226 2015, Vol.36, No.02 食 品 科 学 包 装 贮 运 不 同 时 期 鲳 鱼 冷 藏 期 间 优 势 腐 败 菌 的 多 样 性 变 化 蓝 蔚 青, 谢 晶 *, 周 会, 张 琛 杰 ( 上 海 海 洋 大 学 食 品 学 院, 上 海 水 产 品 加 工 及 贮 藏 工 程 技 术 研 究 中 心, 上 海 201306) 摘 要 : 目 的 : 比 较 分 析 不 同 时 期 冷 藏 鲳 鱼 (Pampus argenteus) 贮 藏 期 间 的 感 官 品 质 ph 值 微 生 物 指 标 与 主 要 微 生 物 菌 群 的 变 化 规 律 方 法 : 冷 藏 (4±1) 条 件 下, 以 感 官 评 定 ph 值 与 菌 落 总 数 为 品 质 评 价 指 标, 采 用 聚 合 酶 链 式 反 应 (polymerase chain reaction,pcr) 扩 增 结 合 生 理 生 化 鉴 定 法 分 别 对 冬 春 两 个 时 期 的 鲳 鱼 进 行 优 势 腐 败 菌 的 变 化 规 律 研 究 将 经 细 菌 培 养 与 分 离 纯 化 得 到 单 菌 落 按 其 形 态 特 征 进 行 分 类, 再 通 过 生 理 生 化 鉴 定 与 革 兰 氏 染 色, 初 步 得 到 菌 落 种 类, 对 单 菌 落 进 行 DNA 提 取 与 PCR 扩 增 并 测 序 结 果 : 冬 季 样 品 获 得 12 种 菌 株, 春 季 样 品 获 得 9 种 菌 株 贮 藏 末 期 时, 冬 季 样 品 中 优 势 腐 败 菌 的 种 类 与 比 例 分 别 为 嗜 冷 杆 菌 (Psychrobacter spp.) 21.51% 草 莓 假 单 胞 菌 (Pseudomonas fragi)16.13% 荧 光 假 单 胞 菌 (Pseudomonas fluorescens)52.68% 与 热 杀 索 丝 菌 (Brochothrix thermosphacta)9.68%; 春 季 样 品 为 草 莓 假 单 胞 菌 (Pseudomonas fragi)8.62% 荧 光 假 单 胞 菌 (Pseudomonas fluorescens)64.66% 与 腐 败 希 瓦 氏 菌 (Shewanella putrefaciens)26.72% 结 论 : 冬 春 时 期 中 冷 藏 鲳 鱼 贮 藏 期 间 优 势 腐 败 菌 的 种 类 基 本 一 致, 以 革 兰 氏 阴 性 菌 为 主, 但 在 细 菌 种 类 与 比 例 上 存 在 差 异, 冬 季 样 品 的 微 生 物 种 类 较 春 季 丰 富 贮 藏 期 间, 随 着 荧 光 假 单 胞 菌 所 占 比 例 的 增 加, 使 腐 败 希 瓦 氏 菌 的 生 长 受 到 明 显 抑 制 关 键 词 : 鲳 鱼 ; 不 同 时 期 ; 冷 藏 ; 优 势 腐 败 菌 ; 微 生 物 多 样 性 Diversity of Dominant Spoilage Bacteria in Pomfret (Pampus argenteus) from Different Growing Seasons during Chilled Storage LAN Weiqing, XIE Jing*, ZHOU Hui, ZHANG Chenjie (Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China) Abstract: Objective: Changes in the sensory and microbial quality, ph and dominant microflora of pomfret (Pampus argenteus) from different growing seasons (winter and spring)were investigated during chilled storage. Methods: Based on the results of sensory evaluation, ph and total viable count (TVC), the diversity of dominant spoilage bacteria in pomfret were monitored by the combination of PCR amplification with physiological and biochemical identification. After separation and purification of dominant spoilage bacteria in pomfret, the single colony types of bacteria were classified according to their morphological features, physio-biochemical identification, Gram staining, DNA extraction, PCR amplification and sequencing. Results: Totally 12 strains of bacteria were obtained in winter samples () and 9 strains of bacteria in spring samples (). The dominant spoilage bacteria in included 21.51% Psychrobacter spp., 16.13% Pseudomonas fragi, 52.68% Pseudomonas fluorescens and 9.68% Brochothrix thermosphacta, while those in dominant spoilage bacteria in spring samples () included 