國 立立 臺 東 大 學 生 命 科 學 研 究 所 碩 士 論論 文 Department of Life Science National Taitung University Master Thesis 指 導 教 授 : 李李 俊 霖 博 士 Advisor: Chun-Lin Lee, Ph. D. 共 同 指 導 教 授 : 胡 焯 淳 博 士 Co-advisor: Cho-Chun, Hu Ph. D 以 毛 細 管 電 泳 偵 測 尿尿 液 中 核 苷 作 為 癌 症 生 物 標 記 之 研 究 Determination of urinary nucleosides as potential cancer biomarker using capillary electrophoresis 研 究 生 : 吳 佳 憲 撰 Student: Chia-Hsien Wu 中 華 民 國 一 百 零零 三 年年 一 月 January, 2014

謝 誌 感 謝 我 的 指 導 教 授 胡 焯 淳 老老 師 在 我 的 研 究 生 涯 中, 對 我 的 指 導 與 鼓 勵勵, 讓 我 可 以 順 利利 的 完 成 學 業, 尤 其 是 在 論論 文 撰 寫 時 給 我 許 多 寶 貴 的 意 見見, 並 適 時 的 引 導 我, 讓 我 可 以 順 利利 進 行行 研 究 感 謝 李李 俊 霖 老老 師 幫 忙, 並 感 謝 謝 明 穆 老老 師 及 邱 泰 嘉 老老 師 擔 任 我 的 口 考 委 員, 許 多 的 老老 師 幫 忙 讓 我 能 順 利利 畢 業 也 要 感 謝 實 驗 室 的 學 長 姊 及 學 弟 妹, 尤 其 是 靜 慧 學 姊 給 予 許 多 寶 貴 的 資 料料 及 意 見見, 讓 我 可 以 減 少 很 多 嘗 試 錯 誤 的 機 會 ; 感 謝 實 驗 室 的 專 題 生 : 玟 玲玲 均 孟 廷 翰 純 亦 馨 屏 等 人, 如 果 沒 有 你 們 在 實 驗 上 的 幫 忙, 我 的 研 究 就 無 法 順 利利 進 行行 了了 其 次 也 要 感 謝 白 明 忠 主 任 對 我 進 修 計 畫 的 支 持, 以 其 科 內 同 事 煥 霖 宜 宗 元 愷 的 大 力力 相 助, 在 這 兩兩 年年 期 間 幫 忙 分 擔 檢 查 室 的 工 作 最 後 要 感 謝 我 的 父 母 及 家 人 支 持 我 讀讀 研 究 所, 不不 斷 給 我 鼓 勵勵 與 加 油 打 氣 尤 其 是 我 的 太 太 幸 茹, 一 人 挑 起 家 庭 的 重 擔, 照 顧 秉 宸 和 秉 叡, 當 我 忙 碌碌 時 更更 是 小 心 翼 翼 的 不不 敢 吵 我 在 讀讀 研 究 所 的 過 程 中, 家 人 無 怨 無 悔 的 付 出, 一 直 是 我 最 大 的 後 盾 讓 我 無 後 顧 之 憂

以 毛 細 管 電 泳 偵 測 尿尿 液 中 核 苷 作 為 癌 症 生 物 標 記 之 研 究 作 者 : 吳 佳 憲 國 立立 臺 東 大 學 生 命 科 學 研 究 所 中 文 摘 要 本 研 究 以 毛 細 管 電 泳 搭 配 紫 外 可 見見 光 吸 收 偵 測 器 ( 簡 稱 CE-UV), 開 發 出 簡 易易 快 速 分 離離 六六 種 核 苷 標 準 品 ( 胞 苷 腺 苷 尿尿 苷 肌 苷 N2,N2- 雙 甲 基 鳥 苷 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 ) 與 肌 酸 酐 的 方 法, 並 可 成 功 檢 測 癌 症 病 人 尿尿 液 中 的 四 種 核 苷 ( 胞 苷 腺 苷 尿尿 苷 肌 苷 ) 本 研 究 探 討 緩 衝 溶 液 硼 酸 鹽 硼 酸 鹽 濃 度度 ph 值 羥 丙 基 -β- 環 糊 精精 (HP-β-CD) 濃 度度 及 樣 品 前 處 理理 添 加 硼 酸 鹽 對 分 離離 核 苷 的 影 響, 結 果 最 佳 分 離離 核 苷 的 條 件 為 15 mm 硼 酸 緩 衝 溶 液 (ph 9.4) 添 加 30 mm HP-β-CD, 並 於 前 處 理理 時 添 加 2 mm 硼 酸 鹽 溶 液 UV 偵 測 波 長 設 在 254 nm, 於 電 壓 16 kv 下, 進 行行 電 泳, 可 在 7 分 鐘 內 完 成 分 離離 本 方 法 最 低 偵 測 極 限 (LOD) 可 達 0.65 μm (N2,N2- 雙 甲 基 鳥 苷, 訊 號 / 雜 訊 比 =3) 此 外, 本 研 究 亦 利利 用 毛 細 管 區 帶 電 泳 分 離離 肌 酸 酐 此 兩兩 種 毛 細 管 電 泳 方 法 偵 測 核 苷 標 準 品 與 的 檢 量量 線 之 R 2 值 皆 大 於 0.99, 且 同 日 間 與 異異 日 間 波 峰 高 度度 的 RSD 值 皆 小 於 2.81%, 回 收 率率率 則 介 於 86 % 至 110% 之 間 利利 用 上 述 方 法 分 析 癌 症 患 者 的 尿尿 液, 結 果 發 現 癌 症 患 者 尿尿 液 中 的 平 均 核 苷 排 放 量量 高 於 健 康 對 照 組 受 試 者 本 方 法 有 潛 力力 可 應 用 於 癌 症 生 物 標 記 的 研 究 關 鍵 詞 : 毛 細 管 電 泳 法 腺 苷 胞 苷 尿尿 苷 肌 苷 癌 症 生 物 標 記 羥 丙 基 -β- 環 糊 精精 i

Determination of urinary nucleosides as potential cancer biomarker using capillary electrophoresis Chia-Hsien Wu Abstract We developed a simple method for rapid detection of six nucleosides standards (cytidine, adenosine, uridine, inosine, N2,N2-dimethylguanosine, 8-hydroxydeoxyguanine), and creatinine by using capillary electrophoresis with UV detection. The method can successfully detect four urinary nucleosides (cytidine, adenosine, uridine, inosine) in cancer patients. We evaluated factors affecting separation of nucleosides, including buffer borate concentration, ph, concentration of HP-β-CD, addition of borate solution during sample pretreatment. Resulting optimum conditions were 15 mm borate buffer (ph 9.4) with 30 mm HP-β-CD and addition of 2 mm borate solution during sample pretreatment. The UV detector was set to 254 nm. With 16 kv voltage, the analysis time was less than 7 min. The limits of detection was 0.65 μm (N2,N2-dimethylguanosine, S/N = 3 ). We also used capillary zone electrophoresis for analysis of urinary creatinine. R 2 of calibration curve for both CE methods were > 0.99. RSD of intraday and interday peak height variation was less than 2.81% and their recovery ranged between 86% and 110%. In real sample application, the results showed that average urinary adenosine, cytidine, uridine, inosine levels were higher in patients with malignancy than in healthy individuals. The methods may be useful in cancer biomarker screening study. Keywords:Capillary electrophoresis; Adenosine; Cytidine; Uridine; Inosine; HP-β-CD; Cancer biomarker ii

目 錄錄 中 文 摘 要... i Abstract... ii 目 錄錄... iii 圖 目 錄錄... v 表 目 錄錄... vi 第 一 章 前 言... 1 壹 癌 症 簡 介... 1 貳 核 苷 與 癌 症 的 關 聯聯 性... 3 一 核 苷 與 血 液 淋淋 巴 癌... 4 二 核 苷 與 肺 癌... 5 三 核 苷 與 乳 癌... 5 四 核 苷 與 肝 膽 腸 胃 道 癌 症... 6 參參 毛 細 管 電 泳 法 的 原 理理... 10 一 電 滲 流流... 10 二 電 泳 流流... 11 三 緩 衝 溶 液 的 種 類類... 11 四 緩 衝 溶 液 的 ph 值... 12 五 緩 衝 溶 液 的 濃 度度... 12 六六 分 離離 電 壓... 12 七 毛 細 管 的 內 徑 與 長 度度... 12 八 進 樣 的 方 式 與 時 間... 12 肆 以 毛 細 管 電 泳 法 分 析 尿尿 液 中 核 苷 的 現 況... 13 伍 環 糊 精精 之 簡 介... 15 陸陸 研 究 動 機... 19 iii

第 二 章 實 驗 材 料料 與 方 法... 20 壹 藥 品 與 溶 劑... 20 貳 儀 器 設 備... 20 參參 標 準 品 與 緩 衝 溶 液 配 置... 21 肆 真 實 樣 品 之 前 處 理理 及 配 製... 21 伍 毛 細 管 電 泳 實 驗 流流 程... 24 第 三 章 實 驗 結 果... 26 壹 分 析 核 苷 的 最 佳 化 條 件 探 討... 26 一 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 的 濃 度度 對 核 苷 分 離離 之 影 響... 26 二 HP-β-CD 的 濃 度度 對 核 苷 分 離離 之 影 響... 31 三 ph 值 對 核 苷 分 離離 之 影 響... 35 四 樣 品 前 處 理理 加 入 硼 酸 鹽 溶 液 對 核 苷 分 離離 之 影 響... 39 五 緩 衝 溶 液 加 入 十 二 烷 基 硫硫 酸 鈉 對 核 苷 分 離離 之 影 響... 44 六六 樣 品 保 存 溫 度度 對 核 苷 訊 號 之 影 響... 46 七 方 法 確 效... 48 貳 分 析 肌 酸 酐 最 佳 化 條 件 探 討... 52 一 ph 值 對 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 分 析 之 影 響... 53 二 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 的 濃 度度 對 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 分 析 之 影 響... 57 三 電 壓 對 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 分 析 之 影 響... 61 四 方 法 確 效... 65 參參 真 實 樣 品 的 應 用... 68 第 四 章 結 論論... 72 第 五 章 未 來來 展 望... 73 第 六六 章 參參 考 文 獻... 74 iv

圖 目 錄錄 圖 一 核 苷 與 核 苷 酸 結 構 示 意 圖... 9 圖 二 β 環 糊 精精 的 分 子 構 造 圖 [52]... 18 圖 三 毛 細 管 電 泳 分 析 作 業 示 意 圖... 25 圖 四 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 28 圖 五 緩 衝 溶 液 中 不不 同 HP-β-CD 濃 度度 分 析 核 苷 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 32 圖 六六 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 36 圖 七 樣 品 前 處 理理 加 入 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 溶 液 所 得 的 核 苷 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 40 圖 八 緩 衝 溶 液 添 加 HP-β-CD 或 十 二 烷 基 硫硫 酸 鈉, 分 析 核 苷 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 45 圖 九 不不 同 檢 體 保 存 溫 度度 與 尿尿 液 中 核 苷 訊 號 的 變 化... 47 圖 十 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 54 圖 十 一 不不 同 濃 度度 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 58 圖 十 二 不不 同 電 壓 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 62 圖 十 三 分 析 癌 症 病 患 與 無 病 對 照 受 試 者 尿尿 液 中 核 苷 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜... 71 v

表 目 錄錄 表 一 以 毛 細 管 電 泳 法 分 離離 尿尿 液 中 核 苷 的 研 究 及 其 分 析 條 件... 14 表 二 環 糊 精精 的 基 本 性 質 [52]... 17 表 三 八 種 分 析 物 的 結 構 式... 22 表 四 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 波 峰 高 度度... 29 表 五 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 分 析 物 解 析 度度... 30 表 六六 緩 衝 溶 液 中 不不 同 HP-β-CD 濃 度度 分 析 核 苷 所 得 的 波 峰 高 度度... 33 表 七 緩 衝 溶 液 中 不不 同 HP-β-CD 濃 度度 分 析 核 苷 所 得 的 分 析 物 解 析 度度... 34 表 八 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 波 峰 高 度度... 37 表 九 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 解 析 度度... 38 表 十 樣 品 前 處 理理 加 入 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 波 峰 高 度度... 41 表 十 一 樣 品 前 處 理理 加 入 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 解 析 度度... 42 表 十 二 分 離離 核 苷 的 最 佳 化 條 件... 43 表 十 三 檢 量量 線 的 線 性 範 圍, 精精 確 度度, 偵 測 極 限 與 定 量量 極 限... 49 表 十 四 準 確 度度 ( 回 收 率率率 )... 50 表 十 五 以 毛 細 管 電 泳 法 分 離離 尿尿 液 中 核 苷 的 研 究 及 其 分 析 條 件... 51 表 十 六六 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 波 峰 高 度度 與 遷 移 時 間... 55 表 十 七 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 遷 移 時 間... 56 表 十 八 不不 同 濃 度度 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 波 峰 高 度度... 59 表 十 九 不不 同 濃 度度 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 遷 移 時 間... 60 表 二 十 不不 同 電 壓 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 波 峰 高 度度... 63 表 二 十 一 不不 同 電 壓 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 遷 移 時 間... 64 表 二 十 二 分 離離 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 的 最 佳 化 條 件... 66 表 二 十 三 檢 量量 線 的 線 性 範 圍, 精精 密 度度, 偵 測 極 限, 定 量量 極 限... 67 表 二 十 三 癌 症 病 患 與 健 康 對 照 受 試 者 基 本 資 料料 與 尿尿 液 中 核 苷 / 肌 酸 酐 的 比 值... 70 vi

