第 卷 第 期 年 月 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版!"#$## %&'&!& 基 础 研 究 人 蛋 白 真 核 表 达 及 细 胞 定 位 与 功 能 刘 旭 张 莹 王 彬 刘 晓 丹 王 豫 曾 妍 潘 秀 颉 周 平 坤 朱 茂 祥 顾 永 清 石 河 子 大 学 生 命 科 学 学 院 新 疆 石 河 子 $ 军 事 医 学 科 学 院 放 射 与 辐 射 医 学 研 究 所 北 京 $% 石 河 子 大 学 医 学 院 新 疆 石 河 子 $ 摘 要 目 的 构 建 &' 蛋 白 真 核 表 达 质 粒 并 使 之 在 细 胞 内 得 以 表 达 确 定 &' 蛋 白 在 细 胞 中 的 定 位 及 其 对 细 胞 迁 移 的 影 响 方 法 以 " 细 胞 ' 为 模 板 经 &( 获 取 &' 编 码 区 ' 将 该 编 码 区 ' 序 列 插 入 &) *+)* 质 粒 中 构 建 带 * 标 签 的 真 核 表 达 重 组 质 粒 重 组 质 粒 转 染 至, 细 胞 中 -"."/ 01 方 法 检 测 其 在 真 核 细 胞 内 的 表 达 重 组 质 粒 转 染 " 细 胞 免 疫 荧 光 法 检 测 其 细 胞 内 的 定 位 划 痕 实 验 观 察 其 对 细 胞 迁 移 的 影 响 结 果 成 功 构 建 了 &' 真 核 表 达 重 组 质 粒 并 在 真 核 细 胞 内 成 功 表 达 确 定 &' 定 位 于 细 胞 质 中 划 痕 实 验 证 明 &' 过 表 达 的 细 胞 迁 移 能 力 明 显 下 降 结 论 在 真 核 细 胞 中 成 功 表 达 了 &' 重 组 质 粒 且 &' 定 位 于 细 胞 质 其 过 表 达 对 细 胞 迁 移 有 抑 制 作 用 为 研 究 &' 的 生 理 功 能 奠 定 实 验 基 础 关 键 词 细 胞 骨 架 肌 动 蛋 白 &' 亚 细 胞 定 位 细 胞 迁 移 重 组 质 粒 中 图 分 类 号 ( 文 献 标 志 码 ' %!"#$$%%!&&&!%%'%!%$%! ' 234 -'53 31) -' 2! 6 2 ' 3!)3" 7 34)8! *1)34 21 4)934 &10"4"1:3:";3"".;3"3 3"/.3;3"3$.3!"1:(31014 (331 *"33""&3"."'"1:*303/ *"33"5"334$% &10"4"1:*"33";3"3 3"/.3;3"3$&3 #### ( (" " ##)#"(*+,"(##"#&-. #/'+(#/'+#"*+, 0(",*1""(*!%)! ## ###("&#(" 0#",#(# &(("##"0#" "##(# &$##)((0""#### &##(("*+,0## ##"" #"#&#("0## ("#&*+,0 #"#(&##)((0"(*+,#" # #& *+,#(" 0## (" ##&*+,(0#"#(&(*+,"#& (" ("(("#" *+,& () * # #"##)#"( *+,### #(" 收 稿 日 期 %)) 修 回 日 期 %)) 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 1,,$$,$ ;!1/""310!/0;3""1! 31 1:&31,,$$,$ 通 讯 作 者 顾 永 清 6)3094!,1 优 先 出 版 83"8."30,,($,$0))!"!#