8.62% Pseudomonas fragi, 64.66% Pseudomonas fluorescens and 26.72% Shewanella putrefaciens. Conclusion: The species of dominant spoilage bacteria in pomfrets from both seasons during chilled storage were mainly composed of Gram-negative bacteria, the species and proportion of bacteria were different between the two seasons. Microbial species were more abundant in winter than those in spring. With the high proportion of Pseudomonas fluorescens, the growth of Shewanella putrefaciens was inhibited obviously during chilled storage. Key words: Pampus argenteus; different growing seasons; chilled storage; dominant spoilage bacteria; microbial diversity 中 图 分 类 号 :TS254.4 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :1002-6630(2015)02-0226-06 doi:10.7506/spkx1002-6630-201502044 收 稿 日 期 :2014-07-05 基 金 项 目 : 十 二 五 国 家 科 技 支 撑 计 划 项 目 (2012BAD38B09); 上 海 市 科 技 兴 农 项 目 ( 沪 农 科 攻 字 2013 第 3-4 号 ); 上 海 海 洋 大 学 科 技 发 展 专 项 作 者 简 介 : 蓝 蔚 青 (1977), 男, 高 级 工 程 师, 博 士, 研 究 方 向 为 水 产 品 低 温 保 鲜 技 术 E-mail:wqlan@shou.edu.cn * 通 信 作 者 : 谢 晶 (1968), 女, 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 水 产 品 低 温 保 鲜 技 术 E-mail:jxie@shou.edu.cn
包 装 贮 运 食 品 科 学 2015, Vol.36, No.02 227 鲳 鱼 (Pampus argenteus) 属 鲈 形 目 鲳 科, 主 要 分 布 于 我 国 东 海 与 南 海 区 域, 是 季 节 性 洄 游 的 近 海 中 下 层 鱼 类 之 一, 为 我 国 重 要 的 鱼 类 资 源 鲳 鱼 体 内 含 8 种 人 体 所 必 需 的 氨 基 酸 与 不 饱 和 脂 肪 酸, 蛋 白 质 含 量 达 16.8%, 且 富 含 维 生 素 (VA VD VB 1 VPP) 和 矿 物 质, 营 养 丰 富 [1] 水 产 品 由 于 受 到 温 度 酶 微 生 物 机 械 损 伤 与 化 学 污 染 等 多 种 因 素 的 影 响, 在 冷 藏 流 通 过 程 中 鲜 度 极 易 下 降, 从 而 产 生 不 可 逆 的 腐 败 变 质 现 象 其 中, 微 生 物 是 导 致 多 数 水 产 品 腐 败 变 质 的 主 要 原 因 现 研 究 发 现, 腐 败 过 程 中, 只 极 少 种 类 的 特 定 腐 败 菌 参 与 这 一 过 程 并 产 生 不 可 接 受 的 异 味 [2], 引 起 ph 值 变 化 品 质 下 降 与 产 品 腐 败, 毒 害 物 质 随 之 产 生 这 些 适 合 生 存 繁 殖 并 产 生 腐 败 臭 味 代 谢 产 物 的 菌 群 就 是 该 产 品 的 特 定 腐 败 菌 [3] 特 定 腐 败 菌 的 生 长 速 度 快 于 其 他 微 生 物, 且 腐 败 活 性 强 [4] 贮 藏 初 期, 其 数 量 和 种 类 并 不 占 明 显 优 势, 但 在 贮 藏 期 间, 这 些 微 生 物 易 适 应 环 境 变 化 而 大 量 繁 殖, 引 起 腐 败, 在 数 量 与 比 重 上 占 绝 对 优 势, 其 他 菌 种 所 占 比 例 明 显 减 少 或 不 再 繁 殖 因 此, 如 何 延 缓 水 产 品 的 品 质 劣 变, 延 长 其 贮 藏 货 架 期, 抑 制 由 于 微 生 物 作 用 而 引 起 的 腐 败 变 质, 现 已 成 为 科 研 工 作 者 普 遍 关 注 的 热 点 近 年 来, 国 内 外 学 者 对 引 起 水 产 食 品 腐 败 变 质 的 微 生 [5-6] 物 开 展 了 相 关 研 究 工 作 崔 正 翠 等 对 大 菱 鲆 在 不 同 温 度 贮 藏 过 程 中 的 细 菌 菌 相 进 行 定 性 和 定 量 分 析, 并 研 究 其 细 菌 组 成 变 化 和 优 势 腐 败 菌, 结 果 得 出 大 菱 鲆 在 0~10 冷 藏 过 程 中 的 优 势 腐 败 菌 是 腐 败 希 瓦 氏 菌, 其 次 是 假 单 [7-8] 胞 菌 曹 荣 等 以 养 殖 南 美 白 对 虾 海 捕 鹰 爪 虾 与 太 平 洋 牡 蛎 为 研 究 对 象, 对 其 贮 藏 过 程 中 细 菌 总 数 和 菌 相 变 化 进 行 研 究, 其 中 发 现 虾 类 与 牡 蛎 中 的 优 势 腐 败 菌 也 以 假 [9-10] 单 胞 菌 为 主 郭 全 友 等 研 究 了 冷 藏 罗 非 鱼 和 养 殖 大 黄 [11] 鱼 的 细 菌 组 成 优 势 腐 败 菌 及 特 征 张 小 伟 等 对 鲤 鱼 冷 [12] 藏 过 程 中 