國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 系 碩 士 學 位 論 文 臺 灣 乳 牛 乳 汁 樣 本 分 離 出 鏈 球 菌 之 調 查 及 其 抗 藥 性 之 研 究 Prevalence of Streptococcus spp. isolated from bovine milk and study of their characteristics of antimicrobial resistance in Taiwan 指 導 教 授 : 莊 士 德 博 士 Dr. Shih-Te Chuang 研 究 生 : 顏 郁 姍 Yu-Shan Yen 中 華 民 國 一 百 零 三 年 七 月
摘 要 乳 房 炎 一 直 以 來 為 乳 牛 重 要 的 疾 病 之 一, 此 外, 此 疾 病 也 造 成 全 世 界 的 乳 品 行 業 每 年 損 失 約 數 十 億 元 最 常 造 成 乳 房 炎 的 微 生 物 包 括 葡 萄 球 菌 屬, 鏈 球 菌 屬, 和 大 腸 菌 群 細 菌 所 導 致 的 乳 房 炎 疾 病 常 使 用 抗 生 素 藥 物 來 做 治 療, 但 是 細 菌 具 有 抗 藥 性 的 問 題 可 能 為 藥 物 治 療 失 敗 的 主 要 原 因 之 一 本 研 究 的 目 的 為 調 查 臺 灣 由 乳 牛 生 乳 中 分 離 出 之 鏈 球 菌 菌 種 的 盛 行 率 及 其 抗 藥 性 型 態 的 分 佈 在 本 實 驗 中, 共 有 157 株 鏈 球 菌 菌 株 被 分 離 鑑 定 出, 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 有 116 株, 異 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus dysgalactiae) 有 16 株, 牛 鏈 球 菌 (Streptococcus bovis) 有 16 株, 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae) 有 6 株, 馬 鏈 球 菌 (Streptococcus equines) 有 2 株 及 1 株 的 緩 症 鏈 球 菌 (Streptococcus mistis) 被 收 集 於 157 株 鏈 球 菌 抗 生 素 藥 物 檢 測 中, 觀 察 到 對 於 amikacin (98.7%) kanamycin (98.7%) streptomycin (98.7%) 及 neomycin (98.0%) 具 有 最 顯 著 的 抗 藥 性, 其 次 為 oxytetracycline (85.4%) tetracycline (85.4%) 及 lincomycin (75.8%) 在 所 有 的 鏈 球 菌 觀 察 到 出 現 最 低 抗 藥 性 的 藥 物 為 amoxicillin (0.7%) cefuroxime (0.7%) cefazolin (1.9%) ceftiofur (1.9%) bacitracin (3.2%) 及 cloxacillin (4.5%) 於 檢 測 的 所 有 菌 株 中 觀 察 會 對 3 種 以 上 至 11 種 抗 生 素 藥 物 產 生 抗 藥 性 共 有 155 株 (155/157, 98.7% ) 選 擇 合 適 的 藥 物 來 治 療 乳 房 炎 可 以 確 保 抗 生 素 藥 物 治 療 的 效 力 和 避 免 藥 物 殘 留 的 問 題, 並 且 是 必 須 持 續 的 監 控 鏈 球 菌 對 於 抗 生 素 藥 物 敏 感 表 現 度 i
Abstract Bovine mastitis is one of the most important diseases in dairy cattle. The most commonly isolated mastitis microrganisms include Staphylococcus spp., Streptococcus spp., and coliforms. Antimicrobial therapy is considered as the most common way to treat mastitis in dairy cow, but the problem of antimicrobial resistance bacteria could be one of the reasons for treatment failures. The aim of this study was to investigate the prevalence of Streptococcus spp. isolated from bovine milk and to study their characteristics of antimicrobial resistance in Taiwan. A total of 157 Streptococcus species isolates including S. uberis (n=116), S. bovis (n=16), S. dysgalactiae (n=16), S. agalactiae (n=6), S. equines (n=2), and S. mitis (n=1) was isolated and identified in this study. Among the 157 Streptococcus isolates tested, manifest antimicrobial resistance was observed to amikacin (98.7%), kanamycin (98.7%), streptomycin (98.7%), and neomycin (98.0%) followed by oxytetracycline (85.4%), tetracycline (85.4%) and lincomycin (75.8%). All Streptococcus species isolates demonstrated low antimicrobial resistance to the amoxicillin (0.7%), cefuroxime (0.7%), cefazolin (1.9%), ceftiofur (1.9%), bacitracin (3.2%), and cloxacillin (4.5%). Resistance to 3 or more of 11 antimicrobial agents was observed in all species (98.7%, 155/157). Owing to therapy effect and antibiotic residues, it is essential to select appropriate antibiotics to treat bovine mastitis and to continuously survey of antimicrobial susceptibility of streptococci. ii
目 次 中 文 摘 要... i 英 文 摘 要... ii 目 次... iv 表 次... vi 圖 次... vii 第 一 章 前 言... 1 第 二 章 文 獻 探 討... 2 第 一 節 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 簡 介... 2 一 鏈 球 菌 之 分 類 型 態 及 生 化 特 性... 2 二 鏈 球 菌 細 胞 壁 醣 類 抗 原 分 類... 2 三 鏈 球 菌 致 病 性... 3 第 二 節 抗 生 素 介 紹... 5 一 抗 生 素 的 作 用 機 制... 5 ( 一 ) 抑 制 細 胞 壁 的 合 成... 5 ( 二 ) 破 壞 細 胞 膜 通 透 性 或 完 整 性... 6 ( 三 ) 抑 制 核 酸 或 DAN 的 合 成... 6 ( 四 ) 抑 制 蛋 白 質 的 合 成... 6 二 抗 生 素 種 類 介 紹... 7 ( 一 ) 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素... 7 ( 二 ) 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 抗 生 素... 9 ( 三 ) 四 環 素 類 (tetracyclines) 抗 生 素... 9 ( 四 ) 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 抗 生 素... 10 ( 五 ) 多 肽 類 (polypeptides) 抗 生 素... 10 iii
( 六 ) 氯 黴 素 類 (chloramphenicols) 抗 生 素... 11 三 抗 生 素 於 農 業 畜 牧 業 的 使 用... 11 第 三 節 鏈 球 菌 盛 行 率 及 抗 藥 性 之 流 行 病 學 調 查... 13 一 鏈 球 菌 盛 行 率 調 查... 13 二 臺 灣 地 區 鏈 球 菌 抗 藥 性 調 查... 13 三 其 他 國 家 之 鏈 球 菌 抗 藥 性 調 查... 15 第 三 章 材 料 與 方 法... 17 第 一 節 鏈 球 菌 菌 株 來 源... 17 一 乳 汁 採 樣 及 培 養... 17 二 微 生 物 培 養... 17 第 二 節 菌 種 培 養 與 鑑 定... 18 一 鏈 球 菌 之 分 離 與 判 定... 18 二 CAMP (Christie-Atkins-Munch-Petersen) 試 驗... 18 三 API 20 Strept 生 化 鑑 定... 18 四 乳 膠 凝 集 試 驗 (Latex agglutination test)... 19 五 菌 種 保 存... 20 第 三 節 抗 生 素 敏 感 性 試 驗... 21 第 四 節 統 計 分 析... 21 第 四 章 結 果... 22 第 一 節 鏈 球 菌 分 離 結 果... 22 一 乳 汁 培 養 結 果... 22 二 菌 種 鑑 定 之 結 果... 22 三 鏈 球 菌 之 乳 膠 凝 集 試 驗 結 果... 23 四 鏈 球 菌 溶 血 型 型 態... 23 五 CAMP 試 驗 結 果... 23 第 二 節 鏈 球 菌 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 檢 測 結 果... 29 iv
一 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果... 29 二 抗 藥 性 之 分 型... 30 第 三 節 鏈 球 菌 於 各 類 抗 生 素 抗 藥 性 結 果... 36 一 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素... 36 二 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 抗 藥 性 之 分 型... 37 三 四 環 類 (tetracyclines) 及 胺 基 配 醣 體 (aminoglycosides) 抗 生 素 之 抗 藥 性... 37 四 其 他 類 抗 生 素... 37 五 牛 隻 乳 房 炎 軟 膏 抗 生 素 藥 物 之 比 較... 37 第 四 節 地 理 位 置 之 菌 種 分 部 及 抗 藥 性 結 果 統 計... 43 一 鏈 球 菌 菌 種 之 地 理 分 佈... 43 二 鏈 球 菌 抗 藥 性 表 現 於 地 理 位 置 的 分 佈... 46 三 鏈 球 菌 抗 藥 性 表 現 於 不 同 地 區 乳 牛 場 分 佈... 46 第 五 章 討 論... 49 一 鏈 球 菌 之 分 離 及 鑑 定 結 果... 49 二 鏈 球 菌 抗 藥 性 結 果 探 討... 51 三 鏈 球 菌 抗 藥 性 分 型 及 於 臺 灣 各 乳 牛 場 之 盛 行 率 探 討... 54 第 六 章 總 結... 56 參 考 文 獻... 57 附 錄.. 67 Appendix 1. The classification of streptococcal group 67 Appendix 2. The chemical structure of penicillin G and ceftazidime.. 68 Appendix 3. The chemical structure of streptomycin... 68 Appendix 4. The chemical structure of lincomycin clindamycin and pirlimycin... 68 Appendix 5. The drugs used to treat bovine mastitis in Taiwan... 69 Appendix 6. Active ingredients and reactions enzyme table for API 20 Strept test... 70 v
Appendix 7. Reading table for API 20 Strept test.. 71 Appendix 8. Zone diameter interpretive standards of streptococci 72 vi
表 次 Table 1. Result of API 20 Strept and Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit to detect streptococcal species and group... 25 Table 2. Result of antimicrobial susceptibility test of streptococcal isolates from milk samples. 32 Table 3. Result of antimicrobial susceptibility of different species of streptococcal isolates identified by API 20 Strept in this study. 34 Table 4. 30 different antibiotic resistance patterns of streptococcal isolates.. 35 Table 5. Table 6. Table 7. Number of streptococci resistant to β-lactam antimicrobials patterns in this study.. 39 Distribution of dairy farms and numbers of streptococci isolated from milk samples. 44 Distribution of S. uberis of penicillin and ampicillin resistance in Taiwan (n=116). 48 vii