第 一 章 前 言 壹 癌 症 簡 介 癌 症 是 指 人 體 內 一 些 生 長 分 裂裂 不不 正 常 的 細 胞, 因 為 生 長 不不 受 正 常 調 控, 而 影 響 並 侵 犯 正 常 的 組 織 器 官, 造 成 器 官 功 能 喪 失 並 導 致 出 血 疼 痛 或 阻 塞塞 等 症 狀狀, 是 一 種 威 脅 人 體 生 命 與 健 康 病 症 根 據 衛 生 福福 利利 部 國 民 健 康 署 公 布 的 國 人 十 大 死 因, 癌 症 蟬 聯聯 十 大 死 因 之 首 已 經 連連 續 31 年年 據 統 計,101 年年 國 人 因 癌 症 死 亡 人 數數 為 43,665 人, 占 所 有 死 因 死 亡 人 數數 的 28.4% [1], 而 其 中, 排 名 前 三 名 的 肺 癌, 肝 癌 與 大 腸 直 腸 癌 就 占 了了 因 癌 症 死 亡 人 數數 一 半 以 上 目 前 已 知 的 癌 症 危 險 因 子, 包 括 與 遺 傳 因 素 環 境 因 素 ( 吸 菸, 吸 二 手 菸 [2], 廚 房 油 煙 [3] 與 空 氣 污 染, 紫 外 線 與 放 射 線 曝 露露 ) 個 人 不不 健 康 行行 為 ( 吸 煙, 喝 酒, 嚼 檳 榔, 應 酬 多, 缺 乏 運 動 ) 病 毒 感 染 (B 型 肝 炎 病 毒,C 型 肝 炎 病 毒 [4], 人 類類 乳 突 瘤 病 毒 [5] 等 ) 等 等, 而 其 有 一 部 分 是 屬 於 可 以 改 變 的 因 素, 例例 如 避 免 曝 露露 於 致 癌 的 環 境 因 素, 改 變 個 人 不不 健 康 行行 為 並 建 立立 良良 好 的 生 活 習 慣 另 一 部 分 則 可 以 透 過 定 期 篩 檢, 在 癌 症 的 初 期 或 癌 前 病 變 階 段 就 診 斷 出 來來, 而 進 一 步 接 受 治 癒 性 療療 法, 達 到 最 大 治 療療 效 益益 與 存 活 率率率 最 好 的 例例 子 就 是 推 廣 子 宮 頸 抹 片 篩 檢 (Pap smear) 成 功 降降 低 子 宮 頸 癌 發 生 率率率 [6] 其 他 例例 子 還 有 透 過 大 腸 鏡 切切 除 腺 性 息 肉, 降降 低 日 後 罹罹 患 大 腸 癌 的 風 險 [7];B 型 肝 炎 C 型 肝 炎 病 患 定 期 接 受 腹 部 超 音 波 檢 查 與 甲 型 胎 兒 蛋 白 檢 驗, 達 到 早 期 診 斷 肝 癌, 增 加 病 患 治 癒 率率率 [8,9]; 以 低 劑 量量 電 腦 斷 層 掃 描 篩 檢 肺 部 結 節, 達 到 早 期 診 斷 肺 癌, 增 加 病 患 治 癒 率率率 [10] 上 述 的 篩 檢, 往 往 涉 及 昂 貴 的 影 像 學 檢 查 游 離離 輻輻 射 的 曝 露露 或 侵 入 性 的 處 置, 且 無 法 應 用 於 大 規 模 無 症 狀狀 病 人 的 篩 檢 因 此, 各 種 癌 症 的 生 物 標 記 也 不不 斷 被 研 1

發 出 來來, 期 望 能 用 於 高 通 量量 的 大 規 模 篩 檢, 然 而 目 前 可 供 臨臨 床 使 用 的 癌 症 生 物 標 記, 常 面 臨臨 靈靈 敏 性 不不 足 ( 僞 陰 性 ) 或 缺 乏 專 一 性 等 等 缺 點, 因 此 整 體 因 癌 症 造 成 的 死 亡 率率率 仍 在 持 續 攀 升 中 根 據 Feng 等 人 發 表 於 2005 年年 的 研 究 [11], 在 連連 續 52 例例 病 理理 確 診 的 大 腸 直 腸 癌 病 患 中, 只 有 38.5% 的 患 者 血 液 中 癌 胚 抗 原 (carcinoembryonic antigen, CEA) 呈 現 異異 常 上 升 甲 型 胎 兒 蛋 白 (α-fetoprotein, AFP) 是 目 前 肝 癌 最 具 專 一 性 的 指 標, 而 依 據 Tevisrani 等 人 發 表 於 2001 年年 的 一 份 病 例例 對 照 性 研 究 報 告, 當 AFP 的 正 常 上 限 值 定 在 16 ng/ml 時, 其 診 斷 肝 癌 的 敏 感 性 只 有 60% [12] 其 他 如 應 用 於 攝 護 腺 癌 的 攝 護 腺 特 異異 性 抗 原 (prostate-specific antigen, PSA), 在 良良 性 攝 護 腺 增 生 而 無 攝 護 腺 癌 的 患 者, 時 常 也 會 出 現 異異 常 上 升 的 情 形, 即 所 謂 的 偽 陽 性 [13] 此 外, Tompson 等 人 研 究 發 現, 攝 護 腺 癌 病 患 中, 有 50.8% 患 者 其 PSA 值 介 於 2.1 4 ng/ml [14], 也 就 是 說說說 約 有 一 半 攝 護 腺 癌 病 人, 其 血 液 中 PSA 值 低 於 一 般 認 定 的 正 常 上 限 值 (4 ng/ml), 此 即 所 謂 的 偽 陰 性 傳 統 癌 症 生 物 標 記 通 常 只 能 用 於 輔 助 診 斷 單 一 種 癌 症, 而 目 前 癌 症 生 物 標 記 的 另 外 一 個 研 究 方 向, 是 一 次 觀 察 大 量量 的 代 謝 物 的 變 化 情 形 所 組 成 的 代 謝 體 學 (metabolomics), 而 非 只 觀 察 單 一 個 生 化 指 標 這 樣 的 方 式 甚 至 可 以 藉 由 分 析 代 謝 體 學 的 特 徵, 反 映 出 個 體 的 健 康 狀狀 態, 或 判 斷 是 否 有 癌 症 [13] 要 達 到 這 樣 的 目 標, 必 需 要 篩 檢 大 量量 癌 症 病 患 與 健 康 對 照 受 試 者 的 檢 體, 然 後 進 行行 生 物 資 訊 學 的 分 析, 其 中 有 些 未 知 的 分 子, 甚 至 需 要 進 行行 質 譜 分 析 鑑 定 因 此, 在 進 行行 代 謝 體 學 的 研 究 之 前, 首 先 必 須 建 立立 一 套 簡 易易 靈靈 敏 又 經 濟 的 分 析 方 法, 可 以 分 析 大 量量 生 物 樣 品, 而 毛 細 管 電 泳 分 析 法 就 具 備 了了 這 樣 的 優 勢 而 尿尿 液 核 酸 代 謝 物 : 核 苷 則 是 一 個 適 合 的 觀 察 目 標, 底 下 章 節 將 介 紹 尿尿 核 苷 與 癌 症 的 關 係 2

貳 核 苷 與 癌 症 的 關 聯聯 性 核 苷 (Nucleoside) 是 一 種 醣 甘 胺 (glycosylamine) 分 子, 由 鹼 基 加 上 五 碳 糖糖 或 去 氧 核 糖糖 所 組 成, 廣 義 來來 看, 核 苷 也 含 括 了了 去 氧 核 苷 例例 如 ( 去 氧 ) 胞 苷 尿尿 苷 ( 去 氧 ) 腺 苷 ( 去 氧 ) 鳥 苷 與 ( 去 氧 ) 胸 腺 苷, 而 這 些 核 苷 加 上 一 個 磷 酸 基 團 就 成 為 ( 去 氧 ) 核 苷 酸, 是 DNA 與 RNA 的 組 成 單 位, 如 圖 一 所 示 修 飾 核 苷 大 部 分 是 從 核 糖糖 核 酸 (Ribonucleic acid, RNA) 而 來來 的, 而 且 傳 遞 RNA (transfer RNA, trna) 佔 了了 絕 大 部 分 修 飾 核 苷 是 透 過 轉 譯 後 修 飾 產 生, 且 每 一 種 化 學 修 飾 都都 需 要 特 定 的 酶 來來 完 成 [15], 其 與 RNA 的 代 謝 速 度度 有 關 例例 如 傳 訊 者 RNA(messenger RNA, mrna) 的 5 Cap 就 是 一 種 甲 基 化 修 飾 的 鳥 苷, 可 以 保 護 mrna 不不 被 降降 解 正 常 的 核 苷 ( 嘌 呤 與 嘧 啶 ) 經 生 物 轉 化 後, 一 部 分 會 經 由 回 收 途 徑 (Salvage passway) 轉 變 成 腺 核 苷 單 磷 酸 (Adenosine monophosphate, AMP), 次 黃 嘌 呤 核 苷 單 磷 酸 (Inosine monphosphate, IMP ), 鳥 嘌 呤 核 苷 單 磷 酸 ( Guanosine monophosphate, GMP), 尿尿 核 苷 單 磷 酸 (Uridine monophosphate, UMP), 胞 核 苷 單 磷 酸 (Guanosine monophosphate, CMP ), 胸 腺 核 苷 單 磷 酸 (Thymidine monophosphate, TMP), 其 餘 最 後 會 被 降降 解 成 尿尿 酸 或 β- 丙 胺 酸 (β-alanine) β- 胺 基 異異 丁 酸 (β-aminoisobutyrate), 而 修 飾 核 苷 (modified nucleosides) 則 因 無 相 對 應 的 分 解 酵 素, 造 成 它 既 不不 易易 被 代 謝 降降 解, 也 不不 能 被 再 回 收 利利 用, 只 能 通 過 尿尿 液 排 出 體 外 [16,17] 所 以, 尿尿 中 修 飾 核 苷 的 量量 能 夠 反 映 出 人 體 內 RNA 的 代 謝 速 度度 在 許 多 狀狀 態 下, 如 孕 婦, 嬰 幼 兒 與 成 長 期 兒 童, 血 液 疾 病, 發 炎 性 疾 病, 後 天 免 疫 不不 全 症 候 群 (AIDS) 以 及 癌 症, 體 內 RNA 的 代 謝 速 度度 會 迅 速 增 加 [13] 此 外, 在 帶 有 肝 癌 的 實 驗 動 物 的 肝 組 織 中, 可 以 觀 察 到 負 責 修 飾 RNA 的 甲 基 化 3

轉 移 酶 出 現 活 性 異異 常 上 升 的 情 形 [18] 綜 合 上 述 兩兩 個 因 素 ( 代 謝 速 度度 增 加 與 修 飾 酶 活 性 增 加 ) 推 測, 當 人 體 發 生 癌 變 時, 血 液 和 尿尿 中 修 飾 核 苷 含 量量 會 急 劇 增 加 自 從 Gehrke 等 學 者 於 1978 年年 首 次 報 導 成 功 偵 測 癌 症 病 人 尿尿 液 中 的 核 苷 以 來來 [19], 陸陸 續 有 許 多 學 者 觀 察 到, 在 不不 同 癌 症 病 患 的 尿尿 中 核 苷 含 量量 皆 高 於 一 般 健 康 人, 因 此 科 學 家 提 出 透 過 檢 測 血 液 或 尿尿 中 修 飾 核 苷 的 含 量量, 來來 推 測 體 內 腫 瘤 的 存 在 目 前 以 知 的 修 飾 核 苷 約 有 九 十 多 種, 其 中 二 十 種 常 被 研 究 用 來來 當 做 診 斷 癌 症 的 生 物 標 記 [20] 底 下 列列 出 文 獻 常 用 的 二 十 種 核 苷 及 其 縮 寫 : 假 尿尿 苷 (Psu, pseudouridine) 尿尿 苷 (U, uridine) 腺 苷 (A, adenosine) 胞 苷 (C, cytidine) 1- 甲 基 腺 苷 (m1a, 1-methyladenosine) 1- 甲 基 肌 苷 或 1- 甲 基 次 黃 嘌 呤 核 苷 (m1i, 1-methylinosine) 1- 甲 基 尿尿 苷 (m1u, 1-methyluridine) 5- 甲 基 尿尿 苷 (m5u, 5-methyluridine) 2- 甲 基 鳥 苷 (m2g, 2-methylguanosine) N2,N2- 雙 甲 基 鳥 苷 (m22g or dmg, N2,N2-dimethylguanosine) 肌 苷 或 次 黃 嘌 呤 核 苷 (I, inosine) 1- 甲 基 鳥 苷 (m1g, 1-methylguanosine) 鳥 苷 (G, guanosine) N4- 乙 醯 胞 苷 (ac4c, N4-acetylcytidine) 6- 甲 基 腺 苷 (m6a, 6-methyladenosine) 5- 甲 基 胞 苷 (m5c, 5-methylcytidine) 7- 甲 基 鳥 苷 (m7g, 7-methylguanosine) ( X, Xanthosine) 1,7- 雙 甲 基 鳥 苷 (m1,7g, 1,7-dimethylguanosine) 2- 吡 啶 酮 -5- 甲 醯 胺 -N1- 呋 喃 核 糖糖 苷 (PCNR, 2-pyridone-5-carboxamide-N1-ribofuranoside) 我 們 也 回 顧 了了 關 於 RNA 修 飾 核 苷 應 用 各 種 癌 症 輔 助 診 斷 的 文 獻 一 核 苷 與 血 液 淋淋 巴 癌 Itoh 等 人 發 現 在 急 性 骨 髓 性 白 血 病 (acute myeloid leukemia, AML) 慢 性 骨 髓 性 白 血 病 (chronic myeloid leukemia, CML) 急 性 淋淋 巴 性 白 血 病 ( acute 4

