害 則 是 由 外 部 因 素 引 起, 例 如 : 來 自 太 陽 的 紫 外 射 線 [UV 200-300nm] 其 他 頻 率 的 輻 射, 包 括 X 射 線 和 γ 射 線 水 解 和 熱 解 某 些 植 物 毒 素 人 造 的 突 變 物 質, 如 吸 煙 產 生 的 某 些 烴 類 及 腫 瘤 的 化 學 療 法 和 放 射 線 療 法 DNA 的 內 源 性 損 害 主 要 是 以 破 壞 DNA 之 初 級 結 構 為 主, 包 括 : 核 苷 酸 鹼 基 之 氧 化 (oxidation) 核 苷 酸 鹼 基 之 烷 基 化 (alkylation) 核 苷 酸 鹼 基 之 去 氨 化 (deamination) 核 苷 酸 鹼 基 之 水 解 (hydrolysis) 及 核 苷 酸 鹼 基 之 錯 誤 配 對 (mismatch) 等 而 外 源 性 的 DNA 損 害, 隨 著 暴 露 在 外 生 性 因 子 的 時 間 劑 量 的 差 異, 其 導 致 的 DNA 損 害 形 式 也 有 很 大 的 差 異 目 前 的 研 究 發 現 細 胞 在 紫 外 線 得 照 射 下 對 使 得 DNA 會 形 成 雙 嘧 啶 鍵 結 (purimidine dimer), 是 一 種 外 源 性 DNA 損 害 的 明 確 類 型 2.3.1 去 鹼 基 核 酸 (Apurinic/Apyrimidinic sites, AP sites) 去 鹼 基 核 酸 (abasic sites Apurinic/apyrimidinic sites AP sites),ap sites 是 DNA 損 害 中 最 常 見 的 一 種 型 式, 約 佔 90% (Swenberg et al., 2011) AP sites 會 導 致 突 變 與 具 有 細 胞 毒 性 之 基 因 變 異 (Ribar, Izumi, & Mitra, 2004) 其 形 成 原 因 為 具 反 應 能 力 之 活 性 氧 分 子, 藉 由 直 接 去 除 DNA 上 面 的 五 碳 糖 (ribose) 上 之 氫 原 子, 生 成 3 - 或 5 - 斷 裂 之 氧 化 去 鹼 基 核 酸, 最 後 形 成 具 有 醛 基 構 造, 這 類 構 造 損 害, 通 稱 為 醛 基 核 酸 損 害 (Aldehydic DNA Lesions,ADL) 根 據 研 究 指 出, 內 源 性 的 氧 化 壓 力 傷 害 主 要 為 AP sites (30000 AP sites 細 胞 / 天 ) (Swenberg et al., 2011) 12

表 2-2 穩 定 狀 態 下 細 胞 內 源 性 DNA 損 害 統 計 (Swenberg et al., 2011) 2.4 核 酸 修 復 (DNA repair) 既 然 內 源 性 (endogenous) 與 外 源 性 (exogenous) 的 DNA 損 害 來 源 均 無 法 避 免, 細 胞 就 必 須 面 對 這 些 DNA 損 害 的 形 式 採 取 適 當 的 措 施 對 一 個 細 胞 來 說, 消 極 的 做 法 是 暫 時 容 忍 損 害 的 存 在, 等 到 細 胞 的 基 因 體 遭 受 損 害 到 一 定 程 度, 細 胞 自 然 無 法 再 持 續 進 行 運 作 ; 而 積 極 的 做 法 則 是 針 對 所 有 可 能 的 DNA 損 害 發 展 出 相 對 應 的 修 復 補 救 措 施, 以 確 保 基 因 體 內 遺 傳 訊 息 的 正 確 性 根 據 分 子 生 物 學 近 幾 年 來 的 研 究 發 展, 科 學 家 已 經 發 現 無 論 是 以 單 細 胞 形 式 存 活 的 酵 母 菌 到 我 們 人 類 的 細 胞, 都 可 以 找 到 相 對 應 的 DNA 修 復 機 制, 這 說 明 DNA 修 復 機 制 在 各 物 種 間 的 高 度 保 守 性 (highly conservative), 更 充 分 顯 示 了 DNA 損 害 所 造 成 的 危 害, 在 生 物 演 化 初 期 就 無 可 避 免 在 現 存 細 胞 內 的 DNA 修 復 機 制 中, 由 DNA 損 害 斷 裂 的 程 度 可 以 分 為 兩 種 類 型, 一 種 是 單 股 損 害, 另 一 種 則 是 DNA 雙 股 斷 裂 前 者 修 復 機 制 通 常 需 要 藉 助 其 對 應 的 另 一 股 當 模 板 (template), 而 後 者 在 缺 乏 另 一 股 13

序 列 當 模 板 的 情 況 下, 則 是 轉 而 透 過 同 源 的 染 色 體 (homologous chromosome) 序 列 或 姊 妹 染 色 分 體 (sister chromatid) 來 尋 求 支 援 1. 單 股 DNA 損 害 修 復 機 制 : 單 股 DNA 損 害 修 復 機 制 的 特 色 是, 當 只 要 DNA 兩 股 的 其 中 一 股 發 生 損 害, 另 一 股 在 這 時 候 就 可 以 當 作 模 板, 以 作 為 修 正 的 依 據 細 胞 為 了 對 抗 各 種 形 式 的 DNA 損 害, 發 展 了 數 種 DNA 單 股 損 害 的 修 復 機 制, 包 括 : (1) 單 一 蛋 白 所 參 與 的 直 接 修 復 機 制 (methylguanine ethyltransferase, MGMT): 具 有 甲 基 轉 移 酶 的 活 性, 因 此 可 以 直 接 將 6 號 位 置 鳥 嘌 呤 的 甲 基 (CH3,O6-methylguanine) 直 接 移 除 而 在 細 菌 內 也 有 一 個 修 復 蛋 白, 光 分 解 酵 素 (photolyase), 可 以 修 復 紫 外 線 所 造 成 的 雙 嘧 啶 鍵 結 (purimidine dimer) 由 於 這 一 類 的 蛋 白 可 以 直 接 將 遭 受 破 壞 的 DNA 或 核 苷 酸 還 原, 因 此 不 需 要 另 一 股 當 作 修 復 的 模 板 (2) 鹼 基 切 除 修 復 (Base excision repair, BER): 用 來 切 除 並 修 復 異 常 的 不 該 出 現 的 鹼 基 這 些 非 A T G C 鹼 基 的 出 現 若 無 適 時 修 復, 則 DNA 聚 合 酶 在 複 製 的 過 程 就 很 容 易 在 碰 到 這 些 鹼 基 時 置 入 錯 誤 的 配 對, 即 會 使 點 突 變 發 生 (3) 核 苷 酸 切 除 修 復 (Nucleotide excision repair, NER):NER 主 要 修 復 那 些 影 響 區 域 性 的 染 色 體 結 構 的 DNA 損 害, 包 括 由 紫 外 線 所 導 致 的 雙 嘧 啶 鍵 結 (pyrimidine dimer), 化 學 分 子 或 蛋 白 質 與 DNA 間 的 鍵 結 DNA 附 加 物 (DNA adduct), 或 者 DNA 與 DNA 的 鍵 結 DNA 交 互 連 結 (cross-link) 等 這 些 損 害 的 形 式 若 沒 有 適 時 的 排 除,DNA 聚 合 酶 將 無 法 辨 識 而 滯 留 在 損 害 的 位 置, 這 時 細 胞 就 會 活 化 細 胞 週 期 檢 查 點 (cell cycle checkpoint) 以 全 面 停 止 細 胞 週 期 的 進 行 (4) 錯 誤 配 對 修 復 (Mismatch repair, MMR): 主 要 是 負 責 DNA 在 複 製 過 程 發 生 嘌 呤 嘧 啶 錯 誤 配 對 的 校 對 工 作 (5) 單 股 DNA 斷 裂 修 復 (Single strand break repair, SSBR): 細 胞 內 參 與 修 復 單 股 DNA 斷 裂 的 機 制 與 鹼 基 切 除 修 復 的 蛋 白 質 種 類 有 很 高 的 14