圖 次 Fig. 1 Identification and prevalence of 157 Streptococcus spp. isolated from bovine milk samples. 22 Fig. 2 Result of Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit to detect streptococcal group (A, B, C, D and E). 26 Fig. 3 The morphology (A, B and C) of streptococcal hemolysis types. 27 Fig. 4 Result of CAMP test (A, B and C) 28 Fig. 5 Antimicrobial susceptibility test of streptococcal isolates from milk samples by use dsk diffusion method... 31 Fig. 6 Proportion (%) of antimicrobial resistance in streptococci from bovine milk samples.. 33 Fig. 7 Proportion (%) of the penicillins resistance in streptococcal strains (n=157)... 40 Fig. 8 Proportion (%) of the cephalosporins resistance in streptococcal strains (n=157)... 40 Fig. 9 Proportion (%) of the tetracyclines and the aminoglycosides resistance in streptococcal strains (n=157) 41 Fig. 10 Proportion (%) of ampicillin, oxytetracycline, tetracycline and neomycin resistance in streptococcal strains (n=157)... 41 Fig. 11 Proportion (%) of ampicillin, cloxacillin, cefuroxime and bacitracin resistance in streptococcal strains (n=157)... 42 Fig. 12 Bovine milk samples collected from 30 dairy farms examined in this study... 43 Fig. 13 Proportion (%) of S. uberis of penicillin and ampicillin resistance in Taiwan (n=116). 48 Fig. 14 Resistant pattern of streptococci in this study (n=157). 48 viii
第 一 章 前 言, 乳 牛 乳 房 炎 (bovine mastitis) 一 直 為 全 世 界 各 國 乳 品 工 業 非 常 重 要 的 問 題, 因 其 乳 房 炎 會 造 成 乳 牛 的 產 乳 量 下 降, 乳 品 質 不 佳 進 而 影 響 生 乳 價 格, 同 時 加 添 獸 醫 診 療 費 及 抗 生 素 藥 物 的 使 用, 增 加 勞 動 人 力 成 本 或 使 牛 隻 過 早 的 被 撲 殺, 造 成 乳 業 經 濟 損 失 嚴 重 ( Bar et al., 2008;Runciman et al., 2010) 導 致 牛 隻 乳 房 炎 的 細 菌 可 依 流 行 病 學 歸 類 為 傳 染 性 病 原 菌 (contagious pathogens) 或 為 環 境 性 病 原 菌 (environmental pathogens)(sandholm et al., 1990; Bradley, 2002; Runciman et al., 2010), 其 菌 屬 種 類 包 含 葡 萄 球 菌 (Staphylococci), 鏈 球 菌 (Streptococci) 及 大 腸 桿 菌 群 (coliform) 為 常 被 從 乳 汁 分 離 出 來 的 病 原 菌 種 類 (Bal et al., 2010; Petrovski et al., 2011), 其 中 鏈 球 菌 已 被 大 多 的 文 獻 報 導 認 為 是 主 要 造 成 乳 房 炎 之 病 菌 之 一 (Guélat-Brechbuehl et al., 2010;Sanford et al., 2006), 然 而 近 年 來 都 以 環 境 性 的 鏈 球 菌 最 常 從 牛 隻 乳 房 炎 的 乳 汁 被 分 離 出 來 (Guérin-Faublée et al., 2002;Botrel et al., 2010) 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 為 革 蘭 氏 陽 性 球 菌, 菌 落 小, 兼 性 厭 氧, 具 有 溶 血 或 不 溶 血 特 性, 可 依 細 菌 細 胞 壁 所 含 的 特 異 性 多 醣 類 的 不 同 來 分 型 分 族 (Facklam, 2002) 鏈 球 菌 普 遍 存 在 於 人 體 或 動 物 的 腸 道 泌 尿 道 及 生 殖 系 統 或 管 腔 中, 也 存 在 於 環 境 中 某 些 致 病 性 的 鏈 球 菌 除 了 會 感 染 牛 隻 並 造 成 乳 牛 臨 床 或 次 臨 床 乳 房 炎 (Guélat-Brechbuehl et al., 2010;Shum et al., 2009), 也 會 對 於 新 生 兒 孕 婦 老 人 及 免 疫 能 力 不 佳 的 人 造 成 感 染, 甚 至 導 致 死 亡 (Bisharat et al., 2004;Brochet et al., 2006), 抗 生 素 因 此 被 廣 泛 用 於 治 療 細 菌 所 造 成 的 感 染 (Pol et al., 2007) 由 於 抗 生 素 普 遍 的 使 用, 造 成 許 多 細 菌 具 有 抗 藥 性 的 產 生 細 菌 對 於 抗 生 素 之 抗 藥 性 在 人 類 醫 學 及 獸 醫 學 上 是 相 當 受 重 視 關 注 的 一 個 領 域, 而 監 測 細 菌 的 抗 藥 性 及 其 型 態 是 非 常 重 要, 可 藉 此 來 獲 得 細 菌 對 藥 物 的 敏 感 性 程 度 (Schwarz et al., 2001) 在 臺 灣 的 乳 牛 場 裡, 乳 房 炎 一 直 都 為 泌 奶 牛 重 要 且 嚴 重 之 疾 病 問 題, 由 鏈 球 菌 造 成 的 乳 房 炎 更 是 屢 見 不 顯 然 而 在 台 灣 關 於 鏈 球 菌 之 菌 種 調 查 及 其 對 抗 生 素 的 抗 藥 性 型 態 相 關 研 究 報 告 並 不 多 因 此, 本 研 究 的 目 的 為 調 查 造 成 牛 隻 臨 床 及 次 臨 床 乳 房 炎 的 乳 汁 樣 本 中, 分 離 及 鑑 定 鏈 球 菌 之 菌 種 並 以 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 來 檢 測 其 抗 藥 性 的 程 度 及 型 態 希 望 藉 由 此 研 究 以 來 暸 解 臺 灣 乳 牛 牧 場 裡 造 成 乳 房 炎 感 染 之 鏈 球 菌 菌 種, 以 助 乳 牛 擠 奶 衛 生 及 飼 養 管 理 參 考 ; 並 且 藉 抗 生 素 之 抗 藥 性 型 態 的 表 現 作 為 現 場 獸 醫 師 在 臨 床 乳 房 炎 防 治 上 及 治 療 用 藥 上 的 參 考 1
第 二 章 文 獻 探 討 第 一 節 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 簡 介 一 鏈 球 菌 之 分 類 型 態 及 生 化 特 性 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 廣 泛 的 存 在 於 人 類 和 動 物 的 腸 道 泌 尿 和 生 殖 系 統 及 自 然 環 境 中, 它 們 為 人 類 口 腔 皮 膚 腸 道 和 上 呼 吸 道 的 共 生 菌 群 (Rurangirwa et al., 2000) 鏈 球 菌 屬 於 兼 性 厭 氧 (facultative anaerobes) 的 革 蘭 氏 陽 性 菌 球 菌 (gram-positive cocci), 觸 酶 (catalase) 陰 性 (Schleifer, 1986; Devriese et al., 1999), 適 合 生 長 於 ph7.4, 溫 度 37 之 環 境 中, 無 法 生 長 於 溫 度 超 過 45 的 環 境 中 或 是 含 有 6.5% 的 鹽 水 中 鏈 球 菌 菌 體 不 具 鞭 毛, 在 顯 微 鏡 下 常 以 兩 兩 成 對 且 呈 現 出 短 鏈 或 長 鏈 狀 型 態 生 長 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 其 菌 落 較 小 且 表 面 光 滑 具 反 光 性 根 據 其 菌 種 的 不 同, 可 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 週 圍 有 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 或 不 溶 血 (γ -hemolysis) 的 特 性 (Facklam et al., 2002) 鏈 球 菌 的 生 化 特 性 為 能 發 酵 簡 單 的 醣 類, 依 據 不 同 菌 種 之 鏈 球 菌 對 於 核 醣 (ribose) 肝 醣 (glycogan) 乳 糖 (lactose) 海 藻 糖 (trehalose) 菊 糖 (inulin) 棉 籽 糖 (raffinose) 甘 露 醇 (mannitol) 山 梨 醇 (sorbitol) 之 反 應 也 不 同 如 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 菌 株, 其 菌 株 之 生 化 特 性 為 對 菊 糖 (inulin) 不 發 酵 或 β 葡 萄 糖 酸 酶 為 陰 性 之 菌 株 (Devriese et al., 1999) 鏈 球 菌 為 營 養 需 求 高 之 細 菌, 可 以 水 解 aesculin, 水 解 後 的 產 物 aesculetin 會 在 培 養 基 中 形 成 不 可 溶 的 黑 色 鹽 類 物 質, 故 在 菌 落 周 圍 會 呈 現 出 黑 色 或 深 褐 色 二 鏈 球 菌 細 胞 壁 醣 類 抗 原 分 類 Lancefield 於 1933 年 依 據 鏈 球 菌 細 胞 壁 所 含 的 特 異 性 多 醣 類 抗 原 與 β 溶 血 鏈 球 菌 之 相 關 聯, 提 出 鏈 球 菌 分 族 的 概 念 (Lancefield, 1933) Sherman(1937) 依 據 所 觀 察 到 的 鏈 球 菌 之 生 理 生 化 特 性 不 同 將 鏈 球 菌 分 為 四 類, 為 化 膿 型 的 (pyogenic), 草 綠 色 型 的 (viridians) 乳 酸 型 的 (lactic) 及 腸 球 菌 型 (enterococci), 並 將 菌 株 細 胞 壁 所 含 的 特 異 性 多 醣 類 抗 原 的 不 同 來 定 義 分 族 (A B C E F 及 G 族 )(Sherman, 1937) 隨 著 鏈 球 菌 菌 種 日 益 的 被 細 分 出,Sherman 提 出 的 這 2
種 劃 分 已 經 與 現 今 的 鑑 識 系 統 不 同 現 今 依 據 不 同 的 菌 種 的 鏈 球 菌 其 細 胞 壁 所 含 的 醣 類 抗 原 不 同 可 將 之 區 分 分 為 A 至 U 族 (Lancefield 氏 分 類 法 )( 附 錄 1) 三 鏈 球 菌 致 病 性 鏈 球 菌 在 人 類 上 可 以 引 起 許 多 的 感 染 症 狀, 而 對 人 類 具 有 致 病 力 的 鏈 球 菌 有 90% 以 上 屬 於 A 族 鏈 球 菌 (Bhakdi et al., 1985), 如 化 膿 性 鏈 球 菌 (Streptococcus pyogenes) 即 為 A 族 β 溶 血 型 鏈 球 菌, 其 A 族 鏈 球 菌 造 成 的 感 染 症 狀 包 括 : 咽 喉 炎 猩 紅 熱 丹 毒 中 耳 炎, 膿 疱 症 及 淋 巴 管 炎 對 於 嚴 重 燒 燙 傷 病 人 而 言,A 族 β 溶 血 型 鏈 球 菌 一 直 是 造 成 此 病 人 引 發 嚴 重 的 感 染 症, 如 : 蜂 窩 性 組 織 炎 和 敗 血 症 (Bang et al., 1999) 同 樣 為 β 溶 血 型 的 B 族 鏈 球 菌 如 : 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae), 會 同 時 對 人 類 及 動 物 造 成 感 染, 是 為 人 類 及 動 物 的 共 同 病 原 菌 於 人 類, 無 乳 鏈 球 菌 會 造 成 新 生 兒 敗 血 症 腦 膜 炎 嬰 幼 兒 全 身 性 感 染 或 是 導 致 細 菌 性 的 心 內 膜 炎, 而 此 菌 也 會 感 染 泌 乳 牛 造 成 乳 房 炎 疾 病 的 發 生 (De Francesco et al., 2012, Rato et al., 2013) 在 鏈 球 菌 細 胞 壁 之 特 異 性 抗 原 尚 未 分 族 的 肺 炎 鏈 球 菌 (Streptococcus pneumoniae) 為 悉 知 造 成 人 類 細 菌 型 肺 炎 腦 膜 炎 或 是 敗 血 症 的 病 原 菌 屬 於 C 族 E 族 及 G 族 的 有 些 鏈 球 菌 偶 爾 會 造 成 人 類 傷 口 的 感 染 菌 血 症, 心 內 膜 炎 及 腦 炎 等, 其 中 C 族 的 異 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae) 及 尚 未 分 族 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 為 常 造 成 牛 隻 乳 房 炎 的 病 原 菌 (Guérin-Faublée et al., 2002; Rato et al., 2013) 鏈 球 菌 的 致 病 可 以 分 為 四 個 過 程 :( 一 ) 黏 附 (adherence) 至 宿 主 細 胞,( 二 ) 侵 入 宿 主 細 胞,( 三 ) 抵 抗 宿 主 的 免 疫 反 應, 及 ( 四 ) 分 泌 產 物 造 成 宿 主 細 胞 被 破 壞 鏈 球 菌 細 胞 壁 主 要 是 由 胜 肽 聚 醣 (peptideglycan) 所 構 成, 為 具 有 特 異 性 多 醣 類 抗 原 莢 膜 是 由 異 質 多 糖 所 構 成, 具 抗 原 性, 可 以 增 加 細 菌 的 致 病 力 此 外, 莢 膜 具 有 逃 避 補 體 活 化 和 調 理 作 用 的 功 能, 可 避 免 被 白 血 球 吞 噬, 此 為 擺 脫 宿 主 的 免 疫 系 統 攻 擊 很 重 要 的 一 環 鏈 球 菌 的 細 胞 壁 上 含 有 許 多 M 蛋 白 及 脂 磷 壁 酸 (lipoteichoic acid, LTA),M 蛋 白 為 鏈 球 菌 重 要 的 致 毒 及 造 成 感 染 的 重 要 因 子 致 病 性 的 鏈 球 菌 能 分 泌 以 下 5 種 毒 力 因 子 產 物 來 造 成 宿 主 細 胞 的 破 壞 及 增 加 細 菌 在 宿 主 體 內 的 傳 染 散 播 :(1) 鏈 球 菌 溶 血 素 (streptolysin), 可 分 為 鏈 球 菌 溶 血 素 S 型 及 O 型 兩 種,S 型 溶 血 素 存 在 於 菌 體 內 且 對 氧 穩 定, 能 溶 解 紅 血 球 白 血 球 及 血 小 板 O 型 溶 血 素 對 氧 不 穩 定, 可 以 誘 導 病 人 產 生 鏈 球 菌 O 型 溶 血 素 的 抗 體 (Bhakdi et al., 1985) (2) 鏈 球 菌 激 酶 (streptokinase), 3