, 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版 第 卷 细 胞 骨 架 在 细 胞 形 态 发 生 胞 质 分 裂 胞 吞 作 用 细 胞 迁 移 等 诸 多 方 面 发 挥 作 用 细 胞 骨 架 异 常 会 诱 发 包 括 神 经 退 行 性 疾 病 在 内 的 多 种 人 类 疾 病 并 可 影 响 肿 瘤 转 移 肌 动 蛋 白 是 细 胞 骨 架 的 重 要 组 成 部 分 单 体 肌 动 蛋 白 与 多 聚 肌 动 蛋 白 间 的 动 态 平 衡 在 细 胞 ) 骨 架 调 控 系 统 中 起 关 键 作 用 因 而 肌 动 蛋 白 的 聚 集 解 离 机 制 引 起 研 究 者 的 广 泛 关 注 并 有 研 究 发 现 &'"000.")..13"/1"3 有 重 要 作 用 &' 是 一 类 广 泛 存 在 于 真 核 生 物 的 保 守 蛋 白 在 酵 母 中 是 腺 苷 酸 环 化 酶 复 合 物 的 组 分 之 一 并 ) 参 与 酵 母 的 (.'* 信 号 通 路 但 在 除 酵 母 以 外 的 其 他 真 核 生 物 中 并 不 作 用 于 这 一 信 号 通 路 而 是 参 与 肌 动 蛋 白 的 调 控 在 人 类 肝 癌 胰 腺 癌 等 多 种 癌 细 胞 中 均 发 现 &' 的 表 达 变 化 这 表 明 &' 可 ) 能 对 癌 细 胞 的 转 移 侵 入 有 潜 在 影 响 为 了 进 一 步 研 究 人 类 &' 蛋 白 的 功 能 尤 其 是 在 癌 症 发 生 转 移 机 制 中 的 潜 在 作 用 本 研 究 构 建 了 人 类 &' 重 组 质 粒 并 在 细 胞 中 实 现 表 达 确 定 &' 在 细 胞 中 的 定 位 并 对 其 在 癌 细 胞 迁 移 方 面 的 影 响 做 了 初 步 的 探 讨 为 研 究 &' 蛋 白 的 功 能 打 下 实 验 基 础 材 料 与 方 法 材 料 &*+)* 哺 乳 动 物 表 达 载 体, 细 胞 由 本 实 验 室 保 藏 " 细 胞 由 北 京 大 学 生 命 科 学 学 院 徐 勤 枝 老 师 惠 赠 ' 高 保 真 聚 合 酶 7) 0!.)"1 购 自 72757 公 司 常 规 &( 聚 合 酶 <&( /"" *3 购 自 北 京 鼎 国 昌 盛 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 限 制 性 内 切 酶 及 连 接 酶 购 自 65 公 司 ' 凝 胶 回 收 试 剂 盒 购 自 东 盛 公 司 % 感 受 态 细 胞 高 纯 度 质 粒 小 提 中 量 试 剂 盒 购 自 '6 公 司 31:"3"* 购 自 3/14" 公 司 鼠 源 * 标 签 抗 体 购 自 ; &/! 公 司 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 二 抗 羊 抗 小 鼠 4( 及 鼠 源 '3 内 参 抗 体 购 自 中 杉 金 桥 公 司 荧 光 标 记 二 抗 '0" 0!1/ $$ 1 ' 3) *1!."4 =' 31 购 自 3:"" 101) 43". 公 司 引 物 合 成 与 重 组 质 粒 的 测 序 由 北 京 擎 科 新 业 生 物 技 术 有 限 公 司 完 成 其 他 常 用 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 +, 蛋 白 - 序 列 的 扩 增 根 据 " 58 数 据 库 提 供 的 &' 蛋 白 7( 序 列 结 合 &*+) * 载 体 多 克 隆 位 点 位 置 利 用 /3"//"3"/% 软 件 设 计 扩 增 引 物 序 列 并 分 别 在 上 下 游 引 物 中 引 入 酶 切 位 点 上 下 游 引 物 序 列 分 别 为 %>)&&&'&&'&'&'&'''') &)>%>)'''''&&&&'&&') &''&&'&)> 按 照 7)0!.)"1 高 保 真 聚 合 酶 说 明 书 所 示 建 立 反 应 体 系 运 行 &( 获 得 目 的 片 段 反 应 条 件 如 下,? 3 个 循 环,$?.$?,.% 个 循 环 +.#/01/! 