的 鲜 度 和 菌 相 进 行 了 分 析 杨 宪 时 等 对 冷 藏 罗 非 [13] 鱼 的 细 菌 种 群 变 化 开 展 了 研 究 许 钟 等 建 立 了 罗 非 鱼 的 特 点 腐 败 菌 生 长 动 力 学 模 型, 并 对 其 货 架 期 进 行 了 预 测 郭 红 [14] [15] 王 凌 燕 等 分 别 对 南 美 白 对 虾 在 冰 温 条 件 下 的 菌 相 变 化 和 [16] 腐 败 微 生 物 开 展 了 分 析 王 庆 丽 等 对 养 殖 大 黄 鱼 和 海 水 鲈 鱼 冷 藏 过 程 中 特 定 腐 败 菌 进 行 研 究 以 上 研 究 结 果 也 为 本 课 题 在 后 期 开 展 鲳 鱼 冷 藏 期 间 的 优 势 腐 败 菌 多 样 性 分 析 提 供 了 基 础 数 据 本 实 验 主 要 以 冬 春 两 个 时 期 的 鲳 鱼 作 为 原 料, 在 进 行 感 官 评 定 ph 值 与 菌 落 总 数 比 较 分 析 的 同 时, 同 时 采 用 聚 合 酶 链 式 反 应 (polymerase chain reaction,pcr) 扩 增 结 合 生 理 生 化 鉴 定 法, 研 究 不 同 时 期 鲳 鱼 冷 藏 期 间 优 势 腐 败 菌 的 变 化 规 律, 为 生 鲜 水 产 品 的 贮 藏 保 鲜 提 供 参 考 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 试 剂 与 仪 器 鲳 鱼 (Pampus argenteus) 购 自 上 海 芦 潮 港 海 鲜 批 发 市 场, 条 质 量 0.25~0.50 kg 其 中, 冬 季 样 品 (winter samples,): 采 样 时 间 为 2013 年 12 月, 春 季 样 品 (spring samples,): 采 样 时 间 为 2014 年 3 月 选 择 这 2 个 时 期 分 别 进 行 样 品 采 集, 并 开 展 实 验 研 究 胰 蛋 白 胨 大 豆 琼 脂 培 养 基 胰 蛋 白 胨 大 豆 肉 汤 上 海 市 疾 病 预 防 控 制 中 心 ; 革 兰 氏 染 液 与 微 生 物 生 理 生 化 微 量 鉴 定 管 杭 州 天 和 生 物 制 剂 限 公 司 ; dp Mixture 10 PCR Buffer TaqDNA 酶 日 本 TaKaRa Bio 株 式 会 社 ; 引 物 27f 1 492r TAE 电 泳 缓 冲 液 (50 TAE) Biospin 细 菌 基 因 组 DNA 提 取 盒 6 Loading Buffer Marker:λDNA /HindⅢ 100 bp DNA Ladder 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 限 公 司 DK-8D 型 电 热 恒 温 水 槽 隔 水 式 恒 温 培 养 箱 DHG-9053A 型 电 热 鼓 风 干 燥 箱 上 海 一 恒 科 技 限 公 司 ;MLS-3750 高 压 灭 菌 锅 上 海 赛 默 科 技 生 物 发 展 限 公 司 ;LDZX-75KBS 立 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 上 海 申 安 医 疗 器 械 厂 ;VS-1300L-U 型 标 准 超 净 工 作 台 苏 州 安 泰 空 气 技 术 限 公 司 ;THZ-82A 型 气 浴 恒 温 振 荡 器 高 速 离 心 机 江 苏 金 坛 市 环 宇 科 学 仪 器 厂 ;MiniSpan Plue 微 型 杭 州 奥 盛 仪 器 限 公 司 ;Disrupter genie DNA 混 匀 器 TC-24/H(b) 型 基 因 扩 增 仪 科 技 限 公 司 ;DYY-6C 型 电 泳 仪 杭 州 博 日 北 京 市 六 一 仪 器 厂 ; 凝 胶 成 像 系 统 ZEI Scope A1. AXIO 电 子 显 微 镜 上 海 永 傲 精 密 仪 器 限 公 司 1.2 方 法 1.2.1 原 料 处 理 选 择 体 型 较 大, 色 泽 光 亮, 肉 质 较 硬, 异 味 的 新 鲜 鲳 鱼, 鱼 样 捕 捞 上 岸 后 即 置 于 碎 冰 中,30 min 内 运 至 实 验 室 进 行 实 验 2 个 采 样 期 内 分 别 随 机 选 取 新 鲜 鲳 鱼 10 条, 将 样 品 经 三 去 ( 去 头 去 尾 去 内 脏 ) 处 理, 用 冰 水 清 洗 后 切 块, 每 份 鱼 样 约 质 量 40 g, 分 别 置 于 保 鲜 袋 中, 在 (4±1) 冰 箱 中 贮 藏, 隔 天 取 样 后 进 行 指 标 测 定 与 微 生 物 多 样 性 分 析 1.2.2 感 官 评 定 [17] 根 据 鲜 冻 鲳 鱼 标 准 采 用 5 分 制 评 分 法, 由 5 名 专 业 人 士 组 成 的 感 官 评 定 小 组, 分 别 从 样 品 的 色 泽 气 味 组 织 形 态 和 弹 性 结 构 4 个 方 面 综 合 评 分, 结 果 取 平 均 值 评 分 标 准 见 表 1, 当 样 品 的 评 定 综 合 指 标 在 3 分 以 下 时, 视 为 其 初 期 腐 败 的 开 始
