云 南 农 业 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 ),2016,30(2):245-249 JournalofYunnanAgriculturalUniversity(NaturalScience) htp: //xb ynau edu cn E mail:xb@ynau edu cn DOI:10 16211/j isn 1004-390X(n) 2016 02 008 小 白 及 无 菌 播 种 组 培 快 繁 技 术 研 究 苏 钛 1,2,3 4, 付 传 明 (1 云 南 省 药 物 研 究 所, 云 南 昆 明 650111;2. 云 南 白 药 集 团 创 新 研 发 中 心, 云 南 昆 明 650111; 3. 云 南 省 中 药 和 民 族 药 新 药 创 制 企 业 重 点 实 验 室, 云 南 昆 明 6501111;4. 广 西 植 物 研 究 所, 广 西 桂 林 541006) 摘 要 : 为 探 索 小 白 及 快 速 繁 育 技 术, 以 小 白 及 蒴 果 为 外 植 体 材 料, 在 大 棚 自 然 条 件 下, 建 立 小 白 及 无 菌 播 种 组 织 培 养 技 术 体 系 研 究 结 果 表 明 : 胚 龄 为 15 周 的 小 白 及 蒴 果 为 最 佳 的 外 植 体 材 料, 消 毒 灭 菌 成 功 率 高, 在 培 养 基 1/2MS+NAA0 3mg/L+6 BA0 1mg/L+ 蔗 糖 3% 上 的 萌 发 率 达 到 90%; 最 佳 的 分 化 培 养 基 为 :MS+ NAA0 5mg/L+BA1 0mg/L+2 ip0 8mg/L+ 蔗 糖 3%, 分 化 率 为 94 5%; 最 佳 的 生 根 培 养 基 为 :1/2MS+ NAA1 0mg/L+ 香 蕉 10% + 糖 3%, 培 养 60d 后 组 培 苗 假 鳞 茎 大, 植 株 健 壮, 生 根 率 达 100% 在 昆 明 地 区, 大 棚 自 然 光 条 件 下 培 养 的 小 白 及 组 培 苗 进 行 大 田 移 栽 后, 成 活 率 高 达 95%, 长 势 良 好, 具 有 广 阔 的 发 展 前 途 关 键 词 : 小 白 及 ; 无 菌 播 种 ; 大 棚 ; 自 然 光 ; 假 鳞 茎 中 图 分 类 号 :S567 239 043 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :1004-390X (2016)02-0245-05 AsepsisSowingandTechnologyofRapidCultureand PropagationforBletilaformosana SUTai 1,2,3,FUChuanming 4 (1.YunnanInstituteofMateriaMedica,Kunming650111,China;2.YunnanBaiYao GroupInnovationandR&DCenter,YunnanInstituteofMateriaMedica,Kunming650111,China; 3.YunnanProvinceCompanyKeyLaboratoryforTCM andethnicdrugofnewdrugcreation,yunnaninstitute ofmateriamedica,kunming650111,china;4.guangxiinstituteofbotany,guilin541006,china) Abstract:TostudythetechnologyofrapidpropagationforBletilaformosana,anasepsissowingtech nicalsystemwasestablishedingreenhouseundernaturalconditionsbyusingfruitsofb.formosanaas explants.theresearchrevealedthatfruitsofb.formosanawhoseembryoageis15weekswerethe