重 组 载 体 的 构 建 前 述 &( 产 物 及 &*+)* 真 核 表 达 载 体 分 别 经 限 制 性 内 切 酶 和 双 酶 切 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 利 用 试 剂 盒 回 收 纯 化 纯 化 后 酶 切 产 物 再 经 连 接 酶? 连 接 过 夜 转 化 % 感 受 态 细 胞 选 菌 落 &( 阳 性 者 抽 提 质 粒 双 酶 切 鉴 定 再 选 可 见 条 带 者 进 行 测 序 经 比 对 正 确 者 即 为 &' 重 组 载 体 命 名 为 &*+)&') * 可 表 达 带 * 标 签 的 &' 重 组 蛋 白 细 胞 转 染 及 过 表 达 蛋 白 的 获 得 于 培 养 皿 内 以 无 抗 生 素 的 *6* 培 养 液 培 养, 或 " 细 胞 待 单 层 细 胞 生 长 占 比 为 @$@ 时 可 进 行 转 染 转 染 时 取 管 加 入 无 抗 生 素 无 血 清 的 *6* 培 养 液 % 其 中 管 内 再 加 入 &*+) &')* 载 体 %4 另 管 内 按 载 体 脂 质 体 质 量 体 积 比 A 加 入 31:"3" * 静 置 %3 后 将 两 者 轻 柔 混 合 再 静 置 3 将 混 合 液 均 匀 滴 入 培 养 皿 培 养 $ $ 后 弃 培 养 液 用? 预 冷 的 5; 洗 次 刮 取 细 胞 至 6 管?%/3 离 心 %3 弃 上 清 留 沉 淀 为 获 取 的 细 胞 根 据 细 胞 量 加 蛋 白 裂 解 液 冰 上 裂 解 3 移 上 清 至 干 净 6 管 将 获 取 蛋 白 测 浓 度 后 加 1345!:"/ 于 沸 水 中 煮 沸 3 用 于 后 续 -"."/ 01 检 测 +*$%& 检 测 根 据 蛋 白 浓 度 取 4 上 样 先 $+ 电 泳 至 */8"/ 分 开 再 + 电 泳 % 4 分 离 胶 + 恒 压 半 干 转 膜 %3 % 4 脱 脂 牛 奶 封 闭 * 标 签 一 抗 及 '3 内 参 抗 体 按 A 比 例 稀 释? 孵 育 过 夜 羊 抗 小 鼠 4( 二 抗 按 A 比 例 稀 释 室 温 孵 育 5; 洗 膜 $ 3 次 共 次 6& 显 色 检 测 &' 蛋 白 表 达 情 况 免 疫 荧 光 定 位 分 析 将 无 水 乙 醇 浸 泡 过 夜 的 盖 玻 片 铺 于 培 养 皿 底 接 种 " 细 胞 或, 细 胞 待 其 长 至 @ 融 合 时 转 染 &*+)&')* 质 粒 $ 后 取 出 盖 玻 片 置 于 孔 板? 预 冷 5; 洗 次 4 多 聚 甲 醛? 固 定 过 夜 经 预 冷 5; 清 洗 后 加? 预 冷 %/31 破 膜 室 温 3 45;' 室 温 封 闭 3 用 45;' 稀 释 抗 体 * 一 抗 A 稀 释 荧 光 二 抗 A 稀 释 ' 用 5; 稀 释 至 终 质 量 浓 度 4 以 预!"!#
期 刘 旭 张 莹 王 彬 等 人 &' 蛋 白 真 核 表 达 及 细 胞 定 位 与 功 能, 冷 5; 清 洗 孔 板 次 向 盖 玻 片 中 心 滴 加 * 标 签 一 抗 湿 盒 内? 过 夜 预 冷 5; 洗 次 后 滴 加 荧 光 二 抗 室 温 湿 盒 避 光 孵 育 预 冷 5; 洗 次 加 ' 染 核 3 室 温 湿 盒 内 避 光 孵 育 取 出 盖 玻 片 倒 置 于 透 明 载 玻 片 上 甘 油 封 片 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 划 痕 实 验 分 析 " 细 胞 于 培 养 皿 内 生 长 至 @ 融 合 时 分 别 转 染 &*+)* 空 载 体 和 &*+)&')* 重 组 载 体 %4 另 设 未 转 染 " 细 胞 对 照 组 后 用 移 液 器 吸 头 在 皿 底 划 一 平 直 痕 迹 5; 清 洗 细 胞 次 去 除 划 下 的 细 胞 使 痕 迹 内 无 " 细 胞 贴 壁 生 长 加 入 新 *6* 培 养 液 继 续 培 养 后 镜 下 观 察 痕 迹 区 域 细 胞 侵 入 情 况, 结 果,+ 重 组 载 体 构 建 及 鉴 定 结 果 以 " 细 胞 ' 为 模 板 经 &( 扩 增 获 得 &' 全 长 序 列 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 得 到 $ 条 带 图 '&( 产 物 &*+)* 质 粒 分 别 双 酶 切 后 以 连 接 酶 连 图, 真 核 细 胞 表 达 鉴 定 346/"..31 1:&*+)&')*3,"0. 