228 2015, Vol.36, No.02 食 品 科 学 包 装 贮 运 Table 1 表 1 鲳 鱼 感 官 评 定 表 Criteria for sensory evaluation of pomfret fillets 项 目 好 (5 分 ) 较 好 (4 分 ) 一 般 (3 分 ) 较 差 (2 分 ) 差 (1 分 ) 色 泽 气 味 组 织 形 态 弹 性 结 构 色 泽 正 常, 肌 肉 切 面 富 光 泽 本 种 类 固 香 味 清 新 肌 肉 组 织 致 密 完 整, 纹 理 很 清 晰 坚 实 富 弹 性, 手 指 压 后 凹 陷 立 即 消 失 色 泽 正 常, 肌 肉 切 面 光 泽 固 香 味, 较 清 新 肌 肉 组 织 紧 密, 纹 理 较 清 晰 坚 实 弹 性, 手 指 压 后 凹 陷 较 快 消 失 色 泽 稍 暗 淡, 肌 肉 切 面 稍 光 泽 固 香 味 清 淡, 略 带 异 味 肌 肉 组 织 不 紧 密, 但 不 松 散 较 弹 性, 手 指 压 后 凹 陷 消 失 较 慢 色 泽 较 暗 淡, 肌 肉 切 面 光 泽 色 泽 暗 淡, 肌 肉 切 面 光 泽 香 味 消 失, 强 烈 腥 臭 味 或 胺 味 腥 臭 为 或 氨 臭 味 肌 肉 组 织 不 紧 密, 局 部 松 散 稍 弹 性, 手 指 压 后 凹 陷 消 失 很 慢 肌 肉 组 织 不 紧 密, 松 散 弹 性, 手 指 压 后 凹 陷 不 消 失 1.2.3 ph 值 测 定 取 绞 碎 的 鱼 肉 5.00 g 置 于 烧 杯 中, 加 入 新 鲜 煮 沸 后 已 冷 却 的 蒸 馏 水, 定 容 至 50 ml, 搅 拌 均 匀, 静 置 30 min 后 过 滤, 测 定 滤 液 的 ph 值, 平 行 测 定 3 次 1.2.4 菌 落 总 数 测 定 [18] 参 照 食 品 微 生 物 学 检 验 : 菌 落 总 数 测 定 的 方 法 进 行 选 3 个 合 适 的 稀 释 度, 每 个 稀 释 度 3 组 平 行 样 品 鲜 度 分 类 : 一 级 鲜 度 : 菌 落 总 数 10 4 ; 二 级 鲜 度 :10 4 菌 落 总 数 10 7 1.2.5 菌 株 分 离 鉴 定 通 过 纯 培 养 方 法 得 到 多 个 不 同 形 态 的 单 菌 菌 落, 根 据 菌 落 外 观 与 菌 体 镜 检 形 态 对 细 菌 初 步 分 类, 计 算 同 一 类 型 的 菌 落 数 量 1.2.5.1 菌 落 与 细 胞 形 态 观 察 对 分 离 纯 化 得 到 的 单 菌 菌 落 进 行 菌 落 形 态 观 察 与 菌 落 计 数, 并 结 合 革 兰 氏 染 色 与 芽 孢 染 色, 观 察 细 胞 形 状, 对 细 菌 进 行 初 步 分 类, 计 算 不 同 时 期 与 贮 藏 时 间 的 同 一 种 类 菌 落 数 选 取 菌 落 数 在 30~300 个 的 计 数 平 板, 随 机 挑 取 不 同 种 类 的 50 个 典 型 单 菌 落, 以 平 板 划 线 法 分 离 纯 化 3 次, 得 到 的 纯 菌 株 保 存 于 试 管 斜 面 培 养 基 上, 以 备 鉴 定 1.2.5.2 分 类 保 存 根 据 菌 落 特 点 与 形 态 学 特 征, 将 在 不 同 时 期 与 贮 藏 时 间 挑 选 出 的 菌 株 依 次 作 好 标 记, 分 组 归 类, 再 进 行 纯 培 养, 重 复 以 上 比 较 随 后 将 特 征 差 异 明 显 的 菌 株 重 新 分 类 标 记, 再 予 以 纯 培 养, 重 复 操 作 3 次, 分 离 得 到 纯 菌 株, 每 一 种 纯 菌 株 作 2 组 平 行, 记 录 其 形 态 特 征 1.2.6 单 细 菌 DNA 提 取 与 纯 化 将 分 离 筛 选 后 的 纯 菌 株 分 别 接 种 到 TSB 中, 在 37 170 r/min 的 摇 床 中 将 其 培 养 至 对 数 生 长 期, 然 后 吸 取 10 ml 细 菌 培 养 液,4 10 000 r/min 离 心 15 min, 弃 上 清 液, 将 细 菌 -20 保 存, 用 于 下 一 步 提 取 DNA [19] 采 用 细 菌 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 提 取 纯 化 菌 株 的 DNA, 同 时 增 加 溶 菌 酶 破 壁 提 取 出 的 DNA 分 别 编 号 后 在 -20 的 冰 箱 中 保 存 备 用 1.2.7 16S rdna 片 段 的 PCR 扩 增 以 提 取 的 细 菌 基 因 组 D N A 为 模 板, 选 用 细 菌 通 用 引 物 正 向 引 物 :27f: 5 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ; 反 向 引 物 : 1 492r:5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 PCR 扩 增 反 应 体 系 如 表 2 所 示 表 2 PCR 扩 增 反 应 体 系 Table 2 PCR Reaction system 序 号 反 应 物 组 分 反 应 物 体 积 /μl 1 2 Taq PCR Master Mix 12.5 2 27f 1.0 3 1 492r 1.0 4 模 板 DNA 1.0 5 ddh 2 O 9.5 合 计 25.0 反 应 步 骤 为 :1)94 热 启 动 5 min;2)94 预 变 性 5 min;3)94 变 性 1 min;4)57 退 火 1 min;5)72 复 性 2 min;6)72 延 伸 10 min; 重 复 步 骤 3) 4) 5) 25 次 [20] 通 过 1.0% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 验 PCR 扩 增 产 物, 产 物 片 段 约 为 1 500 bp 使 用 DNA 纯 化 试 剂 盒 对 PCR 产 物 进 行 纯 化, 获 得 的 纯 化 产 物 送 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 限 公 司 测 序 1.2.8 系 统 发 育 树 分 析 将 测 序 得 到 菌 株 部 分 长 度 约 1 460 bp 的 16S rdna 序 列 登 录 至 NCBI 网 站 (http://www. ncbi. nlm.nih.gov/ blast/), 获 得 各 自 在 GenBank 数 据 库 中 的 临 时 登 录 号 通 过 BLAST 程 序 与 