重 複, 因 此 有 些 人 把 單 股 DNA 斷 裂 的 機 制 也 歸 入 鹼 基 切 除 修 復 的 路 徑 內 2. 雙 股 DNA 損 害 修 復 機 制 :DNA 雙 股 斷 裂 對 細 胞 來 說 是 最 嚴 重 也 是 最 致 命 的 DNA 損 害 類 型 DNA 單 股 的 損 害 在 組 蛋 白 的 保 護 下, 或 許 可 以 逃 過 更 進 一 步 的 損 害 與 化 學 物 質 的 攻 擊, 而 DNA 雙 股 斷 裂 的 結 果 使 得 DNA 的 末 端 直 接 裸 露, 在 這 種 情 況 的 發 生 若 沒 有 及 時 的 處 理, 細 胞 內 DNA 損 害 反 應 (DNA damage response) 機 制 就 會 活 化, 其 後 果 之 一 是 停 止 細 胞 的 生 長 與 分 裂, 或 者 是 啟 動 細 胞 凋 亡, 無 論 如 何 都 是 驅 使 細 胞 走 向 毀 滅 一 途 幸 好 從 真 核 生 物 階 段 細 胞 就 已 發 展 出 數 套 機 制 用 來 防 範 DNA 雙 股 斷 裂 的 產 生, 分 別 是 : (1) 同 源 性 重 組 (Homologous recombination,hr): 同 源 性 重 組 修 復 是 利 用 細 胞 內 的 染 色 體 兩 兩 對 應 的 特 性, 若 其 中 一 條 染 色 體 上 的 DNA 發 生 雙 股 斷 裂, 則 另 一 條 染 色 體 上 對 應 的 DNA 序 列 即 可 當 作 修 復 的 模 板 來 回 復 斷 裂 前 的 序 列, 因 此 在 某 些 條 件 下, 同 源 性 重 組 又 稱 作 基 因 轉 換 (gene conversion) (2) 非 同 源 性 末 端 接 合 (Non-homologous end joining, NHEJ):NHEJ 修 復 機 制 與 前 面 的 HR 最 大 的 差 異, 就 在 於 完 全 不 需 要 任 何 模 板 的 幫 助, 此 一 機 制 的 修 復 蛋 白 可 以 直 接 將 雙 股 裂 斷 的 末 端 彼 此 拉 近, 再 藉 由 DNA 黏 合 酶 (ligase) 的 幫 助 下, 將 斷 裂 的 兩 股 重 新 接 合 相 較 於 HR,NHEJ 的 機 制 既 簡 單 又 不 依 靠 模 板 的 方 式, 在 基 因 體 越 複 雜 包 含 越 多 非 編 碼 DNA 的 生 物 體,NHEJ 的 活 性 相 對 於 HR 是 非 常 活 躍 的, 可 是 在 基 因 體 越 簡 單, 尤 其 是 單 細 胞 型 態 的 生 物,NHEJ 很 有 可 能 破 壞 原 本 序 列 完 整 性, 反 而 不 受 青 睞 15

圖 2-5DNA 損 害 之 修 復 途 徑 (Genois M et al., 2014) 細 胞 中 最 常 見 的 修 復 機 制 為 鹼 基 切 除 修 復 (BER) 及 核 苷 酸 切 除 修 復 (NER), 因 此 以 下 就 此 兩 種 修 復 機 制 說 明 : 2.4.1 鹼 基 切 除 修 復 (Base excision repair, BER) BER 在 哺 乳 動 物 細 胞 內 的 主 要 作 用 是 修 復 較 小 程 度 的 DNA 損 害, 例 如 修 正 單 一 鹼 基 異 常 的 氧 化 還 原 及 甲 基 化, 修 補 少 量 的 鹼 基 缺 失 等 (Kuanget al., 2013) BER 是 內 源 性 的 DNA 損 害 中 重 要 的 修 復 過 程, 主 要 是 針 對 DNA 損 害 當 中 的 單 股 斷 裂 (single-strand break, SSB)(Strömet al., 2010), 其 主 要 受 損 形 式 有 ROS 產 生 之 AP sites 氧 化 核 酸 鹼 基 (oxidized DNA base) 或 游 離 輻 射 及 紫 外 光 所 引 起 的 核 酸 損 壞 BER 修 復 過 程 可 分 為 ( 一 ) 短 片 段 及 ( 二 ) 長 片 段 ( 圖 2-5) (Hoeijmakers, 2001; Nilsen & Krokan, 2001; Sancar, Lindsey-Boltz, Unsal-Kacmaz, & Linn, 2004): ( 一 ) 短 片 段 (1) 辨 認 (recognition) 與 移 除 ( removal): 去 氧 核 醣 核 酸 基 解 酶 (DNA glycosylases) 會 辨 認 出 DNA 上 受 損 之 鹼 基, 並 將 鹼 基 與 去 氧 核 醣 間 的 糖 苷 鍵 (N-glycosidic bond) 水 解, 使 得 鹼 基 被 移 除 而 形 成 AP sites 16