bestexplants.thesuccesrateofdisinfectantandsterilizationwashigh.inmediumof1/2ms+naa 0 3mg/L+6 BA0 1mg/Land3% sugar,thegerminationratewas90%.inthebestdiferentiation mediumofms+naa0 5mg/L+BA1 0mg/L+2 ip0 8mg/Land3% sugar,thediferentiation ratewas94 5%.Inthebestrootingmediumof1/2MS+NAA1 0mg/L,10% bananaand3% sug ar,therootingratewas100%,plantsarehealthywhicharefosteredafter60days.inkunmingarea, B formosanaculturedingreenhousewastransplantedtofieldandthesurvivalratewas95%.ithas broadprospectsfordevelopment. Keywords:Bletilaformosana;asepsissowing;greenhouse;naturallight;falsebulb 收 稿 日 期 :2015-03-04 修 回 日 期 :2015-03-30 网 络 出 版 时 间 :2016-03-24 16:49 作 者 简 介 : 苏 钛 (1981 ), 男 ( 白 族 ), 云 南 大 理 人, 硕 士, 高 级 工 程 师, 主 要 从 事 药 用 植 物 资 源 与 生 物 技 术 研 究 Email:kusutai2000@aliyun com 网 络 出 版 地 址 :htp: //www cnki net/kcms/detail/53 1044 S 20160324 1649 016 html
246 云 南 农 业 大 学 学 报 第 30 卷 小 白 及 [Bletila formosana (Hayata) Schltr ] 属 兰 科 白 及 属 植 物, 广 泛 分 布 于 云 南 贵 州 四 川 广 西 等 地 区 [1] 据 本 草 考 证 及 资 源 调 查, 小 白 及 与 正 品 白 及 [Bletila Striata (Thunb )Reichb f ] 在 植 物 形 态 药 用 功 效 等 方 面 无 较 大 差 异, 在 云 南 四 川 等 民 间 一 直 充 当 白 及 药 材 使 用 [2] 随 着 白 及 药 材 使 用 量 的 加 大, 市 场 价 格 也 水 涨 船 高, 加 之 长 期 以 来 无 序 采 挖, 小 白 及 的 野 生 资 源 已 濒 临 灭 绝 [3] 采 用 植 物 组 织 培 养 技 术 对 小 白 及 进 行 繁 育 生 产, 不 仅 可 以 解 决 市 场 需 求 不 足 的 问 题, 对 保 护 国 家 植 物 品 种 及 维 护 国 家 生 态 都 有 深 厚 的 意 义 利 用 自 然 条 件 进 行 培 养 具 有 节 约 能 源, 节 省 生 产 成 本 的 优 势, 且 培 养 出 的 组 培 苗 具 有 抗 性 好, 炼 苗 成 活 率 高 等 优 势 [4] 目 前, 关 于 小 白 及 的 组 织 培 养 研 究 仅 有 一 篇 简 报 [5], 而 基 于 利 用 自 然 条 件 培 养 及 培 养 基 优 化 等 无 相 关 报 道 因 此, 我 们 对 其 进 行 大 棚 自 然 条 件 下 的 组 织 培 养 技 术 研 究, 拟 优 选 出 小 白 及 无 菌 播 种 分 化 生 根 炼 苗 的 适 宜 条 件, 建 立 起 小 白 及 高 效 低 能 耗 的 组 培 快 繁 体 系, 为 实 现 小 白 及 种 苗 的 规 模 化 生 产 提 供 快 速 扩 繁 技 术 支 持 1 材 料 与 方 法 1 1 材 料 和 试 剂 材 料 为 从 云 南 省 马 关 