lymphoblastic leukemia, ALL) 與 多 發 性 骨 髓 瘤 (multiple myeloma) 患 者 尿尿 液 中 Psu 與 m1a 有 上 升 情 形, 且 化 療療 後 病 情 緩 解 時, 上 述 兩兩 種 尿尿 液 中 核 苷 的 排 放 量量 也 會 恢 復復 至 正 常 [21] AML 與 CML 患 者 尿尿 液 中 Psu 的 量量 與 血 液 中 不不 成 熟 細 胞 的 多 寡, 並 無 明 顯 關 連連 性 然 而 在 Rasmuson 的 研 究 中, 非 霍 杰 金金 氏 淋淋 巴 瘤 (non-hodgkin's lymphoma, NHL) 患 者 病 程 的 進 展 和 尿尿 液 中 Psu 的 量量 有 顯 著 的 相 關 性 [22] 二 核 苷 與 肺 癌 Waalkes 等 人 在 1982 年年 以 HPLC 法 偵 測 了了 小 細 胞 肺 癌 患 者 尿尿 液 中 五 種 修 飾 核 苷 的 量量 (Psu, m1a, m1i, m2g, m22g), 結 果 發 現 癌 症 分 期 與 異異 常 上 升 的 修 飾 核 苷 的 數數 目 有 顯 著 相 關 性, 可 作 為 患 者 預 後 以 及 存 活 率率率 的 指 標 [23,24] Tamura 等 人 則 於 1986 年年 發 表 了了 尿尿 液 中 Psu 的 量量 與 腫 瘤 負 荷 (tumor burden) 呈 正 相 關 [25] 三 核 苷 與 乳 癌 Sasco 等 人 在 1996 年年 報 導, 以 免 疫 法 (ELISA) 檢 測 了了 68 位 乳 癌 患 者 尿尿 液 中 六六 種 修 飾 核 苷 的 量量, 結 果 發 現 尿尿 液 中 m1a m1i 在 疾 病 較 嚴 重 者 ( 癌 症 已 轉 移 或 無 法 手 術 者 ) 有 顯 著 上 升 的 情 形, 且 尿尿 液 中 m1a m1i 上 升 者, 其 五 年年 存 活 率率率 較 低, 可 作 為 預 後 因 子 [26] Zheng 等 人 在 2005 年年 以 毛 細 管 微 胞 電 動 層 析 法 (MEKC) 偵 測 了了 26 名 乳 癌 病 患 20 名 乳 房 良良 性 腫 瘤 病 患 與 41 名 健 康 對 照 受 試 者 等 三 個 群 組 尿尿 液 中 之 十 三 種 修 飾 核 苷, 結 果 發 現 乳 癌 病 患 的 尿尿 中 修 飾 核 苷 排 放 量量, 顯 著 高 於 良良 性 腫 瘤 病 患 或 健 康 對 照 受 試 者 以 此 十 三 種 修 飾 核 苷 的 濃 度度 為 資 料料 向 量量, 進 行行 主 成 份 分 析 (principal component analysis), 則 73% 的 乳 5

癌 病 患 可 與 健 康 受 試 者 區 別 開 來來 [27] 2009 年年,Cho 等 人 採 用 HPLC/MS/MS 方 式 偵 測 乳 癌 患 者 手 術 前 後 以 及 健 康 對 照 受 試 者 的 十 四 種 尿尿 液 中 核 苷 ( 包 含 四 種 去 氧 修 飾 核 苷 ), 結 果 發 現 乳 癌 病 患 手 術 前 尿尿 液 中 m22g m1a 8-OHdG 5-Hydroxymethyl-2 -deoxyuridine 的 量量 顯 著 高 於 健 康 對 照 組, 且 在 手 術 後 兩兩 週 再 次 偵 測, 大 部 分 患 者 的 尿尿 中 核 苷 排 放 量量 都都 下 降降 到 接 近 正 常 的 範 圍, 顯 示 尿尿 中 修 飾 核 苷 除 輔 助 診 斷 外, 也 有 發 展 為 療療 效 評 估 或 預 後 因 子 的 潛 力力 [28] 2011 年年, Hsu 等 人 也 使 用 LC/MS/MS 方 式 偵 測 36 名 乳 癌 患 者 尿尿 液 中 核 苷 的 量量, 結 果 發 現 乳 癌 患 者 尿尿 中 C m3c I 的 量量, 顯 著 高 於 健 康 對 照 受 試 者 [29] 四 核 苷 與 肝 膽 腸 胃 道 癌 症 Clark 等 人 在 1983 年年 發 現, 以 黃 麴 毒 素 B1 誘 發 肝 癌 的 小 鼠, 其 尿尿 液 中 的 假 尿尿 苷 ( Psu ) 有 異異 常 上 升 的 情 形, 且 這 種 現 象 在 肝 腫 瘤 尚 未 形 成 的 癌 症 前 期 就 能 觀 察 到 [30] 之 後 1986 年年 Tamura 應 用 HPLC 法 偵 測 尿尿 液 中 假 尿尿 苷, 並 設 定 假 尿尿 苷 上 升 高 於 健 康 對 照 組 平 均 值 兩兩 個 標 準 差 為 肝 癌 陽 性, 同 時 合 併 血 清 中 胎 兒 蛋 白 作 為 診 斷 工 具, 結 果 發 現 肝 癌 的 診 斷 敏 感 度度 可 達 83% (19 of 23 HCC patients) [31] Yang 研 究 團 隊 在 2004 年年 以 HPLC 法 偵 測 了了 肝 惡惡 性 腫 瘤 急 性 慢 性 肝 炎, 與 肝 硬 化 等 四 個 群 組 病 患 之 尿尿 液 中 的 十 五 種 修 飾 核 苷 排 放 量量, 結 果 發 現 肝 惡惡 性 腫 瘤 組 病 患 的 五 種 尿尿 液 修 飾 核 苷 (Psu, m1a, X, m1i, m1g), 顯 著 高 於 其 它 三 組 [32] 2008 年年, 黃 智 銘 等 人 以 高 效 毛 細 管 電 泳 法 (HPCE) 分 析 了了 21 位 肝 細 胞 癌 病 患 腫 瘤 切切 除 前 與 手 術 後 三 天 尿尿 中 四 種 修 飾 核 苷 (m5u, I, Ac4C, X) 排 放 量量 的 變 化, 並 與 10 位 良良 性 肝 腫 瘤 病 患 21 位 肝 硬 化 病 患 以 及 30 位 健 康 人 做 比 較 結 果 發 現 手 術 前 尿尿 中 修 飾 核 苷 排 放 量量 顯 著 高 於 手 術 後 或 其 它 肝 硬 化 6

或 良良 性 肝 腫 瘤 病 患 [33] 2009 年年 鄭 隆隆 賓 等 人 首 次 發 表 了了 以 高 效 液 相 層 析 / 串串 聯聯 質 譜 (HPLC/MS/MS) 法, 對 25 位 肝 細 胞 癌 病 患 與 20 位 健 康 人 尿尿 中 七 種 修 飾 核 苷 ( 包 括 一 種 去 氧 修 飾 核 苷 dg) 進 行行 分 析, 結 果 發 現 肝 細 胞 癌 病 患 尿尿 液 中 的 三 種 修 飾 核 苷 (C, A, I) 顯 著 高 於 健 康 人, 並 能 增 加 肝 癌 診 斷 的 靈靈 敏 度度, 由 原 本 單 獨 使 用 甲 型 胎 兒 蛋 白 的 68%, 提 升 至 80% [34] 2009 年年, Lai 等 人 以 HPLC/MS/MS 方 式 偵 測 26 位 大 腸 癌 患 者 與 18 位 健 康 對 照 組 受 試 者 尿尿 液 中 的 九 種 核 苷 ( 包 括 兩兩 種 去 氧 核 苷 ), 結 果 發 現 大 腸 癌 病 患 尿尿 中 修 飾 核 苷 A C m22g U 與 8-OHdG 的 排 放 量量 顯 著 高 於 對 照 組 [35] 修 飾 去 氧 核 苷 (modified deoxynucleosides) 是 來來 自 於 DNA, 是 DNA 受 到 氧 化 壓 力力 的 攻 擊 而 產 生 經 過 體 內 基 因 修 補 系 統 修 復復 後, 這 些 修 飾 去 氧 核 苷 會 經 由 尿尿 液 排 出, 可 反 應 出 DNA 氧 化 損 傷 的 程 度度 [36] DNA 氧 化 損 傷 是 造 成 老老 化, 退 化 性 疾 病, 與 癌 症 的 重 要 因 之 一, 而 DNA 氧 化 損 傷 的 標 記 則 能 用 來來 評 估 癌 症 的 風 險, 老老 化 的 情 形 以 及 癌 症 治 療療 效 果 的 評 估 目 前 研 究 大 多 以 8- 羥 基 去 氧 鳥 嘌 呤 核 苷 (8-OHdG) 做 為 DNA 氧 化 損 傷 的 標 記, 因 為 它 會 造 成 基 因 突 變 (point mutation, CG AT) [37], 且 常 在 一 些 癌 症 相 關 的 基 因 中 被 發 現 [38] 此 外, 在 實 驗 動 物 的 標 的 組 織 中,8-OHdG 的 含 量量 也 與 癌 症 的 發 生 率率率 有 關 連連 性 [39] 2008 年年,Makoto 等 人 以 免 疫 組 織 染 色 法 分 析 了了 104 位 慢 性 C 型 肝 炎 患 者 的 肝 臟 組 織 病 理理 切切 片 中 8-OHdG 表 現 量量, 並 且 持 續 追 蹤 患 者 是 否 發 生 肝 細 胞 癌 結 果 發 現 在 肝 切切 片 8-OHdG 表 現 量量 高 於 30% 組, 其 病 患 累累 積 肝 細 胞 癌 發 生 率率率 顯 著 高 於 8-OHdG 表 現 量量 低 於 30% 組 這 表 示 DNA 氧 化 損 傷 標 記 8-OHdG 在 慢 性 C 型 肝 炎 是 一 個 肝 細 胞 癌 的 危 險 因 子 [40] 在 肺 癌, 大 腸 癌, 婦 科 癌 症 與 頭 部 癌 症 患 者, 也 有 研 究 指 出 其 尿尿 液 中 8-OHdG 的 含 量量 顯 著 高 於 健 康 對 照 組 受 試 7

者 (35.26±27.96 nm versus 13.51±5.08 nm,p<0.05) [41], 此 外 當 患 者 接 受 手 術 切切 除 腫 瘤, 或 化 學 治 療療 之 後, 尿尿 液 中 的 8-OHdG 的 含 量量 則 出 現 顯 著 下 降降 的 情 形 [41] 大 部 分 文 獻 都都 只 探 討 了了 癌 症 與 RNA 修 飾 核 苷 或 DNA 修 飾 去 氧 核 苷 兩兩 者 其 中 一 種 的 關 聯聯 性, 目 前 同 時 偵 測 尿尿 液 中 修 飾 核 苷 與 DNA 氧 化 損 傷 標 記 8-OHdG 的 文 獻 只 有 兩兩 篇 [28,35], 是 關 於 大 腸 癌 與 乳 癌 患 者 尿尿 液 中 修 飾 核 苷 的 變 化, 結 果 發 現 數數 種 尿尿 中 RNA 修 飾 核 苷 以 及 DNA 修 飾 去 氧 核 苷 在 癌 症 病 患 都都 有 上 升 的 趨 勢, 且 在 乳 癌 患 者 手 術 後, 兩兩 者 同 樣 會 下 降降 到 接 近 健 康 對 照 組 的 平 均 值 8

圖 一 核 苷 與 核 苷 酸 結 構 示 意 圖 Fig. 1 Structure characteristics of nucleosides and nucleotides 9

參參 毛 細 管 電 泳 法 的 原 理理 電 泳 是 指 帶 電 荷 物 質 在 電 場 中, 受 到 電 場 的 作 用 力力 而 移 動 的 現 象, 所 謂 毛 細 管 電 泳 就 是 將 電 泳 的 現 象 移 到 25 ~100 μm 的 細 管 中 進 行行, 而 傳 統 平 板 電 泳 的 膠 體, 在 毛 細 管 電 泳 中 就 變 成 了了 充 滿 毛 細 管 的 緩 衝 溶 液, 提 供 分 析 物 質 在 管 內 移 動 的 介 質 實 際 操 作 時, 首 先 將 毛 細 管 充 滿 緩 衝 溶 液, 之 後 再 將 分 析 物 由 毛 細 管 入 口 處 注 入, 之 後 將 毛 細 管 兩兩 端 置 放 於 兩兩 個 裝 有 緩 衝 溶 液 的 容 器, 然 後 將 電 極 也 分 別 置 入 兩兩 個 緩 衝 溶 液 的 容 器 中, 施 加 電 壓, 此 時 分 析 物 質 即 開 始 產 生 電 泳 的 現 象, 並 依 荷 質 比 的 差 異異 以 不不 同 的 速 度度 朝 出 口 端 移 動, 當 分 析 物 到 達 接 近 出 口 端 的 偵 測 器 時, 即 可 被 偵 測 到 而 產 生 訊 號 毛 細 管 材 質 一 般 為 融 矽 毛 細 管 (fused silica), 管 外 塗 佈 一 層 polyamide 高 分 子 聚 合 物, 可 增 加 韌 性 而 減 少 斷 裂裂 的 情 形 而 毛 細 管 內 徑 小, 表 面 積 與 體 積 的 比 值 高, 散 熱 佳, 可 於 高 電 場 的 情 況 進 行行 分 離離 而 不不 過 熱 由 於 所 需 的 設 備 簡 單 分 離離 效 率率率 高 溶 劑 耗 損 少 所 需 樣 品 少 以 及 分 析 快 速 等 等 優 點, 毛 細 電 泳 已 廣 泛 應 用 於 生 物 化 學 醫 學, 製 藥 與 分 析 化 學 等 等 領領 域 [42] 影 響 毛 細 管 電 泳 分 析 物 分 離離 的 因 素 包 括 下 列列 幾 點 : 一 電 滲 流流 電 滲 流流 (electroosmotic flow, EOF) 是 緩 衝 溶 液 在 毛 細 管 中 移 動 的 重 要 現 象 毛 細 管 材 質 內 壁 表 面 含 有 矽 醇 官 能 基 (SiOH, pka=1.5), 當 緩 衝 溶 液 ph 2 時, SiOH 會 解 離離 成 SiO - 而 帶 負 電, 緩 衝 溶 液 中 的 陽 離離 子 有 一 部 分 會 被 吸 附 到 管 壁 上 而 形 成 電 雙 層, 其 餘 則 向 管 柱 中 心 形 成 濃 度度 逐 漸 降降 低 的 擴 散 層 而 由 於 管 壁 至 中 心 的 陽 離離 子 電 荷 分 佈 不不 均, 會 產 生 Zeta 電 位 (ζ) 當 毛 細 管 施 加 電 壓 後, 10