GenBank 中 的 核 酸 序 列 进 行 同 源 性 分 析 比 对, 选 出 相 似 性 较 高 的 序 列, 应 用 Chromas Version 1.62 和 DNAMAN Version 6.0 软 件 进 行 多 重 比 较 后 构 建 系 统 发 育 树 1.2.9 生 理 生 化 鉴 定 分 析 参 照 文 献 [21-22] 对 分 类 筛 选 后 的 纯 菌 株 进 行 生 理 生 化 鉴 定, 并 结 合 蔗 糖 山 梨 醇 乳 糖 麦 芽 糖 甘 露 糖 甘 露 醇 木 糖 尿 素 等 进 行 糖 醇 类 发 酵 利 用 实 验, 由 培 养 后 的 颜 色 反 应 进 一 步 判 断 细 菌 种 类 2 结 果 与 分 析 2.1 感 官 评 定 Fig.1 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 /d 图 1 不 同 时 期 鲳 鱼 冷 藏 期 间 的 感 官 分 值 变 化 Changes in sensory evaluation scores of pomfret fillets during chilled storage
2015, Vol.36, No.02 229 食品科学 包装贮运 由图1可知 不同时期鲳鱼样品冷藏期间的感官分值 别达到8.17±0.15和8.40±0.20 此时的鱼肉色泽灰暗 呈总体下降趋势 且变化规律基本相同 表明在同等流 光泽不再 流出汁液 腥臭味散出 纹理不再清晰 通环境下 样品的感官品质变化与捕捞时期关 新鲜 鱼体变软 失去弹性 表明样品已进入腐败阶段 到第8 鲳鱼切面色泽正常 富光泽 味道清新 肌肉组织肌 天时 样品已完全腐败 2.4 细菌菌落形态分析 理清晰 弹性良好 随着贮藏时间的延长 鱼体表面色 采用稀释平板分离法和划线分离法 经过3 次以上 弹性 部分汁液流出 散发腥臭 纹理模糊 品质明 的比较分组与归类计数 一共从2 个时期的鲳鱼样品冷藏 显下降 逐渐趋于腐败 2.2 ph值 菌落与细菌的基本特征见表3 ph 泽逐渐暗淡 失去原光泽 色泽变黄 发黏 软且 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 表3 Table 3 不同时期鲳鱼冷藏期间的细菌菌落特征分析 Characteristics of bacterial colonies in pomfret fillets during chilled storage 0 图2 Fig.2 期间分离出12 种典型菌 分别命名为X1 X2 X12 其 2 4 6 䍞㯿 䰤/d 8 不同时期鲳鱼冷藏期间的pH值变化 Changes in ph of pomfret fillets during chilled storage 由图2可见 两个时期鲳鱼样品贮藏期间的pH值呈 菌株编号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 形状 革兰氏染色 球形 G G 中杆 G G G 中杆 G 杆形 G G 球形 G 线形 中 G G G X11 X12 芽孢 菌落形态 菌落颜色 乳白 浅黄 色 浅棕 白色 乳白 白色 黄色 橘红 白色 浅黄 橘黄 菌落隆起度 菌落表面状态 干燥 菌落光泽 菌落边缘状态 先降后升的 V 形变化趋势 主要由于是样品捕捞上 菌落干湿程度 湿润 湿润 湿润 湿润 湿润 湿润 湿润 湿润 湿润 湿润 湿润 湿润 菌落透明度 半透明 半透明 透明 半透明 半透明 半透明 不透明 不透明 不透明 半透明 半透明 半透明 岸后 先后经历了初期的生理生化变化 死后僵硬 解 注 X1 X2 X12分别为12 株菌 僵 自溶与腐败的过程 ph值下降是由于水产品僵直 过程中糖原的酵解和ATP分解产生乳酸 丙酮酸 磷酸 2.5 菌株的16S rdna基因序列分析 等酸性物质 随着鱼体内蛋白酶分解释放出氨及胺类物 用正向引物27f和反向引物1 492r对两组样品中的优 质 ph值开始上升 僵硬期间 样品的pH值略下降 势菌进行16S全长序列的PCR扩增 对产物进行电泳检 自溶腐败期间pH值持续升高[23] ph值越高 说明样品的 测 得到条带稳定且重复性好 杂带不明显 片段长度 腐败程度相对越严重 鲜度和品质也随之降低 通过对 约为1 500 bp 电泳图谱如图4所示 两个时期样品pH值变化情况的比较分析 可发现冬季样 M ˉ X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 品pH值的增长速度较缓 可能由于冬季时期的环境温度 较春季略低 使样品死后各个时期的生理生化变化适当 㦠㨑ᘏ lg CFU/g 延后 从而延缓了鲳鱼的腐败进程 2.3 菌落总数 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 Ѡ㑻剰ᑺ X1 X2 X12分别为12 株菌.阴性对照 M. 100 bp DNA Ladder 图4 0 图3 Fig.3 1 500 bp 2 4 6 䌂㮣ᯊ䯈/d 8 不同时期鲳鱼冷藏期间的菌落总数变化 Changes in TVC in pomfret fillets during chilled storage Fig.4 菌株的16S rdna电泳图谱 Electrophoretic analysis of PCR amplification products of 16S rdna gene fragments 2.6 系统发育树分析 由图3可知 两个时期鲳鱼样品的菌落总数与感官分 将12 株分离细菌所获得的16S rdna序列提交 NCBI 获得其在GenBank数据库中的临时登录号 通过 值的变化趋势基本一致 鱼样均在冷藏的第4天超过国标 BLAST软件与GenBank中已发表的16S rdna序列进行同 规定的二级鲜度 贮藏的第6天 其菌落总数的对数值分 源性比较分析 选取同源性多数在99%以上的8 个菌株进