县 采 集 的 栽 培 小 白 及 种, 植 物 生 长 调 节 剂 NAA(Naphthaleneaceticacid) 2 ip[6 ( isopenylamino) purine] 6 BA (6 benzylaminopurine) 和 ZT(6 Furfurylaminopurine) 均 为 分 析 纯, 为 上 海 sigma 公 司 生 产 1 2 方 法 1 2 1 种 子 无 菌 播 种 将 获 得 的 不 同 成 熟 期 的 小 白 及 蒴 果 ( 胚 龄 为 10 15 20 周 ) 在 流 水 下 冲 洗 干 净, 利 用 多 菌 灵 (500 倍 ) 消 毒 10min, 冲 洗 干 净, 进 行 消 毒 处 理 ( 在 超 净 工 作 台 内 操 作 ) 消 毒 方 法 : 先 用 75% 乙 醇 浸 泡 30s, 然 后 在 酒 精 灯 火 焰 上 烧 10s, 再 用 0 1% 氯 化 汞 消 毒 20min( 加 吐 温 -802 滴 ), 用 无 菌 水 冲 洗 5 次, 将 消 毒 好 后 的 蒴 果 放 在 接 种 盘 中, 切 去 果 柄, 纵 切 蒴 果, 取 出 种 子, 放 置 于 无 菌 水 中, 混 匀, 用 滴 管 取 5mL, 滴 入 培 养 基 中, 使 种 子 均 匀 附 在 培 养 基 表 面, 接 种 培 养 基 为 :1/2 MS+NAA0 3+BA0 1+ 糖 3%, 放 置 在 大 棚 中 利 用 自 然 条 件 培 养, 每 个 处 理 重 复 10 瓶,30d 后 观 察 记 录 发 芽 率, 计 算 公 式 如 下 : 发 芽 率 = ( 萌 发 数 / 播 种 数 ) 100% 1 2 2 小 白 及 拟 原 球 茎 分 化 培 养 由 前 期 实 验 得 知 :NAA BA 2 ip ZT 对 小 白 及 生 长 有 很 大 的 影 响 ; 因 此 利 用 无 菌 播 种 获 得 的 小 白 及 拟 原 球 茎, 以 1/2MS 为 基 本 培 养 基, 考 察 NAA BA 2 ip ZT 几 种 不 同 植 物 生 长 调 节 剂 组 合 和 质 量 浓 度 对 小 白 及 拟 原 球 茎 分 化 的 影 响, 筛 选 出 最 优 培 养 基 每 个 激 素 取 4 个 水 平 ( 表 1), 根 据 L 16 ( 4 ) [6] 正 交 表 安 排 16 个 试 验, 接 种 后 放 在 大 棚, 利 用 自 然 光 培 养,40d 后 观 察 记 录 分 化 率 水 平 表 1 激 素 种 类 和 水 平 表 Tab 1 Hormonetypesandlevels ρ/(mg L -1 ) levels NAA ZT BA 2 ip 1 0 0 0 0 2 0 5 0 5 1 0 0 2 3 1 0 1 5 2 0 0 8 4 2 0 3 0 3 0 3 0 1 2 3 小 白 及 生 根 培 养 将 长 至 3cm 左 右 的 小 白 及 苗, 切 去 叶 片 1/3, 接 种 于 以 1/2MS 为 基 本 培 养 基, 考 察 NAA,IBA 不 同 质 量 浓 度, 及 添 加 香 蕉 和 土 豆 对 小 白 及 生 根 苗 的 影 响, 接 种 后 放 在 大 棚, 利 用 自 然 光 培 养, 60d 后 观 察 记 录 生 根 率 以 及 假 鳞 茎 直 径 1 2 4 炼 苗 及 移 栽 将 苗 高 5~7cm, 假 鳞 茎 直 径 >0 3cm 的 小 白 及 苗 取 出 培 养 瓶, 清 洗 干 净 根 部 附 着 的 培 养 基, 用 百 菌 清 浸 泡 10min, 栽 种 在 苗 床 上 苗 床 基 质 组 成 为 V( 腐 殖 土 ) V ( 红 土 ) V ( 腐 熟 羊 粪 ) V ( 河 沙 ) =5 5 5 2, 苗 床 70% 遮 阴 网 遮 阴, 3~5d 后 可 长 出 新 根, 统 计 成 活 率, 计 算 公 式 为 成 活 率 = ( 成 活 数 / 栽 种 数 ) 100% 2 结 果 与 分 析 2 1 无 菌 苗 的 获 得 将 灭 菌 后 的 不 同 成 熟 度 的 种 子 接 种 于 萌 发 培 养 基 30d 后 观 察, 结 果 表 明 : 不 同 成 熟 度 的 种 子 发 芽 率 有 很 大 的 差 异 ; 其 中, 胚 龄 在 15 周 20 周 的 种 子 发 芽 率 高, 达 到 90%, 形 成 的 拟 原 球 茎 呈 绿 色, 但 20 周 胚 龄 的 蒴 果 容 易 在 灭 菌 过 程 中 开 裂, 导 致 灭 菌 失 败 胚 龄 在 10 周 的 种 子 发 芽 率 最 低, 仅 不 到