可 以 溶 解 纖 維 蛋 白 來 協 助 細 菌 的 散 播 (3) 玻 尿 酸 酶 (hyaluronidase) 可 以 分 解 結 締 組 織, 加 速 細 菌 的 滲 透 及 散 播 (4) 蛋 白 酶 (proteinase), 為 鏈 球 菌 分 解 宿 主 的 蛋 白 質 之 重 要 的 酵 素 (5) 核 酸 酶 (nuclease), 具 有 A B C 及 D 共 四 型 核 酸 酶 A 及 C 具 有 DNase 活 性, 核 酸 酶 B 及 D 具 有 RNase 的 活 性 ; 其 作 用 為 分 解 宿 主 發 炎 膿 腫 內 白 血 球 細 胞 的 DNA, 降 低 傷 口 膿 瘍 的 黏 度 來 助 長 細 菌 之 向 外 散 播 (Baltimore, 1982; Schlievert et al., 1996; Cunningham, 2000; 蔡, 2002) 4
第 二 節 抗 生 素 介 紹 抗 微 生 物 製 劑 (antimicrobial agent) 包 含 許 多 種 類, 如 : 抗 生 素 (antibiotics) 抗 黴 菌 劑 (antifungals) 或 是 化 學 治 療 藥 劑 (chemotherapeutic abents) 然 而 抗 生 物 質 為 細 菌 黴 菌 或 放 射 線 菌 代 謝 產 生 的 物 質, 此 物 質 能 殺 死 或 抑 制 其 它 的 微 生 物 的 生 長 或 繁 殖 (Waksman, 1942), 固 抗 生 素 被 廣 泛 的 運 用 於 來 治 療 細 菌 所 造 成 的 感 染 抗 生 素 的 起 源 於 1928 年,Alexander Fleming 觀 察 發 現 被 青 黴 菌 所 污 染 的 金 黃 色 葡 萄 球 培 養 皿 中, 生 長 於 青 黴 菌 周 圍 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 皆 被 抑 制, 隨 後 將 此 物 質 純 化 分 離 出 來, 並 命 名 為 青 黴 素 (pencillin), 青 黴 素 為 人 類 醫 學 上 第 一 個 被 發 現 且 廣 泛 使 用 的 抗 生 素, 因 為 它 的 發 現 對 於 疾 病 的 治 療 有 了 重 大 的 突 破, 解 決 了 很 多 由 細 菌 感 染 所 造 成 的 疾 病 於 現 今 臨 床 使 用 的 抗 生 素 種 類 約 莫 有 一 百 五 十 種 類 (Pommerville, 2004) 一 抗 生 素 的 作 用 機 制 不 同 種 類 的 抗 生 素 其 作 用 機 制 也 不 相 同, 按 照 性 質 的 不 同, 可 將 抗 生 素 分 為 殺 菌 性 (bactericidal) 或 是 抑 菌 性 (bacteriostatic) 的 抗 生 素 (Waksman,1942), 其 對 於 細 菌 的 作 用 機 制 可 分 為 四 類 : ( 一 ) 抑 制 細 胞 壁 的 合 成 細 菌 的 細 胞 壁 是 維 持 細 菌 體 很 重 要 的 支 撐 結 構, 因 細 菌 細 胞 質 濃 度 常 大 於 其 生 存 環 境 中 的 濃 度, 由 滲 透 壓 原 理, 水 分 會 由 低 濃 度 地 方 往 濃 度 高 的 地 方 移 動, 因 此 會 造 成 細 胞 外 水 分 不 斷 擴 散 進 入 細 胞 內, 而 細 胞 壁 的 存 在 可 防 止 細 胞 因 不 斷 膨 脹 而 使 得 細 胞 膜 破 裂 導 致 細 菌 死 亡 構 成 細 菌 細 胞 壁 的 主 要 成 份 為 肽 聚 糖 (peptidoglycan), 由 N-acetylglucosamine 及 N-acetylmuramic 相 互 交 織 形 成 的 網 狀 結 構 青 黴 素 結 合 蛋 白 (penicillin-binding proteins,pbs) 為 催 化 細 菌 細 胞 壁 合 成 起 始 步 驟 之 酵 素, 而 青 黴 素 (penicillins) 結 構 上 的 β-lactam 環 會 和 肽 聚 糖 鏈 (peptidoglycan chain) 產 生 交 聯 (cross-link) 後, 再 與 青 黴 素 結 合 蛋 白 結 合 後, 使 得 細 菌 的 細 胞 壁 因 殘 缺 不 完 整 之 肽 聚 糖 組 成 的 細 胞 壁 而 變 得 薄 弱 結 構 不 完 整 而 造 成 菌 體 滲 透 壓 不 穩 定 導 致 細 菌 破 裂 分 解 而 死 亡 (Sauvage, 2008) 5
( 二 ) 破 壞 細 胞 膜 通 透 性 或 完 整 性 細 菌 的 細 胞 膜 為 調 控 物 質 進 出 重 要 的 通 道, 一 旦 細 胞 膜 受 到 損 壞, 細 胞 內 的 蛋 白 質 離 子 及 遺 傳 物 質 便 會 向 外 流 失 而 造 成 細 菌 死 亡, 其 抗 生 素 如 polymyxins amphotericin 及 nystatin 的 作 用 機 制 皆 屬 於 此, 進 而 導 致 細 菌 細 胞 內 的 重 要 物 質 流 失 如 polymyxins 為 主 要 抗 革 蘭 氏 陰 性 菌 之 藥 劑, 其 作 用 為 會 和 陰 性 菌 細 胞 膜 上 的 磷 脂 質 結 合 後, 並 且 嵌 入 細 胞 膜 形 成 通 道, 增 加 細 胞 膜 的 通 透 性 來 造 成 細 菌 死 亡 (Hancock et al., 1999; Clausell et al., 2003) ( 三 ) 抑 制 核 酸 或 DNA 的 合 成 抑 制 DNA 合 成 的 藥 物 有 fluoroquinolones 及 nitroimidazole 等 藥 物, 抑 制 DNA-dependent RNA polymerase 或 抑 制 mrna 的 藥 物 為 rifampin, 抑 制 核 酸 合 成 藥 物 有 actiomycin 及 idoxuridine, 這 些 藥 物 會 干 擾 微 生 物 之 DNA 複 製 或 轉 錄 (transcription) fluoroquinolones 藥 物 為 直 接 抑 制 DNA 的 合 成, 依 據 細 菌 的 不 同, 其 藥 物 的 機 制 可 分 為 作 用 在 DNA gyrase 或 是 作 用 在 拓 樸 異 構 酶 (topoisomerase IV) 上 (Hooper, 2001) 抑 制 葉 酸 (folate) 的 藥 物 有 sulfonamides 及 trimethoprim, 以 sulfonamides 為 例, 其 作 用 機 制 為 利 用 競 爭 型 抑 制 (competitive inhibition) 來 達 到 抑 制 的 效 果 因 葉 酸 在 核 酸 及 許 多 胺 基 酸 的 生 合 成 上 扮 演 很 重 要 的 角 色, 而 para-aminobenzoic acid (PABA) 是 合 成 葉 酸 所 需 之 受 質,sulfanilamide 的 結 構 類 似 PABA, 當 sulfanilamide 存 在 時, 會 使 得 原 本 與 PABA 結 合 的 酵 素 轉 而 與 sulfanilamide 結 合, 故 細 菌 無 法 合 成 葉 酸 而 進 一 步 的 造 成 微 生 物 停 止 生 長 (Sköld, 2000) ( 四 ) 抑 制 蛋 白 質 的 合 成 原 核 生 物 及 真 核 生 物 其 細 胞 的 蛋 白 質 合 成 具 備 非 常 重 要 的 功 能, 因 此 許 多 抗 微 生 物 劑 的 作 用 機 制 以 結 合 至 目 標 物 的 核 醣 體 阻 斷 其 蛋 白 質 的 製 造 來 達 到 抑 制 微 生 物 複 製 繁 衍 根 據 其 抗 微 生 物 劑 結 合 細 菌 核 醣 體 次 單 位 的 不 同 可 以 分 為 兩 類, 作 用 於 30S 核 醣 體 次 單 位 有 胺 基 配 醣 體 類 藥 物 及 四 環 素 類 藥 物, 作 用 於 50S 核 醣 體 次 單 位 有 巨 環 類 及 氯 黴 素 (Hirsh and Zee, 1999) 6
二 抗 生 素 種 類 介 紹 ( 一 ) 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 為 殺 菌 性 的 抗 生 素, 其 藥 物 作 用 原 理 為 抑 制 細 菌 細 胞 壁 的 合 成 和 破 壞 細 菌 細 胞 壁 的 結 構 來 達 到 殺 菌 的 作 用 其 殺 菌 之 機 制 為 結 構 上 的 乙 內 醯 胺 酶 環 (β-lactam ring) 會 和 細 菌 合 成 細 胞 壁 起 始 的 酵 素 青 黴 素 結 合 蛋 白 (penicillin-binding proteins) 做 結 合, 而 隨 著 細 菌 的 不 同 其 青 黴 素 結 合 蛋 白 之 催 化 功 能 也 不 同 青 黴 素 類 (penicillins) 抗 生 素 及 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 抗 生 素 皆 屬 於 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 (Fisher et al., 2005), 其 兩 類 抗 生 素 在 結 構 上 均 有 β-lactam 環, 此 外, 青 黴 素 類 的 抗 生 素 結 構 上 具 有 的 五 角 型 硫 環 (Thiazolidine ring), 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 有 六 原 環 (Dihydrothiazine ring) 結 構 (Mims et al., 2006), 其 化 學 結 構 詳 見 附 錄 2 青 黴 素 類 的 抗 生 素 可 依 結 構 及 抗 菌 範 圍 分 為 四 大 類 :(1)natural penicillin: 藉 由 青 黴 菌 培 養 後 萃 取 純 化 其 代 謝 產 物 而 得, 如 pencillin G 及 pencillin V (2) aminopencillins: 半 合 成 的 青 黴 素 衍 生 物, 在 烷 基 的 α 位 置 上 有 一 個 游 離 的 胺 基 團 (amino group), 如 amoxicillin ampicillin 及 hetacillin (3) penicillinase-resistant penicillin: 在 胺 基 側 鏈 的 CO 基 上 接 上 一 個 環 狀 的 結 構, 此 環 狀 結 構 上 的 取 代 基 可 以 保 護 β-lactam ring, 避 免 被 細 菌 的 乙 內 醯 胺 酶 (β-lactamase) 水 解, 如 :cloxacillin dicloxacillin methicillin nafcillin 及 oxacillin (4) extended-spectrum penicillins: 在 烷 基 的 α 位 上 具 有 一 個 酸 基 團 (carboxylic acid group) 或 鹼 基 團 (basic group), 此 結 構 使 此 類 別 的 青 黴 素 衍 生 物 比 起 前 三 項 更 具 廣 效 性 (Adams, 2001; Fisher et al., 2005) 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 抗 生 素 為 一 群 半 合 成 的 廣 效 型 抗 生 素, 其 對 大 部 分 的 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 某 些 革 蘭 氏 陰 性 菌 有 殺 菌 或 是 抑 菌 的 效 果 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 依 其 抗 菌 性 質 及 發 展 的 時 間 順 序 來 將 之 分 為 第 一 代 第 二 代 第 三 代 及 第 四 代 第 一 代 頭 孢 子 素 類 (first-generation cephalosporins) 其 藥 理 作 用 為 抑 制 細 菌 細 胞 壁 中 mucopeptide 的 合 成, 導 致 細 菌 細 胞 壁 薄 弱 因 滲 透 壓 不 穩 而 造 成 細 菌 的 死 亡 第 一 代 的 頭 孢 子 素 抗 菌 的 活 性 強, 但 是 抗 菌 範 圍 較 窄 7