(2) 切 除 (incision):ap sites 形 成 後, 裂 解 酶 會 將 DNA 雙 股 結 構 打 開 並 將 AP sites 兩 側 之 3 端 之 磷 酸 雙 酯 鍵 水 解, 此 時 第 一 類 之 脫 嘌 呤 / 脫 嘧 啶 核 酸 內 切 酶 (APE1) 會 再 將 5 端 之 磷 酸 雙 酯 鍵 水 解 形 成 缺 口 (3) 填 補 : 當 此 缺 口 形 成 後,PARP1 會 鍵 結 至 此 缺 口, 將 其 他 DNA 修 補 酵 素 吸 引 至 缺 口 進 行 修 補, 隨 後 PARP1 會 被 水 解 蛋 白 PNKP (Polynucleotide kinase 3'-phosphatase, PNKP) 水 解 使 其 脫 離 DNA 序 列, 接 著 XRCC1 會 使 其 他 DNA 修 補 過 程 中 所 需 要 的 酵 素 鍵 結 至 其 結 構 上, 如 Polβ (DNA polymeraseβ, Polβ) DNA 黏 合 酶 III (ligase 3) 及 DNA 重 組 蛋 白 APTX (Aprataxin, APTX) 形 成 聚 合 物, 且 polyβ 會 開 始 被 催 化, 並 以 完 整 的 互 補 鏈 作 為 模 板, 按 照 5' 3 之 方 向 填 補 已 切 除 的 空 隙 (4) 黏 合 (ligation): 最 後 再 由 DNA 黏 合 酶 III 將 新 合 成 的 DNA 片 段 與 原 本 的 DNA 斷 鏈 連 接 起 來, 並 完 成 修 復 恢 復 原 來 的 DNA 結 構 ( 二 ) 長 片 段 前 面 步 驟 跟 短 片 段 相 同, 受 損 之 鹼 基 會 先 被 去 氧 核 醣 核 酸 基 解 酶 移 除, 而 形 成 AP sites, 而 APE1 會 將 5 端 之 磷 酸 雙 酯 鍵 水 解, 然 後 DNA 聚 合 酶 δ (DNA polymerase δ, Polδ), 會 與 細 胞 增 生 抗 原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 複 製 因 子 C (replication factor C, RFC) 以 及 皮 瓣 結 構 特 異 性 內 切 酶 (flap structure-specific endonuclease 1, FEN1) 等 蛋 白 質 形 成 聚 合 物, 而 此 聚 合 物 能 在 DNA 結 構 上 移 動 且 快 速 完 成 修 復, 最 後 再 由 DNA 黏 合 酶 I(ligase I) 將 切 口 黏 合 17

圖 2-6 鹼 基 切 除 修 補 機 制 (Helen E Bryant et al., 2009) 18

2.4.2 核 苷 酸 切 除 修 復 (Nucleotide Excision Repair, NER) 核 苷 酸 切 除 修 復 (NER) 是 存 在 於 真 核 細 胞 當 中 一 個 重 要 的 修 復 機 制, 主 要 是 修 復 較 嚴 重 的 DNA 損 害, 並 將 這 些 結 構 產 生 病 變 的 損 害 移 除, 例 如 嘧 啶 二 聚 體 經 UV 照 射 後 所 產 生 的 化 學 胼 合 物 暴 露 於 致 癌 物 質 及 其 他 化 療 藥 物 所 引 起 的 病 變 (May et al., 2010) 其 修 復 步 驟 為 辨 認 損 害 位 置 並 移 除 該 位 置 之 DNA 單 股 片 段, 將 另 一 股 為 受 損 害 的 DNA 片 段 作 為 模 板, 以 合 成 另 一 互 補 序 列 並 黏 合 完 成 修 復 NER 可 分 為 (1) 全 基 因 修 復 (global genomic NER, GG-NER) 及 (2) 轉 錄 互 補 修 復 (transcription coupled NER, TC-NER) 兩 者 的 不 同 之 處 在 於 確 認 受 損 位 置 的 方 式 不 同,GG-NER 會 先 由 細 胞 互 補 DNA 蛋 白 (Xeroderma pigmentosum C,XPC) 鍵 結 至 受 損 位 置, 而 TC-NER 會 先 使 RNA 聚 合 酶 卡 在 通 道 上, 不 讓 其 通 過 進 行 轉 錄, 再 由 內 切 酶 (Xeroderma pigmentosumg, XPG) 進 行 受 損 位 置 確 認 並 將 DNA 其 中 一 端 切 除 此 後 修 復 步 驟 兩 者 皆 相 同, 受 損 位 置 確 認 後 DNA 修 復 酶 A(Xeroderma pigmentosuma, XPA) 會 和 複 製 蛋 白 C 結 合 開 始 準 備 進 行 修 復, 而 切 除 修 復 蛋 白 XPD(Xeroderma pigmentosumd, XPD) 和 XPB(Xeroderma pigmentosumb, XPB) 及 轉 錄 因 子 TFIIH 會 使 受 損 位 置 之 雙 股 螺 旋 結 構 打 開 約 30 個 鹼 基 片 段, 接 著 XPG 和 ERCC1-ERCC4(ERCC1-XPF) 會 分 別 將 受 損 之 DNA 鏈 的 3 和 5 端 裂 解 開 並 將 受 損 片 段 切 除, 而 此 時 DNA 聚 合 酶 δ(polyδ) 會 先 佔 據 此 缺 口, 再 利 用 未 受 損 之 DNA 鏈 作 為 複 製 模 板 將 正 確 的 核 苷 酸 放 至 此 缺 口, 最 後 以 DNA 黏 合 酶 I (ligase I) 黏 合 切 口 完 成 修 復 (Sakodaet al., 2012)( 圖 2-6) 19

圖 2-7 核 苷 酸 切 除 修 復 (NER) 之 流 程 圖 (Fuss and Cooper, 2006) 2.5 基 因 多 型 性 (Genetic Polymorphism) DNA 中 的 核 苷 酸 依 其 鹼 基 不 同, 共 分 四 種 (Adenine Thymine Cytonine Guanine:A T C G), 而 基 因 為 三 個 核 苷 酸 排 列 成 一 組 基 因 組, 依 據 不 同 的 排 列 組 合, 經 轉 錄 成 RNA( 其 中 T 會 被 Uracil : U 取 代 ) 後 可 產 生 具 不 同 意 義 的 生 物 功 能, 其 他 不 同 組 合 則 可 轉 譯 出 不 同 胺 基 酸 或 作 為 修 飾 其 他 基 因 組 功 能, 而 胺 基 酸 序 列 可 組 成 蛋 白 質, 不 同 蛋 白 質 在 生 物 體 內 會 執 行 或 調 控 不 同 生 理 作 用, 如 代 謝 生 長 繁 殖 等 單 一 核 苷 酸 多 型 性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNPs) 所 代 表 的 意 思 是 DNA 序 列 中 的 單 一 鹼 基 對 (base pair) 變 異, 也 就 是 DNA 序 列 中 A T C G 的 改 變, 即 基 因 組 (genome) 的 一 個 特 異 和 定 位 的 位 點 出 現 兩 個 或 多 個 的 核 苷 酸 可 能 性, 會 造 成 這 樣 的 變 異 原 因 為 基 因 發 生 刪 除 插 入 或 是 取 代 反 應 20