未 转 染 的, 细 胞 转 染 &*+)* 空 载 %4 转 染 &*+)&')* 重 组 载 体 4 转 染 &*+)&') * 重 组 载 体 %4,+. 蛋 白 细 胞 内 定 位 分 析 结 果 以 &*+) &')* 重 组 载 体 %4 分 别 瞬 时 转 染, 细 胞 和 " 细 胞 另 设 未 转 染, 细 胞 对 照 组 鼠 源 * 抗 体 为 一 抗 山 羊 抗 鼠 绿 色 荧 光 二 抗 特 异 性 结 合 * 一 抗 细 胞 核 以 ' 染 色 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 未 转 染 细 胞 仅 见 细 胞 核 未 见 绿 色 荧 光 信 号 经 转 染 的, 细 胞 和 " 细 胞 可 见 明 显 绿 色 荧 光 信 号 且 仅 存 在 于 细 胞 质 中 图 可 知 &' 蛋 白 定 位 于 细 胞 质 接 并 转 化 % 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 选 取 菌 落 &( 阳 性 者 抽 提 质 粒 再 次 双 酶 切 鉴 定 可 见 $ 及 $ 的 条 带 位 置 正 确 图 5 质 粒 送 擎 科 公 司 测 序 后 比 对 与 "58 数 据 库 完 全 一 致 图 重 组 载 体 的 构 建 及 鉴 定 34 '03:331 1:&'/"130.33. 3"3:331 1!0")""0"4" '&( 扩 增 目 的 片 段 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 *%' */8"/ &' 的 7( 条 带 5 菌 落 &( 阳 性 质 粒 双 酶 切 后 的 电 泳 * %' */8"/ 质 粒 经 限 制 性 内 切 酶 和 双 酶 切 后 条 带,+,*$%& 鉴 定 蛋 白 真 核 细 胞 表 达 情 况 &*+)* 空 载 质 粒 %4 及 &*+)&') * 重 组 载 体 4%4 分 别 转 染, 细 胞 并 设 未 转 染 细 胞 为 对 照 组 转 染 $ 收 集 细 胞 提 取 全 蛋 白 在 预 期 位 置 可 见 明 显 条 带 且 转 染 %4 表 达 条 带 较 转 染 4 更 为 明 显 图 可 知 &*+)&')* 重 组 质 粒 在, 细 胞 中 可 以 过 表 达 图. 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 在 细 胞 内 的 定 位 情 况 34/"0!0/0131 1:&'1."/"!"/" 1:103/1.1"< ' 未 转 染 的, 细 胞 &5& 分 别 转 染 &*+)&')* 重 组 载 体 的, 细 胞 和 " 细 胞,+ 蛋 白 过 表 达 对 细 胞 迁 移 的 影 响 分 别 在 划 痕 后 及 拍 照 观 察 比 较 划 痕 实 验 结 果 中 &*+)&')* 重 组 载 体 及 &*+)* 空 载 体 及 未 转 染 对 照 组 细 胞 的 迁 移 能 力 结 果 显 示 后 未 转 染 的 " 细 胞 及 转 染 &*+)* 空 载 体 的 " 细 胞 划 痕 与 &' 过 表 达 的 " 细 胞 划 痕 相 比 宽 度 更 窄 提 示 &' 过 表 达 的 " 细 胞 内 迁 移 能 力 明 显 下 降 图!"!#