第 2 期 苏 钛, 等 : 小 白 及 无 菌 播 种 组 培 快 繁 技 术 研 究 247 10%, 形 成 的 拟 原 球 茎 呈 淡 黄 绿 色 在 显 微 镜 下 观 察 不 同 成 熟 度 的 种 子 发 现, 胚 龄 在 10 周 的 种 子 仅 有 少 数 形 成 球 形 胚 ( 呈 纺 锤 形 )( 图 1A), 多 数 为 尚 未 形 成 胚 ( 呈 线 性 ) ( 图 1B), 而 胚 龄 大 于 15 周 的 种 子 大 部 分 都 形 成 球 形 胚 综 合 比 较, 胚 龄 为 15 周 的 小 白 及 蒴 果 为 最 佳 的 外 植 体 ( 图 2A,2B) 2 2 小 白 及 拟 原 球 茎 分 化 培 养 将 获 得 的 小 白 及 拟 原 球 茎 接 种 于 设 计 的 16 种 培 养 基 中 ( 表 2),40d 后 观 察 记 录 分 化 率 苗 高 苗 健 壮 度 从 直 观 上 可 知 :5 号,9 号,15 号 培 养 基 上 小 白 及 的 分 化 率 高, 而 1 号,2 号,5 号 的 分 化 苗 的 健 壮 度 较 高 由 方 差 分 析 ( 表 3) 可 以 看 出,NAA 和 2 ip 对 小 白 及 的 分 化 有 显 著 性 影 响, 为 重 要 因 素 分 化 率 及 苗 高 与 2 ip 质 量 浓 度 成 正 相 关 ; 当 NAA 质 量 浓 度 为 0 5mg/L 时, 分 化 率 及 苗 高 的 比 较 好, 而 且 苗 的 健 壮 度 高 ; 而 BA 和 ZT 无 显 著 性 影 响, 为 非 重 要 因 素 另 外, 观 察 发 现 添 加 BA 对 小 白 及 的 苗 健 壮 度 有 较 好 的 影 响 ( 图 2C, 2D), 因 此, 按 照 重 要 因 素 取 最 佳 值, 非 重 要 因 素 取 最 小 值 的 经 济 原 则, 选 择 5 号 培 养 基 MS+NAA 0 5mg/L+BA1 0mg/L+2 ip0 8mg/L + 糖 3% 为 分 化 培 养 基, 分 化 率 为 94 5%, 诱 导 的 苗 比 较 健 壮, 颜 色 为 深 绿 色 表 2 不 同 植 物 生 长 调 节 剂 对 小 白 及 分 化 的 影 响 Tab 2 EfectsofdiferentplantgrowthregulatorsonthediferentiationofB formosana 培 养 基 编 号 ρ/(mg.l -1 ) 分 化 率 /% 苗 高 /cm 健 壮 度 No. NAA ZT BA 2 ip diferentiationrate plantheight planthealth 1 0 0 0 0 10 0 1 54 ++++ 2 0 0 5 1 0 0 2 15 3 1 53 ++++ 3 0 1 5 2 0 0 8 35 6 1 94 +++ 4 0 3 0 3 0 3 0 69 6 7 05 + 5 0 5 0 1 0 0 8 94 5 6 65 ++++ 6 0 5 0 5 0 3 0 86 6 7 63 ++ 7 0 5 1 5 3 0 0 76 3 6 36 ++ 8 0 5 3 0 2 0 0 2 80 0 6 56 + 9 1 0 0 2 0 3 0 98 8 7 96 + 10 1 0 0 5 3 0 0 8 80 2 6 86 + 11 1 0 1 5 0 0 2 45 2 3 26 +++ 12 1 0 3 0 1 0 0 69 6 5 32 ++ 13 2 0 0 3 0 0 2 39 5 4 63 + 