# 薜 荔 榕 小 蜂 的 分 子 遗 传 关 系 研 究 ** 孙 伶 俐, 毛 健 萍, 刘 燕, 陈 友 铃 ( 福 建 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院, 福 州 350117) 5 摘 要 : 本 实 验 用 核 糖 体 28SrDNAD1-D3 区 基 因 部 分 序 列, 对 采 自 福 建 不 同 样 地 的 薜 荔 传 粉 10 15 小 蜂 和 三 个 不 同 品 系 的 栽 培 爱 玉 子 的 传 粉 小 蜂 进 行 分 析, 结 果 表 明 :(1) 薜 荔 传 粉 小 蜂 和 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 的 核 糖 体 28S 序 列 的 碱 基 组 成 中 A,T,G,C 四 种 含 量 较 平 均,C+G 的 平 均 含 量 (56%) 稍 高 于 A+T 的 含 量 (44%) 28S 序 列 的 薜 荔 传 粉 榕 小 蜂 个 体 间 遗 传 距 离 为 0.00170.0048, 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 各 样 本 间 平 均 遗 传 距 离 为 0; 薜 荔 传 粉 小 蜂 与 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 群 体 间 遗 传 距 离 为 0.0043, 两 群 体 间 的 遗 传 距 离 大 于 群 体 内 各 样 本 之 间 的 遗 传 距 离, 以 28S 序 列 用 NJ(Neighbor-joining) 法 建 立 系 统 发 育 树 显 示, 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 三 个 样 本 和 薜 荔 传 粉 小 蜂 两 个 样 本 各 自 先 汇 聚 成 一 支, 再 汇 聚 到 一 起, 表 明 薜 荔 传 粉 小 蜂 与 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 群 体 之 间 已 经 产 生 了 一 定 的 变 异, 表 明 薜 荔 传 粉 小 蜂 与 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 可 能 为 两 个 不 同 的 种 关 键 词 : 薜 荔, 爱 玉 子, 榕 小 蜂, 28S 中 图 分 类 号 :Q949 20 25 30 35 Studies on the Molecular Genetic Relationship of Wiebesia pumilae SUN Lingli, MAO Jianping, LIU Yan, CHEN Youling (College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China) Abstract: In the present studies, we used three molecular markers including 28SrDNA D1-D3 genes to investigate the genetic relationship of these two pollinators. The pollinator samples were collected from Ficus pumila var. pumila at three different locations as well as three cultivars of Ficus pumila var. awkeotsang. The data are summarized as follows: (1) The distribution of the four bases including A, T, G, C in the 28SrDNA sequence from the pollinators of Ficus pumila var. pumila and Ficus pumila var. awkeotsang is relatively akin. The average content of C + G (56%) is slightly higher than the average content of A+T (44%). The average genetic distance of the 28S sequence of each sample within Ficus pumila var. pumila or