230 2015, Vol.36, No.02 食品科学 包装贮运 菌种类 其中 分别对主要优势菌X 3与X 4绘制系统发育 生化鉴定与系统进化树分析加以鉴别得出其各自 属种 可得X 1 为嗜冷杆菌 Psychrobacter spp. 树 图5 X 2 为草莓假单胞菌 Pseudomonas fragi X 3 为荧 行比较 并构建系统发育树 根据亲缘关系远近判断细 光假单胞菌 Ps eudom onas fluores cens X 4 为 腐 败 希 瓦 氏 菌 S h e w a n e l l a p u t re f a c i e n s X 5 为 成 AY259121.1 Pseudomonas spp. GQ205106.1 Pseudomonas spp. DQ064611.1 Arctic seawater bacterium HM468105.1 Pseudomonas spp. DQ645482.1 Pseudomonas spp. HQ870650.1 Pseudomonas fluorscens X3 HQ178952.1 Bacterium DC24 U91552.1 Shewanella putrefaciens 团肠杆菌 Enterobacter agglomerans X 6 为腐生 葡萄球菌 Staphylococcus saprophyticus X 7 为松 鼠葡萄球菌 Staphylococcus sciuri X 8 为微杆菌 Microbacterium esteraromaticum X 9为嗜根库克菌 Kocuria rhizophila X10为热杀索丝菌 Brochothrix thermosphacta X11为蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus AF006671.1 Shewanella putrefaciens AY573039.1 Shewanella spp. X12为金黄色葡萄杆菌 Chryseobacterium spp. X4 2.8 GU930786.1 Shewanella putrefaciens 根据对不同时期鲳鱼冷藏期间的菌株进行反复分离 AB205580.1 Shewanella baltica 纯化并鉴定分析 将不同时间的鲳鱼样品经反复分离纯 EU719603.1 Shewanella spp. 图5 化与比较分类 并对典型菌株进行计数 计算其各自所 基于16S rdna序列同源性的x3与x4菌株的系统发育树 Fig.5 Phylogenetic tree of strains X3 and X4 based on 16S rdna sequences 2.7 菌株的生理生化鉴定分析 不同时期的鲳鱼样品在冷藏货架期结束时 菌相 X2 X3与X4 通过对12 种主要优势菌株的生理生化特征 鉴定分析 其各项生理生化指标结果如表4所示 Table 4 Physiological and biochemical characteristics of dominant bacteria in pomfret fillets during chilled storage 细菌编号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 蔗糖 山梨醇 乳糖 麦芽糖 甘露糖 木糖 尿素 Hugh-Leifson OF 丙二酸盐 精氨酸双水解酶 细菌种类 嗜冷 草莓假 荧光假 腐败希 成团肠 腐生葡 松鼠葡 杆菌 单胞菌 单胞菌 瓦氏菌 杆菌 萄球菌 萄球菌 Table 5 鲳鱼在不同时期冷藏过程中的细菌组成与变化分析 Changes in bacterial proportion and composition of pomfret fillets during chilled storage % 细菌种类 G X1嗜冷杆菌 X2草莓假单胞菌 不同时期鲳鱼冷藏期间主要优势菌的生理生化特征 甘露醇 占比例 结果如表5所示 表5 逐渐趋于简单 其中冬季样品贮藏末期的主要优势菌为 X 1 X 2 X 3 与X 10 春季样品贮藏末期的主要优势菌为 表4 不同时期鲳鱼冷藏过程中的菌相组成变化 AB205578.1 Shewanella baltica 微杆 嗜根库 热杀 蜡样芽 金黄色葡 菌 克菌 索丝菌 孢杆菌 萄杆菌 注.大多数 90% 菌株为阳性.大多数 90% 菌株为阴 性.未实验 X3荧光假单胞菌 0d 2d 21.98 12.09 85.68 54.85 30.83 3.14 4d 8d 95.87 100.00 60.90 51.05 96.88 2.60 92.55 30.85 90.32 100.00 21.51 29.09 14.29 14.21 12.50 10.64 16.13 8.62 9.38 51.06 52.68 64.66 26.72 96.47 100.00 93.33 50.91 6d X4腐败希瓦氏菌 20.00 20.68 34.74 72.40 X5成团肠杆菌 9.89 G 78.02 14.32 3.53 0.00 4.13 0.00 3.12 7.45 9.68 0.00 X6腐生葡萄球菌 X7松鼠葡萄球菌 52.75 15.38 X8微杆菌 5.49 X9嗜根库克菌 4.40 14.32 X10热杀索丝菌 X11蜡样芽孢杆菌 X12金黄色葡萄杆菌 3.12 7.45 9.68 3.53 4.13 注.未检出 由表5可得 贮藏末期冬季样品中优势腐败菌的 比例为嗜冷杆菌 Psychrobacter spp. 21.51% 草莓 假单胞菌 Pseudomonas fragi 16.13% 荧光假单胞 菌 Pseudomonas fluorescens 52.68%与热杀索丝菌 通过在GenBank进行基因序列的相似性比对 Brochothrix thermosphacta 9.68% 春季样品为草 莓假单胞菌 Pseudomonas fragi 8.62% 荧光假单胞 结 合 菌 株 的 生 理 生 化 特 征 分 析 可 判 断 出 X 1为 嗜 冷 杆菌属 Psychrobacter spp. 中的一种 X 2 与X 3 分 菌 Pseudomonas fluorescens 64.66%与腐败希瓦氏菌 Shewanella putrefaciens 26.72% 这与国内外部分学 别 为 假 单 胞 菌 属 P s e u d o m o n a s s p p. 细 菌 X 4为 希瓦氏菌属 Shewanella spp. 中的一种 其余8 种 分析结果表明腐败希瓦氏菌和假单胞菌是低温贮藏大黄 菌均在PCR扩增测序结果比对的基础上 结合生理 鱼的优势腐败菌 Gill等[25]认为假单胞菌属和希瓦氏菌属 者的研究结果相一致 郭全友等[24]对养殖大黄鱼的菌相