, 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 如 葡 萄 球 菌 屬 (Staphylococcus spp.) 具 有 較 強 的 藥 物 作 用 活 性 (Sabath, 1989) 屬 於 第 一 代 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 有 cefadroxil cephalexin cefazoline cephalothin cephapirin 及 cephradine 第 二 代 頭 孢 子 素 類 (second-generation cephalosporins) 抗 生 素 於 1960 至 1970 年 代 發 展 出 來, 其 性 質 較 第 一 代 頭 孢 子 素 的 抗 菌 範 圍 更 廣, 且 對 於 抗 革 蘭 氏 陰 性 的 腸 道 菌 有 較 強 的 活 性, 因 其 對 抗 於 細 菌 所 產 生 的 乙 內 醯 安 酶 具 有 更 穩 定 的 結 構 (Joan C, 1997) 藥 物 有 cefoxitin cefprozil ceforanide 及 cefuroxime 第 三 代 頭 孢 子 素 (third-generation cephalosporins) 為 廣 效 型 的 抗 生 素, 對 於 對 第 一 代 及 第 二 代 頭 孢 子 素 具 有 抗 藥 性 之 細 菌 更 有 效 藥 物 有 ceftiofur ceftriaxone cefoperazone cefpodoxime cefotaxime 及 ceftizoxime, 其 中 以 cefotaxime 及 ceftizoxime 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 之 作 用 效 力 較 強 cefotaxime ceftazidime ceftriaxone 及 cefoperazone 對 於 革 蘭 氏 陰 性 菌 具 有 較 良 好 的 藥 物 活 性, 但 對 於 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 其 對 抗 能 力 弱 (Joan C, 1997) 第 四 代 頭 孢 子 素 (fourth-generation cephalosporins) 為 廣 效 型 抗 生 素, 其 抗 菌 譜 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 革 蘭 氏 陰 性 菌 和 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 均 具 有 良 好 的 藥 物 效 力, 第 四 代 頭 孢 子 素 包 含 cefepime cefepime cefoselis cefclidine cefozopran 和 cefquinome 根 據 文 獻 指 出 於 某 些 國 家 運 用 cefepime 和 cefpirome 來 治 療 幾 種 中 度 至 重 度 的 細 菌 感 染 症 (Joan C, 1997) cefpirome 對 於 臨 床 上 產 生 乙 內 醯 胺 酶 的 菌 株 具 有 良 好 的 抵 抗 性, 且 為 悉 知 用 於 治 療 牛 或 豬 疾 病 的 抗 生 素 (Shpigel et al., 1997; Thomas et al., 2006) 細 菌 對 於 β-lactam 類 抗 生 素 產 生 抗 藥 性 有 三 個 主 要 因 素, 為 (1) 細 菌 自 身 產 生 乙 內 醯 胺 酶 (β-lactamase) 造 成 乙 內 醯 胺 (β-lactam) 類 藥 物 被 水 解 而 失 去 活 性,(2) 細 菌 細 胞 壁 的 通 透 性, 和 (3) 青 黴 素 結 合 蛋 白 (penicillin-binding proteins,pbs) 的 敏 感 度 細 菌 自 身 產 生 乙 內 醯 胺 酶 (β-lactamase) 來 水 解 乙 內 醯 胺 (β-lactam) 環 為 細 菌 主 要 的 抗 藥 性 表 現 的 機 制, 而 不 同 的 β-lactamase 可 能 對 於 青 黴 素 類 抗 生 素 有 專 一 性 (penicillinases) 或 是 對 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 具 有 專 一 性 (cephalosporinases)(adams, 2001; Fisher et al., 2005; Li et al., 2007) 8
( 二 ) 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 抗 生 素 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 為 廣 效 型 的 殺 菌 性 抗 生 素, 其 作 用 機 制 為 與 細 菌 的 30S 核 醣 體 次 單 位 結 合 而 抑 制 蛋 白 質 的 合 成, 主 要 作 為 治 療 由 革 蘭 氏 陰 性 菌, 需 氧 菌 所 造 成 的 感 染 (Magnet et al., 2005) 此 藥 物 與 乙 內 醯 胺 (β-lactam) 類 藥 物 合 併 使 用 具 有 協 同 性 而 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 於 許 多 醫 療 院 為 最 常 使 用 的 抗 生 素, 其 副 作 用 具 有 腎 毒 性 及 耳 毒 性 ( 嗅 覺 及 前 庭 ), 且 其 毒 性 相 較 於 其 它 類 的 抗 生 素 大, 細 菌 對 此 藥 物 易 有 抗 藥 性 (Kotra et al., 2000) 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 結 構 主 要 由 兩 個 胺 基 醣 以 醣 鍵 與 六 碳 醣 核 心 鍵 結, 為 親 水 性 的 抗 生 素, 故 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 所 造 成 的 感 染 治 療 效 果 不 佳 (Adams, 2001) 屬 於 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 有 streptomycin kanamycin gentamicin tobramycin 及 neomycin, 其 結 構 詳 見 附 錄 3 ( 三 ) 四 環 素 類 (tetracyclines) 抗 生 素 四 環 素 類 (tetracyclines) 被 發 現 於 20 世 紀 40 年 代, 為 廣 效 型 的 制 菌 性 抗 生 素, 其 作 用 機 制 為 結 合 在 細 菌 的 30S 核 醣 體 次 單 位 來 達 到 抑 制 蛋 白 質 的 合 成 其 主 要 作 為 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 革 蘭 氏 陰 性 菌 造 成 感 染 之 代 替 治 療 藥 劑 此 外, 四 環 素 類 抗 生 素 被 認 為 是 霍 亂 衣 原 體 立 克 次 氏 體 感 染 復 發 熱 及 對 於 青 黴 素 藥 物 過 敏 之 淋 病 病 患 之 較 佳 選 擇 的 藥 物 四 環 素 類 抗 生 物 藥 物 抗 菌 活 性 相 似, 但 其 藥 物 動 力 學 具 有 差 異 四 環 素 (tetracycline) 及 土 黴 素 (oxytetracycline) 為 短 作 用 型 的 藥 物, 半 衰 期 6-10 小 時 其 餘 的 四 環 素 類 衍 生 物 其 半 衰 期 為 11-20 小 時, 為 長 效 型 藥 物 四 環 素 類 (tetracyclines) 抗 生 素 為 價 錢 較 低 的 抗 生 素, 故 其 被 廣 泛 的 用 於 人 類 和 動 物 感 染 的 預 防 和 治 療 ; 另 外 也 常 將 四 環 素 添 加 在 動 物 飼 料 中 作 為 生 長 促 進 劑 因 此 大 量 的 使 用 四 環 素 類 藥 物 造 成 許 多 細 菌 對 於 此 種 藥 物 產 生 了 抗 藥 性, 而 細 菌 大 部 分 對 抗 四 環 素 類 藥 物 會 經 由 三 種 機 制 來 呈 現, 為 (1) 將 藥 物 排 出 (efflux mechanism) 於 細 菌 體 外 來 達 到 降 低 藥 物 的 吸 收 量,(2) 細 菌 藉 由 核 醣 體 的 保 護 蛋 白 (ribosomal protection proteins, RPPs) 來 使 四 環 素 類 藥 物 無 法 結 合 於 細 菌 的 30S 核 醣 體 次 單 位 上 而 被 釋 放 出, 和 (3) 細 菌 的 酵 素 性 修 飾 四 環 素 作 用 (Aminov 2001; Chopra et al., 2001; Roberts, 2005) 9
( 四 ) 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 抗 生 素 林 可 醯 胺 類 (Lincosamides) 藥 物 於 1960 年 代 被 發 現, 結 構 為 一 群 具 有 胺 基 酸 側 鏈 之 單 醣 類 的 抗 生 素, 為 廣 效 性 的 抗 生 素, 包 括 lincomycin clindamycin 及 pirlimycin, 其 中 lincomycin 與 clindamycin 此 兩 種 抗 生 素 的 結 構 相 似 ( 附 錄 4), 作 用 機 制 為 與 細 菌 的 50S 核 醣 體 次 單 位 結 合 至 23S rrna 進 而 抑 制 蛋 白 質 的 合 成, 抗 菌 範 圍 與 作 用 機 制 類 似 於 巨 環 類 (macrolides) 的 抗 生 素 (Petinaki et ajl., 2008) 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 藥 物 用 於 治 療 如 : 葡 萄 球 菌 屬 (Staphylococcus spp.) 鏈 球 菌 屬 (Streptococcus spp.) 棒 狀 桿 菌 屬 (Corynebacterium spp.) 及 methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 等 於 獸 醫 的 用 藥 中,lincomycin 及 pirlimycin 常 用 於 治 療 泌 乳 牛 乳 房 炎 的 疾 病 (Petinaki et ajl., 2008) 由 於 廣 泛 的 使 用, 許 多 細 菌 對 於 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 藥 物 已 出 現 抗 藥 性, 其 抗 藥 性 機 制 普 遍 可 分 為 兩 的 途 徑, 為 (1) 抗 生 素 的 修 飾 作 用 (antibiotic modification), 此 機 制 常 被 發 現 表 現 於 革 蘭 氏 陽 性 球 菌 上 (Dutta and Devriese, 1982), 或 是 (2) 藉 由 Erm 甲 基 轉 移 酶 (Erm methyltransferases) 甲 基 化 (methylation) 核 醣 體 的 23S rrna, 而 此 機 制 在 巨 環 類 (macrolides) 及 B 型 鏈 陽 菌 素 (B streptogramin) 抗 生 素 常 被 觀 察 到 (Courvalin et al., 1985; Morar et al., 2009) ( 五 ) 多 肽 類 (polypeptides) 抗 生 素 多 肽 類 (polypeptides) 藥 物 屬 於 殺 菌 性 的 抗 生 素, 包 含 gramicidins polymyxins bacitracins 和 glycopeptides(hancock and Chapple, 1999) polymyxins 主 要 用 來 治 療 由 革 蘭 氏 陰 菌 所 造 成 的 感 染 症 狀, 如 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 鮑 氏 不 動 桿 菌 (Acinetobacter baumanni) 及 carbapenemase-producing Enterobacteriaceae, 作 用 機 制 因 其 為 是 藥 物 具 有 陽 離 子 帶 有 陽 性 電 荷, 而 細 菌 的 外 膜 帶 負 電 荷, 因 此 polymyxins 可 以 與 細 菌 的 外 膜 結 合 而 干 擾 細 菌 外 膜 的 完 整 性 而 此 藥 物 的 副 作 用 為 神 經 毒 性 和 腎 毒 性, 此 藥 物 的 副 作 用 較 危 險, 因 而 大 大 的 限 制 了 全 身 性 使 用 (Landman et al., 2008) bacitracin 為 含 有 金 屬 的 抗 菌 劑, 被 廣 泛 用 作 醫 藥 和 飼 料 添 加 劑 其 機 制 為 結 合 細 菌 細 胞 壁 脂 質 載 體 幾 種 重 要 的 中 間 產 物 undecaprenyl-pyrophosphate 來 達 到 干 擾 細 菌 細 胞 壁 的 生 合 成 多 肽 類 的 化 合 藥 物, 對 於 由 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 某 些 革 蘭 氏 陰 性 菌 所 造 成 的 感 染 具 有 良 10
好 的 治 療 效 果 (Economou et al., 2013) ( 六 ) 氯 黴 素 類 (chloramphenicols) 抗 生 素 氯 黴 素 (chloramphenicol) 於 1940 年 代 被 發 現, 為 廣 效 型 的 抑 菌 性 抗 生 素 氯 黴 素 的 作 用 機 制 為 藉 由 作 用 在 50S 次 單 位 上 核 醣 體 RNA 阻 斷 蛋 白 質 合 成 所 需 酵 素 胜 肽 轉 移 酶 (peptidyl transferase) 之 功 能 而 來 達 到 抑 制 蛋 白 質 合 成 的 功 能 (Jardetzky, 1962) 氯 黴 素 使 用 時 最 嚴 重 的 副 作 用 為 具 有 骨 髓 毒 性, 會 造 成 骨 髓 抑 制 或 再 生 不 良 性 貧 血 (Smilack, 1991), 目 前 美 國 法 國 (Guérin-Faublée et al., 2002) 與 我 國 已 經 禁 止 將 氯 黴 素 使 用 於 經 濟 動 物 中 氯 黴 素 對 於 各 種 革 蘭 氏 陽 性 菌 陰 性 菌 及 包 括 大 部 分 厭 氧 性 的 微 生 物 皆 具 有 藥 物 效 力, 因 其 製 造 容 易 且 價 格 相 對 低 廉 而 使 氯 黴 素 被 廣 泛 的 使 用, 但 也 因 為 被 廣 泛 的 使 用 造 成 細 菌 產 生 抗 藥 性 的 問 題, 目 前 已 知 細 菌 會 透 過 下 列 的 機 制 來 對 氯 黴 素 產 生 抗 性 (1) 藉 由 乙 醯 轉 移 酶 (acetyltransferases) 或 氯 黴 素 磷 酸 轉 移 酶 (chloramphenicol phosphotrans ferases) 來 使 酵 素 失 去 活 性,(2) 經 由 突 變 或 修 飾 來 改 變 標 靶 位 置 (target site), (3) 降 低 細 菌 外 膜 的 通 透 性, 及 (4) 利 用 藥 物 輸 出 幫 浦 (efflux pumps) 的 multidrug extrusion transporters 將 藥 物 排 出 而 來 降 低 細 菌 體 內 藥 物 的 濃 度 (Fernández et al., 2012) 三 抗 生 素 於 農 業 畜 牧 業 的 使 用 抗 生 素 於 1950 年 代 普 遍 使 用 在 農 業 的 家 禽 家 畜 及 畜 牧 業 上, 因 為 適 當 的 使 用 抗 生 素 可 以 改 善 動 物 健 康 及 增 加 動 物 的 生 產 力, 並 且 可 以 減 少 造 成 食 物 中 毒 的 病 原 菌 此 外, 抗 生 素 使 用 於 食 用 動 物 或 經 濟 動 物 上 的 目 的 除 了 治 療 由 細 菌 感 染 所 造 成 的 疾 病 外, 短 期 的 預 防 性 投 予 用 藥 來 防 止 遭 受 細 菌 的 感 染 或 是 添 加 於 飼 料 中 來 促 進 動 物 的 生 長 及 增 加 動 物 的 飼 料 換 肉 率 然 而 將 抗 生 素 添 加 在 飼 料 裡 來 增 加 經 濟 動 物 的 生 長 受 到 很 多 的 爭 議, 因 為 已 有 文 獻 指 出 如 此 會 導 致 細 菌 產 生 抗 藥 性 的 情 況 發 生 為 了 維 持 抗 生 素 藥 物 的 治 療 效 力 及 避 免 細 菌 出 現 抗 藥 性, 謹 慎 的 選 擇 抗 生 素 藥 劑 是 非 常 重 要 的 (Mathew et al., 2007;Redding et al., 2014 ) 在 現 代 的 飼 養 乳 牛 的 牧 場 裡, 抗 生 素 藥 物 常 被 用 於 治 療 細 菌 感 染 造 成 疾 病 和 預 防 性 的 投 與 用 藥, 然 而 大 多 數 的 抗 生 素 被 使 用 在 治 療 細 菌 感 染 上 在 乳 牛 場, 抗 生 素 被 廣 泛 使 用 在 治 療 乳 牛 乳 房 炎 疾 病 及 牛 隻 的 傳 染 性 疾 病 上 11