14 2 0 0 5 2 0 0 40 6 5 00 ++ 15 2 0 1 5 1 0 3 0 96 9 8 02 + 16 2 0 3 0 0 0 8 76 6 6 38 + 注 : 表 中 的 分 化 率 苗 高 的 数 据 为 20 瓶 数 据 平 均 值 ; 健 壮 度 从 差 到 好 用 + ++ +++ ++++ 级 表 示 ; 下 同 Note:Thedateofrateofdiferentiationandheightofplantistheaverageof20botlesplantsheight; +, ++, + ++, ++++ respectivelyindicateplanthealth;thesameasbelow.
云南农业大学学报 第 卷 ４ 表 小白及分化结果方差分析 Ｔ ｂ Ｖ ｙ ｓ ｓ ｈ ｓ Ｂ ｍ ｓ 因素 偏差平方和 ｓ ｕ ｍ ｄ ｖ 自由度 ｄ Ｆ ＮＡＡ ＺＴ ＢＡ Ｐ ５ ４ ４ ５ ４ 误差 Ｅ ５ 临界值 ｖ ｕ 显著性 ｓ ｇ 注 表示在 ５水平上显著 Ｎ ｍ ｓ ｇ ｄ ５ ｖ ４ ｍ 而添加土豆的不明显突起 鳞茎直径达到 仅为 ｍ左右 假鳞茎是小白及重要的营养器官 其大小对其后续炼苗及生长具有至关重要的作用 香蕉能明显促进假鳞茎的膨大 因此 适合小白及 生根的培养及为 ＭＳ ＮＡＡ ｍｇ Ｌ 香蕉 糖 所诱导的根生长良好 假鳞茎直径也 较大 苗较为健壮 图 Ａ 将生根苗打开瓶盖 ｄ 左右移栽在基质中 生长良好 ５ｄ左右可看到根 尖发出新的生长点 炼苗 个月左右可以移栽大田 正常管理 成活率达 ５ 长势很好 图 Ｂ Ｃ 不同质量浓度 ＮＡＡ和 Ｉ ＢＡ以及不同的添加 物对小白及生根的影响 小白及分化苗长至 ｍ左右时转入生根培养基 表 ４ 培养 ｄ后结果显示 ＮＡＡ 和 Ｉ ＢＡ对小 白及根的诱导均具有作用 但 ＮＡＡ的影响作用大于 Ｉ ＢＡ 而且 ＮＡＡ诱导的根较粗壮 而 Ｉ ＢＡ诱导的根 较为细长 在 ＭＳ ＮＡＡ ｍｇ Ｌ 香蕉 糖 的培养基上 生根率达到 根较为健壮 随着 ＮＡＡ质量浓度增大 苗变得细弱 假鳞茎直径 变小 相同条件下 添加香蕉的小白及苗假鳞茎明 显增大 而添加土豆的苗细嫩 假鳞茎不明显膨大 对比其余条件相同 添加土豆和添加香蕉的培养对 比 结果显示 添加香蕉所培养的小白及生根苗假
第 2 期 249 表 4 NAA IBA 香 蕉 土 豆 对 小 白 及 生 根 的 影 响 Tab 4 EfectofNAA,IBA,bananasandpotatoesontherootofB formosana 培 养 基 编 号 ρ/(mg L -1 ) 添 加 物 /% additives 生 根 率 /% 假 鳞 茎 直 径 /cm 苗 健 壮 度 No. NAA IBA 香 蕉 banana 土 豆 potato rootingrate falsebulbdiameter planthealth 1 0 0 5 0 10 51 63 未 见 膨 大 ++ 2 0 1 0 0 10 59 35 0 18 + 3 0 2 0 0 10 49 68 1 21 + 4 0 5 0 10 0 83 23 0 37 +++ 5 1 0 0 10 0 100 00 0 45 ++++ 6 2 0 0 10 0 100 00 0 31 ++ 7 0 0 5 10 0 58 34 0 20 ++ 8 0 1 0 10 0 64 32 0 29 +++ 9 0 2 0 10 0 59 05 0 27 ++ 10 0 5 0 10 76 63 0 19 + 11 1 0 0 10 100 00 0 26 ++ 12 2 0 0 10 98 65 0 30 + 注 : 表 中 的 生 根 率 直 径 的 数 据 为 20 瓶 数 据 平 均 值 Note:Thedateofrootingofrateanddiameteristheaverageof20botlesplantsheight. 