於 所 有 可 能 的 DNA 序 列 差 異 性 (sequence differenciation) 中,SNP 是 最 普 遍 發 生 的 一 種 遺 傳 變 異 在 人 體 中,SNP 的 發 生 機 率 大 約 是 0.1%, 也 就 是 每 1200 至 1500 個 鹼 基 對 中, 就 可 能 有 一 個 SNP 目 前 科 學 界 已 發 現 了 約 400 萬 個 SNPs 平 均 而 言, 每 1kb 長 的 DNA 中, 就 有 一 個 SNP 存 在 ; 換 言 之 每 個 人 的 DNA 序 列 中, 每 隔 1kb 單 位 長 度, 就 至 少 會 發 生 一 個 單 一 鹼 基 變 異 由 於 SNP 的 發 生 頻 率 非 常 之 高, 故 SNP 常 被 當 作 一 種 基 因 標 記 (genetic marker) 用 來 進 行 研 究 但 必 須 注 意 的 是, 並 非 所 有 的 SNP 都 有 臨 床 意 義 對 疾 病 發 生 和 藥 物 治 療 有 重 大 影 響 的 SNP, 估 計 只 佔 數 以 百 萬 計 SNP 的 很 小 一 部 分 即 使 產 生 了 SNP, 也 不 一 定 造 成 蛋 白 質 氨 基 酸 編 碼 改 變 或 基 因 表 達 調 控 改 變, 或 導 致 蛋 白 質 結 構 或 活 性, 而 造 成 對 於 藥 物 的 特 殊 影 響 基 因 是 具 有 功 能 的 遺 傳 因 子, 其 排 列 組 合 至 關 重 要, 其 中 任 一 位 點 錯 誤 可 能 將 導 致 無 可 挽 回 的 嚴 重 後 果, 如 許 多 調 控 生 理 的 蛋 白 質 無 法 生 成 或 失 去 作 用 大 多 與 此 有 關, 甚 至 癌 症 的 生 成 即 是 因 為 基 因 組 錯 誤 的 累 積, 最 後 造 成 調 控 細 胞 生 殖 的 功 能 失 效, 造 成 癌 細 胞 無 限 增 生 2.5.1 XRCC1 之 功 能 及 其 基 因 多 型 性 XRCC1(X-ray repair cross-complementing protein 1 ) 是 哺 乳 動 物 細 胞 中 修 復 蛋 白 的 一 種, 其 功 能 是 負 責 修 復 DNA 之 單 股 斷 裂 XRCC1 會 影 響 受 到 暴 露 於 電 子 游 離 輻 射 及 烷 基 化 等 所 造 成 的 DNA 單 股 斷 裂 之 修 復 速 率, 且 會 在 生 殖 細 胞 進 行 有 絲 分 裂 及 DNA 重 組 時 發 揮 其 功 效 根 據 2008 年 中 研 院 研 究 報 告 中 指 出, 修 復 過 程 中 ATM-Chk2 會 辨 認 DNA 的 小 傷 害 ( 如 自 由 基 所 造 成 的 傷 害 ), 並 使 XRCC1 蛋 白 前 往 修 復 以 避 免 基 因 突 變 或 癌 症 的 產 生 若 細 胞 帶 有 受 損 的 XRCC1 蛋 白, 非 但 無 法 修 復 細 胞 損 傷, 還 會 使 細 胞 快 速 死 亡 此 外, 其 他 文 獻 亦 曾 提 到,DNA 之 修 復 系 統 若 發 生 缺 陷, 會 導 致 癌 症 之 產 生 而 XRCC1 被 認 為 能 夠 在 DNA 之 修 復 系 統 中 同 時 發 揮 阻 止 腫 瘤 產 生 及 遺 傳 上 的 缺 陷 之 效 用 (Liu et al., 2010) 而 許 多 證 據 也 顯 示,XRCC1 在 編 碼 區 產 生 之 異 常, 除 了 會 降 低 DNA 之 修 復 能 力, 21

也 會 使 得 人 類 癌 症 風 險 相 對 提 高 並 增 加 乳 癌 的 易 感 性 (Saadat, 2010) XRCC1 Arg399Gln 是 最 廣 泛 被 研 究 的 位 置, 當 細 胞 受 到 電 子 游 離 輻 射 烷 基 化 或 其 他 原 因 所 造 成 之 DNA 單 股 斷 裂 時, 此 時 若 XRCC1 Arg399Gln 該 位 置 發 生 異 常 就 會 延 遲 細 胞 週 期 (Saadat, 2010) 不 同 階 段 的 細 胞 週 期 對 其 感 受 度 不 同, 處 於 M 期 的 細 胞 較 為 敏 感, 會 引 起 細 胞 立 即 性 的 死 亡 或 者 染 色 體 產 生 畸 變, 雖 不 影 響 細 胞 分 裂 過 程, 卻 會 影 響 下 一 週 期 延 遲 而 使 得 下 一 次 分 裂 時 子 代 死 亡 ; 而 C1 期 的 早 期 對 輻 射 不 敏 感, 後 期 則 較 為 敏 感, 會 抑 制 RNA 蛋 白 質 和 酶 之 合 成, 使 細 胞 延 遲 進 入 S 期 ;S 前 期 亦 較 為 敏 感, 會 直 接 阻 止 DNA 合 成, 而 在 S 期 的 後 期 敏 感 性 降 低, 則 此 時 已 完 成 DNA 合 成, 即 使 DNA 受 損 亦 可 修 復 之 故 G2 期 是 極 敏 感 的 階 段, 分 裂 所 需 特 異 性 蛋 白 質 和 RNA 之 合 成 發 生 障 礙, 因 而 細 胞 在 G2 期 停 留 下 來, 稱 G2 阻 斷 (G2block), 這 也 是 細 胞 會 即 刻 發 生 細 胞 分 裂 延 遲 主 要 原 因 XRCC1 於 目 前 研 究 中 均 顯 示 該 酵 素 無 法 單 獨 發 揮 其 作 用, 因 此 XRCC1 於 修 復 過 程 中 扮 演 的 角 色 為 使 其 他 鹼 基 切 除 修 復 過 程 中 所 需 要 的 酵 素 如 Poly β LigaseⅢ 鍵 結 於 其 結 構 上, 藉 以 調 節 酵 素 之 活 性, 以 利 更 精 確 有 效 的 識 別 及 修 復 DNA 損 傷 2.5.2 PARP1 之 功 能 及 其 基 因 多 型 性 PARP(poly ADP-ribose polymerase) 是 一 種 DNA 修 復 酶, 它 在 DNA 損 傷 修 復 與 細 胞 凋 亡 中 發 揮 著 重 要 的 功 用 PARP 是 存 在 於 多 數 真 核 細 胞 中 的 一 個 多 功 能 蛋 白 質 轉 譯 後 修 飾 酶 它 能 識 別 結 構 損 傷 的 DNA 片 段 而 被 激 活, 被 認 爲 是 DNA 損 傷 的 感 受 器 它 還 能 對 許 多 核 蛋 白 進 行 聚 腺 苷 二 磷 酸 核 糖 基 化, 受 它 修 飾 的 蛋 白 質 包 括 組 蛋 白 RNA 聚 合 酶 DNA 聚 合 酶 DNA 連 接 酶 等 重 要 DNA 修 復 酵 素 通 過 組 蛋 白 的 ADP- 核 糖 基 化 使 組 蛋 白 脫 離 下 來, 將 有 助 細 胞 進 行 DNA 的 損 傷 修 復 如 果 DNA 未 能 及 時 修 復, 會 使 細 胞 週 期 中 斷, 導 致 細 胞 凋 亡 研 究 發 現, 許 多 癌 細 胞 都 有 PPAR 功 能 提 升 的 情 形, 癌 細 胞 常 利 用 PPAR 的 DNA 修 復 機 轉, 使 得 細 胞 得 以 不 斷 的 22

