第 34 卷 第 6 期 生 态 科 学 34(6): 36 41 2015 年 11 月 Ecological Science Nov. 2015 罗 琪 宇, 方 扬, 张 定 鹏, 等. 转 基 因 番 木 瓜 PCR 快 速 检 测 体 系 的 优 化 [J]. 生 态 科 学, 2015, 34(6): 36 41. LUO Qiyu, FANG Yang, ZHANG Dingpeng, et al. Optimization of PCR-based method for rapid detection of genetically modified (GM) papaya[j]. Ecological Science, 2015, 34(6): 36 41. 转 基 因 番 木 瓜 PCR 快 速 检 测 体 系 的 优 化 罗 琪 宇 1,2,3, 方 扬 1,2,3, 张 定 鹏 1,2,3, 朱 鹏 1,2,3, 谈 凤 笑 1,2,3, 王 建 武 1,2,3,* 1. 华 南 农 业 大 学 农 学 院, 广 州 510642 2. 华 南 农 业 大 学 农 业 部 华 南 热 带 农 业 环 境 重 点 实 验 室, 广 州 510642 3. 华 南 农 业 大 学 广 东 省 高 等 学 校 农 业 生 态 与 农 村 环 境 重 点 实 验 室, 广 州 510642 摘 要 随 着 公 众 对 转 基 因 食 品 安 全 性 的 关 注, 转 基 因 番 木 瓜 的 快 速 检 测 技 术 成 为 关 键 问 题 优 化 了 番 木 瓜 总 DNA 的 提 取 方 法, 选 用 木 瓜 蛋 白 酶 基 因 (Papain) 作 为 内 源 参 照 基 因, 建 立 了 转 基 因 番 木 瓜 GM YK 和 华 农 一 号 的 双 重 PCR 定 性 检 测 方 法 通 过 对 广 州 市 超 市 和 批 发 市 场 222 个 样 品 的 检 验, 并 与 SN/T 2653 2010 行 业 标 准 对 比, 证 明 该 方 法 具 有 污 染 少 速 度 快 成 本 低 的 优 点 关 键 词 : 转 基 因 番 木 瓜 ; 品 系 鉴 定 ; PCR 检 测 ; DNA 提 取 doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2015.06.006 中 图 分 类 号 :S158 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1008-8873(2015)06-036-06 Optimization of PCR-based method for rapid detection of genetically modified (GM) papaya LUO Qiyu 1,2,3, FANG Yang 1,2,3, ZHANG Dingpeng 1,2,3, ZHU Peng 1,2,3, TAN Fengxiao 1,2,3, WANG Jianwu 1,2,3,* 1. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China 2. Key Laboratory of Agro-Environments in Tropics, Ministry of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China 3. Key Laboratory of Agroecology and Rural Environment of Guangdong Regular Higher Education Institutions, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China Abstract: The safety of genetically modified (GM) food has attracted much attention recently. Demands for developing rapid identification method of GM crops in food have been increased dramatically. In this study, a rapid method for detection of genetically modified papaya by multiplex polymerase chain reaction (PCR) was developed. The method for the extraction of total DNA method was optimized, the Papain was used as an endogenous reference gene, and a double PCR qualitative way to detect GM papaya varieties GM YK and Huanong No.1 was established. Through testing 222 papaya samples from supermarkets