包 装 贮 运 食 品 科 学 2015, Vol.36, No.02 231 是 冷 链 流 通 中 高 水 分 蛋 白 食 品 的 特 定 腐 败 菌 荧 光 假 单 胞 菌 (Pseudomonas fluorescens) 是 水 产 品 的 主 要 条 件 致 病 菌 与 腐 败 菌, 当 鱼 体 因 捕 捞 贮 运 等 过 程 中 的 人 为 操 作 不 当 或 机 械 损 伤 等 原 因, 鱼 体 易 被 该 菌 侵 入 引 起 发 病 致 腐 [26] [27] 胥 亚 夫 等 研 究 证 明 水 产 品 中 常 见 的 腐 败 菌 假 单 胞 菌 属 细 菌 主 要 为 荧 光 假 单 胞 菌 腐 臭 假 单 胞 菌 和 边 缘 假 单 胞 菌 此 外, 课 题 组 于 贮 藏 末 期 在 冬 季 样 品 中 未 检 出 腐 败 希 瓦 氏 菌, 而 在 春 季 样 品 中 检 出 少 量 可 能 是 由 于 较 高 浓 度 的 荧 光 假 单 胞 菌 对 腐 败 希 瓦 氏 菌 的 正 常 生 长 产 生 抑 制 [28] 3 结 论 1) 2 个 时 期 鲳 鱼 的 冷 藏 货 架 期 均 为 4 d, 其 中 冬 季 样 品 的 初 始 新 鲜 度 略 优 于 春 季 样 品, 这 可 能 同 样 品 自 身 品 质 季 节 洄 游 性 特 点 与 环 境 温 度 条 件 直 接 相 关 ;2) 鲳 鱼 的 优 势 腐 败 菌 主 要 为 革 兰 氏 阴 性 菌, 其 中 嗜 冷 杆 菌 (Psychrobacter spp.) 假 单 胞 菌 (Pseudomonas spp.) 与 腐 败 希 瓦 氏 菌 (Shewanella putrefaciens) 为 主 要 优 势 菌 ; 革 兰 氏 阳 性 菌 则 以 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus spp.) 与 热 杀 索 丝 菌 (Brochothrix thermosphacta) 为 主 ; 较 高 浓 度 的 荧 光 假 单 胞 菌 对 腐 败 希 瓦 氏 菌 的 正 常 生 长 产 生 抑 制 ;3) 冬 季 样 品 组 : 初 始 阶 段 中 革 兰 氏 阴 性 菌 所 占 比 例 明 显 高 于 革 兰 氏 阳 性 菌, 随 着 贮 藏 时 间 的 延 长, 革 兰 氏 阴 性 菌 所 占 比 例 逐 渐 升 高, 并 占 绝 对 优 势, 其 主 要 由 嗜 冷 杆 菌 (Psychrobacter spp.) 假 单 胞 菌 (Pseudomonas spp.) 与 热 杀 索 丝 菌 (Brochothrix thermosphacta) 组 成, 其 他 菌 群 数 量 则 随 之 减 少 说 明 不 同 微 生 物 之 间 的 相 互 作 用 可 影 响 其 生 长 和 新 陈 代 谢 [2] 微 生 物 间 的 相 互 作 用 使 优 势 菌 的 种 类 比 例 在 腐 败 期 间 不 断 改 变 ;4) 春 季 样 品 组 : 从 初 始 至 完 全 腐 败 的 过 程 中, 革 兰 氏 阴 性 菌 始 终 占 绝 对 比 重 其 中 0 d 的 细 菌 组 成 比 例 与 冬 季 样 品 组 明 显 区 别, 说 明 了 在 不 同 时 期 里, 由 于 样 品 自 身 品 质 觅 食 条 件 与 生 活 环 境 差 异 等 原 因, 对 鲳 鱼 样 品 的 主 要 微 生 物 种 群 分 布 产 生 影 响 主 要 优 势 菌 为 假 单 胞 菌 (Pseudomonas spp.) 与 腐 败 希 瓦 氏 菌 (Shewanella putrefaciens) 两 个 季 节 中 主 要 腐 败 菌 的 类 型 基 本 一 致, 但 微 生 物 种 类 与 比 例 明 显 不 同, 存 在 着 不 同 微 生 物 间 相 互 影 响 的 现 象 参 考 文 献 : [1] 庄 桂 东, 韩 荣 伟, 安 桂 香, 等. 低 值 鲳 鱼 制 取 风 味 鱼 脯 的 研 究 [J]. 食 品 研 究 与 开 发, 2004, 25(2): 91-93. [2] 姜 兴 为, 杨 宪 时. 水 产 品 腐 败 菌 与 保 鲜 技 术 研 究 进 展 [J]. 湖 南 农 业 科 学, 2010(15): 100-103. [3] GRAM L, HU H H. Fresh and processed fish and shellfish [M]//LUND B M, BAIRD-PARKER T C, GOULD G W. The Microbiological safety and quality of food. Gaithersburg Maryland, USA: Aspen Publishers Inc, 2000: 472-506. [4] JOS H J, HUIS I V. Microbial and biochemical spoilage of foods: an overview[j]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 33(2): 1-18. [5] 崔 正 翠, 许 钟, 杨 宪 时, 等. 