,$ 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版 第 卷 图 影 响 2 细 胞 迁 移 情 况 34&'1"/"/"..31 0"1"4/"..3"34/31 3.31 1:""0.< ' 划 痕 后 5 划 痕 后 未 转 染 " 细 胞 转 染 空 载 体 " 细 胞 转 染 &' 重 组 载 体 " 细 胞. 讨 论 肌 动 蛋 白 形 成 的 纤 维 状 聚 合 物 和 各 种 调 控 蛋 白 交 错 连 接 的 网 络 结 构 是 细 胞 骨 架 在 维 持 真 核 细 胞 形 态 胞 内 运 输 变 形 运 动 及 细 胞 凋 亡 等 方 面 发 挥 作 用 的 物 质 基 础 多 种 肿 瘤 细 胞 中 细 胞 骨 架 均 存 在 异 常 这 种 异 常 既 表 现 为 肌 动 蛋 白 聚 合 物 的 结 构 异 常 也 表 现 为 相 关 调 控 蛋 白 的 状 态 异 常 &' 基 因 位 于 人 类 号 染 色 体 包 含 个 外 显 子 7( 框 长 度 为 $ 编 码 个 约 %%8! 的 蛋 白 质 该 蛋 白 序 列 保 守 但 在 不 同 物 种 中 行 使 不 同 的 调 控 功 能 在 酵 母 细 胞 中 参 与 (.'* 信 号 通 路 调 控 在 其 他 物 种 包 括 人 类 细 胞 中 主 要 作 为 细 胞 骨 架 调 控 蛋 白 有 研 究 表 明 在 肝 癌 胰 腺 癌 等 多 种 癌 细 胞 中 &' 存 在 表 达 上 调 并 推 测 可 能 促 进 细 胞 迁 移 另 有 报 道 称 其 在 肺 癌 细 胞 中 存 在 生 化 性 质 转 变 并 具 有 作 为 颅 内 肿 瘤 转 移 诊 断 标 志 物 的 潜 在 应 用 前 景 由 此 推 测 &' 在 人 类 细 胞 中 除 了 已 知 的 细 胞 骨 架 调 控 功 能 外 可 能 还 有 其 他 功 能 并 且 当 细 胞 癌 变 时 这 些 已 知 和 或 未 知 的 功 能 会 发 生 变 化 为 了 深 入 研 究 &' 的 生 理 功 能 本 研 究 构 建 了 &' 的 真 核 表 达 质 粒 并 在 肿 瘤 细 胞 中 过 表 达 通 过 免 疫 荧 光 实 验 分 析 可 知 &' 主 要 定 位 于 细 胞 质 当 中 这 与 其 作 为 细 胞 骨 架 调 控 蛋 白 的 功 能 是 相 一 致 的 同 时 令 人 意 外 的 是 在 &' 过 表 达 " 细 胞 的 划 痕 实 验 中 &' 的 过 表 达 变 化 对 细 胞 迁 移 效 率 产 生 了 明 显 的 抑 制 作 用 这 一 发 现 尚 属 首 次 很 可 能 体 现 了 &' 的 某 些 未 知 功 能 本 研 究 对 以 &' 蛋 白 为 切 入 点 为 揭 示 细 胞 尤 其 是 癌 细 胞 骨 架 蛋 白 的 生 物 活 性 功 能 及 调 控 机 制 提 供 了 实 验 基 础 &' 的 进 一 步 研 究 对 掌 握 癌 细 胞 的 生 理 生 化 特 性 诸 如 骨 架 结 构 形 态 或 动 态 特 征 的 改 变 相 关 调 控 因 素 的 变 化 等 方 面 提 供 了 一 个 可 行 的 思 考 方 向 最 终 为 通 过 检 测 &' 蛋 白 功 能 指 标 或 人 为 改 变 &' 蛋 白 性 质 以 达 到 早 期 发 现 或 治 疗 某 些 肿 瘤 参 考 文 献 梁 赞 姜 汲 坤 王 立 军 等 & 大 鼠 不 同 脏 器 )# 1'+ 稳 定 性 差 异 的 实 验 研 究 & 锦 州 医 学 院 学 报 $)& $+'+*.'&+#() (#&$#*$# %$)&.--1$ +%!232,&* #)#"() *+,# "#"#() &4+$-$),,& 43/%25 +-+$1 1&*" ##*+,$&##" ""##)#" (&*,,,)& %4/21)*.+35'!/$*.'$1-12+*.1&$1% 6"1+$#"## & *,,,)& 43/ '35++ -125 /&,# 1+$)("###( $## # # (("" "&!* -,$$$%%,)%& %73'+ *!+51 '2$2'1&$##() *//,*/4,*-",*-%#) (#(&.,(# )& 下 转 第 页!"!#