3 讨 论 经 过 对 比 观 察, 培 养 室 内 日 光 灯 恒 温 培 养 的 小 白 及 组 培 苗 生 长 更 快, 但 是 叶 片 明 显 偏 薄, 炼 苗 时 打 开 瓶 盖 后 容 易 失 水, 假 鳞 茎 难 以 形 成 大 棚 自 然 条 件 下 培 养 的 小 白 及 组 培 苗 生 长 虽 慢, 但 能 有 效 地 增 强 组 培 苗 叶 片 的 厚 度, 促 进 气 孔 的 发 育, 这 极 大 地 提 高 了 后 续 组 培 苗 的 炼 苗 成 活 率, 这 与 仲 乃 琴 [7] 王 福 斌 [8] [9] 陈 小 凤 等 的 研 究 结 果 相 似 小 白 及 在 大 棚 自 然 条 件 下 更 较 容 易 形 成 假 鳞 茎, 这 可 能 与 大 棚 内 自 然 光 和 温 差 有 关 大 棚 自 然 条 件 培 养 特 点 是 白 天 光 照 强, 温 度 高, 夜 晚 黑 暗 温 度 低, 具 有 较 大 的 温 差, 而 此 环 境 中 的 小 白 及 白 天 光 合 作 用 强, 晚 上 呼 吸 作 用 低, 有 效 的 增 加 了 干 物 质 的 积 累 [10], 急 剧 的 温 度 变 化 还 促 进 了 小 白 及 淀 粉 及 白 及 多 糖 的 形 成, 从 而 促 进 了 假 鳞 茎 的 形 成 及 生 长, 而 且 组 培 苗 健 壮 ; 而 在 恒 温 灯 光 下 培 养 的 小 白 及 一 直 处 于 较 弱 光 下, 呼 吸 作 用 较 强, 因 此 不 易 形 成 假 鳞 茎, 导 致 组 培 苗 较 细 弱 利 用 大 棚 自 然 条 件 培 养 还 可 以 大 大 地 降 低 组 培 苗 生 产 的 电 费, 节 约 能 源 因 此, 充 分 利 用 云 南 的 光 能 资 源, 解 决 组 培 工 厂 耗 能 巨 大 的 问 题, 在 获 得 了 生 长 良 好 成 活 率 高 的 优 质 的 小 白 及 组 培 苗 的 同 时, 大 大 降 低 生 产 成 本, 加 快 小 白 及 种 植 产 业 的 发 展, 为 制 药 企 业 提 供 稳 定 的 药 材 渠 道, 实 现 中 药 的 现 代 化 都 具 有 重 要 意 义 [ 参 考 文 献 ] [1] 中 国 科 学 院 昆 明 植 物 研 究 所. 云 南 植 物 志 : 第 十 四 卷 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,2003. [2] 云 南 省 药 物 研 究 所, 朱 兆 云. 云 南 天 然 药 物 图 鉴 : 第 一 卷 [M]. 昆 明 : 云 南 科 技 出 版 社,2003:139. [3] 云 南 省 药 物 研 究 所, 朱 兆 云. 云 南 重 要 天 然 药 物 : 续 一 [M]. 昆 明 : 云 南 科 技 出 版 社,2011:96. [4] 谢 玲 玲, 王 尔 惠. 工 厂 化 生 产 组 培 苗 的 成 本 控 制 技 术 [J]. 湖 北 农 业 科 学,2007,46(1):30. [5] 孙 长 生, 韩 见 宇, 龙 祥 友. 小 白 及 的 组 织 培 养 与 快 速 繁 殖 [J]. 植 物 生 理 学 通 讯,2004,40(4):453. [6] 杨 善 朝, 张 军 舰.SPSS 统 计 软 件 应 用 基 础 [M]. 桂 林 : 广 西 师 范 大 学 出 版 社,2001:58. [7] 仲 乃 琴, 王 一 航, 齐 恩 芳. 碳 源 质 量 浓 度 对 不 同 光 源 培 养 的 马 铃 薯 脱 毒 试 管 苗 生 长 的 影 响 [J]. 中 国 马 铃 薯,2000,14(2):73. [8] 王 福 斌. 菊 花 名 贵 品 种 的 速 繁 与 室 内 自 然 光 培 养 [J]. 山 东 农 业 科 学,1992(5):46. [9] 陈 小 凤, 龚 明 霞, 方 锋 学, 等. 自 然 光 及 NH4+ 对 洋 桔 梗 玻 璃 化 的 影 响 [J]. 广 西 农 业 科 学,2008, 39(4):519. [10] 高 慧 君, 陈 涛. 马 铃 薯 脱 毒 试 管 苗 自 然 光 照 培 养 研 究 [J]. 马 铃 薯 杂 志,1996,10(1):29.