and wholesale markets in Guangzhou, the new established double PCR qualitative detection method shows advantages of less pollution, quicker detection and lower cost as compared with the results of industry standard SN/T 2653 2010. Key words: GM papaya; cultivar identification; PCR test; DNA extraction 1 前 言 番 木 瓜 (Carica papaya Linn.) 属 于 番 木 瓜 科 番 木 瓜 属, 是 热 带 亚 热 带 重 要 的 水 果, 在 我 国 南 方 尤 为 受 欢 迎, 素 有 岭 南 佳 果 的 美 称 其 果 实 可 鲜 食 亦 可 被 烹 饪 成 佳 肴 食 用, 也 可 被 加 工 成 饮 料 果 冻 收 稿 日 期 : 2015-05-04; 修 订 日 期 : 2015-06-05 基 金 项 目 : 华 南 农 业 大 学 国 家 级 创 新 训 练 项 目 ( 编 号 : 201310564050) 作 者 简 介 : 罗 琪 宇 (1993 ), 女, 本 科 生, 主 要 从 事 转 基 因 生 物 安 全 性 评 价 研 究, E-mail: 1359711536@qq.com * 通 信 作 者 : 王 建 武, 男, 教 授, 主 要 从 事 转 基 因 生 物 安 全 性 评 价 及 循 环 农 业 研 究, E-mail: wangjw@scau.edu.cn
6 期 罗 琪 宇, 等. 转 基 因 番 木 瓜 PCR 快 速 检 测 体 系 的 优 化 37 果 脯 木 瓜 膏 等 食 品 从 上 个 世 纪 开 始, 由 于 番 木 瓜 环 斑 病 毒 (papaya ringspot virus, PRSV) 的 危 害, 世 界 各 地 的 番 木 瓜 生 产 受 到 严 重 影 响 [1] PRSV 属 于 马 铃 薯 Y 病 毒 属 成 员, 通 过 非 持 久 性 传 毒 的 蚜 虫 进 行 传 播 [2] 由 于 缺 乏 天 然 的 抗 病 资 源, 通 过 传 统 育 种 方 式 难 以 获 得 抗 病 毒 木 瓜 品 种 [3,4] 转 基 因 技 术 是 培 育 抗 病 品 种 的 有 效 途 径 [5] 1990 年 首 例 转 PRSV 衣 壳 蛋 白 (coat protein, CP) 基 因 番 木 瓜 问 世, 美 国 在 1991 年 获 得 了 首 个 转 基 因 番 木 瓜 品 系 Event 55-1, 商 品 名 称 为 SunUP( 日 升 ) 和 Rainbow( 彩 虹 ) [6], 它 们 在 田 间 试 验 中 表 现 出 对 番 木 瓜 环 斑 病 毒 的 良 好 抗 性, 并 于 1998 年 5 月 在 夏 威 夷 正 式 投 入 商 业 化 生 产 [7] 后 于 2008 年, 美 国 佛 罗 里 达 州 立 大 学 的 研 究 人 员 获 得 了 转 基 因 番 木 瓜 株 系 UFL-X17CP-6(X17-2) [8] GM YK 为 中 国 台 湾 流 行 株 系 PRSV YK 转 化 当 地 品 种 后 获 得 的 品 系 [9] 到 目 前 为 止, 全 世 界 已 获 准 商 业 化 种 植 的 抗 病 毒 转 基 因 番 木 瓜 有 Event 55-1 X17-2 和 华 农 一 号 三 个 品 系, 但 正 进 行 田 间 试 验 的 转 基 因 番 木 瓜 种 类 众 多 [10] 我 国 仅 华 南 农 业 大 学 李 华 平 等 培 育 的 高 抗 PRSV 的 转 基 因 番 木 瓜 华 农 一 号 在 2006 年 通 过 农 业 部 的 批 准 被 允 许 在 中 国 境 内 生 产 和 销 售 [11] 随 着 转 基 因 番 木 瓜 的 不 断 商 业 化, 研 究 开 发 快 速 高 效 简 便 经 济 的 多 基 因 同 时 检 测 技 术 成 为 了 现 实 需 要 现 在 已 经 建 立 的 检 测 方 法 中 以 基 于 其 中 外 源 DNA 检 测 的 PCR 方 法 应 用 最 广 泛 [12] 现 有 报 道 中 番 木 瓜 总 DNA 的 提 取 方 法 较 为 常 用 的 是 CTAB 法 和 试 剂 盒 法 [13 17], 但 是 大 都 采 用 液 氮 手 工 研 磨, 比 较 费 时 费 力 本 研 究 采 用 FastPrep-24 仪 器 研 磨 提 取 总 DNA, 避 免 了 人 工 研 磨 样 品 破 碎 程 度 不 同 DNA 产 率 不 一 致 PCR 反 应 需 要 进 行 逐 个 调 模 板 质 量 浓 度 的 烦 琐 操 作 等 问 题, 使 番 木 瓜 的 PCR 检 测 规 模 化 标 准 化 快 速 分 析 成 为 可 能 [18] 值 得 注 意 的 是, 本 研 究 在 研 磨 之 前 先 加 入 了 DNA 提 取 液, 以 防 止 因 为 研 磨 产 生 高 温 而 