Ficus pumila var. awkeotsang is 0.0017 or 0, while the average genetic distance between the two wasp populations is 0.0043. Since the genetic distance between the two wasp groups are significantly greater than the genetic distance within the respective group, these data suggest that the two groups of fig wasps have differentiated during the evolution and reached to the level of species identification, namely the pollinators of Ficus pumila var. pumila and Ficus pumila var. awkeotsang are the two different wasp species. Key words: Ficus pumila var. pumila, Ficus pumila var. awkeotsang, fig wasps, 28S 0 引 言 40 薜 荔 (Ficus pumila var. pumila) 隶 属 桑 科 榕 属, 为 攀 援 或 匍 匐 灌 木, 主 要 分 布 于 福 建 江 西 浙 江 安 徽 江 苏 台 湾 湖 南 广 东 广 西 贵 州 云 南 东 南 部 四 川 及 陕 西 等 地, 基 金 项 目 : 福 建 省 自 然 科 学 基 金 项 目 (2011N0014); 福 建 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院 生 物 学 拔 尖 生 培 养 计 划 项 目 作 者 简 介 : 孙 伶 俐 (1988-), 女, 研 究 生, 研 究 方 向 : 生 化 与 分 子 生 物 学 通 信 联 系 人 : 陈 友 铃 (1966-), 男, 教 授, 研 究 方 向 : 动 物 学. E-mail: chenyouling2000@126.com - 1 -
被 广 泛 用 于 园 林 的 绿 化 [1, 2], 爱 玉 子 (Ficus pumila var. awkeotsang) 为 薜 荔 的 变 种, 是 我 国 特 有 的 植 物, 原 产 自 台 湾, 在 福 建 浙 江 等 地 少 量 的 野 生 分 布, 目 前 在 台 湾 和 大 陆 长 江 以 南 有 广 泛 栽 培 [1, 3] 45 50 55 薜 荔 和 爱 玉 子 在 植 株 性 状 茎 叶 形 态 花 与 花 序 的 形 态 结 构 等 方 面 均 十 分 相 似, 二 者 究 竟 是 原 变 种 与 变 种 的 关 系, 拟 或 为 不 同 的 两 个 种, 长 期 以 来 争 论 不 休 李 和 惠 用 trnt-trnl 序 列 和 核 内 NIA-i3 和 ITS2 序 列 对 薜 荔 和 爱 玉 子 植 株 进 行 研 究 发 现, 核 内 NIA-i3 和 ITS2 序 列 两 者 之 间 不 存 在 差 异,trnT-trnL 序 列 上 存 在 微 小 差 异, 认 为 两 者 为 同 一 个 种 [4] 而 林 贊 標 的 研 究 表 明, 爱 玉 子 瘦 果 中 的 果 胶 甲 酯 酶 的 活 性 (95.8 活 性 单 位 ) 比 薜 荔 (4.8 活 性 单 位 ) 高 很 多, 且 爱 玉 子 果 胶 甲 酯 酶 有 两 个 亚 型, 在 薜 荔 果 胶 甲 酯 酶 只 有 一 个 亚 型 [5], 暗 示 薜 荔 和 爱 玉 子 可 能 是 亲 缘 关 系 很 近 的 两 个 不 同 的 种 长 期 以 来, 人 们 一 直 认 为 薜 荔 与 爱 玉 子 的 传 粉 小 蜂 为 同 一 种 传 粉 榕 小 蜂 (Wiebesia pumilae (Hill)) [6, 7] 由 于 薜 荔 传 粉 小 蜂 与 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 之 间 的 形 态 差 异 极 其 细 微, 仅 依 赖 传 统 的 形 态 标 记 分 类 方 法, 难 以 将 它 们 区 别 开 来 薜 荔 传 粉 小 蜂 和 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 究 竟 是 同 种? 还 是 两 个 不 同 的 种? 