擴 散 層 中 的 陽 離離 子 受 到 負 極 吸 引, 會 往 負 極 移 動, 同 時 也 帶 動 管 柱 中 的 溶 液 整 體 往 負 極 移 動, 此 即 所 謂 的 電 滲 流流, 其 與 ζ 的 關 係 如 下 公 式 所 示 [43]: Ve0 = ( ε ζ / 4π η ) x E Ve0: 電 滲 流流 的 移 動 速 率率率 ε: 介 電 常 數數 ζ:zeta 電 位 η: 緩 衝 溶 液 的 黏 稠 度度 E: 電 場 強 度度 電 滲 流流 與 緩 衝 溶 液 的 黏 度度 成 反 比, 黏 度度 越 大 時, 電 滲 流流 越 小 電 滲 流流 與 Zeta 電 位 成 正 比, Zeta 電 位 越 大, 電 滲 流流 也 越 大 二 電 泳 流流 帶 電 分 析 物 在 電 場 中, 受 到 電 場 的 作 用 力力 而 移 動, 稱 之 為 電 泳 流流 電 泳 流流 的 移 動 方 向 與 分 析 物 本 身 所 帶 電 荷 有 關, 會 往 與 本 身 所 代 電 荷 相 反 的 電 極 移 動 毛 細 管 電 泳 中, 在 設 計 條 件 下 使 電 滲 流流 遠 大 於 電 泳 流流 時, 則 不不 論論 分 析 物 所 帶 電 荷 為 何, 所 有 分 析 物 一 律律 跟 電 滲 流流 往 負 極 移 動, 然 而 其 淨 遷 移 率率率 則 為 電 滲 流流 與 電 泳 流流 同 時 作 用 在 該 分 析 物 上 的 淨 移 動 力力 所 造 成 的 結 果 因 此, 移 動 到 毛 細 管 出 口 偵 測 端 的 順 序 為 1. 帶 正 電 分 析 物 2. 不不 帶 電 分 析 物 3. 帶 負 電 分 析 物 三 緩 衝 溶 液 的 種 類類 每 一 種 緩 衝 溶 液 有 一 定 的 ph 緩 衝 範 圍 與 不不 同 的 介 電 常 數數, 需 根 據 分 析 物 的 性 質 (pka) 選 擇 適 當 種 類類 的 緩 衝 溶 液, 以 維 持 ph 穩 定 11

四 緩 衝 溶 液 的 ph 值 緩 衝 溶 液 的 ph 值 會 影 響 毛 細 管 壁 SiOH 解 離離 程 度度, 進 而 影 響 Zeta 電 位 與 電 滲 流流 EOF 的 大 小 此 外,pH 值 也 會 影 響 分 析 物 本 身 的 所 帶 的 電 荷 與 電 泳 流流 五 緩 衝 溶 液 的 濃 度度 緩 衝 溶 液 濃 度度 增 加 時, 離離 子 強 度度 也 增 強, 同 時 溶 液 黏 度度 也 上 升, 電 滲 流流 與 電 泳 流流 都都 會 變 小 六六 分 離離 電 壓 分 離離 電 壓 會 影 響 分 析 物 遷 移 時 間 的 長 短 與 解 析 度度, 但 並 不不 會 改 變 對 分 析 物 的 選 擇 性 七 毛 細 管 的 內 徑 與 長 度度 毛 細 管 管 徑 越 細, 長 度度 越 長, 一 般 來來 說說說 解 析 度度 也 越 高 八 進 樣 的 方 式 與 時 間 進 樣 的 方 式 可 分 類類 為 壓 力力 進 樣, 重 力力 進 樣, 電 動 進 樣, 真 空 抽 吸 進 樣 ; 而 進 樣 時 間 長 短 會 影 響 樣 品 進 入 毛 細 管 的 體 積 此 外, 樣 品 注 射 之 體 積 所 佔 毛 細 管 總 體 積 之 比 例例, 甚 至 可 能 影 響 緩 衝 溶 液 的 導 電 度度, 進 而 影 響 分 離離 效 率率率 12

肆 以 毛 細 管 電 泳 法 分 析 尿尿 液 中 核 苷 的 現 況 分 析 尿尿 液 樣 品 中 核 苷 與 修 飾 的 核 苷 的 方 法, 包 括 免 疫 法, 高 效 液 相 層 析 法 (HPLC) 以 及 毛 細 管 電 泳 法 結 合 UV 檢 測 (HPCE-UV) 或 光 電 二 極 管 陣 列列 檢 測 器 (HPCE-DAD) 或 質 譜 (MS) 檢 測 免 疫 法 的 測 定 需 要 使 用 專 一 性 的 單 株 抗 體, 然 而 並 非 每 個 核 苷 都都 有 商 品 化 的 單 株 抗 體 可 用, 且 可 能 會 發 生 交 叉 反 應 (cross-reaction), 而 造 成 僞 陽 性 的 結 果 ; 而 高 效 液 相 層 析 法 所 需 要 的 檢 體 體 積 較 大, 且 需 要 繁 複 的 分 析 管 柱 處 理理 流流 程, 而 且 過 程 中 需 要 使 用 大 量量 有 機 溶 劑 ; 而 質 譜 儀 檢 測 則 需 要 昂 貴 的 儀 器 且 不不 利利 於 自 動 化 操 作 流流 程, 因 此 本 實 驗 使 用 毛 細 管 電 泳 法 結 合 UV 檢 測 的 方 式 檢 驗 尿尿 液 中 核 苷 表 一 列列 出 了了 近 十 二 年年 內, 使 用 毛 細 管 電 泳 法 分 析 尿尿 液 中 核 苷 的 相 關 研 究 大 部 分 的 研 究 使 用 固 相 萃 取 法 (SPE) 進 行行 樣 品 前 處 理理, 以 去 除 檢 體 中 基 質 干 擾 由 於 核 苷 ( 除 去 氧 核 苷 外 ) 含 1,2- 順 式 二 醇, 會 與 硼 酸 鹽 發 生 錯 合 作 用 [44], 因 此 緩 衝 溶 液 的 選 擇 大 都都 以 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 為 主 大 部 份 的 研 究 者 使 用 毛 細 管 微 胞 電 動 層 析 法 (MEKC) 分 離離 核 苷, 而 於 緩 衝 溶 液 中 加 入 界 面 活 性 劑 十 二 烷 基 硫硫 酸 鈉 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) 或 溴 化 十 六六 烷 基 三 甲 銨 (Cetyltrimethylammonium Bromide, CTAB), 形 成 微 胞 (Micelle), 而 分 析 物 根 據 疏 水 性 的 差 異異, 則 進 入 微 胞 的 機 會 也 不不 同, 因 此 分 析 物 在 緩 衝 溶 液 與 微 胞 之 間 分 配 係 數數 也 不不 同, 藉 此 來來 進 行行 分 離離 表 一 所 列列 出 的 研 究, 其 偵 測 方 式 大 都都 是 以 紫 外 / 可 見見 光 (UV/VIS) 為 主, 偵 測 極 限 大 都都 在 微 莫 爾 濃 度度 範 圍 (μm) [27,45-48], 當 以 質 譜 儀 偵 測 時, 則 可 將 偵 測 靈靈 敏 度度 提 昇 至 nm 的 範 圍 [49] 13

Real sample 表 一 以 毛 細 管 電 泳 法 分 離離 尿尿 液 中 核 苷 的 研 究 及 其 分 析 條 件 Table 1. Analytical conditions of studies determining urinary nucleosides by capillary electrophoresis Preparation Detection type Condition Analysis Urine SPE CE-MS with positive ion mode BGE: prepared by mixing 150 mm acetic acid with 15% methanol and 15% ethanol; uncoated fused silica capillary (60 cm 50 μm I.D.); voltage 25 kv Urine SPE UV at 254 nm BGE: 300 mm SDS, 25 mm Na2B4O7, 50 mm phosphate (ph 6.9); uncoated fused silica capillary (50 cm 50 μm I.D.); voltage 7 kv Urine SPE UV at 254 nm BGE: 160 mm SDS, 100 mm Na2B4O7, 72.5 mm NaH2PO4 (ph 6.7) ; uncoated fused silica capillary (70 cm 50 μm I.D.); voltage 25 kv Urine SPE UV in the range from 190 to 390 nm BGE: 25 mm borate, 42.5 mm phosphate ph 6.7, 200 mm SDS; uncoated fused-silica capillary (57.0 cm 50 mm I.D.); voltage 15 kv, Urine SPE UV at 254 nm BGE: 25 mm CTAB, 25 mm Na2B4O7, 25 mm NaH2PO4 (ph 9.50); uncoated fused silica capillary (48 cm 50 μm I.D.);; voltage 15 kv Urine SPE UV at 254 nm BGE: 300 mm SDS, 25 mm Na2B4O7, 50 mm NaH2PO4 (ph 6.9); uncoated fused silica capillary (50 cm 50 mm I.D.); voltage 7 kv time LOD 18 min 0.009 3.82 (μm) 45 min 3.1 74.2 (μm) 25 min 0.17 2.26 (μm) 30 min 4.8 12.2 (μm) 7 min 0.55 1.67 ( M) Ref. [49] [45] [47] [46] [48] 45 min - [27] 14

伍 環 糊 精精 之 簡 介 環 糊 精精 (cyclodextrins) 是 由 六六 個 以 上 葡 萄 糖糖 以 α 1, 4 糖糖 苷 鍵 聯聯 合 而 成 的 巨 環 聚 合 物, 依 組 成 的 葡 萄 糖糖 數數 目 不不 同 而 命 名 其 中 最 常 見見 三 種 的 是 α 環 糊 精精 (α-cyclodextrin) β 環 糊 精精 (β-cyclodextrin) γ 環 糊 精精 (γ-cyclodextrin), 分 別 由 六六 個 七 個 與 八 個 葡 萄 糖糖 分 子 所 組 成, 表 二 列列 出 了了 其 基 本 性 質 Villiers 在 1891 年年 的 時 候 首 先 發 現 了了 環 糊 精精, 之 後 1902 到 1911 年年 間, Schardinger 鑑 定 出 α β 環 糊 精精, 且 在 1930 年年 代 鑑 定 出 γ 環 糊 精精, 不不 久 之 後 Cramer 等 人 發 現 了了 環 糊 精精 具 有 形 成 包 容 錯 合 物 的 能 力力 到 了了 1950 年年 代, 環 糊 精精 的 基 礎 物 理理 化 學 特 性, 包 括 幫 助 藥 物 溶 解 與 提 高 藥 物 穩 定 性 等 特 質, 已 被 研 究 發 表 出 來來, 然 而 真 正 將 環 糊 精精 應 用 於 藥 物 學 的 產 品 則 在 1970 年年 代 末 期 才 出 現 [50] 目 前 工 業 生 產 環 糊 精精 是 使 用 一 種 天 然 的 酶, 稱 為 環 糊 精精 葡 萄 糖糖 轉 移 酶 (cyclodextrin glucosyltransferase, CGTase), 其 會 將 澱 粉 分 解 產 生 環 糊 精精 CGTase 從 兩兩 端 切切 斷 呈 螺螺 旋 狀狀 的 澱 粉, 之 後 再 將 頭 尾 連連 接 起 來來 組 成 一 個 中 空 錐 筒 狀狀 構 造 CGTase 可 以 合 成 各 種 形 式 的 環 糊 精精, 取 決 於 剪 切切 出 來來 的 澱 粉 長 度度 不不 同, 而 不不 同 的 CGTase 對 於 α β γ 環 糊 精精 生 成 的 比 例例 也 不不 同 [51], 需 經 純 化 步 驟 來來 分 離離 出 這 三 種 形 態 的 環 糊 精精, 其 分 離離 原 理理 則 是 利利 用 他 們 對 水 的 溶 解 度度 不不 同 環 糊 精精 具 有 特 殊 的 結 構, 如 圖 二 所 示, 包 括 內 部 疏 水 性 的 腔 室 以 及 外 部 親 水 性 的 環 狀狀 開 口, 以 β 環 糊 精精 為 例例, 其 葡 萄 糖糖 單 體 C6 位 置 的 羥 基 為 一 級 羥 基, C2 C3 位 置 的 羥 基 則 為 二 級 羥 基,β 環 糊 精精 具 有 七 個 一 級 羥 基 與 十 四 個 二 級 羥 基, 分 別 位 於 中 空 錐 筒 狀狀 構 造 的 開 口 兩兩 端 ( 一 級 羥 基 端 窄, 二 級 羥 基 端 寬 ), 屬 於 極 性 親 水 性 部 份 ; 而 各 個 葡 萄 糖糖 單 體 的 C3 的 甲 基 O 與 C5 的 甲 基 則 面 向 腔 室 內 部 排 成 三 列列, 屬 於 非 極 性 疏 水 性 部 份 [52] 環 糊 精精 可 以 利利 用 其 疏 水 性 的 15