於 美 國, 合 法 被 允 許 用 來 治 療 乳 牛 乳 房 炎 抗 生 素 藥 物 有 penicillin cephapirin ceftiofur amoxicillin hetacillin cloxacillin erythromycin novobiocin 和 pirlimycin 而 β-lactams sulfonamides tetracyclines lincomycin 為 對 於 治 療 牛 隻 的 呼 吸 道 疾 病 子 宮 感 染 和 傳 染 性 足 病 (infectious foot disease) 為 常 使 用 的 抗 菌 藥 劑 於 乳 牛 場 裡, 將 抗 生 素 用 於 治 療 乳 牛 乳 房 炎 疾 病 的 頻 度 相 較 於 抗 生 素 用 於 治 療 其 他 疾 病 是 為 最 高 的 (Pol and Ruegg, 2007) 在 德 國 (Tenhagen et al., 2006) 阿 根 廷 (Denamiel et al., 2005) 及 愛 沙 尼 亞 (Kalmus et al., 2011), 以 乙 內 醯 胺 酶 類 抗 生 素 及 巨 環 類 抗 生 素 為 常 用 於 治 療 乳 牛 乳 房 炎 疾 病 的 藥 物 種 類 於 附 錄 5 列 出 臺 灣 目 前 核 可 且 乳 牛 場 使 用 於 治 療 乳 牛 乳 房 炎 之 乳 房 炎 軟 膏 及 其 成 份 12
第 三 節 鏈 球 菌 盛 行 率 及 抗 藥 性 之 流 行 病 學 調 查 一 鏈 球 菌 盛 行 率 調 查 許 多 微 生 物 皆 可 能 是 引 起 乳 牛 乳 房 炎 症 狀 之 因 素, 包 括 革 蘭 氏 陰 性 菌 革 蘭 氏 陽 性 菌, 類 質 菌 體 和 藻 類, 其 中 由 細 菌 所 引 起 乳 房 炎 的 情 況 為 最 常 見 (Zadoks et al., 2011) 導 致 牛 隻 乳 房 炎 的 細 菌 可 依 流 行 病 學 歸 類 為 傳 染 性 病 原 菌 或 為 環 境 性 病 原 菌 (Sandholm et al., 1990), 傳 染 性 病 原 菌 傳 染 方 式 為 藉 由 消 毒 未 完 全 的 榨 乳 杯 受 汙 染 的 抹 布 或 是 經 由 擠 乳 人 員 的 手 來 將 病 原 體 從 原 本 已 患 病 的 乳 牛 傳 遞 給 其 它 健 康 牛 隻, 其 中 以 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus), 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae), 棒 狀 桿 菌 (Corynebacterium spp.) 和 黴 漿 菌 (Mycoplasma spp.) 最 為 重 要 環 境 性 的 病 原 體 主 要 源 自 於 環 境 中, 如 ; 牛 床, 在 乳 牛 榨 乳 時 伺 機 感 染, 其 致 病 菌 如 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 克 雷 伯 氏 菌 屬 (Klebsiella spp) 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 及 腸 球 菌 屬 ( Enterococcus spp.)(rossitto et al., 2002), 其 中 鏈 球 菌 已 被 報 導 是 成 為 主 要 造 成 乳 房 炎 之 病 菌 之 一 (Sanford et al., 2006;Guélat-Brechbuehl et al., 2010), 而 近 年 來 的 研 究 發 現 以 環 境 性 的 鏈 球 菌 ; 如 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 為 最 常 從 牛 隻 乳 房 炎 的 乳 汁 被 分 離 出 來 (Todhunter et al., 1995; Rossitto et al., 2002; Guérin-Faublée et al., 2002; Botrel et al., 2010) 在 紐 西 蘭,Petrovski 等 人 (2011) 發 現 從 乳 汁 微 生 物 培 養 出 來 的 結 果 以 乳 房 鏈 球 菌 佔 23.6% 的 比 例 為 最 高, 其 次 為 金 黃 色 葡 萄 球 菌 佔 23.5%, 凝 固 酶 陰 性 葡 萄 球 菌 佔 7.2% Shum 等 人 (2009) 於 澳 洲 的 New South Wales 調 查 乳 房 炎 乳 牛 生 乳 培 養 結 果 發 現, 環 境 性 的 病 原 菌 佔 91%, 大 腸 桿 菌 佔 33.6%, 環 境 性 的 鏈 球 菌 佔 41.6% 及 葡 萄 球 菌 屬 佔 15.7 % 二 臺 灣 地 區 鏈 球 菌 抗 藥 性 調 查 於 臺 灣, 有 關 於 牧 場 鏈 球 菌 調 查 資 料 不 多, 而 大 多 數 是 以 人 醫 醫 院 裡 分 離 出 的 鏈 球 菌 做 為 研 究 目 前 發 現 臺 灣 來 自 動 物 分 離 出 之 鏈 球 菌 其 抗 藥 性 的 調 查 研 究 有 兩 篇 其 一 為 Ma 等 人 (2006) 於 臺 灣 北 部 及 東 部 兩 個 地 理 共 16 個 乳 牛 牧 場, 從 生 乳 及 牧 場 的 環 境 進 行 細 菌 菌 種 的 調 查 其 細 菌 培 養 後 鑑 定 結 果 共 有 1346 株 細 菌 被 分 離, 其 中 包 括 226 株 的 大 腸 桿 菌,30 株 的 假 單 孢 菌 及 259 株 革 蘭 氏 陰 性 菌,271 株 腸 球 菌,314 株 的 葡 萄 球 菌 及 195 株 的 鏈 球 菌 及 51 株 革 13
蘭 氏 陽 性 菌, 並 對 分 離 出 的 細 菌 做 藥 物 敏 感 性 測 試, 其 陽 性 菌 測 試 的 藥 物 為 有 amoxicillin/clavulanic acid cephalothin chloramphenicol doxycycline enrofloxacin erythromycin oxacillin oxytetracycline penicillin G sulfadimethoxine 及 vancomycin 實 驗 結 果 以 sulfadimethoxine 呈 現 最 高 的 抗 藥 性 表 現, 且 不 同 地 區 來 源 的 細 菌 其 抗 藥 性 型 態 也 不 相 同, 作 者 認 為 可 能 是 因 各 個 牧 場 的 用 藥 習 慣 不 同 所 造 成 此 現 象 (Ma et al., 2006) 第 二 篇 文 獻 由 Hung 等 人 (2008) 於 臺 灣 調 查 從 動 物 及 人 類 身 上 分 離 出 的 鏈 球 菌 對 於 藥 物 敏 感 性 及 其 紅 黴 素 抗 藥 性 基 因 的 關 聯 從 15 種 動 物 及 人 類 一 共 蒐 集 了 248 株 鏈 球 菌, 並 使 用 azithromycin clarithromycin erythromycin spiramycin amoxicillin 及 enrofloxacin 一 共 7 種 抗 生 素 對 收 集 到 的 鏈 球 菌 菌 株 檢 測 其 對 藥 物 的 敏 感 性 程 度, 並 利 用 聚 合 酶 鏈 鎖 反 應 (PCR) 的 方 法 檢 測 其 紅 黴 素 抗 藥 性 基 因 結 果 不 同 來 源 的 248 株 鏈 球 菌 對 spiramycin 呈 現 最 高 的 抗 藥 性 表 現, 而 對 於 amoxicillin 藥 物 的 感 受 性 最 好, 以 PCR 偵 測 紅 黴 素 抗 藥 性 基 因 在 本 篇 研 究 以 erm(b) 所 佔 的 比 例 最 高 雖 然 在 臺 灣 也 有 其 它 的 文 獻 報 導 由 人 類 身 上 分 離 出 的 鏈 球 菌 是 以 mef(a) 為 主 要 的 紅 黴 素 抗 藥 性 基 因, 但 由 於 來 源 物 種 的 不 同, 作 者 認 為 在 臺 灣 由 動 物 身 上 所 分 離 出 帶 有 erm(b) 基 因 是 鏈 球 菌 主 要 對 於 紅 黴 素 類 藥 物 產 生 抗 藥 性 的 主 要 基 因 (Hung et al., 2008) 在 臺 灣, 由 程 (1993) 的 針 對 臺 灣 中 部 地 區 無 乳 鏈 球 菌 的 抗 藥 型 態 研 究, 其 將 分 離 出 來 的 178 株 無 乳 鏈 球 菌 以 penicillin methicillin bacitracin cephalothin cephaloridine nalidixic acid polymyxin B kanamycin streptomycin neomycin tetracycline gentamicin amikacin novobiocin ampicillin clindamycin chloramphenicol oxicillin erythromycin 及 vancomycin 共 20 種 藥 物 檢 測 其 抗 藥 性, 結 果 顯 示 無 乳 鏈 球 菌 的 抗 藥 性 比 例 最 高 為 nalidixic acid (100%), 其 次 為 polymyxin B (74.72%) kanamycin (70.2%) streptomycin (70.22%) neomycin (39.89%) tetracycline (34.83%) gentamicin (29.21%) amikacin (23.6%) 及 novobiocin (14.61%), 而 其 餘 的 抗 生 素 藥 物 在 此 篇 研 究 裡 少 有 抗 藥 性 或 無 抗 藥 性 由 趙 (1994) 對 於 分 離 出 的 76 株 乳 房 鏈 球 菌 以 17 種 抗 生 素 藥 物 檢 測 其 抗 藥 性 的 表 現, 藥 物 包 含 streptomycin colistin tetracycline penicillin methicillin bacitracin cephalothin polymyxin B kanamycin neomycin gentamicin novobiocin ampicillin clindamycin chloramphenicol erythromycin 及 vancomycin 結 果 顯 示 乳 房 鏈 球 菌 的 抗 藥 性 程 度 最 高 的 藥 物 依 序 為 14
streptomycin (97.3%) colistin (88.0%) tetracycline (78.7%) neomycin (66.7%) clindamycin (58.7%) kanamycin (49.3%) erythromycin (45.3%) polymyxin B (36.0%) 及 gentamicin (25.3%), 而 其 他 藥 物 的 抗 藥 性 比 例 低 或 無 抗 藥 性 根 據 程 (1993) 及 趙 (1994) 對 於 鏈 球 菌 在 台 灣 乳 牛 場 的 抗 藥 性 研 究 結 果, 可 與 本 次 實 驗 之 鏈 球 菌 抗 藥 性 程 度 的 表 現 來 相 互 比 較 三 其 他 國 家 之 鏈 球 菌 抗 藥 性 調 查 在 丹 麥,Rato 等 人 (2013) 在 2002 年 1 月 至 2003 年 5 月 於 11 個 牧 場 從 365 隻 次 臨 床 乳 房 炎 乳 牛 收 集 到 444 個 生 乳 樣 本 ; 培 養 後 分 離 出 60 株 具 有 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 的 B 族 無 乳 鏈 球 菌 18 株 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 的 C 族 異 乳 鏈 球 菌 及 30 株 不 溶 血 (γ-hemolysis) 的 乳 房 鏈 球 菌, 並 利 用 紙 碇 擴 散 法 (disk diffusion method) 來 對 這 些 菌 株 做 藥 物 敏 感 性 試 驗, 測 試 的 藥 物 有 penicillin cefazolin cefoperazone pirlimycin gentamicin streptomycin amoxicillin-clavulanic acid chloramphenicol erythromycin vancomycin tetracycline 及 rifaximin 其 抗 藥 性 結 果 以 streptomycin (97.2%) 及 gentamicin (80.6%) 為 最 高, 其 次 為 屬 tetracycline (64.8%) 作 者 認 為 其 結 果 鏈 球 菌 會 對 tetracycline 產 生 高 的 抗 藥 性 的 原 因 為 此 藥 物 已 長 時 間 的 被 廣 泛 使 用 於 治 療 牛 隻 疾 病 上, 所 以 造 成 細 菌 對 tetracycline 已 經 有 產 生 抗 藥 性 Nam 等 人 (2009) 於 韓 國 從 乳 牛 乳 汁 樣 本 分 離 出 的 鏈 球 菌 研 究 其 抗 藥 性 生 乳 汁 劃 於 血 液 瓊 脂 基, 經 35-37,18-24 小 時 培 養 後, 利 用 VITEK 系 統 來 鑑 定 菌 種, 抗 藥 性 的 檢 測 方 式 為 利 用 抗 生 素 紙 碇 擴 散 法 (disk diffusion method) 一 共 蒐 集 178 株 鏈 球 菌, 其 菌 種 分 布 為 有 99 株 的 Streptococcus uberis,30 株 的 Streptococcus bovis,24 株 的 Streptococcus oralis,13 株 的 Streptococcus salivarius, 7 株 的 Strepto coccus intermedius 及 5 株 的 Streptococcus agalactiae, 對 其 檢 測 7 種 藥 物 為 gentamicin lincomycin oxacillin penicillin cephalothin erythromycin 及 tetracycline 檢 測 的 178 株 鏈 球 菌 對 於 tetracycline(61.2%) 呈 現 最 高 的 抗 藥 性 結 果, 其 次 為 lincomycin(43.2%) 和 gentamicin(35.3%) 而 鏈 球 菌 對 於 penicillin 及 cephalothin 為 最 具 有 藥 物 的 敏 感 性 作 者 認 為 鏈 球 會 對 tetracycline 產 生 相 較 於 其 他 藥 物 較 高 的 抗 藥 性 原 因 和 韓 國 在 動 物 上 的 用 藥 習 慣 有 關, 作 者 提 到 tetracycline 在 韓 國 佔 50% 以 上 的 動 物 用 藥 (Nam et al., 2009) 15