生 長 與 增 殖 (Taiwan Clinical Oncology Research Foundation, 2011) PARP-1 聚 合 酶 參 與 BER 過 程 與 擁 有 訊 息 傳 遞 (signal transduction) 和 去 除 因 為 氧 化 壓 力 (ROS) 而 產 生 之 7,8-dihydro-8-oxoguani -ne (8-oxoG) 的 DNA 傷 害 8-oxG 傷 害 修 復 過 程 中, 體 內 的 醣 基 解 酶 HOGG1 會 先 切 除 損 害 部 分, 再 由 DNA 內 切 酶 APE1 使 之 產 生 一 段 缺 口, 在 由 DNA 聚 合 酶 Polβ 使 切 口 黏 補, 而 PAPR-1 能 加 速 的 招 來 許 多 DNA 聚 合 酶, 例 如 XRCC1 與 Polβ 等, 最 後 完 成 修 補 過 程 (Le Page, Schreiber, Dherin, De Murcia, & Boiteux, 2003) PARP1 在 鹼 基 切 除 修 復 過 程 中 之 基 至 主 要 可 以 分 為 兩 個 途 徑 : 第 一 個 途 徑 為, 若 DNA 的 損 傷 並 不 嚴 重, 則 會 透 過 一 般 的 修 復 過 程 進 行 鹼 基 修 復, 即 PARP1 確 認 鹼 基 受 損 位 置 後, 鍵 結 至 該 處 並 開 始 大 量 消 耗 細 胞 當 中 的 能 量 (NAD + (nicotineamide-adenine-dinucleotide, NAD + ) 及 ATP (Adenosine TriPhosphate, ATP)) 使 其 成 為 一 較 大 的 聚 合 物, 將 其 他 修 補 酵 素 吸 引 至 此 後 隨 即 水 解, 讓 其 他 修 補 酵 素 進 行 修 復 ; 若 DNA 之 損 傷 過 於 嚴 重, 則 PARP1 仍 會 佔 據 該 損 傷 缺 口, 但 會 開 始 發 揮 抑 制 作 用 阻 止 其 他 修 補 酵 素 鍵 結 於 該 處 進 行 修 復, 進 而 啟 動 細 胞 凋 亡 路 徑, 導 致 細 胞 凋 亡 而 避 免 受 損 之 DNA 繼 續 被 複 製 (Jane de Lartigue, 2013) 圖 2-8PARP1 之 作 用 機 制 (Jane de Lartigue, 2013) 23

2.5.3 APE1 之 功 能 及 其 基 因 多 型 性 第 一 類 脫 嘌 呤 / 嘧 啶 核 酸 內 切 酶 (apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease 1,APE1) 是 一 種 多 功 能 的 酵 素, 其 作 用 包 括 DNA 鹼 基 之 修 復 與 轉 錄 因 子 的 氧 化 還 原 之 調 控 而 APE1 是 參 與 DNA 鹼 基 切 除 修 補 (Base excision repair,ber) 過 程 中 的 一 種 酵 素, 當 DNA 醣 基 解 酶 將 受 損 之 鹼 基 移 除 後,APE1 再 經 由 親 和 醯 基 取 代 反 應 (nucleophilic acyl substitution) 將 核 苷 酸 上 的 5 端 之 磷 酸 骨 幹 水 解 切 除, 使 之 產 生 缺 口, 再 配 合 其 他 酵 素 完 成 修 復 (Tarek M. A. Abdel-Fatah et al., 2014) APE1 Asp148Glu 為 最 多 學 者 研 究 的 位 置, 此 變 異 由 於 第 2197 的 位 置 的 鹼 基 由 胸 腺 嘧 啶 (T) 變 異 為 鳥 嘌 呤 (G), 導 致 DNA 轉 譯 的 胺 基 酸 從 天 冬 胺 酸 (aspartic) 變 異 為 谷 胺 酸 (glutamic) 有 文 獻 指 出 APE1 Asp148Glu 會 使 細 胞 G2 期 延 長, 且 會 導 致 健 康 人 類 在 特 定 輻 射 照 射 下 的 DNA 修 補 速 率 及 DNA 遭 受 氧 化 損 傷 的 修 復 速 率 有 明 顯 下 降 (Hu, Smith, Miller, Lohman, & Case, 2002; Vodicka et al., 2007) Cell cycle (G2) 的 延 遲 為 一 種 低 外 顯 性 的 乳 癌 風 險 因 子, 而 G2 期 的 延 遲 又 與 輻 射 敏 感 性 相 關, 故 一 般 認 為 APE1 變 異 使 得 DNA 修 補 速 率 降 低, 會 導 致 乳 癌 風 險 的 上 升 但 是 許 多 文 獻 指 出, 並 不 是 所 有 人 種 此 位 置 變 異 皆 會 使 乳 癌 風 險 上 升, 因 為 變 異 後 會 阻 礙 有 絲 分 裂 進 而 導 致 G2 期 延 遲 與 修 補 速 率 的 降 低, 但 這 兩 種 機 制 反 而 不 會 造 成 DNA 傷 害 的 累 積, 而 是 較 易 使 細 胞 凋 亡 機 制 的 啟 動 (Sangrajrang et al., 2008), 因 此 造 成 風 險 上 升 或 降 低 的 原 因 可 能 會 由 於 人 種 而 有 所 不 同 24

第 三 章 實 驗 設 計 架 構 與 假 設 3.1 實 驗 設 計 架 構 本 實 驗 主 要 目 的 為 探 討 XRCC1 及 PARP1 與 先 前 本 實 驗 室 已 完 成 之 台 灣 地 區 女 性 乳 癌 患 者 與 女 性 健 康 對 照 組 體 內 之 白 血 球 細 胞 核 中 去 鹼 基 核 酸 背 景 值 之 相 關 性 研 究, 再 根 據 乳 癌 病 者 與 健 康 對 照 組 之 BMI 年 齡 等 乳 癌 風 險 因 子 做 為 區 分, 探 討 彼 此 之 間 的 關 連 性 以 MCF-7 細 胞 分 別 直 接 暴 露 於 TCDD NNK 及 E 2, 探 討 三 者 之 間 對 於 人 類 腫 瘤 細 胞 MCF-7 所 造 成 對 核 酸 損 害 之 影 響 3.2 實 驗 假 設 目 標 一 : 鹼 基 切 除 修 復 基 因 之 基 因 多 型 性 與 AP sites 之 相 關 性 AP sites XRCC1 R399Q PARP1 V762A 25

目 標 二 : 人 類 乳 腺 細 胞 暴 露 於 雌 性 激 素 (E 2 ) 與 環 境 致 癌 物 質 (TCDD 及 NNK) 所 誘 導 之 DNA 單 股 斷 裂 Control DMSO TCDD MCF-7 cells Vehicle Control NNK TCDD+NNK DNA single strand break TCDD E 2 NNK TCDD+NNK 26

第 四 章 實 驗 材 料 與 方 法 4.1 實 驗 設 備 與 材 料 設 備 Minifold II Manifold Slot-Blot (Catalog No.10447800) 即 時 定 量 聚 合 酵 素 鏈 鎖 反 應 器 (Roche LightCycler1.5) 分 光 光 度 計 (Cary 100) 滾 輪 式 混 合 器 (Stovall Rol-115) 迴 旋 振 盪 器 (KS) 核 酸 電 泳 膠 體 照 像 系 統 (Gel Doc 2000)(Bio-Rad) 恆 溫 乾 浴 器 聚 合 酵 素 鏈 鎖 反 應 器 (GeneAmp PCR system 9700) 真 空 烘 箱 超 音 波 震 盪 器 (Branson 3510) 酸 鹼 值 測 定 儀 (Suntex SP-701) 微 量 高 速 離 心 機 (Hitachi Mikro 20) 血 球 計 數 盤 電 泳 槽 螢 光 顯 微 鏡 (Olympus BX51) 27