腔 室 為 主 體, 包 合 各 種 不不 同 的 有 機 無 機 化 合 物, 離離 子 或 稀 有 氣 體, 形 成 主 客 錯 合 物 (host-guest complex) 或 稱 為 內 包 錯 合 物 (inclusion complex), 這 些 錯 合 物 的 穩 定 性 與 客 體 分 子 的 大 小, 形 狀狀 與 疏 水 性 有 關, 此 外 環 糊 精精 與 客 體 分 子 間 的 非 共 價 鍵 結 作 用 力力 ( 凡 得 瓦 力力 氫 鍵 與 疏 水 性 交 互 作 用 ) 也 扮 演 重 要 的 角 色 當 各 種 物 質 被 環 糊 精精 包 合 後, 其 穩 定 性, 溶 解 度度 與 揮 發 性 等 各 種 理理 化 性 質 會 產 生 明 顯 的 改 變, 也 因 此 使 它 可 廣 泛 應 用 於 許 多 不不 同 的 領領 域, 例例 如, 醫 藥 化 妝 品 分 析 材 料料 合 成 及 分 子 生 物 等 尤 其 是 醫 藥 方 面 的 應 用, 除 了了 增 加 藥 物 溶 解 度度 穩 定 性 與 生 體 可 用 率率率, 降降 低 藥 物 的 毒 性 副 作 用 苦 味 與 對 黏 膜 的 刺刺 激 性 外 [50], 其 本 身 也 具 有 療療 效, 可 應 用 於 膽 固 醇 代 謝 異異 常 的 疾 病 ( 尼 曼 匹 克 症,Niemann-Pick disease) [53] 羥 丙 基 -β- 環 糊 精精 (HP-β-CD) 是 由 β-cd 與 環 氧 丙 烷 (propylene oxide) 經 化 學 反 應 後, 將 β-cd 的 一 級 羥 基 對 稱 取 代 為 CH2CHOHCH3 而 來來 的 由 於 此 取 代 基 具 高 極 性, 因 此 HP-β-CD 的 溶 解 度度 也 大 幅 提 昇, 且 毒 性 低 於 β-cd [54] HP-β-CD 在 分 析 化 學 的 應 用, 主 要 是 用 來來 分 離離 異異 構 物, 其 分 離離 原 理理 是 藉 由 異異 構 物 本 身 立立 體 空 間 結 構 的 差 異異, 造 成 所 與 環 糊 精精 所 形 成 的 內 包 錯 合 物 穩 定 度度 不不 同, 而 達 到 分 離離 此 外, 它 也 可 以 幫 助 提 昇 疏 水 性 物 質 的 溶 解 度度 本 研 究 首 次 將 其 應 用 於 幫 助 分 離離 尿尿 液 中 的 核 苷 16

表 二 環 糊 精精 的 基 本 性 質 [52] Table 2. Characteristics of cyclodextrins 環 糊 精精 α β γ 葡 萄 糖糖 單 體 數數 目 6 7 8 分 子 式 ( 無 水 ) C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40 分 子 量量 ( 無 水 )g/mol 972.85 1134.99 1297.14 腔 室 高 度度,nm 0.8 0.8 0.8 腔 室 內 徑,nm( 估 計 值 ) 0.52 0.66 0.84 17

圖 二 β 環 糊 精精 的 分 子 構 造 圖 [52] Fig. 2 Molecular structure of β-cyclodextrin 18

陸陸 研 究 動 機 癌 症 的 診 斷 與 預 後 相 關 的 生 物 標 記, 一 直 都都 很 有 研 究 價 值, 主 要 是 因 為 其 高 盛 行行 率率率 與 高 復復 發 率率率, 而 有 用 的 生 物 標 記 可 能 幫 助 臨臨 床 醫 師 在 疾 病 早 期 診 斷 出 來來, 讓 患 者 有 機 會 接 受 治 癒 性 的 治 療療, 且 在 治 療療 後 的 追 蹤, 也 同 樣 能 幫 助 醫 師 篩 選 出 高 復復 發 危 險 性 的 病 患, 進 行行 更更 密 切切 的 追 蹤 數數 種 尿尿 液 中 核 酸 代 謝 物 組 成 的 代 謝 體 學, 是 有 別 於 傳 統 生 化 學 腫 瘤 標 記 外 的 另 一 個 癌 症 生 物 標 記 的 研 究 方 向, 但 需 要 一 個 靈靈 敏, 簡 單, 迅 速 的 分 析 工 具, 來來 分 析 大 量量 生 物 檢 體, 探 尋 有 用 的 生 物 標 記 因 此 本 研 究 希 望 開 發 出 一 種 不不 須 前 處 理理 或 萃 取 步 驟 的 毛 細 管 電 泳 法, 可 迅 速 分 析 癌 症 與 健 康 對 照 受 試 者 尿尿 液 中 的 數數 種 修 飾 核 苷 與 DNA 氧 化 損 傷 標 記 8-OHdG 的 變 化, 作 為 之 後 大 量量 篩 檢 作 業 的 工 具 由 於 肝 癌 與 大 腸 癌 為 癌 症 死 亡 原 因 的 第 二 三 名 [1], 因 此 在 選 擇 偵 測 目 標 時, 我 們 參參 考 了了 2009 年年 鄭 隆隆 賓 等 人 的 研 究 結 果 : 肝 細 胞 癌 病 患 尿尿 液 中 的 三 種 修 飾 核 苷 (C, A, I) 高 於 健 康 人 [34], 以 及 2009 年年, Lai 等 人 的 發 現 : 大 腸 癌 病 患 尿尿 中 修 飾 核 苷 A C m22g U 與 8-OHdG 的 排 放 量量 顯 著 高 於 對 照 組 [35], 而 選 擇 偵 測 的 苷 項 目 為 8-OHdG A C m22g U I 等 六六 種 19

第 二 章 實 驗 材 料料 與 方 法 壹 藥 品 與 溶 劑 實 驗 中 所 使 用 之 磷 酸 氫 二 鈉 (Na2HPO3) 磷 酸 二 氫 鈉 (NaH2PO3) 氫 氧 化 鈉 (Sodium hydroxide) 十 六六 烷 基 硫硫 酸 鈉 (SDS) 羥 丙 基 -β- 環 糊 精精 (HP-β-CD) 四 硼 酸 鈉 (Sodium tetraborate) 肌 酸 酐 (Creatinine) 及 核 苷 標 準 品 ( 胞 苷 腺 苷 尿尿 苷 肌 苷 雙 甲 基 鳥 苷 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 ) 均 購 自 美 國 Sigma 公 司 尿尿 酸 則 是 購 自 於 Riedel-de-Haen 公 司 二 次 去 離離 子 水 由 美 國 Barnstead 公 司 出 產 之 超 純 水 系 統 所 製, 電 阻 值 皆 大 於 18 MΩ/cm 貳 儀 器 設 備 ( 一 ) 紫 外 光 - 可 見見 光 吸 收 儀 Lambda EZ210 購 自 美 國 Perkin Elmer ( 二 ) 毛 細 管 電 泳 系 統 Model Prince 250 CE System ( 三 ) 紫 外 光 吸 收 偵 測 器 Bischoff Lambda 1010 偵 測 器 經 電 腦 以 WPrince 32 bit 軟 體 控 制, 以 SISC 32 2.0 中 文 版 軟 體 系 統 擷 取 與 處 理理 數數 據 偵 測 核 苷 時 波 長 設 定 為 254 nm; 偵 測 肌 酸 肝 和 尿尿 酸 波 長 設 定 為 240 nm ( 四 ) 毛 細 管 柱 購 自 美 國 Plymicro Technologies Inc. 公 司, 其 為 內 徑 為 75 μm, 外 徑 為 375 μm 的 Undeactivated fused silica Column, 總 長 為 60 公 分, 有 效 長 度度 為 50 公 分 ( 五 ) ph meter 使 用 ph/ion meter D-23, 購 自 日 本 HORIBA ( 六六 ) 去 離離 子 水 使 用 NANO pure Infinty UV/UFe, 購 自 美 國 Barnstead Thermolyn ( 七 ) 超 音 波 震 盪 器 BRANSON 1510 購 自 美 國 20

( 八 ) 迷 你 微 量量 離離 心 機 (Mini Centrifuge) QS-7011 ( 轉 速 6500 rpm), 購 自 美 國 Quick Spin 參參 標 準 品 與 緩 衝 溶 液 配 置 標 準 品 ( 肌 酸 酐 尿尿 酸 胞 苷 腺 苷 尿尿 苷 肌 苷 雙 甲 基 鳥 苷 和 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 ) 使 用 二 次 水 配 置 為 濃 度度 1 10-2 M 的 母 液 備 用, 並 存 放 於 4 冰 箱 中, 實 驗 進 行行 前, 再 稀 釋 到 所 需 的 濃 度度 上 述 八 種 分 析 物 的 結 構 式 列列 於 表 三 分 析 肌 酐 酸 與 尿尿 酸 的 緩 衝 溶 液 是 使 用 磷 酸 氫 二 鈉 (Na2HPO3) 磷 酸 二 氫 鈉 (NaH2PO3) 與 純 磷 酸 (H3PO4) 所 混 合, 使 用 時 再 配 製 所 需 濃 度度 及 所 需 ph 值 ; 分 析 核 苷 的 緩 衝 溶 液 是 以 四 硼 酸 鈉 (Sodium tetraborate) 和 羥 丙 基 -β- 環 糊 精精 (HP-β-CD) 或 十 六六 烷 基 硫硫 酸 鈉 (SDS) 混 合 而 成, 再 以 10 M 氫 氧 化 鈉 (NaOH) 調 配 至 所 需 的 ph 值 肆 真 實 樣 品 之 前 處 理理 及 配 製 本 實 驗 的 真 實 樣 品 為 人 體 尿尿 液, 包 括 來來 自 台 東 馬 偕 醫 院 的 10 位 健 康 對 照 組 受 試 者 與 10 位 癌 症 患 者 ( 基 本 資 料料 請 見見 表 15), 在 簽 署 受 試 者 同 意 書 後 ( 馬 偕 紀 念念 醫 院 IRB 計 畫 編 號 13MMHIS069), 收 集 其 隨 機 中 段 尿尿 液, 並 將 尿尿 液 檢 體 儲 存 於 -80 下 實 驗 前, 將 尿尿 液 樣 品 置 於 室 溫 下 回 溫, 然 後 取 1 ml 的 尿尿 液 樣 品, 以 6500 rpm 離離 心 15 分 鐘, 之 後 取 出 上 清 液 部 分 備 用, 進 行行 電 泳 分 析 時, 再 以 超 純 水 稀 釋 至 所 需 倍 率率率 後 即 可 上 機 偵 測 為 使 核 苷 濃 度度 符 合 檢 量量 線 之 線 性 範 圍, 偵 測 健 康 對 照 組 受 試 者 尿尿 液 中 的 核 苷 時, 稀 釋 倍 率率率 為 20 倍, 偵 測 癌 症 病 人 的 尿尿 液 核 苷 則 是 以 30 倍 稀 釋, 此 外, 偵 測 肌 酸 酐 時 的 稀 釋 倍 率率率 為 400 倍 21

表 三 八 種 分 析 物 的 結 構 式 Table 3. Molecular structure of eight analytes 胞 苷 ( Cytidine ) 腺 苷 (Adenosine) 肌 苷 (Inosine) 尿尿 苷 (Uridine) N2,N2- 雙 甲 基 鳥 苷 (N2,N2-dimethylguanine) 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 ( 8-hydroxy-2-deoxyguanosine) 22

尿尿 酸 (Uric acid) 肌 酸 酐 (Creatinine) 23

伍 毛 細 管 電 泳 實 驗 流流 程 新 的 毛 細 管 先 充 滿 0.1 M NaOH 溶 液 後, 靜 置 8~12 個 小 時, 之 後 將 NaOH 以 ddh2o 置 換 備 用 每 天 進 行行 實 驗 之 前, 先 以 0.1 M NaOH 1000 mbar 沖 洗 20 分 鐘, 再 用 ddh2o 1000 mbar 沖 洗 10 分 鐘, 之 後 即 可 開 始 進 行行 實 驗 每 次 電 泳 實 驗 結 束, 進 行行 下 一 次 電 泳 實 驗 前, 先 用 0.1 M NaOH 1000 mbar 沖 洗 1 分 鐘, 如 圖 3A 所 示, 之 後 以 0.1 M ddh2o 1000 mbar 沖 洗 2 分 鐘, 再 用 緩 衝 溶 液 1000 mbar 沖 洗 3 分 鐘, 如 圖 3B 所 示, 接 著 以 100 mbar 進 樣 6 秒, 如 圖 3C 所 示, 最 後 再 以 高 壓 電 進 行行 電 泳 分 析, 分 離離 分 析 物, 如 圖 3D 所 示 電 泳 完 畢 之 後, 以 緩 衝 溶 液 1000 mbar 推 1 分 鐘 將 毛 細 管 內 殘 餘 樣 品 推 出 每 天 實 驗 結 束 後, 使 用 0.1 M NOH 1000 mbar 沖 洗 5 分 鐘,ddH2O 1000 mbar 沖 洗 5 分 鐘, 最 後 讓 毛 細 管 內 充 滿 ddh2o 的 情 況 下, 即 可 關 機 24

圖 三 毛 細 管 電 泳 分 析 作 業 示 意 圖 Fig. 3 Scheme of capillary electrophoresis operation (A) 使 用 0.1 M NaOH 沖 洗 毛 細 管 (B) 使 毛 細 管 充 滿 緩 衝 溶 液 (C) 注 入 分 析 樣 品 (D) 施 加 高 壓 電, 分 離離 分 析 物 25