Petrovski 等 人 (2011) 於 2003 年 到 2006 年 為 期 40 個 月 對 從 乳 牛 生 乳 樣 本 培 養 出 的 細 菌 調 查 其 抗 生 素 敏 感 性 的 研 究 利 用 實 驗 室 常 規 的 檢 測 來 鑑 定 細 菌, 根 據 培 養 後 細 菌 菌 落 的 外 觀 型 態 革 蘭 氏 染 色 觸 酶 的 測 試 凝 固 酶 測 試 CAMP 測 試 及 發 酵 反 應 將 細 菌 做 區 分, 菌 種 包 含 鏈 球 菌 屬 腸 球 菌 屬 金 黃 色 葡 萄 球 菌 凝 固 酶 陰 性 的 葡 萄 球 菌 及 大 腸 桿 菌 而 於 分 離 出 的 鏈 球 菌 菌 種 中, 以 屬 於 環 境 性 菌 的 乳 房 鏈 球 菌 所 佔 的 比 例 為 最 高 以 11 種 抗 生 素 藥 物 對 細 菌 做 檢 測, 藥 物 種 類 為 amoxicillin-clavulanic acid ampicillin oxacillin penicillin trimethoprim/sulphonamide cephalothin erythromycin neomycin streptomycin tetracycline 及 lincomycin 其 鏈 球 菌 藥 物 敏 感 性 結 果 顯 示 乳 房 鏈 球 菌 對 於 neomycin 及 streptomycin 的 藥 物 敏 感 度 最 低, 於 所 有 鏈 球 菌 種 中 對 於 amoxicillin-clavulanic acid 及 cephalothin 具 有 良 好 的 藥 物 感 受 性 然 而 乳 房 鏈 球 菌 對 於 相 同 屬 於 乙 內 醯 胺 類 藥 物 的 penicillin 及 oxacillin 呈 現 出 不 相 同 的 藥 物 敏 感 性 然 而 在 先 前 的 文 獻 中 報 導 由 人 類 分 離 出 的 鏈 球 菌 菌 株 也 具 有 與 Petrovski 等 人 (2011) 研 究 相 似 的 對 penicillin 及 oxacillin 具 有 不 同 的 敏 感 度 結 果, 作 者 認 為 這 可 能 是 與 細 菌 本 身 的 青 黴 素 結 合 蛋 白 不 同 有 關 (Petrovski et al., 2011) 在 法 國,Guérin-Faublée 等 人 (2002) 從 乳 房 炎 的 生 乳 中 分 離 出 50 株 的 乳 房 鏈 球 菌,42 株 的 異 乳 鏈 球 菌 及 8 株 的 無 乳 鏈 球 菌, 並 利 用 penicillin G amoxycillin cloxacillin cephalexin cefazolin cephapirin cefquinome erythromycin lincomycin minocycline rifaximin tetracycline streptomycin kanamycin gentamicin trimethoprim, chloramphenicol 和 rifampicin 的 藥 物 來 做 敏 感 性 測 試 結 果 鏈 球 菌 對 四 環 素 類 藥 呈 現 出 最 高 的 抗 藥 性 程 度, 抗 藥 性 次 高 的 為 巨 環 類 藥 及 林 可 醯 胺 類 藥 物 作 者 認 為 鏈 球 菌 會 對 某 些 藥 物 呈 現 出 高 的 抗 藥 性 表 現 其 原 因 為 廣 泛 及 長 時 間 使 用 某 類 抗 生 素 來 導 致 細 菌 出 現 抗 藥 性 的 結 果 (Guérin-Faublée et al., 2002) 16
第 三 章 材 料 與 方 法 第 一 節 鏈 球 菌 株 來 源 本 實 驗 所 使 用 之 鏈 球 菌 株 為 自 2012 年 8 月 至 2013 年 8 月 間 蒐 集 於 台 灣 各 地 區 乳 牛 牧 場 之 生 乳 樣 本 並 進 行 培 養 分 離, 共 計 有 157 株 經 鑑 定 為 鏈 球 菌 及 進 行 各 項 試 驗 一 乳 汁 採 樣 及 培 養 乳 汁 樣 本 蒐 集 於 2012 年 8 月 至 2013 年 8 月 間, 採 樣 及 培 養 過 程 參 照 美 國 國 家 乳 房 炎 評 議 會 (National Mastitis Council, NMC) 之 無 菌 操 作 程 序 (NHC, 1999) 乳 汁 採 樣 前, 使 用 清 水 沖 洗 牛 隻 乳 頭 後, 使 用 乾 淨 之 毛 巾 或 紙 巾 將 殘 留 在 乳 頭 上 的 水 滴 徹 底 擦 乾, 並 依 各 牧 場 習 慣 進 行 前 藥 浴 的 消 毒 使 用 含 有 70 % 乙 醇 棉 花 徹 底 將 牛 隻 乳 頭 開 口 擦 拭 消 毒, 消 毒 順 序 由 離 採 樣 人 員 最 遠 的 乳 頭 開 始 至 離 採 樣 人 員 最 近 的 乳 頭, 進 行 乳 汁 採 樣 時 則 由 離 採 樣 人 員 最 近 的 乳 頭 至 遠 乳 汁 收 集 時 須 先 榨 去 各 分 房 之 乳 頭 前 端 的 生 乳 二 至 三 次 後, 再 以 15 ml 無 菌 離 心 管 收 集 乳 汁 樣 本 採 集 時, 無 菌 離 心 管 應 與 地 面 呈 45 度, 並 且 離 心 管 之 開 口 不 能 觸 碰 到 雙 手 及 乳 頭 開 口, 採 樣 過 程 必 需 是 維 持 無 污 染 採 集 的 乳 汁 樣 本 可 分 為 分 房 乳 (quarter milk) 和 混 合 乳 (composed milk), 分 房 乳 為 採 集 各 個 獨 立 分 房 至 少 3 ml 之 乳 汁 樣 本 於 無 菌 的 15 ml 離 心 管, 混 合 乳 為 採 集 每 個 分 房 乳 汁 樣 本 2-3mL 於 同 一 管 無 菌 的 15mL 離 心 管, 每 管 試 管 均 分 別 標 記 記 號 採 樣 完 成 後 將 試 管 放 置 於 含 有 冰 塊 的 攜 帶 式 冰 箱 暫 時 保 存 並 帶 回 實 驗 室 進 行 微 生 物 培 養 二 微 生 物 培 養 乳 汁 樣 本 試 管 外 表 經 70% 乙 醇 噴 霧 消 毒 後 置 於 無 菌 操 作 檯 內, 並 將 試 管 上 下 輕 微 搖 晃 數 次 使 乳 汁 混 合 均 勻 後, 每 一 管 樣 本 以 接 種 環 沾 取 約 5-10 μl 乳 汁 接 種 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 (Blood agar plate, Creative Microbioloicals, Taiwan) 上, 於 37 好 氧 培 養 18-24 小 時 後 判 讀 17
第 二 節 菌 種 培 養 與 鑑 定 一 鏈 球 菌 之 分 離 與 判 定 所 採 集 之 生 乳 樣 本 直 接 接 種 於 血 液 瓊 脂 培 養 基, 以 37 好 氧 培 養 18-24 小 時 後, 觀 察 生 長 之 細 菌 菌 落 型 態, 若 為 圓 型, 表 面 光 滑, 顏 色 不 透 明, 菌 落 大 小 約 為 0.5-1 mm, 及 伴 隨 著 具 有 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 或 不 溶 血 (γ-hemolysis) 的 特 性 ; 經 革 蘭 氏 染 色 法 檢 驗 結 果 若 為 陽 性 球 菌, 則 以 接 種 環 刮 取 單 一 個 菌 落 接 種 於 Edwards agar plate (Oxoid TM Modified Edwards Medium with 5% bovine washed erythrocyte), 於 37 好 氧 培 養 24 小 時 若 可 於 Edwards agar plate 上 生 長 出 之 細 菌 並 且 菌 落 外 有 黑 色 色 素 產 生 則 初 步 判 定 為 鏈 球 菌, 之 後 挑 出 獨 立 菌 落 保 存 並 待 進 一 步 鑑 定 二 CAMP (Christie-Atkins-Munch-Petersen) 試 驗 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae) 會 與 只 具 有 β 溶 血 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 產 生 共 同 溶 血 反 應 (cohemolytic reaction), 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 產 生 類 似 半 月 型 或 三 角 型 的 完 全 溶 血 區, 而 只 有 無 乳 鏈 球 菌 是 唯 一 可 以 利 用 實 驗 室 常 規 的 好 氣 檢 驗 方 法 CAMP 來 確 定 (Guélat-Brechbuehl et al., 2010) 將 經 Edward agar plate 篩 選 後 且 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 具 有 完 全 溶 血 圈 之 鏈 球 菌 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (BCRC 12654) 共 同 培 養, 過 操 作 方 法 下 如 下 : ( 一 ) 先 以 接 種 環 沾 取 只 具 有 β 溶 血 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (BCRC 12654) 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 中 央 劃 一 直 線 ( 二 ) 將 懷 疑 是 無 乳 鏈 球 菌 的 菌 株 以 接 種 環 沾 取 其 菌 落 並 劃 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 直 線 成 垂 直, 兩 線 之 間 需 有 3mm 的 距 離 ( 三 ) 以 37 培 養 18-24 小 時 後 判 讀 三 API 20 Strept 生 化 鑑 定 經 Edwards agar plate 篩 選 之 鏈 球 菌 菌 株 繼 代 培 養 在 血 液 瓊 脂 培 養 基,37 好 氧 培 養 24 小 時 後, 以 接 種 環 刮 取 單 一 個 獨 立 菌 落 接 種 在 哥 倫 比 亞 血 液 瓊 脂 培 養 基 (Columbia CAN agar with 5% sheep blood, Creative Microbioloicals, 18
Taiwan) 上,37 厭 氧 培 養 24 小 時 後, 再 以 API 20 Strept 生 化 鑑 定 套 組 (biomérieux, Marcy-l Etoile, France) 進 行 細 菌 鑑 定 其 操 作 步 驟 如 下 : ( 一 ) 以 接 種 環 挑 取 哥 倫 比 亞 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 的 菌 落 至 3mL 已 滅 菌 的 蒸 餾 水 中 混 合 均 勻, 並 以 比 色 計 調 整 細 菌 混 合 液 濃 度 至 大 於 等 於 4 McFarland ( 二 ) 以 微 量 吸 管 將 細 菌 混 合 液 依 序 加 入 至 試 驗 條 上 的 小 孔 內 ( 三 ) 於 試 驗 條 上 的 試 驗 小 孔 VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP 及 ADH 加 入 約 100 μl 的 細 菌 混 合 液 ( 四 ) 取 500 μl 的 細 菌 混 合 液 加 入 API GP Medium 中 混 合 均 勻, 再 以 微 量 吸 管 將 混 有 菌 液 的 GP Medium 之 混 合 液 加 滿 至 試 驗 小 孔 RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD 及 GLYG ( 五 ) 加 完 菌 液 的 試 驗 小 孔 ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD 及 GLYG 需 以 無 菌 礦 物 油 填 滿 以 維 持 厭 氧 的 狀 態, 恆 溫 37 好 氧 培 養 4 個 小 時 ( 六 ) 培 養 4 小 時 後, 試 驗 小 孔 VP 加 入 試 劑 VP1 及 VP2 各 一 滴 試 驗 小 孔 HIP 加 入 試 劑 NIN 兩 滴 試 驗 小 孔 PYRA αgal βgur β GAL PAL 及 LAP 加 入 試 劑 ZYM A 及 ZYM B 各 一 滴, 靜 待 十 分 鐘 後 判 讀 其 餘 項 目 需 立 即 判 讀 試 驗 小 孔 內 所 含 的 物 質 及 判 讀 結 果 如 附 錄 6 及 附 錄 7 ( 七 ) 判 讀 完 畢 記 錄 後 再 將 試 驗 條 以 恆 溫 37 好 氧 培 養 18-20 小 時 ( 八 ) 培 養 完 成 後 將 判 讀 結 果 輸 入 apiwebtm (biomérieux, Marcy-l Etoile, France), 即 可 得 知 試 驗 之 菌 種 及 鑑 定 率 四 乳 膠 凝 集 試 驗 (Latex agglutination test) Lancefield 認 為 不 同 鏈 球 菌 種 其 細 胞 壁 所 含 的 胜 肽 多 醣 (Peptidoglycan) 也 不 相 同, 可 以 依 照 其 所 含 抗 原 特 性 將 鏈 球 菌 分 為 A 至 T 族 群 此 試 驗 為 使 用 Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, United Kingdom) 鑑 定 鏈 球 菌 細 胞 壁 所 含 特 異 性 多 醣 類 抗 原 A B C D F 和 G 之 乳 膠 凝 集 試 驗, 其 操 作 步 驟 如 下 : ( 一 ) 血 清 型 A B C D F 和 G 乳 膠 試 劑 在 使 用 前 需 先 置 室 溫 回 溫, 並 確 實 將 乳 膠 懸 浮 液 搖 晃 混 合 均 勻 ( 二 ) 將 萃 取 酵 素 依 據 包 裝 標 示, 加 入 無 菌 去 離 子 水 回 溶 Oxoid 19
Streptococcus extraction enzyme (DR0593), 取 大 約 0.4 ml 酵 素 試 劑 於 每 個 試 驗 反 應 玻 璃 管 ( 三 ) 於 培 養 基 上 挑 選 2-3 個 菌 落 數 至 反 應 玻 璃 管 中 與 酵 素 乳 化 後, 置 於 水 浴 槽 37 培 養 10 分 鐘 ( 培 養 5 分 鐘 時 將 試 管 拿 起 來 搖 晃 混 合 2-3 秒, 再 繼 續 培 養 ) 培 養 後, 降 溫 至 室 溫 此 萃 取 液 可 以 檢 測 備 用 ( 四 ) 取 一 滴 乳 膠 試 劑 置 於 試 驗 卡 的 反 應 圈 上 ( 五 ) 取 一 滴 細 菌 之 萃 取 液 滴 於 反 應 圈 上 ( 六 ) 利 用 塑 膠 棒 將 乳 膠 試 劑 與 細 菌 萃 取 液 混 合 並 均 勻 擴 散 到 整 個 反 應 圈, 並 輕 輕 的 旋 轉 反 應 卡,30 秒 內 會 開 始 凝 集, 判 讀 勿 超 過 1 分 鐘 ( 八 ) 當 凝 集 發 生, 則 將 結 果 判 定 為 陽 性 ; 若 無 凝 集 發 生, 結 果 則 判 定 為 陰 性 微 弱 凝 集, 則 將 結 果 視 為 陰 性 五 菌 種 保 存 挑 選 於 哥 倫 比 亞 血 液 瓊 脂 培 養 基 上,37 厭 氧 培 養 24 小 時 之 獨 立 菌 落 經 API 20 Strept 鑑 定 為 鏈 球 菌 者, 接 種 於 含 有 1 ml Tryptic Soy Broth (TSB, Difco Laboratories, Sparks, Maryland, USA) 冷 凍 小 管 中,37 好 氧 培 養 24 小 時 後, 使 用 微 量 吸 管 注 入 200 μl 之 無 菌 甘 油 (glycerol), 使 得 於 Tryptic Soy Broth 好 氧 培 養 24 小 時 後 之 細 菌 與 甘 油 充 分 混 合 均 勻, 保 存 於 -70 冰 箱 20