冷 藏 大 菱 鲆 细 菌 组 成 变 化 和 优 势 腐 败 菌 [J]. 食 品 科 学, 2011, 32(13): 184-187. [6] 崔 正 翠, 许 钟, 杨 宪 时, 等. 大 菱 鲆 腐 败 菌 生 长 动 力 学 研 究 和 货 架 期 预 测 [J]. 海 洋 渔 业, 2010, 32(4): 454-460. [7] 曹 荣, 刘 淇, 殷 邦 忠. 对 虾 冷 藏 过 程 中 细 菌 菌 相 变 化 的 研 究 [J]. 保 鲜 与 加 工, 2011(1): 17-20. [8] 曹 荣, 薛 长 湖. 太 平 洋 牡 蛎 在 -3 微 冻 贮 藏 过 程 中 的 品 质 和 细 菌 菌 相 变 化 [J]. 南 方 水 产, 2010(1): 49-53. [9] 郭 全 友, 杨 宪 时, 许 钟. 冷 藏 罗 非 鱼 优 势 腐 败 菌 的 鉴 定 及 其 特 征 [J]. 食 品 与 机 械, 2009(3): 87-90. [10] 郭 全 友, 许 钟, 杨 宪 时. 养 殖 大 黄 鱼 加 工 和 冰 藏 过 程 中 鲜 度 和 细 菌 类 型 的 变 化 [J]. 海 洋 渔 业, 2008, 30(3): 261-267. [11] 张 小 伟, 许 钟, 杨 宪 时, 等. 鲤 鱼 冷 藏 中 的 鲜 度 变 化 与 货 架 期 [J]. 海 洋 渔 业, 2010, 32(2): 211-217. [12] 杨 宪 时, 郭 全 友, 许 钟. 罗 非 鱼 冷 藏 过 程 细 菌 种 群 的 变 化 [J]. 中 国 水 产 科 学, 2008, 5(6): 50-55. [13] 许 钟, 肖 琳 琳, 杨 宪 时. 罗 非 鱼 特 定 腐 败 菌 生 长 动 力 学 模 型 和 货 架 期 预 测 [J]. 水 产 学 报, 2005, 29(4): 540-546. [14] 郭 红, 董 士 远, 刘 尊 英, 等. 南 美 白 对 虾 冰 温 下 菌 相 变 化 [J]. 中 国 海 洋 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版, 2010(6): 77-80. [15] 王 凌 燕. 南 美 白 对 虾 腐 败 微 生 物 分 析 与 防 黑 变 保 鲜 技 术 研 究 [D]. 青 岛 : 青 岛 大 学, 2012: 16-25. [16] 王 庆 丽. 养 殖 大 黄 鱼 和 海 水 鲈 鱼 冷 藏 过 程 中 特 定 腐 败 菌 的 鉴 别 [D]. 杭 州 : 浙 江 工 商 大 学, 2012: 39-52. [17] 中 国 水 产 科 学 研 究 院 东 海 水 产 研 究 所. SC/T 31032010 鲜 冻 鲳 鱼 [S]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社, 2011. [18] 卫 生 部. GB 4789.22010 食 品 微 生 物 学 检 验 : 菌 落 总 数 测 定 [S]. 北 京 : 中 国 标 准 出 版 社, 2010. [19] 王 亮, 曾 名 湧, 董 士 远, 等. 不 同 包 装 方 式 的 凡 纳 滨 对 虾 冰 温 贮 藏 过 程 中 腐 败 微 生 物 的 变 化 规 律 [J]. 食 品 与 发 酵 工 业, 2010, 36(3): 196-201. [20] 蓝 蔚 青, 谢 晶. 传 统 生 理 生 化 鉴 定 技 术 结 合 PCR 法 分 析 复 合 保 鲜 剂 对 冷 藏 带 鱼 菌 相 变 化 的 影 响 [J]. 食 品 工 业 科 技, 2012, 33(10): 330-335. [21] 希 坎 南 R E. 伯 杰 氏 细 菌 鉴 定 手 册 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社, 1989. [22] 东 秀 珠, 蔡 妙 英, 王 宝 玲, 等. 常 见 细 菌 系 统 鉴 定 手 册 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社, 2001. [23] 沈 月 新. 水 产 食 品 学 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社, 2001. [24] 郭 全 友, 许 钟, 杨 宪 时. 冷 藏 养 殖 大 黄 鱼 品 质 变 化 特 征 及 细 菌 相 分 析 [J]. 上 海 水 产 大 学 学 报, 2006, 15(6): 216-221. [25] GILL C O, BADONI M, JONES T. Hygienic effects of trimming and washing operations in a beef carcass dressing process[j]. Journal of Food Protection, 1996, 59: 666-669. [26] 邓 显 文, 谢 芝 勋, 刘 加 波, 等. 罗 非 鱼 荧 光 假 单 胞 菌 的 分 离 鉴 定 [J]. 广 西 农 业 科 学, 2010, 41(6): 612-615. [27] 胥 亚 夫, 林 洪, 张 茜, 等. 冷 藏 牙 鲆 中 主 要 腐 败 菌 卵 黄 抗 体 的 抑 菌 性 能 [J]. 食 品 科 学, 2010, 31(23): 109-113. [28] GRAM L, MECHIORSEN J. Interaction between fish spoilage bacteria Pseudomonas spp. and Shewanella putrefaciens in fish extracts and on fish tissue[j]. Journal of Applied Bacteriology, 1996, 80(15): 589-595.