第 三 章 實 驗 結 果 壹 分 析 核 苷 的 最 佳 化 條 件 探 討 含 1,2- 順 式 二 醇 的 核 苷 在 高 ph 值 環 境 會 與 硼 酸 離離 子 發 生 錯 合 作 用, 改 變 分 析 物 的 質 荷 比, 影 響 分 離離 解 析 度度, 因 此 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 常 見見 於 毛 細 管 電 泳 分 離離 核 苷 的 實 驗 中 [27,45-48] 十 二 烷 基 硫硫 酸 鈉 (SDS) [27,45-47] 十 六六 烷 基 三 甲 基 溴 化 銨 (CTAB) [48], 也 被 報 導 過 用 於 微 胞 電 動 力力 毛 細 管 電 層 析 法 (MEKC) 分 離離 尿尿 液 中 核 苷 本 實 驗 初 期 曾 嘗 試 了了 於 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 加 入 CTAB 或 SDS, 但 均 無 法 順 利利 分 離離 胞 苷 與 腺 苷, 之 後 參參 考 了了 2011 年年 Xiaojing Ding 等 人 所 發 表 應 用 於 分 離離 奶 粉 中 核 苷 酸 的 方 法 [55], 利利 用 羥 丙 基 -β- 環 糊 精精 (HP-β-CD) 與 樣 品 形 成 內 包 錯 合 物 (inclusion complex) 程 度度 的 差 異異, 以 及 核 苷 與 硼 酸 離離 子 間 的 錯 合 作 用, 順 利利 分 離離 胞 苷 腺 苷 尿尿 苷 肌 苷 雙 甲 基 鳥 苷 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 等 六六 種 核 苷 標 準 品 以 下 探 討 了了 影 響 分 離離 效 率率率 的 因 素, 並 找 出 分 離離 核 苷 的 最 佳 化 條 件 一 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 的 濃 度度 對 核 苷 分 離離 之 影 響 1,2- 順 式 二 醇 與 硼 酸 鹽 的 錯 合 作 用 只 發 生 於 高 ph 值 的 環 境 下 [44], 所 以 我 們 先 將 緩 衝 溶 液 的 ph 值 維 持 在 ph 9.4, 並 將 HP-β-CD 的 濃 度度 固 定 在 30 mm, 然 後 分 別 探 討 10 15 20 25 30 mm 五 種 不不 同 濃 度度 的 四 硼 酸 鈉 緩 衝 溶 液, 對 分 離離 效 率率率 的 影 響, 分 析 核 苷 標 準 品 所 得 的 波 峰 高 度度 與 解 析 度度 的 結 果 列列 於 表 四 表 五, 而 電 泳 圖 結 果 如 圖 四 所 示 隨 著 四 硼 酸 鈉 緩 衝 溶 液 濃 度度 增 高, 因 為 離離 子 強 度度 變 大 使 得 Zeta 電 位 降降 低, 導 致 電 滲 流流 降降 低, 而 使 分 析 物 的 遷 移 時 間 拉拉 長 當 濃 度度 大 於 15 mm 時,8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 胞 苷 與 腺 苷 樣 品 訊 號 重 疊 的 情 形 會 更更 明 顯, 造 成 解 析 度度 下 降降 而 當 四 硼 酸 鈉 緩 衝 溶 液 濃 度度 為 10 mm 時, 雖 然 遷 移 時 間 較 短, 26

但 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 與 胞 苷 以 及 胞 苷 與 腺 苷 之 間 的 解 析 度度 較 四 硼 酸 鈉 緩 衝 溶 液 濃 度度 為 15 mm 時 差 因 此 選 擇 15 mm 四 硼 酸 鈉 緩 衝 溶 液 濃 度度 為 最 佳 分 離離 條 件 27

圖 四 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜 Fig. 4 Electropherograms of nucleosides in various borate buffer concentrations 在 固 定 濃 度度 的 HP-β-CD(30mM) ph 9.4 分 離離 電 壓 16 kv 偵 測 波 長 254 nm 的 條 件 下, 使 用 (A) 10 mm (B) 15 mm (C) 20 mm (D) 25 mm (E) 30 mm, 等 不不 同 濃 度度 的 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 六六 種 核 苷 標 準 品 所 得 的 電 泳 圖 譜 核 苷 分 析 物 標 示 : (1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (2) Adenosine (3) Cytidine (4) N2,N2-dimethylguanine (5) Uridine (6) Inosine 28

表 四 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 波 峰 高 度度 Table 4. Effect of various buffer concentration on peak height of the six nucleoside standards Peak height (mv) Buffer Concentration (mm) 10 15 20 25 30 8OHdG 7.64 7.88 7.11 6.80 6.87 A 5.23 5.70 5.90 5.65 5.63 C 2.87 3.13 3.25 3.18 3.19 m22g 7.10 7.55 7.75 7.62 7.48 U 4.31 4.48 4.92 4.79 4.82 I 5.25 6.48 5.30 5.22 5.06 29

表 五 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 分 析 物 解 析 度度 Table 5. Effect of various buffer concentration on resolution of the six nucleoside standards Resolution Buffer Concentration (mm) 10 15 20 25 30 8OhdG/A 0.68 0.73 0.80 0.88 0.88 A/C 1.13 1.10 0.91 0.89 1.02 C/m22G 0.95 1.14 1.09 0.98 0.89 m22g/u 2.91 3.46 2.92 2.44 2.80 U/I 1.81 2.40 2.01 1.69 1.71 30

二 HP-β-CD 的 濃 度度 對 核 苷 分 離離 之 影 響 早 在 1970 年年 代 就 學 者 發 表 使 用 環 糊 精精 膠 體 進 行行 核 酸 的 層 析 分 離離 [56], 而 Madhusudanan 等 人 以 質 譜 儀 碰 撞 誘 導 解 離離 光 譜 證 實 了了 核 苷 與 β 環 糊 精精 (β-cyclodextrin,β-cd) 會 產 生 非 共 價 鍵 結 的 主 客 錯 合 物 (host-guest complex) 或 稱 為 內 包 錯 合 物 (inclusion complex) [57] 過 去 曾 有 少 數數 文 獻 報 導 過 同 時 使 用 硼 酸 鹽 與 β-cd 或 HP-β-CD 成 功 分 離離 數數 種 核 苷 酸 [55,58-60], 而 核 苷 比 核 苷 酸 少 了了 磷 酸 基 團, 更更 容 易易 與 硼 酸 鹽 或 環 糊 精精 形 成 錯 合 物, 因 此 本 實 驗 分 別 探 討 了了 含 0 10 20 30 40 mm 五 種 不不 同 HP-β-CD 濃 度度 的 四 硼 酸 鈉 緩 衝 溶 液 (15 mm, ph 9.4) 對 核 苷 分 離離 的 影 響, 分 析 核 苷 標 準 品 所 得 的 波 峰 高 度度 與 解 析 度度 結 果 列列 於 表 六六 表 七, 而 電 泳 圖 的 結 果 如 圖 五 所 示 在 沒 有 添 加 HP-β-CD 時 可 發 現 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 腺 苷 胞 苷 的 訊 號 有 重 疊 的 現 象 當 HP-β-CD 濃 度度 由 10 mm 增 加 到 40 mm 時,8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 腺 苷 胞 苷 三 者 訊 號 的 解 析 度度 也 隨 之 上 升, 同 時 伴 隨 遷 移 時 間 逐 漸 延 長 推 測 為 核 苷 先 與 四 硼 酸 鈉 產 生 錯 合, 再 與 HP-β-CD 產 生 主 客 錯 合 物, 此 錯 合 物 較 原 先 分 析 物 帶 更更 多 負 電 且 質 量量 增 加, 因 而 延 長 遷 移 時 間, 提 高 分 離離 效 率率率 當 HP-β-CD 濃 度度 到 達 40 mm 時, 會 導 致 胞 苷 與 雙 甲 基 鳥 苷 間 的 解 析 度度 降降 低, 且 遷 移 時 間 超 過 7 分 鐘, 所 以 最 後 選 擇 30 mm HP-β-CD 作 為 最 佳 化 條 件 31

圖 五 緩 衝 溶 液 中 不不 同 HP-β-CD 濃 度度 分 析 核 苷 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜 Fig. 5 Electropherograms of nucleosides in buffer with various HP-β-CD concentrations 在 固 定 濃 度度 的 硼 酸 鹽 (15mM) 緩 衝 溶 液 ph 9.4 分 離離 電 壓 16 kv 偵 測 波 長 254 nm 的 條 件 下, 使 用 (A) 0 mm (B) 10 mm (C) 20 mm (D) 30 mm (E) 40 mm, 等 不不 同 濃 度度 的 HP-β-CD 緩 衝 溶 液 分 析 六六 種 核 苷 標 準 品 所 得 的 電 泳 圖 譜 核 苷 分 析 物 標 示 :(1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (2) Adenosine (3) Cytidine (4) N2,N2-dimethylguanine (5) Uridine (6) Inosine 32

表 六六 緩 衝 溶 液 中 不不 同 HP-β-CD 濃 度度 分 析 核 苷 所 得 的 波 峰 高 度度 Table 6. Effect of various HP-β-CD concentration in buffer on peak height of the six nucleoside standards Peak height (mv) HP-β-CD (mm) 0 10 20 30 40 8OHdG NR 7.37 6.11 5.88 6.17 A NR NR 5.67 5.64 5.64 C NR NR 3.18 3.22 3.20 m22g 7.73 7.44 6.89 6.71 6.56 U 5.29 5.01 4.85 4.72 4.56 I 7.04 0.84 6.52 6.39 6.02 NR : non resolved 33

表 七 緩 衝 溶 液 中 不不 同 HP-β-CD 濃 度度 分 析 核 苷 所 得 的 分 析 物 解 析 度度 Table 7. Effect of various HP-β-CD concentration in buffer on resolution of the six nucleoside standards Resolution HP-β-CD (mm) 0 10 20 30 40 8OhdG/A NR NR 0.96 1.02 1.00 A/C NR NR 0.91 1.03 1.15 C/m22G NR NR 1.09 0.84 0.79 m22g/u 2.54 2.97 3.11 3.54 3.42 U/I 2.24 2.53 2.21 2.26 2.33 NR : non resolved 34

三 ph 值 對 核 苷 分 離離 之 影 響 在 毛 細 管 電 泳 分 離離 的 過 程, 緩 衝 溶 液 的 ph 值 會 影 響 電 滲 流流 的 大 小, 進 而 影 響 整 體 遷 移 時 間 與 分 析 物 的 解 析 度度 此 外 緩 衝 溶 液 的 ph 值 對 核 苷 本 身 的 荷 電 的 情 形 也 有 不不 同 程 度度 的 影 響, 進 而 影 響 核 苷 在 毛 細 管 內 遷 移 的 速 度度, 因 此 可 藉 由 調 整 ph 值 來來 控 制 分 析 物 間 的 分 離離 度度 而 本 實 驗 使 用 四 硼 酸 鈉 做 為 緩 衝 溶 液, 與 帶 順 式 二 醇 的 核 苷 間 的 錯 合 作 用, 更更 深 受 ph 值 的 影 響 我 們 利利 用 5 M HCl 和 5 M NaOH 調 整 緩 衝 溶 液 酸 鹼 度度 至 9.2 9.25 9.3 9.4 9.5 等 的 五 種 ph 值, 在 15 mm 四 硼 酸 鈉 緩 衝 溶 液 ( 含 固 定 30 mm 濃 度度 的 HP-β-CD) 下 進 行行 條 件 探 討, 分 析 核 苷 標 準 品 所 得 的 波 峰 高 度度 與 解 析 度度 結 果 列列 於 表 八 表 九, 而 電 泳 圖 結 果 如 圖 六六 所 示 當 ph 值 由 9.2 升 至 9.5 時, 整 體 遷 移 時 間 延 長, 推 測 是 由 於 核 苷 - 硼 酸 鹽 錯 合 物 中 的 硼 酸 鹽 之 自 由 羥 基 離離 子 化 (pka = 9.2)[55], 而 使 得 整 個 錯 合 物 更更 具 負 電 性, 同 時 胞 苷 跟 雙 甲 基 鳥 苷 訊 號 的 解 析 度度 也 隨 之 上 升 當 ph 值 低 於 9.3 時, 胞 苷 跟 雙 甲 基 鳥 苷 訊 號 一 直 無 法 分 離離, 直 到 ph 值 達 9.4 以 上 時, 才 可 分 離離, 而 在 ph 9.5 的 情 況 下,8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 與 腺 苷 訊 號 有 會 有 重 疊 的 現 象 因 此 選 擇 ph 9.4 為 最 佳 分 離離 條 件 35

圖 六六 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜 Fig. 6 Electropherograms of nucleosides in various ph value of buffer 分 析 條 件 :15 mm 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 含 30 mm HP-β-CD 分 離離 電 壓 16 kv 偵 測 波 長 254 nm 使 用 (A) ph 9.2 (B) ph 9.25 (C) ph 9.3 (D) ph 9.4 (E) ph 9.5, 等 不不 同 ph 值 的 緩 衝 溶 液, 分 析 六六 種 核 苷 標 準 品 所 得 的 電 泳 圖 譜 核 苷 分 析 物 標 示 :(1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (2) Adenosine (3) Cytidine (4) N2,N2-dimethylguanine (5) Uridine (6) Inosine 36

表 八 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 波 峰 高 度度 Table 8. Effect of various ph value of buffer on peak height of the six nucleoside standards Peak height (mv) ph 9.20 9.25 9.30 9.40 9.50 8OHdG 7.38 7.15 7.17 6.88 6.04 A 5.92 5.64 5.73 5.34 5.54 C NR NR NR 3.00 3.27 m22g NR NR NR 7.46 6.56 U 4.58 4.54 4.55 4.50 4.48 I 6.31 6.23 6.30 6.33 6.20 NR : non resolved 37

表 九 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 解 析 度度 Table 9. Effect of various ph value of buffer on resolution of the six nucleoside standards Resolution ph 9.20 9.25 9.30 9.40 9.50 8OhdG/A 1.23 1.14 1.10 0.78 0.56 A/C NR NR NR 1.00 0.95 C/m22G NR NR NR 1.43 1.32 m22g/u NR NR NR 3.18 3.34 U/I 2.00 1.85 2.09 2.05 2.00 NR : non resolved 38