第 三 節 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 所 選 用 的 抗 生 素 藥 物 為 Ampicillin (AMP-10) Amoxicillin (AML-25) Penicillin (P-10) Cefazolin (KZ-30) Cefuroxime (CXM-30) Ceftiofur (EFT-30) Cloxacillin (OB-5) Bacitracin (B-10) Neomycin (N-30) Oxytetracycline (OT-30) Tetracycline (TE-30) Amikacin (AK-30) Chloramphenicol (C-30) Lincomycin (MY-15) Streptomycin (S-10) Kanamycin (K-30) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) 等 16 種 藥 物 進 行 測 試 實 驗 方 法 參 照 美 國 國 家 臨 床 實 驗 室 標 準 委 員 會 (Clinical and Laboratroy Standard Institute, CLSI) 之 紙 碇 擴 散 法 (Disk diffusion method) (CLSI, 2008) 以 接 種 環 挑 選 血 液 瓊 脂 培 養 基 經 37 好 氧 培 養 之 鏈 球 菌 落 至 滅 菌 的 蒸 餾 水 中, 混 合 均 勻 之 菌 液 濃 度 需 調 整 至 0.5 McFarland 以 spectrophotometer (Biochrom, C08000) 調 整 菌 液 濃 度 至 與 0.5 McFarland ( 約 莫 1.5 10 8 CFU/mL) 相 同 濁 度 之 0.13 吸 光 值, 以 滅 菌 棉 棒 沾 取 菌 液, 將 吸 滿 菌 液 的 棉 棒 以 三 個 方 向 (120 度 ) 平 均 塗 勻 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上, 將 抗 生 素 藥 片 放 置 器 (Disk dispenser, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) 放 入 欲 測 試 的 抗 生 素 藥 片 並 貼 於 均 勻 塗 滿 菌 液 的 血 液 瓊 脂 培 養 基 上,37 好 氧 培 養 16-18 小 時, 依 據 CLSI 之 抑 菌 圈 說 明 表 ( 附 錄 8) 來 判 定 是 否 具 有 抗 藥 性 (R, resistant) 中 間 性 (I, intermediate) 或 為 敏 感 性 (S, susceptible) 第 四 節 統 計 分 析 本 實 驗 結 果 使 用 Chi-square test 進 行 統 計 學 分 析, 實 驗 數 據 以 SPSS (16.0 版 ) 統 計 軟 體 處 理 分 析, 分 析 分 離 來 自 乳 汁 樣 本 之 鏈 球 菌 對 於 各 類 抗 生 素 之 敏 感 性 及 抗 藥 性 的 相 關 性, 統 計 結 果 以 費 雪 檢 定 (Fisher s exact test) 來 檢 測 是 否 具 有 顯 著 的 差 異, 當 P 值 小 於 0.05 時 判 定 具 有 顯 著 差 異 21
第 四 章 結 果 第 一 節 鏈 球 菌 分 離 結 果 一 乳 汁 培 養 結 果 本 實 驗 於 2012 年 8 月 至 2013 年 8 月 間 自 台 灣 各 地 區 共 計 30 個 乳 牛 牧 場 共 採 集 2971 個 乳 汁 樣 本, 進 行 一 般 微 生 物 培 養 及 鏈 球 菌 菌 株 挑 選, 初 步 挑 選 353 個 疑 似 鏈 球 菌 株, 之 後 以 Edwards agar plate 進 行 細 菌 篩 選 分 離, 初 步 結 果 共 分 離 185 株 菌 進 行 生 化 鑑 定 二 菌 種 鑑 定 之 結 果 本 實 驗 利 用 API 20 Strept 生 化 鑑 定 套 組 鑑 定 結 果, 除 了 27 株 為 Aerococcus spp. Enterococcus spp. 及 Lactococcus lactis spp. 外, 共 鑑 定 鏈 球 菌 157 株, 其 中 包 括 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 116 株 (73.9%), 牛 鏈 球 菌 (Streptococcus bovis) 16 株 (10.2%), 異 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus dysgalactiae) 16 株 (10.2%), 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae) 有 6 株 (3.8%), 馬 鏈 球 菌 (Streptococcus equines) 2 株 (1.3%) 及 1 株 (0.6%) 緩 症 鏈 球 菌 (Streptococcus mistis)(fig. 4), 鑑 定 結 果 以 乳 房 鏈 球 所 佔 的 比 例 73.9% 最 高 S. dysgalactiae n=16 S. agalactiae n=6 S. equinus n=2 S. mitis n=1 S. bovis n=16 S. uberis n=116 Fig. 1 Identification and prevalence of 157 Streptococcus spp. isolated from bovine milk samples. 22
三 鏈 球 菌 之 乳 膠 凝 集 試 驗 結 果 以 Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit 檢 測 由 API 20 Strept 生 化 鑑 定 套 組 鑑 定 為 鏈 球 菌 之 157 株 菌 的 細 胞 壁 特 異 性 多 醣 類 之 抗 原 特 性 分 族, 其 結 果 ;A 族 鏈 球 菌 0 株,B 族 鏈 球 菌 6 株,C 族 鏈 球 菌 16 株,D 族 鏈 菌 15 株, F 族 鏈 球 菌 0 株,G 族 鏈 球 菌 1 株 以 及 無 凝 集 反 應 為 119 株 與 API 20 Strept 鑑 定 菌 種 的 結 果 相 互 比 較, 其 鏈 球 菌 特 異 性 醣 類 抗 原 抗 體 凝 集 反 應 試 驗 結 果 未 有 A 族 鏈 球 菌 而 API 20 Strept 未 鑑 定 出 相 關 之 菌 種 B 族 鏈 球 菌 共 有 6 株 菌 具 有 凝 集 反 應 為 API 20 Strept 鑑 定 出 菌 種 全 為 S. agalactiae C 族 鏈 球 菌 有 16 株,API 20 Strept 鑑 定 出 菌 種 全 為 S. dysgalactiae 於 D 族 的 抗 原 抗 體 呈 現 凝 集 反 應 共 有 15 株 鏈 球 菌, 包 含 2 株 API 20 Strept 鑑 定 為 S. equines 及 13 株 的 S. bovis F 族 未 有 鏈 球 菌 有 抗 原 抗 體 凝 集 反 應, 其 API 20 Strept 未 鑑 定 出 相 關 菌 種 G 族 鏈 球 菌 有 1 株 菌 具 有 凝 集 反 應, 其 此 菌 在 API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 S. bovis 而 抗 原 抗 體 無 凝 集 反 應 共 有 119 株 菌,API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 S. uberis 共 有 116 株 2 株 的 S. bovis 和 1 株 的 S. mitis, 在 血 清 抗 原 抗 體 反 應 中 皆 無 凝 集 實 驗 檢 測 圖 列 於 Fig. 2, 與 API 20 Strept 鑑 定 結 果 相 互 比 較 列 於 Table 1 四 鏈 球 菌 溶 血 型 型 態 本 實 驗 之 鏈 球 菌 於 培 養 過 程 中 觀 察 到 三 種 不 同 的 溶 血 型 態, 分 別 為 ; 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 及 不 溶 血 (γ-hemolysis) 的 特 性 將 蒐 集 到 的 菌 株 分 別 培 養 在 血 液 瓊 脂 培 養 基, 恆 溫 37 24 小 時 培 養 後 拍 攝 圖 A 為 編 號 16 經 由 API 20 Strept 鑑 定 為 異 乳 鏈 球 菌,24 小 時 37 培 養 後, 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 周 圍 具 有 綠 色 的 不 完 全 溶 血 圈 圖 B 為 編 號 162 經 由 API 20 Strept 鑑 定 後 為 無 乳 鏈 球 菌,24 小 時 37 培 養 後, 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 周 圍 具 有 乾 淨 的 完 全 溶 血 圈 圖 C 為 編 號 20 經 API 20 Strept 鑑 定 後 為 乳 房 鏈 球 菌,24 小 時 37 培 養 後, 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 周 圍 無 溶 血 圈 Fig. 3 之 圖 A B 及 C 為 生 長 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 鏈 球 菌 菌 落 之 溶 血 型 態 五 CAMP 試 驗 結 果 6 株 ( 菌 株 號 碼 為 154 155 159 162 163 及 166) 具 有 完 全 溶 血 鏈 球 菌 於 API 20 Strept 鑑 定 為 無 乳 鏈 球 菌 之 CAMP 試 驗 結 果 皆 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 23
(Staphylococcus aureus,bcrc 12654) 產 生 共 同 溶 血 反 應 (cohemolytic reaction), CAMP 試 驗 結 果 圖 列 於 Fig. 4 之 圖 A 及 圖 B API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 牛 鏈 球 菌 ( 菌 株 編 號 1), 異 乳 鏈 球 菌 ( 菌 株 編 號 6), 馬 鏈 球 菌 ( 菌 株 編 號 12) 及 乳 房 鏈 球 菌 ( 菌 株 編 號 20) 之 CAMP 試 驗 結 果 皆 不 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus,bcrc 12654) 產 生 共 同 溶 血 反 應 詳 見 Fig. 4 之 圖 C 24
Table 1. Result of API 20 Strept and Oxoid dryspot streptococcal grouping kit to detect streptococcal species and group. Number of streptococcal strains API 20 Strept Streptococcal grouping kit A * B C D F G NA S. uberis 0 0 0 0 0 0 116 S. bovis 0 0 0 13 0 1 2 S. dysgalactiae 0 0 16 0 0 0 0 S. agalactiae 0 6 0 0 0 0 0 S. equinus 0 0 0 2 0 0 0 S. mitis 0 0 0 0 0 0 1 Total 0 6 16 15 0 1 119 * : A, Group A streptococci; B, Group B streptococci; C, Group C streptococci; D, Group D streptococci; F, Group F streptococci; G, Group G streptococci; NA, no agglutination. 25
A. B. * * C. D. * * E. F. * Fig. 2 Result of Oxoid dryspot streptococcal grouping kit to detect streptococcal group. (A. and B. are both S. dysgalactiae, group c is positive with agglutination. C. and D. are both S. agalactiae, group B is positive with agglutination. E. is S. bovis, group D is positive with agglutination. F is S. uberis, no group agglutinated in this reaction.) 26
A. B. C. Fig. 3 The morphology (A, B, and C) of streptococcal hemolysis types (A is α-hemolysis, B is β-hemolysis and C is γ-hemolysis), after 24 hours incubation at 37, the strain of A is S. dysgalactiae, B is S. agalactiae, and C is S. uberis. 27
A. B. Staphylococcus aureus BCRC 12654 Staphylococcus aureus BCRC 12654 NO. 163 S. agalactiae NO. 159 S. agalactiae NO. 162 S. agalactiae NO. 154 S. agalactiae NO. 166 S. agalactiae NO. 155 S. agalactiae C. Staphylococcus aureus BCRC 12654 NO. 20 S. uberis NO. 12 S. equinus NO. 162 S. agalactiae NO. 1 S. bovis NO. 6 S. dysgalactiae Fig. 4 Result of CAMP test (A, B, and C) of Streptococcus spp. and Staphylococcus aureus BCRC 12654 on blood agar plates after 24 hours incubation at 37. 28