或 是 互 为 隐 种 关 系? 这 一 直 是 悬 而 未 决 的 问 题 分 子 标 记 技 术 的 快 速 发 展, 给 这 一 难 题 的 解 决 带 来 希 望 本 文 用 核 糖 体 28SrDNAD1-D3, 以 及 线 粒 体 COI 和 Cytb 三 种 分 子 标 记 对 分 类 地 位 模 糊 的 薜 荔 和 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 进 行 鉴 定, 明 确 薜 荔 传 粉 小 蜂 与 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 之 间 的 分 子 遗 传 关 系, 以 期 在 爱 玉 子 的 经 济 栽 培 中 起 到 指 导 性 作 用 1 材 料 和 方 法 60 1.1 样 本 的 采 集 及 保 存 从 2010 年 3 月 至 2012 年 12 月 间 于 福 建 省 福 州 市 莆 田 市 等 地 采 集 实 验 小 蜂, 样 本 及 采 集 地 点 ( 见 表 1) 将 采 集 来 的 榕 小 蜂 存 放 入 含 有 无 水 乙 醇 保 存 液 的 1.5 ml 的 离 心 管 中, 使 小 蜂 迅 速 死 亡, 置 于 -20 保 存 65 表 1 实 验 材 料 及 采 集 地 及 其 登 陆 号 Table 1 Origin of the tested wasps materials 宿 主 Ficus host 小 蜂 种 类 Wasp Species 采 集 地 点 Sampling locality 样 品 编 码 Code 28S 登 录 号 Accession Number 爱 玉 子 Wiebesia pumilae 莆 田 Putian WiePum21 KC593620 爱 玉 子 Wiebesia pumilae 莆 田 Putian WiePum74 KC593621 爱 玉 子 Wiebesia pumilae 莆 田 Putian WiePum156 KC593622 薜 荔 Wiebesia pumilae 福 州 长 安 山 Changan Mountain WiePumLQ KC593623 薜 荔 Wiebesia pumilae 福 州 坟 崹 山 Fenti Mountain WiePumFT KC593624 高 榕 Eupristina altissima 福 州 旗 山 Qishan EupAltQS KC593627 黄 葛 树 Sycoscapter sp 福 州 旗 山 Qishan SycSpQS KC593628 1.2 基 因 组 DNA 的 提 取,PCR 及 测 序 取 95% 的 酒 精 -20 下 储 存 的 榕 小 蜂 样 品, 用 酚 氯 仿 抽 提 法 进 行 基 因 组 DNA 提 取 用 提 取 的 基 因 组 DNA 进 行 目 的 片 段 PCR 扩 增 : 28S 序 列 上 游 引 物 28S-F:5 -ACCCGCTGAATTTAAGCATAT-3 70 28S 序 列 下 游 引 物 28S-R:5 -TAGTTCACCATCTTTCGGGTC-3 28S 序 列 扩 增 条 件 为 94 预 变 性 3 min,94 变 性 60 s,60 退 火 50 s,72 延 伸 70 s, 34 个 循 环 后 72 延 伸 7 min 结 束,4 保 温 - 2 -
对 PCR 扩 增 的 产 物 直 接 进 行 测 序, 所 有 PCR 产 物 均 送 至 生 工 生 物 公 司 进 行 测 序 将 测 序 所 得 序 列 上 传 GenBank 上 1.3 数 据 处 理 得 到 测 序 序 列 后, 在 NCBI 上 用 BLAST 进 行 相 似 性 检 索, 确 定 所 得 的 序 列 确 实 为 目 的 片 段 将 这 些 片 段 用 CLUSTAL X 1.83 进 行 序 列 比 对, BioEdit 3.3 校 正 比 对 结 果, 截 取 相 同 长 度 的 序 列 进 行 分 析, 运 用 MEGA 4.0 软 件 计 算 不 同 序 列 的 碱 基 组 成 及 碱 基 替 换, 用 邻 接 法 (Neighbor-Joining) 构 建 系 统 进 化 树 并 进 行 系 统 进 化 分 析, 计 算 K2P 遗 传 距 离 80 2 结 果 2.1 榕 小 蜂 核 糖 体 28S 序 列 分 析 85 2.1.1 榕 小 蜂 28S 序 列 组 成 分 析 对 榕 小 蜂 28S 序 列, 用 CLUSTAL X 1.83 软 件 进 行 序 列 比 对, 截 取 对 准 的 941 pb 序 列 进 行 分 析, 用 