材 料 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yloxy (TEMPO)(Aldrich, Catalog No.21400) 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin ( TCDD) ( Sigma, 48599-1ml) 4-(methylnitro-samino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone ( NNK) ( Sigma, 49578-2MG) 0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 17β-estradiol ( E 2 ) (Sigma, E8875-1G) Albumin from bovine serium (BSA)(Sigma, Catalog No.A7906) Aldehyde reactive probe (ARP)(Dojindo, Lot No.VL609) Ammonium acetate (NH 4 OAc)(USB, Lot No.117686) Antibiotic (Gibco, 15240-062 ) Calf thymus DNA (Sigma, Catalog No.D1501) Casein (Sigma, Catalog No.C7078) Cell lysis buffer (QIAGEN sciences, Lot No.8273787) DMEM( w/ phenol red)(sigma, D5523) Enhancde-chemiluminescence reagent (ECL reagent)(amersham, Lot No. 152) Ethanol absolut (Riedel-de Haën, Lot No.22550) Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma, Catalog No.E5134) FBS(Gibco, 10437-028) Ficoll (Pharmacia, 17-1440-03) 28

Gel blot paper (Whatman, Catalog No. 10426892) HEPES (Sigma, H4034 ) HybProbe mix (Roche) Insulin (Gibco, 13007-018 ) Isopropanol (Sigma, Catalog No.I9516) LightCycler Capillaries (Roche) LightCycler Fast-Start DNA Master HybProbe (Roche, Catalog No.03003248001) NaHCO3(Sigma, S-8875) Nitrocellulose membrane (NC membrane)(whatman, Catalog No.10401196) Polyoxyethylenesorbitan monolyaurate (Tween 20) (Amresco, Catalog No.0777) Primer mix (Roche) Protein precipitation solution (QIAGEN sciences, Lot No.8272183) Putrescine (Sigma, Catalog No.P7630) RNase A (Sigma, Catalog No.R4642) Sodium chloride (NaCl)(Aldrich, Lot No.31434) Streptavidin peroxidase label (HRP)(BioGenex Lot No.HK3200210) Tris (Amresco, Lot No.2098B302KG23, Catalog No.0826) Tris-Base (USB, Catalog No.0826) Tris-HCl (USB, Lot No.119964) Trisodium citrate(sigma, Catalog No.S4641) 29

X-ray film (Kodak, Catalog No.1788207) YoYo-1 iodide ( Invitrogen0 定 影 液 (Kodak, Catalog No.4980561) 離 心 管 (50 ml Falcon 15 ml Corning) 顯 影 液 (Kodak, Catalog No.4980553) 30

4.2 研 究 族 群 本 實 驗 室 收 集 之 DNA 樣 本 分 為 兩 族 群 : 台 灣 女 性 乳 癌 患 者 與 台 灣 女 性 健 康 對 照 組, 其 中 乳 癌 患 者 的 部 分 由 彰 化 基 督 教 醫 院 在 2009 年 5 月 至 2010 年 6 月 之 間 所 提 供, 共 計 194 位 ; 而 健 康 對 照 組 部 分 由 大 千 綜 合 醫 院 在 2011 年 12 月 至 2012 年 6 月 之 間 所 提 供, 共 計 200 位 每 位 受 試 者 皆 已 簽 署 受 試 者 同 意 書, 並 經 由 中 山 醫 學 大 學 人 體 試 驗 委 員 會 審 核 通 過 而 本 研 究 篩 選 出 去 除 吸 菸 喝 酒 與 化 療 等 因 素 的 樣 本 族 群 進 行 實 驗, 各 篩 選 出 的 BMI 及 年 齡 之 背 景 資 料 如 ( 表 4-1) ( 表 4-2) (Lin et al., 2013; Lin et al., 2014) 表 4-1 乳 癌 患 者 之 年 齡 與 BMI 資 料 Breast cancer patients (n=148) Age (years) BMI (kg/m 2 ) Mean 50.8 24.7 Median 49.2 24.0 Range 16-79 15.6 40.9 表 4-2 健 康 對 照 組 之 年 齡 與 BMI 資 料 Healthy controls (n=142) Age (years) BMI (kg/m 2 ) Mean 42.0 22.8 Median 41.0 22.5 Range 23-69 16.1 32.9 31

4.3 實 驗 方 法 4.3.1 全 血 分 離 將 全 血 血 液 以 4 738 g (2000rpm) 離 心 15 分 鐘 分 離 血 漿 (plasma) 與 血 球, 離 心 後 會 分 上 層 與 下 層, 上 層 為 血 漿, 下 層 為 血 球, 將 上 層 淡 黃 色 血 漿 取 出 分 裝 至 600μl tube 在 下 層 之 血 球 中 加 入 相 同 體 積 之 saline (0.9% NaCl), 混 合 均 勻, 並 將 其 沿 管 壁 緩 緩 地 倒 入 裝 有 ficoll 之 離 心 管, 以 4 738 g (2000rpm) 離 心 20 分 鐘 分 離 紅 血 球 與 白 血 球 ( 主 要 為 嗜 中 性 白 血 球 ), 離 心 後 會 分 四 層, 由 上 而 下 分 別 為 saline buffy coat ficoll 及 紅 血 球, 白 血 球 即 存 在 於 buffy coat 中 將 saline 及 buffy coat 取 出, 並 放 入 有 10 ml 1X PBS 的 離 心 管, 吸 取 時 避 免 吸 到 ficoll 吸 出 的 saline 及 buffy coat 以 4 738 g (2000rpm) 離 心 5 分 鐘, 離 心 後 將 上 層 液 倒 掉, 再 加 入 300μl 1X PBS 回 溶, 並 保 存 於 -80 冰 箱 ( 圖 4-1) 而 此 全 血 分 離 步 驟 由 彰 化 基 督 教 醫 院 提 供 32

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圖 4-1 全 血 分 離 流 程 4.3.2 核 酸 萃 取 此 方 法 參 照 Nakamura 等 人 所 提 列 之 方 法 (Nakamura et al., 1998), 利 用 PureGene DNA extraction kit (Gentra Systems, Inc.) 及 抗 氧 化 劑 (TEMPO) 進 行 白 血 球 細 胞 核 內 DNA 之 萃 取, 以 降 低 萃 取 過 程 中 核 酸 氧 化 損 壞 作 用 之 背 景 值 上 升 其 中 TEMPO 將 作 為 抗 氧 化 劑, 並 將 樣 本 於 步 驟 進 行 時 避 免 光 線 照 射 及 保 持 低 溫 (4 ) 狀 態, 且 維 持 TEMPO 濃 度 約 在 20 mm, 以 達 到 降 低 背 景 值 之 效 果 首 先 在 白 血 球 細 胞 分 別 加 入 核 糖 核 酸 酶 (RNase A) 及 lysis buffer ( 內 含 20 mm TEMPO) 以 打 破 細 胞 膜 並 將 RNA 水 解 避 免 干 34