第 二 節 鏈 球 菌 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 檢 測 結 果 一 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 本 實 驗 所 分 離 及 鑑 定 後 的 鏈 球 菌 菌 株 (n=157) 之 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 ( 如 Fig. 5), 其 結 果 列 於 Table 2 及 Fig. 6 中, 抗 藥 性 比 例 最 高 者 為 amikacin (98.7%, 155/157) kanamycin (98.7%,155/157) streptomycin (98.7%,155/157) neomycin (98.0%,157/154),oxytetracycline (85.4%,134/157) tetracycline (85.4%,134/157) 及 lincomycin (75.8%,119/157); 而 抗 藥 性 出 現 率 最 低 的 抗 生 素 有 amoxicillin (0.7%,1/157) cefuroxime (0.7%,1/157) cefazolin (1.9%,3/157) ceftiofur (1.9%,3/157) chloramphenicol (2.5%,4/157) bacitracin (3.2%,5/157) 及 cloxacillin (4.5%,7/157), 其 次 為 penicillin (17.2%,27/157) 和 ampicillin (22.9%,36/157) 實 驗 使 用 16 種 抗 生 素 來 對 從 乳 汁 樣 本 分 離 出 的 鏈 球 菌 做 藥 物 敏 感 性 試 驗, 將 16 種 抗 生 素 依 照 種 類 區 分 為 7 大 類 青 黴 素 類 (penicillins) 的 penicillin amoxicillin ampicillin 及 cloxacillin, 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 的 cefazolin cefuroxime 及 ceftiofur, 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 的 amikacin kanamycin neomycin 及 streptomycin, 四 環 素 類 (tetracyclines) 的 oxytetracycline 和 tetracycline, 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 的 lincomycin, 多 肽 類 (polypeptides) 的 bacitracin 和 屬 氯 黴 素 類 (chloramphenicols) 的 chloramphenicol 將 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 與 API 20 Strept 鑑 定 鏈 球 菌 菌 種 結 果 做 關 聯 性 比 較, 鏈 球 菌 各 不 同 菌 種 之 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 詳 見 於 Table 3 157 株 鏈 球 菌 於 API 20 Strept 鑑 定 結 果, 除 了 2 株 的 S. agalactiae 外, 其 155 株 鏈 球 菌 皆 呈 現 對 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 amikacin kanamycin streptomycin 及 neomycin 具 有 抗 藥 性, 其 抗 藥 性 的 比 例 為 最 高 (S. uberis:100% (116/116),S. bovis:100% (16/16),S. dysgalactiae:100% (16/16),S. agalactiae;66.6% (4/6) 及 2 株 S. equinus 和 1 株 S. mitis : 100% (3/3)), 抗 藥 性 次 高 為 四 環 素 類 (tetracyclines) 藥 物 的 oxytetracycline 和 tetracycline ; 再 之 為 屬 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 藥 物 的 lincomycin S. uberis 對 於 青 黴 素 類 (penicillins) 藥 物 的 penicillin (22.4%,26/116) 及 Ampicillin (29.3%,34/116) 抗 藥 性 表 現 相 對 於 其 他 青 黴 素 類 (penicillins) 藥 物 的 amoxicillin (0.9%,1/116) 和 cloxacillin (5.2%,6/116) 的 抗 藥 性 呈 現 較 高, 而 S. uberis 對 於 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 藥 物 cefazolin (2.6%, 3/116) 29
cefuroxime (0.9%,1/116) 及 ceftiofur (2.6%,3/116) 及 bacitracin (3.4%,4/116) 抗 生 素 呈 現 較 低 的 抗 藥 性 比 例, 具 有 較 好 的 感 受 性 鏈 球 菌 之 S. bovis S. dysgalactiae S. agalactiae S. equinus 及 S. mitis 皆 對 於 青 黴 素 類 (penicillins) 藥 物 和 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 藥 物 呈 現 良 好 的 的 感 受 性 二 抗 藥 性 之 分 型 157 株 鏈 球 菌 中, 依 照 鏈 球 菌 對 本 研 究 所 測 試 的 16 種 抗 生 素 藥 物 之 抗 藥 性 可 分 為 30 種 抗 藥 型 態 ; 抗 藥 性 最 低 的 菌 株 對 所 檢 測 的 16 種 藥 物 之 2 種 抗 生 素 產 生 抗 藥 性 (1.3%,2/157); 其 次 依 序 為 4 種 (5.0%,8/157),5 種 (6.4%,10/157) 6 種 (16.6%,26/157) 7 種 (45.9%,72/157) 8 種 (10.2%,16/157),9 種 (8.9%, 14/157) 10 種 (4.4%,7/157) 及 11 種 (1.3%,2/157) 其 抗 藥 性 型 態 最 常 被 觀 察 為 對 7 種 抗 生 素 具 有 抗 藥 性, 又 以 對 amikacin kanamycin neomycin streptomycin oxytetracycline tetracycline 和 lincomycin 的 抗 藥 性 型 態 比 例 最 高 其 抗 藥 性 型 態 詳 列 於 Table 4 30
Inhibition zone No inhibition zone 1 2 3 Inhibition zone diameter 8 4 7 6 5 Fig. 5 Antimicrobial susceptibility test of streptococcal isolates from milk samples by using disk diffusion method with 24 hours incubation at 37. The results were evaluated with Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacterial isolated from animals; approved standards- third edition (CLSI, 2008) and information of commercial product (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK). Antimicrobial agents disk: no.1 disk is N30 (neomycin), no.2 disk is B10 (bacitracin), no.3 disk is OB5 (cloxacillin), no.4 disk is AMP (ampicillin), no.5 disk is KZ30 (cefazolin), no.6 disk is CXM30 (cefuroxime), no.7 disk is EFT30 (ceftiofur), no.8 disk is OT30 (oxytetracycline). 31
Table 2. Result of antimicrobial susceptibility test of streptococcal isolates from milk samples. Antimicrobial All isolates (n=157) agents S * % I % R % Amikacin (AK 30) 1.3 0 98.7 Amoxicillin (AML 25) 99.3 0 0.7 Ampicillin (AMP 10) 77.1 0 22.9 Bacitracin (B 10) 96.8 0 3.2 Cefazolin (KZ 30) 96.8 1.3 1.9 Cefuroxime (CXM 30) 96.8 2.5 0.7 Ceftiofur (EFT 30) 96.8 1.3 1.9 Cloxacillin (OB 5) 93.0 2.5 4.5 Chloramphenicol (C 30) 74.5 23.0 2.5 Kanamycin (K 30) 1.3 0 98.7 Lincomycin (MY 15) 13.4 10.8 75.8 Neomycin (N 30) 1.3 0.7 98.0 Oxytetracycline (OT 30) 2.5 12.1 85.4 Penicillin (P 10) 82.8 0 17.2 Streptomycin (S 10) 1.3 0 98.7 Tetracycline (TE 30) 2.5 12.1 85.4 * : S, susceptible; I, intermediate; R, resistant. 32
100 90 Antimicrobial resistance % 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Antimicrobial agents* Fig. 6 Proportion (%) of antimicrobial resistance in streptococci from bovine milk samples. * : AK30, amikacin; AML25, amoxicillin; AMP10, ampicillin; B10, bacitracin; KZ30, cefazolin; CXM30, cefuroxime; EFT30, ceftiofur; OB5, cloxacillin; C30, chloramphenicol; K30, kanamycin; MY15, lincomycin; N30, neomycin; OT30, oxytetracycline; P10, penicillin; S10, streptomycin; TE30, tetracycline. 33
Table 3. Result of antimicrobial susceptibility of different species of streptococcal isolates identified by API 20 Strept in this study. Antimicrobial S. uberis S. bovis S. dysgalactiae S. agalactiae Streptococcus spp. a agents S b % I % R % S % I % R % S % I % R % S % I % R % S % I % R % Amikacin (AK 30) 0 0 100 0 0 100 0 0 100 33.3 0 66.7 0 0 100 Amoxicillin (AML 25) 99.1 0 0.9 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Ampicillin (AMP 10) 70.7 0 29.3 87.5 0 12.5 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Bacitracin (B 10) 96.6 0 3.4 100 0 0 93.8 0 6.2 100 0 0 100 0 0 Cefazolin (KZ 30) 95.7 1.7 2.6 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Cefuroxime (CXM 30) 95.7 3.4 0.9 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Ceftiofur (EFT 30) 95.7 1.7 2.6 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Cloxacillin (OB 5) 91.4 3.4 5.2 100 0 0 93.8 0 6.2 100 0 0 100 0 0 Chloramphenicol (C 30) 69.8 27.6 2.6 87.4 6.3 6.3 81.2 18.8 0 100 0 0 100 0 0 Kanamycin (K 30) 0 0 100 0 0 100 0 0 100 33.3 0 66.7 0 0 100 Lincomycin (MY 15) 6.0 8.6 85.4 31.2 25.0 43.8 12.5 12.5 75.0 100 0 0 33.3 33.3 33.3 Neomycin (N 30) 0 0.9 99.1 0 0 100 0 0 100 33.3 0 66.7 0 0 100 Oxytetracycline (OT 30) 2.6 11.2 86.2 0 0 100 0 0 100 0 0 100 33 0 67 Penicillin (P 10) 77.6 0 22.4 93.7 0 6.3 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Streptomycin (S 10) 0 0 100 0 0 100 0 0 100 33.3 0 66.7 0 0 100 Tetracycline (TE 30) 2.6 12.9 84.5 0 0 100 0 0 100 0 0 100 33.3 0 66.7 a : Streptococcus spp. = S. mitis + S. equines. b : S, susceptible; I, intermediate; R, resistant. 34