Mega4.0 软 件 中 的 Data explore 软 件 进 行 各 小 蜂 的 碱 基 组 成 分 析 在 28S 序 列 中, 不 变 位 点 702 个, 变 异 位 点 233 个, 简 约 信 息 位 点 91 个, 自 裔 位 点 140 个, 变 异 性 为 24.8% 各 样 品 的 碱 基 组 成 分 析 见 表 2, 由 表 2 可 知, 所 有 的 小 蜂 样 本 碱 基 组 成 都 比 较 平 均, C+G 的 含 量 在 55.7% -58.4%,C+G 的 含 量 略 大 于 A+T 的 含 量 表 2 榕 小 蜂 28S 序 列 的 碱 基 组 成 Table 2 The base frequency of 28S sequence 小 蜂 种 类 Wasp Species A% G% T% C% C+G% WiePum21 21.5 30.4 22.7 25.4 55.8 WiePum74 21.6 30.3 22.7 25.4 55.7 WiePum156 21.4 30.5 22.7 25.3 55.8 WiePumLQ 21.4 30.6 22.6 25.4 56.0 WiePumFT 21.5 30.5 22.5 25.5 56.0 EupAltQS 22.1 30.5 22.0 25.4 55.9 SycSpQS 19.7 31.7 21.9 26.7 58.4 Average 21.5 30.6 22.6 25.4 56.0 90 2.1.2 榕 小 蜂 核 糖 体 28S 序 列 的 遗 传 距 离 分 析 用 Mega4.0 软 件 中 的 K2P 法 计 算 遗 传 距 离 ( 见 表 3) 所 有 样 品 间 的 遗 传 距 离 在 0.0000 0.1503 之 间, 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 样 品 间 的 遗 传 距 离 为 0.0000; 薜 荔 传 粉 小 蜂 样 品 间 遗 传 距 离 为 0.0017; 两 群 体 间 的 平 均 遗 传 距 离 为 0.0043 95 100 表 3 基 于 Kimura 双 参 数 模 型 榕 小 蜂 28S 序 列 的 遗 传 距 离 - 3 -
Table 3 Genetic distances of 28S sequences banse on Kimura 2-parameter of fig wasps WiePum21 WiePum74 WiePum156 WiePumLQ WiePumF T EupAltQS WiePum21 WiePum74 0.0000 WiePum156 0.0000 0.0000 WiePumLQ 0.0034 0.0034 0.0034 WiePumFT 0.0051 0.0051 0.0051 0.0017 EupAltQS 0.0798 0.0798 0.0798 0.0768 0.0779 SycSpQS 0.1171 0.1171 0.1171 0.1160 0.1184 0.1503 SycSpQS 105 2.1.3 榕 小 蜂 核 糖 体 28S 序 列 系 统 发 育 树 的 构 建 在 NCBI 网 站 上 对 实 验 中 的 28S 序 列 进 行 同 源 性 检 索, 下 载 4 种 前 人 研 究 过 的 榕 小 蜂 28S 序 列 ( 见 表 4) 进 行 分 析 表 4 GenBank 上 下 载 的 榕 小 蜂 28S 序 列 Table 4 28S sequences of fig wasps download from GenBank 小 蜂 种 类 Wasp Species 代 码 Code 登 陆 号 Accession Number Eupristina verticillata EupVer AY616558.1 Eupristina koningsbergeri EupKon HM802744.1 Sycoscapter australis SycAus AJ298400.1 Sycoscapter roxburghi SycRox HE793252.1 110 115 用 Mega4.0 软 件 对 实 验 所 得 与 GenBank 中 下 载 的 榕 小 蜂 28S 序 列 用 NJ (Neighbor-joining) 法, 同 时 用 重 复 抽 样 1000 次 检 验 分 子 系 统 树 各 分 支 的 置 信 值, 建 立 系 统 发 育 树 见 图 1 图 中 显 示, 相 同 属 的 小 蜂 汇 聚 到 一 起, 显 示 出 较 近 的 亲 缘 关 系, 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 