擾 DNA 萃 取, 再 以 protein precipitation solution 將 蛋 白 質 沉 澱 以 12718 g 4 之 條 件 離 心 15 分 鐘, 上 層 液 即 為 含 DNA 之 溶 液 將 此 溶 液 與 異 丙 醇 (isopropanol) 混 合 均 勻, 使 DNA 內 水 分 脫 除 並 沈 澱, 將 沈 澱 之 DNA 經 70% 酒 精 均 勻 洗 過 後 使 其 乾 操, 最 後 在 將 DNA 溶 於 含 1 mm TEMPO 之 無 菌 水 中, 於 4 避 光, 待 DNA 溶 解 後, 以 分 光 光 度 計 (Cary 100) 測 其 O.D. 値 (260 nm), 定 量 DNA 濃 度 後 進 行 ASB assay 4.3.3 核 酸 醛 基 損 害 分 析 方 法 (Aldehyde Reactive Probe-Slot-Blot assay, ASB assay) 此 方 法 參 照 Nakamura 等 人 所 提 列 之 方 法 (Nakamura et al., 1998), 自 樣 本 萃 取 之 DNA 中 取 8 μg 於 37 與 醛 基 反 應 探 針 (aldehyde reactive probe, ARP) 反 應 30 分 鐘 再 利 用 醇 類 將 DNA 沈 澱 後, 重 新 溶 於 TE buffer (10 mm Tris,1 mm EDTA,pH 7.2) DNA 經 100 加 熱 10 分 鐘 將 DNA 變 性, 再 與 等 體 積 2 M 醋 酸 銨 (Ammonium acetate, NH 4 OAc) 溶 液 混 和 均 勻 將 與 醋 酸 銨 混 合 均 勻 之 DNA 利 用 Minifold II Manifold Slot-Blot 真 空 過 濾 裝 置 ( vacuum filter device) 固 定 於 硝 化 纖 維 膜 (nitrocellulose membrane, NC membrane) 上, 待 溶 液 抽 乾 後, 將 硝 化 纖 維 膜 以 5X SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M trisodium citrate) 溶 液 於 37 混 合 15 分 鐘, 其 後 於 80 之 真 空 烘 箱 乾 燥 1-2 小 時 隨 後 硝 化 纖 維 膜 以 含 BSA 20mM Tris-HCl (ph 7.5), 0.1 M NaCl,1 mm EDTA,0.5% casein,0.25% BSA,0.1% Tween 20) 及 10 mm Tris-NaCl 溶 液 於 室 溫 預 先 培 養 30 分 鐘, 之 後 添 加 streptavidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) 於 BSA 溶 液 中 於 室 溫 下 培 養 45 分 鐘 再 經 沖 洗 緩 衝 液 (0.26 M NaCl,1 mm EDTA,20 mm 35

Tris-HCl,0.1%Tween 20,pH 7.5) 潤 溼 硝 化 纖 維 膜 15 分 鐘, 硝 化 纖 維 膜 上 之 酵 素 活 性 將 以 ECL (Enhancde-chemiluminescence) 試 劑 呈 現 硝 化 纖 維 膜 以 X 光 底 片 曝 光, 再 以 Gel Doc 2000 數 據 影 像 處 理 分 析 系 統 及 Quantity One 軟 體 系 統 分 析 X 光 底 片 最 後 再 與 AP sites 之 內 標 準 品 (internal standard) 比 較 以 估 計 待 測 物 中 所 含 有 的 AP sites 數 目 O HN S NH (CH 2 ) 4 O H H O C N N C H C H O NH 2 圖 4-2 ARP 結 構 式 4.3.4 Putrescine-cleavage assay 參 考 Nakamura 等 人 (Lin et al., 2003) 所 提 列 之 方 法, 自 樣 本 萃 取 的 DNA 中 取 8 μg, 在 1X PBS 存 在 之 環 境 下 與 100 mm putrescine 於 37 反 應 30 分 鐘, 反 應 完 成 後 利 用 醇 類 將 DNA 沉 澱 後, 隨 後 進 行 ASB assay 4.3.5 細 胞 培 養 ERα(+)/MCF-7 細 胞 株 以 Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) 培 養 於 5%CO2 37 之 恆 溫 培 養 箱 中, 其 中 DMEM 中 含 有 5%FBS 0.1% insulin 1% antibiotic 細 胞 生 長 至 約 八 分 滿 時 進 行 細 胞 繼 代, 先 將 舊 的 細 胞 培 養 液 移 除, 加 入 HBSS/EDTA 溶 液 潤 洗 後 移 除, 再 加 入 1% 之 Trypsin/EDTA, 待 細 胞 脫 離 後 將 細 胞 收 集 置 於 含 有 細 胞 培 養 液 之 離 心 管, 並 以 4 1000rpm 之 條 36

件 離 心 五 分 鐘, 後 將 上 層 液 移 除 並 加 入 適 當 的 細 胞 培 養 液, 混 合 均 勻 後 以 血 球 計 數 器 (hemocytometer) 計 算 細 胞 數, 接 著 依 照 實 驗 之 需 求 將 細 胞 以 特 定 數 量 分 至 不 同 的 實 驗 培 養 器 皿 中 (Lin et al., 2007; Lin et al., 2008) 4.3.6 單 細 胞 凝 膠 電 泳 分 析 (Comet assay) 本 方 法 以 Singh 等 人 (Singh et al., 1988) 所 描 述 之 方 法 作 為 依 據, 透 過 真 核 細 胞 嵌 於 agarose 中, 並 固 定 於 載 玻 片 上, 經 lysis 後 僅 留 細 胞 骨 架 與 核 酸, 並 浸 泡 於 鹼 性 溶 液 中 使 DNA 雙 股 螺 旋 打 開, 透 過 微 電 泳 進 行 分 析 細 胞 中 的 損 害 DNA 片 段, 因 為 分 子 量 較 小 在 電 場 中 移 動 速 度 較 快, 使 細 胞 核 呈 現 出 彗 星 式 的 圖 案, 而 正 常 無 DNA 斷 裂 的 核 則 保 持 圓 球 形 經 由 螢 光 染 色 後, 視 其 彗 星 狀 的 尾 巴 長 度 及 螢 光 長 度, 來 評 估 單 一 細 胞 DNA 受 損 程 度 將 1x10 5 個 細 胞 /dish 種 於 細 胞 培 養 皿 中 培 養 12 小 時 候 加 藥 反 應 製 備 好 的 1% normal 1% low melting agar 及 1.2% low melting agar, 分 別 取 適 量 至 eppendorf 中,1% normal melting agar 保 存 於 55 乾 浴 槽 中,1% 及 1.2% low melting agar 保 存 於 35 乾 浴 槽 中 接 著 去 除 培 養 皿 中 的 培 養 液, 並 以 HBSS/EDTA 清 洗 一 次, 再 加 入 200μl Trypsin/EDTA 使 細 胞 脫 離, 以 5000rpm 5 分 鐘 4 之 條 件 進 行 離 心, 離 心 後 將 上 澄 液 去 除, 加 入 PBS 並 混 合 均 勻 為 細 胞 懸 浮 液 將 磨 砂 載 玻 片 放 在 乾 浴 器 上,loading 80μl 之 1% normal agar, 蓋 上 蓋 玻 片 使 其 平 鋪 於 載 玻 片, 再 放 置 冰 上 使 其 凝 固 凝 固 後 取 下 玻 片, 再 以 100μl 之 1.2% low melting agar 與 100μl 之 細 胞 懸 浮 液 混 合 均 勻, 接 著 取 80μl 之 混 合 液 loading 於 第 一 層 膠 上, 蓋 上 蓋 玻 片 使 其 平 鋪, 放 置 冰 上 約 凝 固 5 分 鐘 待 第 二 層 膠 凝 固 後 將 蓋 玻 片 取 下, 再 取 80μl 之 1% low melting 37