四 樣 品 前 處 理理 加 入 硼 酸 鹽 溶 液 對 核 苷 分 離離 之 影 響 除 了了 使 用 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 提 高 核 苷 的 分 離離 效 率率率, 我 們 也 嘗 試 在 樣 品 前 處 裡裡 階 段, 於 樣 品 中 直 接 添 加 四 硼 酸 鈉 溶 液, 增 加 四 硼 酸 鈉 與 核 苷 接 觸 反 應 的 時 間, 期 望 與 樣 品 先 形 成 穩 定 的 錯 合 物, 一 旦 上 機 進 行行 電 泳 時, 再 與 緩 衝 溶 液 中 HP-β-CD 結 合, 形 成 內 包 錯 合 物, 進 而 增 加 分 離離 效 率率率 本 實 驗 直 接 添 加 0 2 4 6 8 mm 五 種 不不 同 濃 度度 的 四 硼 酸 鈉 溶 液 至 樣 品 中, 然 後 探 討 其 對 核 苷 分 離離 之 影 響 分 析 核 苷 標 準 品 所 得 的 波 峰 高 度度 與 解 析 度度 結 果 列列 於 表 十 表 十 一 如 圖 七 所 示, 未 添 加 四 硼 酸 鈉 溶 液 時, 可 發 現 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 和 腺 苷 有 訊 號 重 疊 的 現 象 當 樣 品 中 添 加 2 mm 的 四 硼 酸 鈉 溶 液 時, 可 看 出 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 和 腺 苷 具 有 良良 好 的 分 離離 效 果 隨 著 添 加 的 四 硼 酸 鈉 濃 度度 增 加, 會 發 生 訊 號 強 度度 降降 低 的 現 象, 且 解 析 度度 也 變 差, 如 表 十 表 十 一 所 示, 因 此 選 擇 於 樣 品 中 添 加 2 mm 的 四 硼 酸 鈉 溶 液 作 為 最 佳 化 條 件 綜 合 前 述 影 響 核 苷 分 離離 條 件 的 實 驗 分 析 後, 我 們 將 所 探 討 出 的 最 佳 化 條 件 列列 於 表 十 二 39

圖 七 樣 品 前 處 理理 加 入 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 溶 液 所 得 的 核 苷 毛 細 管 電 泳 圖 譜 Fig. 7 Electropherograms of nucleosides with addition of various concentration of borate solution during sample pretreatment 分 析 條 件 :15 mm 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 (ph 9.4) 含 30 mm HP-β-CD 分 離離 電 壓 16 kv 偵 測 波 長 254 nm 於 樣 品 中 添 加 (A) 0 mm (B) 2 mm (C) 4 mm (D) 6 mm (E) 8 mm, 等 不不 同 濃 度度 的 硼 酸 鹽 溶 液 分 析 六六 種 核 苷 標 準 品 所 得 的 電 泳 圖 譜 核 苷 分 析 物 標 示 :(1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (2) Adenosine (3) Cytidine (4) N2,N2-dimethylguanine (5) Uridine (6) Inosine 40

表 十 樣 品 前 處 理理 加 入 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 波 峰 高 度度 Table 10. Effect of addition of various concentration of borate solution during sample pretreatment on peak height of the six nucleoside standards Peak height (mv) Sample pretreatment borate (mm) 0 2 4 6 8 8OHdG 3.11 3.28 3.27 2.83 2.97 A C m22g U I 3.41 3.84 3.49 3.53 3.57 1.87 1.86 1.82 1.73 1.84 5.26 4.44 4.22 4.08 4.37 2.72 2.42 2.38 2.05 2.26 4.50 3.77 3.55 3.36 3.72 41

表 十 一 樣 品 前 處 理理 加 入 不不 同 濃 度度 硼 酸 鹽 溶 液 分 析 核 苷 所 得 的 解 析 度度 Table 11. Effect of addition of various concentration of borate solution during sample pretreatment on resolution of the six nucleoside standards Resolution Sample pretreatment borate (mm) 0 2 4 8 10 8OhdG/A 1.01 1.52 1.18 1.33 1.33 A/C C/m22G m22g/u U/I 1.57 1.84 1.42 1.70 1.57 2.36 2.36 2.24 2.23 1.89 7.34 7.87 6.96 7.34 6.37 4.60 4.72 4.72 4.84 4.29 42

表 十 二 分 離離 核 苷 的 最 佳 化 條 件 Table 12. Optimal conditions for separating nucleoside standards Wavelength 254 nm ph 9.4 HP-β-CD concentration Applied voltage Buffer concentration Sample preparation Total length Capillary 30 mm 16 kv 15 mm borate solution 2mM borate 60 cm (50 cm effective length) 75 μm i.d. and 375 μm o.d 43

五 緩 衝 溶 液 加 入 十 二 烷 基 硫硫 酸 鈉 對 核 苷 分 離離 之 影 響 表 一 中, 有 數數 篇 文 獻 報 導 過 使 用 含 SDS 之 緩 衝 溶 液, 以 微 胞 電 動 力力 毛 細 管 電 層 析 法 (MEKC) 分 離離 尿尿 液 中 核 苷 [27,45-47], 藉 著 分 析 物 疏 水 性 的 差 異異, 則 進 入 SDS 所 形 成 的 微 胞 的 機 會 也 不不 同, 可 藉 此 增 加 分 離離 效 率率率, 同 時 伴 隨 遷 移 時 間 的 延 長 本 研 究 一 開 始 使 用 SDS 以 MEKC 方 式 分 離離 胞 苷 雙 甲 基 鳥 苷 尿尿 苷 肌 苷 等 四 種 核 苷 標 準 品, 並 探 討 了了 緩 衝 溶 液 ph 值 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 的 濃 度度 SDS 的 濃 度度 與 分 離離 電 壓 對 核 苷 分 離離 的 影 響, 結 果 此 方 法 的 最 佳 化 條 件 為 15 mm 硼 酸 緩 衝 溶 液 (ph 9.8) 添 加 25 mm SDS 分 離離 電 壓 16 kv 然 而, 使 用 此 最 佳 化 MEKC 結 合 SDS 的 方 法 分 析 胞 苷 腺 苷 尿尿 苷 肌 苷 雙 甲 基 鳥 苷 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 等 六六 種 核 苷 標 準 品 時, 卻 無 法 分 離離 胞 苷 與 腺 苷, 比 對 我 們 前 述 最 佳 化 HP-β-CD 與 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 的 方 法 ( 表 十 二 ), 則 可 完 全 分 離離 此 六六 種 核 苷 標 準 品, 結 果 如 圖 八 所 示 44

圖 八 緩 衝 溶 液 添 加 HP-β-CD 或 十 二 烷 基 硫硫 酸 鈉, 分 析 核 苷 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜 Fig. 8 Electropherograms of nucleosides with addition of HP-β-CD or SDS in borate buffer 分 析 條 件 :(A)15 mm 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 (ph 9.4) 含 30 mm HP-β-CD, 並 於 樣 品 中 添 加 2 mm 硼 酸 鹽 溶 液 ;(B) 15 mm 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 (ph 9.8) 含 25 mm 十 二 烷 基 硫硫 酸 鈉 兩兩 者 分 離離 電 壓 皆 為 16 kv, 偵 測 波 長 皆 為 254 nm, 分 析 六六 種 核 苷 標 準 品 所 得 的 電 泳 圖 譜 核 苷 分 析 物 標 示 :(1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (2) Adenosine (3) Cytidine (4) N2,N2-dimethylguanine (5) Uridine (6) Inosine 45

六六 樣 品 保 存 溫 度度 對 核 苷 訊 號 之 影 響 核 苷 在 ph 值 高 於 5 的 溶 液 中, 很 容 易易 會 發 生 降降 解 的 情 形 [61,62], 此 外 溫 度度 也 可 能 會 加 速 尿尿 液 檢 體 中 核 苷 分 解 的 情 形 2007 年年, 學 者 Szymanska 就 針 對 ph 5.2,pH 6.7,pH 7.4 等 三 種 不不 同 酸 鹼 值 的 尿尿 液, 一 組 酸 化 至 ph 4 之 後 保 存 於 -24, 另 一 組 則 不不 酸 化 尿尿 液, 直 接 保 存 於 -24 下, 並 於 第 一 二 三 個 月 時, 解 凍 檢 測 尿尿 液 檢 體 中 核 苷 降降 解 的 情 況, 結 果 發 現 不不 論論 有 無 酸 化 尿尿 液, 核 苷 降降 解 的 情 況 並 無 顯 著 差 異異 ( 差 異異 性 小 於 10%) [47], 因 此 尿尿 液 中 核 苷 毋 須 經 過 酸 化 處 理理, 可 於 -24 下 保 存 至 少 三 個 月 大 部 分 研 究 用 尿尿 液 檢 體 收 集, 會 經 由 醫 院 檢 驗 單 位 代 為 收 集, 分 裝 處 理理, 然 後 置 於 4 冰 箱, 直 到 轉 移 到 專 門 存 放 檢 體 的 -20 或 -80 冰 箱 所 以 尿尿 液 檢 體 有 相 當 時 間 會 處 於 室 溫 ( 病 人 採 集 尿尿 液 後 至 檢 驗 單 位 處 理理 前 ) 或 4 的 情 況 下, 因 此 本 研 究 進 一 步 探 討, 於 室 溫,4,-80 情 形 下, 尿尿 液 中 核 苷 訊 號 的 變 化 我 們 將 兩兩 位 健 康 對 照 組 受 試 者 的 尿尿 液 保 存 於 室 溫,4,-80 等 三 種 溫 度度 下, 並 於 24 小 時,72 小 時,120 小 時 三 個 時 間 點, 偵 測 尿尿 液 中 肌 苷 訊 號 變 化 情 形, 結 果 如 圖 九 所 示, 三 種 保 存 溫 度度 在 24 小 時 內, 訊 號 變 化 無 顯 著 差 異異, 而 4 保 存 下, 在 72 小 時 內, 訊 號 無 顯 著 下 降降 情 形 一 般 檢 驗 單 位 尿尿 液 檢 體 處 理理 流流 程 下, 檢 體 大 部 分 會 存 放 於 4 保 存, 因 此 只 要 72 小 時 內, 將 檢 體 轉 存 至 研 究 檢 體 專 用 的 -80 冰 箱, 即 可 減 少 核 苷 訊 號 自 然 降降 解 造 成 的 誤 差 另 一 方 面, 這 也 表 示 若若 要 進 行行 大 規 模 篩 檢 而 有 大 量量 的 尿尿 液 檢 體 時, 可 先 將 檢 體 冰 存 於 當 地 簡 易易 的 檢 體 冰 箱 (4 ), 然 後 72 小 時 內 低 溫 宅宅 配 至 實 驗 室 研 究 檢 體 專 用 的 -80 冰 箱 即 可 46

圖 九 不不 同 檢 體 保 存 溫 度度 與 尿尿 液 中 核 苷 訊 號 的 變 化 Fig. 9 Urinary inosine degradation in various storage temperature 47

七 方 法 確 效 以 HP-β-CD 結 合 硼 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 離離 核 苷 的 最 佳 分 離離 條 件 如 表 十 二 所 示 應 用 此 條 件 可 在 7 分 鐘 內 完 全 分 離離 六六 種 核 苷 使 用 此 最 佳 化 條 件 分 析 六六 種 核 苷 標 準 品 的 線 性 範 圍, 皆 介 於 3 μm ~ 500 μm 之 間, 如 表 十 三 所 示 以 訊 號 / 雜 訊 比 為 3 所 對 應 的 濃 度度 定 義 為 偵 測 極 限 LOD 時, 則 六六 種 核 苷 之 LOD 值 分 別 是 : 8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 為 1.47 μm ; 腺 苷 為 1.31 μm ; 胞 苷 為 1.12 μm ;N2,N2- 雙 甲 基 鳥 苷 為 0.65 μm ; 尿尿 苷 為 1.35 μm ; 肌 苷 為 1.14 μm 當 訊 號 / 雜 訊 比 為 10 所 對 應 的 濃 度度 定 義 為 定 量量 極 限 LOQ 時, 則 六六 種 核 苷 之 LOQ 分 別 是 :8- 羥 基 去 氧 鳥 苷 為 4.91 μm ; 腺 苷 為 4.37 μm ; 胞 苷 為 3.72 μm ;N2,N2- 雙 甲 基 鳥 苷 為 2.17 μm ; 尿尿 苷 為 4.50 μm ; 肌 苷 為 3.81 μm 同 日 間 (Intraday)RSD 小 於 2.25 %, 且 異異 日 間 (interday)rsd 小 於 2.81 % 我 們 同 時 也 使 用 標 準 品 添 加 法 測 量量 尿尿 液 樣 品 中 核 苷 的 回 收 率率率, 結 果 其 範 圍 介 於 86 ~ 110 % 之 間 ( 表 十 四 ), 在 80 ~ 120% 可 接 受 範 圍 之 內 綜 合 以 上 之 數數 據 資 料料 顯 示 本 研 究 所 開 發 之 方 法 再 現 性 良良 好, 具 有 可 靠 性 將 本 研 究 所 開 發 出 來來 的 方 法 與 表 一 中 其 他 毛 細 管 電 泳 分 析 尿尿 液 核 苷 的 研 究 比 較, 本 方 法 分 離離 時 間 短, 且 樣 品 不不 需 複 雜 的 固 相 萃 取 之 前 處 理理, 而 偵 測 極 限 也 不不 亞 於 其 他 以 紫 外 光 偵 測 訊 號 的 研 究 ( 表 十 五 ), 因 此 有 潛 力力 可 應 用 於 大 量量 實 際 樣 品 的 分 析 48

表 十 三 檢 量量 線 的 線 性 範 圍, 精精 確 度度, 偵 測 極 限 與 定 量量 極 限 Table 13. Linearity, linear range of calibration curve, precision, limit of detection and limit of quantitation Compound Linear range (μm) Linear equation R Repeatability (%) Reproducibility (%) LOD (μm) a LOQ (μm) a 8OHdG 5-300 Y = 62005 X - 0.0508 0.9938 1.40 1.87 1.47 4.91 A 5-300 Y= 68982 X - 0.1847 0.9917 1.75 1.97 1.31 4.37 C 3-100 Y = 36208 X - 0.0444 0.9967 2.25 2.81 1.12 3.72 m22g 3-300 Y = 76790 X - 0.3589 0.9905 1.57 2.29 0.65 2.17 U 5-500 Y = 38553 X - 0.3534 0.9912 0.80 1.60 1.35 4.50 I 3-300 Y = 72240 X - 0.1344 0.9947 0.58 1.86 1.14 3.81 LOQ: S/N=10;LOD: S/N=3;RSD for 3 replicate injections on the same day (repeatability) or over successive days (reproducibility) of peak height 49