三 个 样 本 和 薜 荔 传 粉 小 蜂 两 个 样 本 各 自 先 汇 聚 成 一 支, 再 汇 聚 到 一 起, 表 明 薜 荔 传 粉 小 蜂 与 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 群 体 之 间 已 经 产 生 了 一 定 的 变 异 图 中 显 示 每 个 属 的 小 蜂 都 能 够 明 显 的 区 分 开 来, 这 说 明 28S 序 列 可 以 做 为 小 蜂 分 子 分 类 的 鉴 定 依 据 97 WiePum156 WiePum74 99 WiePum21 WiePumLQ 85 WiePumFT 92 EupVer EupKon EupAltQS SycAus 100 SycRox SycSpQS 0.01 图 1 邻 接 法 构 建 的 榕 小 蜂 28S 序 列 系 统 发 育 树 Fig.1 Phylogenetic tree reconstructed using NJ based on 28S sequence of fig wasps - 4 -
3 结 论 120 125 遗 传 标 记 序 列 分 析 结 果 表 明,28S 序 列 中 四 种 碱 基 的 含 量 较 为 平 均,G+C 碱 基 的 平 均 含 量 为 56%, 比 A+T 的 含 量 稍 高, 符 合 Campbell 小 蜂 总 科 28SD2 序 列 对 小 蜂 总 科 及 各 科 间 的 系 统 发 育 关 系 进 行 研 究 时 得 出 的 28SD2 序 列 G+C 碱 基 的 含 量 偏 高 的 结 论 [8] 基 于 28S 序 列 所 得 的 结 果 显 示, 福 建 地 区 的 薜 荔 传 粉 小 蜂 和 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 各 自 群 体 内 部 的 遗 传 距 离 都 很 小, 没 有 隐 存 种 的 分 化, 但 二 者 群 体 之 间 的 遗 传 距 离 达 到 了 种 间 分 异 的 水 平, 加 之 Chen 等 人 研 究 显 示 福 建 地 区 的 薜 荔 传 粉 小 蜂 与 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 之 间 已 存 在 生 殖 隔 离 [9], 因 此 薜 荔 传 粉 小 蜂 与 爱 玉 子 传 粉 小 蜂 可 以 被 认 为 是 两 个 不 同 的 种 [ 参 考 文 献 ] (References) 130 135 140 [1] 张 秀 实, 吴 征 镒, 曹 子 余. 中 国 植 物 志 ( 第 二 十 三 卷. 第 一 分 册 ). 北 京 : 科 学 出 版 社, 1998:205-206. [2] 吴 文 珊, 陈 友 铃. 爱 玉 子 (Ficus awkeotsang) 不 同 品 系 的 繁 殖 生 态 学 比 较. 生 态 学 报. 2008, 28 (10): 4692-4702. [3] 陈 友 铃, 吴 文 珊. 爱 玉 子 花 序 挥 发 物 成 分 以 及 对 其 传 粉 小 蜂 的 吸 引 作 用. 生 态 学 报. 2010, 30 (8): 2212-2219. [4] 李 和 惠. 薜 荔 和 爱 玉 子 及 其 传 粉 小 蜂 之 遗 传 分 化 [D]. 台 湾 大 学 昆 虫 学 研 究 所, 2009. [5] 林 赞 标, 刘 哲 政, 杨 居 源, 黄 瑞 祥, 李 永 生, 张 森 永. 爱 玉 与 薜 荔 隐 花 果 形 态 与 其 生 化 特 性 比 较. 林 业 试 验 所 研 究 报 告 季 刊, 1990, 5: 37-43. [6] 陈 勇, 李 宏 庆, 马 炜 梁. 薜 荔 和 爱 玉 及 其 传 粉 昆 虫 繁 殖 特 性. 植 物 生 态 学 报, 2002, 26 (1): 58-63. [7] 陈 勇, 李 宏 庆, 马 炜 梁. 栽 培 爱 玉 的 传 粉 生 态. 应 用 生 态 学 报, 2006, 17 (12): 2403-2407. [8] Campbell B, Steffen Campbell J, Werren J. Phylogeny of the Nasonia species complex (Hymenoptera: Pteromalidae) inferred from an internal transcribed spacer (ITS2) and 28S rdna sequences. Insect Molecular Biology. 1994, 2 (4): 225-237. - 5 -