期 闫 蕊 单 虎 林 琳 等 链 脲 佐 菌 素 诱 导 的 糖 尿 病 性 心 肌 病 大 鼠 心 脏 结 构 及 血 管 紧 张 素 的 变 化 版 社 %)& 楚 洪 波 李 冬 梅 石 博 等 & 大 豆 皂 苷 对 糖 尿 病 大 鼠 心 肌 组 织 中 '2) 和 (( 表 达 的 影 响 及 其 对 心 肌 的 保 护 作 用 & 吉 林 大 学 学 报 医 学 版,%)%& 7.'8.,$4+' 4&0) )),#" ( (#)) "#""#&-#,#%,%$) %& 1'+'/ /1!+ 8&/##" (! &+#*"#/%$) %& %43' 4$521'$3' -$12-*5&+" #"##"#&*#1,$,),& +.33+'3+8%+/+!/31%$%!*'3.&,) "" #"#"# &*,,#,$ %%)%& -+'*1388$!&4"#(# () ##"##" &%#.1! $%%)%,& $ 王 国 宏 袁 申 元 边 延 涛 & 血 管 紧 张 素 及 其 受 体 在 大 鼠 糖 尿 病 性 心 肌 病 发 生 中 的 作 用 & 中 华 内 分 泌 代 谢 杂 志 )&,82!+'$!%+' 72''%/ +' /35,&) 0 # )"#" "))# 0##"# &"*"#!"$$$,),$&.+'8 /+'8 +'8 *&+ () 王 智 敏 吴 瑕 & 阿 托 伐 他 汀 对 自 发 性 高 血 压 大 鼠 左 心 室 肥 厚 的 影 响 & 郑 州 大 学 学 报 医 学 版 %%)%%& +'$!3'8.&*"#($") "("(0&3# *"# # $ %%)& 1)+3!21 8.81 &#( ( $!+/#"#&*"# 1,%)%& 董 志 恒 李 才 曲 萌 & 苯 那 普 利 对 糖 尿 病 大 鼠 心 肌 *84 基 因 表 达 的 影 响 及 作 用 机 制 & 吉 林 大 学 学 报 医 学 版 %)%& %$1!+'' /1$*.2 $+1$&*) "#"# ( # #"#"##" ( & (#(&/ %)& 金 秀 平 吴 云 丹 崔 路 坤 & 甘 精 胰 岛 素 对 糖 尿 病 大 鼠 心 肌 纤 维 化 及 超 微 结 构 的 影 响 & 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版, )& $33.+'8 /&'##"#() # #84)".34) +)"" #"#&*!!"%,$)$& $4'8 +'8 *+3&!# ()"##) #(# #") #""##"&-# -(1 *$)$,&, 宓 宇 仙 倪 劲 松 魏 义 臣 &.34) 在 大 鼠 实 验 性 糖 尿 病 心 肌 病 中 的 表 达 & 临 床 和 实 验 医 学 杂 志,$$$),& ( +/,)#)#)4#"#) 编 辑 邱 芬 &!**",%)& 上 接 第,$ 页 +!+7+535+5+!1+!!+$83&+") $$.3-++ 1!213/ &2(#) ##)#" ( (" (## #)#" ( (## ##" ### & 3 &**#1$%)%$&,$,%)&,7**.33!'2 57'$2% %+&8) 谢 朝 晖 陈 兰 英 & 细 胞 骨 架 研 究 进 展 & 癌 变 畸 变 突 变 (((###(# " %)$& )"###""& +'!$2'8 7.+'8 8&2("),#'+#"$#$+%$)$%& ##)#"(#"0..+'$+!&,#)") ##&2#(,)& ####"("#() #(&3,#%)%%& 编 辑 国 荣!"!#