agar 使 其 loading, 並 蓋 上 蓋 玻 片 使 其 平 鋪 後 置 於 冰 上 凝 固 凝 固 後 取 下 玻 片, 將 載 玻 片 置 於 lysis buffer 中 浸 泡 24 小 時, 並 置 於 4 冰 箱 中 且 須 避 光 24 小 時 後 將 載 玻 片 取 出, 在 室 溫 下 以 d.d.h2o 清 洗 五 次, 每 次 三 分 鐘 清 洗 後 將 玻 片 於 室 溫 泡 在 basic buffer 中 20 分 鐘, 後 再 進 行 電 泳 (25V 300mA 20 分 鐘 ) 完 成 電 泳 後, 將 玻 片 以 d.d.h2o 清 洗 三 次, 每 次 五 分 鐘 加 入 50μl 之 YoYo-1 染 色 並 蓋 上 蓋 玻 片 後 避 光 利 用 10X 螢 光 用 物 鏡 (10X 目 鏡 ) 觀 察 並 進 行 拍 攝, 最 後 再 使 用 1.5 版 之 CometScore 程 式 定 量 Tail Moment 每 片 玻 片 計 算 100 顆 細 胞, 每 組 實 驗 進 行 三 重 複 (Lin et al., 2007; Lin et al., 2008) 4.4 單 一 核 苷 酸 多 型 性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNPs) 4.4.1 XRCC1 R399Q 與 PARP1 V762A XRCC1 R399Q 與 PARP1 V762A 參 照 Popanda 等 人 (Popanda et al., 2004) 所 提 出 的 方 法 進 行 分 析 利 用 Roche LightCycler 1.5 進 行 即 時 聚 合 酵 素 鏈 鎖 反 應 (Real-time PCR), 並 添 加 hybridization probe 與 Light-Cycler DNA master hybr-idization probes kit Hybridization probe 是 由 兩 個 短 且 相 鄰 oligonucleotides 序 列 片 段 其 中 一 個 探 針 在 5' 端 標 有 Light-Cycler-red 螢 光, 在 3' 端 磷 酸 化 ; 另 一 探 針 標 有 螢 光 素 當 此 兩 探 針 接 近 時, 兩 探 針 之 間 會 產 生 螢 光 共 振 能 量 轉 移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET), 部 分 產 生 之 能 量 轉 移 至 Light-Cycler-red 而 放 出 螢 光, 而 由 即 時 定 量 聚 合 酵 素 鏈 鎖 反 應 器 偵 測 放 出 之 螢 光 並 定 量 Real-Time PCR 之 引 子 與 探 針 皆 由 TIB MOLBIOL 合 成 38

表 4-3 primers and hybridization probes sequence Gene Primers sequence Hybridization probes XRCC1 5'-CCCCAAGTACAGCCAGGTC -3' 5'-CCCTCCCAGAGGTAAGGCC-FL-3' 5'-TGTCCCGCTCCTCTCAGTAG -3' 5'-LC-CACACGCCAACCCTGCTCCTTAT-PH-3' PARP1 5'-AATGTCAGTTTTGAGCTTCTCATAGTT-3' 3'-CCAAGGCGGAAATGCTTGAC--FL -5'' 5'-AGGAGGGTTTGCCATTCACT -3' 3'-LC640-ACCTGCTGCTGGACATCGAGGTGGC-PH-5' (TIB MOLBIOL design, 2013) 註 : 標 記 之 位 置 為 變 異 偵 測 位 置 39

表 4-4 Real-Time PCR XRCC1 R399Q 之 反 應 條 件 Cycles Segment Temperatures Times Acquisition model Hot-start 1 1 95 10 min None denaturation 95 10 sec None Amplification 45 annealing 56 10 sec Single extension 72 15 sec None denaturation 95 20 sec None Melting Curve 1 annealing 40 20 sec None melting 85, slope=0.1 /sec 0 sec continue (TIB MOLBIOL design, 2013) 40

表 4-5 Real-Time PCR PARP1 V762A 之 反 應 條 件 Cycles Segment Temperatures Times Acquisition model Hot-start 1 1 95 10 min None denaturation 95 10 sec None Amplification 45 annealing 57 10 sec Single extension 72 15 sec None denaturation 95 20 sec None Melting Curve 1 annealing 40 20 sec None melting 85, slope=0.1 /sec 0 sec continue (TIB MOLBIOL design, 2013) 41

4.5 統 計 分 析 實 驗 之 結 果,ASB assay 均 是 二 重 複,SNP 以 即 時 定 量 聚 合 酵 素 鏈 鎖 反 應 器 分 析, 由 定 序 確 認 即 時 定 量 聚 合 酵 素 鏈 鎖 反 應 器 之 分 析 結 果 統 計 分 析 是 以 Statistical Package for Social Science (SPSS Advanced Statistics version 18.0) 統 計 軟 體 與 Kyplot 軟 體 versions 2.0 beta 並 經 由 數 據 常 態 分 佈 檢 定 (Kolmogorov-Smirnov,K-S) One-Way ANOVA 相 關 性 t-test 及 Dunnett s multiple comparison test 勝 算 比 (odds ratio) 等 分 析,(*) ( **) (***) 分 別 表 示 相 較 於 控 制 組 具 有 差 異 顯 著 (p < 0.05) (p < 0.01) (p < 0.001) 42

第 五 章 實 驗 結 果 5.1 方 法 偵 測 極 限 (method detection limit, MDL) 與 變 異 係 數 (coefficient of variation, C.V.) 經 加 熱 / 酸 處 理 過 後 之 小 牛 胸 腺 DNA(calf-thymus DNA, ctdna) 大 約 有 300 AP site/106 核 苷 酸, 經 稀 釋 4 倍 後 當 作 Primary DNA 使 用, 並 將 Primary DNA 經 等 體 積 但 未 與 ARP 反 應 之 小 牛 胸 腺 DNA 序 列 稀 釋, 以 X 光 底 片 之 壓 片 結 果 如 圖 5-1 所 示 內 標 準 品 之 AP site 數 量 利 用 Dr. Kubo 發 展 之 microtiter plate method 定 量 由 ASB assay 分 析 之 最 低 偵 測 極 限 經 由 核 酸 電 泳 膠 體 照 相 系 統 之 白 光 半 定 量 得 知 為 0.3 AP site/10 6 核 苷 酸, 方 法 偵 測 之 變 異 係 數 (coefficient of variation, C.V.) 值 以 小 牛 胸 腺 DNA 為 測 試 樣 本, 其 結 果 為 5.1% (n=5) 0.3 AP site/10 6 核 苷 酸 圖 5-1 ASB assay 法 之 最 低 偵 測 極 限 43