表 十 四 準 確 度度 ( 回 收 率率率 ) Table 14. Accuracy (recovery) Ingredient Original (μm) Added (μm) Found (μm) Recovery (%) 8OHdG ND 10 11 110 A 47 10 54 95 C 12 10 19 86 m22g ND 10 9 90 U 13 10 23 100 I 61 10 74 104 50

表 十 五 以 毛 細 管 電 泳 法 分 離離 尿尿 液 中 核 苷 的 研 究 及 其 分 析 條 件 Table 15. Analytical conditions of studies determining urinary nucleosides by capillary electrophoresis Real sample Preparation Detection type Condition Analysis Urine SPE CE-MS with positive ion mode BGE: prepared by mixing 150 mm acetic acid with 15% methanol and 15% ethanol; uncoated fused silica capillary (60 cm 50 μm I.D.); voltage 25 kv Urine SPE UV at 254 nm BGE: 300 mm SDS, 25 mm Na2B4O7, 50 mm phosphate (ph 6.9); uncoated fused silica capillary (50 cm 50 μm I.D.); voltage 7 kv Urine SPE UV at 254 nm BGE: 160 mm SDS, 100 mm Na2B4O7, 72.5 mm NaH2PO4 (ph 6.7) ; uncoated fused silica capillary (70 cm 50 μm I.D.); voltage 25 kv Urine SPE UV in the range from 190 to 390 nm BGE: 25 mm borate, 42.5 mm phosphate ph 6.7, 200 mm SDS; uncoated fused-silica capillary (57.0 cm 50 mm I.D.); voltage 15 kv, Urine SPE UV at 254 nm BGE: 25 mm CTAB, 25 mm Na2B4O7, 25 mm NaH2PO4 (ph 9.50); uncoated fused silica capillary (48 cm 50 μm I.D.);; voltage 15 kv Urine SPE UV at 254 nm BGE: 300 mm SDS, 25 mm Na2B4O7, 50 mm NaH2PO4 (ph 6.9); uncoated fused silica capillary (50 cm 50 mm I.D.); voltage 7 kv time LOD 18 min 0.009 3.82 (μm) 45 min 3.1 74.2 (μm) 25 min 0.17 2.26 (μm) 30 min 4.8 12.2 (μm) 7 min 0.55 1.67 ( M) Ref. [49] [45] [47] [46] [48] 45 min - [27] 51

貳 分 析 肌 酸 酐 最 佳 化 條 件 探 討 肌 酸 酐 (creatinine) 是 由 肌 肉 中 的 能 量量 傳 遞 單 位 : 肌 酸 (creatine) 和 磷 酸 肌 酸 (phosphocreatine) 所 產 生 的 代 謝 廢 物 在 正 常 情 況 下, 它 會 以 恆 定 的 速 率率率 經 由 腎 臟 排 泄 至 尿尿 液 中, 而 肌 酸 酐 的 產 生 量量 會 與 個 體 的 肌 肉 質 量量 成 正 比 尿尿 液 中 的 肌 酸 酐 含 量量, 通 常 以 肌 酸 酐 清 除 率率率 的 形 式 來來 表 示, 用 以 評 估 腎 臟 功 能 或 肌 肉 功 能 障 礙 此 外, 尿尿 中 的 肌 酸 酐 濃 度度 也 經 常 被 用 來來 當 作 一 個 標 準 化 的 工 具, 當 尿尿 液 中 藥 物 濃 度度 或 外 源 性 化 學 物 質 的 濃 度度 除 以 尿尿 液 中 肌 酸 酐 的 濃 度度 所 得 的 比 值 作 為 一 個 定 量量 的 評 估 時, 可 避 免 尿尿 液 中 水 含 量量 的 差 異異 造 成 的 干 擾 正 常 人 尿尿 液 中 肌 酸 酐 濃 度度 範 圍 為 2.5 至 23 毫 莫 爾 濃 度度 (mm), 而 低 於 0.45 mm 時 則 可 能 出 現 加 入 尿尿 液 以 外 的 液 體 做 稀 釋 的 情 況 傳 統 上 肌 酸 酐 的 定 量量 法 是 由 肌 酸 酐 與 苦 味 酸 (picric acid) 在 鹼 性 溶 液 中 形 成 有 色 的 錯 合 物 (JAFFE 反 應 ), 之 後 以 分 光 光 度度 計 測 定 波 長 505 nm 的 吸 收 值 來來 定 量量 肌 酸 酐 與 化 學 方 法 相 比, 儀 器 分 析 如 毛 細 管 電 泳 法 能 提 供 更更 高 的 準 確 度度 和 精精 確 度度 [63] 本 研 究 也 參參 考 Munoz 等 人 發 表 於 2010 年年 的 方 法 [64], 以 毛 細 管 電 泳 法 偵 測 尿尿 液 中 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 濃 度度, 並 探 討 的 緩 衝 溶 液 ph 值, 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 的 濃 度度 與 分 離離 電 壓 對 分 離離 效 率率率 的 影 響 實 驗 初 期, 吾 人 計 畫 偵 測 尿尿 液 中 肌 酸 酐 濃 度度, 用 來來 標 準 化 尿尿 液 中 核 苷 的 含 量量, 同 時 計 畫 觀 察 腺 嘌 類類 核 苷 代 謝 的 終 產 物 尿尿 酸 在 癌 症 病 人 尿尿 液 中 的 變 化, 但 之 後 考 慮 到 影 響 尿尿 酸 濃 度度 的 因 素 太 多 ( 如 飲 食, 藥 物 等 等 ), 且 專 一 性 不不 佳, 因 此 最 後 並 未 量量 測 癌 症 病 患 尿尿 液 中 的 尿尿 酸 濃 度度 52

一 ph 值 對 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 分 析 之 影 響 我 們 以 固 定 濃 度度 10 mm 的 磷 酸 緩 衝 溶 液, 在 ph 2.0, ph 3.0, ph 4.0, ph 5.0, 與 ph 6.0 等 五 種 不不 同 條 件 下, 偵 測 波 長 設 定 在 240 nm, 而 分 離離 電 壓 為 20 kv, 對 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 標 準 品 進 行行 電 泳 分 析, 探 討 ph 值 對 於 分 析 物 訊 號 強 度度 與 遷 移 時 間 的 影 響 其 電 泳 圖 如 圖 十 所 示, 而 波 峰 高 度度 與 遷 移 時 間 的 數數 據 分 別 列列 於 表 十 六六 表 十 七 結 果 發 現, 隨 著 ph 值 升 高, 遷 移 時 間 也 隨 之 縮 短, 這 是 因 為 ph 提 高 時, 會 使 毛 細 管 中 的 矽 醇 官 能 基 解 離離 更更 充 分, 其 所 產 生 的 Zeta 電 位 差 大, 故 電 滲 流流 遷 移 的 力力 量量 也 增 加, 因 而 縮 短 分 析 物 的 遷 移 時 間 當 ph 值 大 於 4.0 時, 雖 然 遷 移 時 間 短, 但 波 形 變 寬 且 產 生 拖 尾 峰 的 情 形, 而 在 ph 值 小 於 2.0 時, 雖 然 肌 酸 酐 和 尿尿 酸 可 完 全 分 離離, 但 是 兩兩 者 訊 號 皆 產 生 波 峰 變 寬 的 情 形, 且 整 體 遷 移 時 間 超 過 10 分 鐘, 因 此 我 們 採 用 ph 值 3.0 為 最 佳 化 條 件 53

圖 十 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜 Fig. 10 Electropherograms of creatinine and uric acid in phosphate buffer with various ph 分 析 條 件 :10 mm 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 離離 電 壓 20 kv 偵 測 波 長 240 nm 使 用 (A) ph 2.0 (B) ph 3.0 (C) ph 4.0 (D) ph 5.0 (E) ph 6.0, 等 不不 同 ph 值 的 緩 衝 溶 液, 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 標 準 品 所 得 的 電 泳 圖 譜 分 析 物 標 示 :(1) 肌 酸 酐,(2) 尿尿 酸 54

表 十 六六 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 波 峰 高 度度 與 遷 移 時 間 Table 16. Effect of various ph value of buffer on peak height of creatinine and uric acid Peak height (mv) ph 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Cr 2.68 4.07 2.78 3.88 1.81 UA 4.48 9.46 3.95 5.54 2.02 55

表 十 七 不不 同 ph 值 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 遷 移 時 間 Table 17. Effect of various ph value of buffer on migration time of creatinine and uric acid Migration time (min) ph 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Cr 2.78 3.14 2.37 2.58 2.60 UA 9.18 6.81 4.41 3.67 3.91 56

二 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 的 濃 度度 對 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 分 析 之 影 響 固 定 溶 液 ph 值 (ph 3.0) 與 分 離離 電 壓 (20 kv), 我 們 分 別 以 5 mm 10 mm 15 mm 20 mm 25 mm 五 種 不不 同 濃 度度 的 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液, 進 行行 毛 細 管 電 泳 分 離離 肌 酸 酐 和 尿尿 酸, 並 探 討 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 的 濃 度度 對 分 離離 效 率率率 之 影 響, 所 得 的 波 峰 高 度度 與 遷 移 時 間 的 數數 據 分 別 列列 於 表 十 八 表 十 九 如 電 泳 圖 十 一 所 示, 隨 著 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 濃 度度 增 高, 離離 子 強 度度 也 越 強, 而 使 得 Zeta 電 位 差 變 小, 電 滲 流流 也 跟 著 下 降降, 使 得 分 析 物 的 遷 移 時 間 拉拉 長, 但 是 分 析 物 的 波 峰 高 度度 也 相 對 提 高 當 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 小 於 15 mm 時, 雖 然 整 體 的 遷 移 時 間 小 於 10 分 鐘, 然 而 肌 酸 酐 和 尿尿 酸 訊 號 的 波 峰 寬 度度 較 寬, 訊 號 強 度度 較 低 當 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 濃 度度 到 達 25 mm 時, 尿尿 酸 的 遷 移 時 間 超 過 13 分 鐘, 且 電 流流 值 相 對 也 較 高, 因 此 最 後 選 擇 20 mm 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 濃 度度 為 最 佳 分 離離 條 件 57

圖 十 一 不不 同 濃 度度 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 毛 細 管 電 泳 圖 譜 Fig. 11 Electropherograms of creatinine and uric acid in various concentration of phosphate buffer 分 析 條 件 : 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 ph 3 分 離離 電 壓 20 kv 偵 測 波 長 240 nm 使 用 (A) 5 mm (B) 10 mm (C) 15 mm (D) 20 mm (E) 25 mm, 等 不不 同 濃 度度 的 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液, 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 標 準 品 所 得 的 電 泳 圖 譜 分 析 物 標 示 :(1) 肌 酸 酐,(2) 尿尿 酸 58

表 十 八 不不 同 濃 度度 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 波 峰 高 度度 Table 18. Effect of various phosphate buffer concentration on peak height of creatinine and uric acid Peak height (mv) Buffer concentration (mm) 5 10 15 20 25 Cr 3.60 4.07 5.77 6.84 5.71 UA 4.47 9.46 13.57 15.60 15.56 59

表 十 九 不不 同 濃 度度 磷 酸 鹽 緩 衝 溶 液 分 析 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 所 得 的 遷 移 時 間 Table 19. Effect of various phosphate buffer concentration on migration time of creatinine and uric acid Migration time (min) Buffer concentration (mm) 5 10 15 20 25 Cr 3.02 3.14 3.34 4.04 3.92 UA 5.58 6.81 8.56 12.62 13.40 60

三 電 壓 對 肌 酸 酐 與 尿尿 酸 分 析 之 影 響 在 電 泳 實 驗 中, 電 壓 越 大 可 增 加 電 場 強 度度, 提 高 分 離離 效 果 與 速 度度, 但 也 會 造 成 焦 耳 熱 上 升, 而 產 生 再 現 性 不不 佳 的 問 題 本 實 驗 分 別 以 17.5 kv 20.0 kv 22.5 kv 25.0 kv 27.5 kv 五 種 不不 同 電 壓 進 行行 電 泳 分 析, 希 望 找 出 分 離離 快, 又 能 保 有 良良 好 再 現 性 的 電 壓 條 件, 其 電 泳 圖 結 果 如 圖 十 二 所 示, 而 波 峰 高 度度 與 遷 移 時 間 的 結 果 列列 於 表 二 十 表 二 十 一 隨 著 電 壓 提 高, 分 離離 時 間 會 縮 短, 在 27.5 kv 下, 分 離離 肌 酸 酐 和 尿尿 酸 只 需 9 分 鐘, 然 而 因 電 流流 值 過 高 (>100 μa), 容 易易 發 生 基 線 不不 穩 的 情 況, 且 尿尿 酸 訊 號 出 現 波 峰 寬 度度 變 寬 的 情 形, 故 沒 有 繼 續 嘗 試 更更 高 的 電 壓 進 行行 探 討 當 施 加 電 壓 為 17.5 kv 20.0 kv 22.5 kv 時, 肌 酸 酐 和 尿尿 酸 的 解 析 度度 良良 好, 但 遷 移 時 間 過 超 過 13 分 鐘, 且 整 體 分 析 物 的 波 形 較 其 它 電 壓 來來 得 寬, 推 測 是 由 於 溶 質 在 毛 細 管 內 停 留留 時 間 比 較 久, 產 生 擴 散 作 用 的 影 響 最 後 選 擇 25.0 kv 為 最 佳 分 離離 條 件 61