导 致 DNA 降 解, 能 高 通 量 与 高 质 量 的 提 取 番 木 瓜 DNA, 为 后 续 试 验 提 供 更 好 的 样 品 基 础, 优 化 了 番 木 瓜 的 总 DNA 提 取 方 法 针 对 市 场 上 可 能 遇 到 的 转 基 因 番 木 瓜 种 类, 本 研 究 选 用 木 瓜 蛋 白 酶 (Papain) 基 因 作 为 内 源 基 因 CaMV35S 启 动 子 作 为 转 基 因 筛 选 检 测 基 因, 结 合 现 有 的 报 道 选 择 55-1 GM YK 和 华 农 一 号 品 系 (Event) 的 特 异 PCR 引 物 [10], 优 化 了 PCR 的 条 件, 建 立 了 3 个 抗 病 毒 转 基 因 番 木 瓜 的 品 系 共 用 的 特 异 性 双 重 PCR 定 性 检 测 方 法 2 材 料 与 方 法 2.1 材 料 2.1.1 样 品 试 验 所 用 的 阳 性 参 照 阴 性 参 照 和 待 测 番 木 瓜 样 品 的 种 类 和 来 源 见 表 1 表 2 除 阳 性 参 照 与 阴 性 参 照 材 料 取 自 番 木 瓜 植 株 的 叶 片 外, 其 余 样 品 材 料 均 取 自 番 木 瓜 皮 2.1.2 试 剂 Taq 酶 dntps 10 PCR 缓 冲 液 购 自 TaKaRa 生 物 有 限 公 司 ; CTAB 购 自 Promega 公 司 ; CWBIO 新 型 植 物 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 购 自 康 为 世 纪 生 物 科 技 有 限 公 司 ; 其 他 常 用 试 剂 为 国 产 分 析 纯 选 用 CaMV35S 启 动 子 作 为 转 基 因 筛 选 检 测 基 因 [19], 以 Papain 基 因 作 为 内 参 基 因 [20], 具 体 的 引 物 参 考 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 木 瓜 中 转 基 因 成 分 定 性 PCR 检 测 方 法 (SN/T 2653 2010) 的 引 物 信 息 [21] ( 见 表 2), 所 有 引 物 由 上 海 生 工 生 物 技 术 有 限 公 司 合 成 2.1.3 主 要 仪 器 和 设 备 FastPrep-24 样 品 快 速 制 备 系 统 ( 美 国 MP 公 司 ) 高 速 离 心 机 (Eppendorf 公 司 ) 170-9703 型 PCR 仪 ( 美 国 Bio-Rad 公 司 ) 电 泳 仪 (DYY-6C 北 京 六 一 仪 器 厂 ) GelDoc XR 型 全 自 动 凝 胶 成 像 系 统 ( 美 国 Bio-Rad 公 司 ) DK-8D 型 电 热 恒 温 水 浴 锅 ( 上 海 精 宏 实 验 设 备 有 限 公 司 ) 2.2 方 法 2.2.1 不 同 番 木 瓜 总 DNA 提 取 方 法 的 比 较 各 取 约 0.3 g 新 鲜 番 木 瓜 皮 分 别 作 5 种 处 理 处 理 一 : 样 品 放 入 2 ml 冷 冻 管 后 直 接 在 FastPrep-24 仪 上 研 磨 至 粉 末 状 后, 添 加 CTAB 缓 冲 液 ; 处 理 二 : 样 品 表 1 番 木 瓜 阳 性 与 阴 性 对 照 样 品 Tab. 1 Positive and negative samples of papaya 样 品 编 号 1 2 3 样 品 名 称 来 源 备 注 转 基 因 番 木 瓜 GM YK 系 列 ( 叶 片 ) 转 基 因 番 木 瓜 华 农 一 号 ( 叶 片 ) 非 转 基 因 番 木 瓜 Malaysia( 叶 片 ) 华 南 农 业 大 学 华 南 农 业 大 学 华 南 农 业 大 学 阳 性 参 照 阳 性 参 照 阴 性 参 照
38 生 态 科 学 34 卷 表 2 广 州 市 采 集 的 番 木 瓜 待 测 样 品 Tab. 2 Papaya samples collected from Guangzhou 鲜 木 瓜 加 工 品 采 样 地 点 数 量 / 个 奶 制 品 类 / 份 果 蔬 类 / 份 江 南 水 果 批 发 市 场 ( 白 云 区 ) 60 风 行 木 瓜 牛 奶 地 扪 糖 水 热 带 杂 果 天 平 架 水 果 批 发 市 场 ( 天 河 区 ) 27 香 满 楼 木 瓜 牛 奶 特 别 好 热 带 杂 果 花 都 水 果 批 发 市 场 ( 花 都 区 ) 26 晨 光 木 瓜 牛 奶 饮 品 都 乐 热 带 杂 果 水 果 土 特 产 一 条 街 ( 南 沙 区 ) 16 晨 光 岭 南 食 尚 木 瓜 牛 奶 饮 品 鹰 金 钱 红 枣 莲 子 炖 木 瓜 新 垦 综 合 市 场 ( 南 沙 区 ) 12 卡 士 木 瓜 酸 乳 鹰 金 钱 冰 糖 雪 耳 木 瓜 大 沙 综 合 批 发 市 场 ( 黄 埔 区 ) 11 鲜 键 木 瓜 牛 奶 饮 品 嘉 丽 果 木 瓜 汁 东 城 水 果 批 发 市 场 ( 番 禺 区 ) 7 维 记 木 瓜 牛 奶 papaya juice 增 城 水 果 批 发 市 场 ( 增 城 市 ) 9 伊 利 大 果 粒 风 味 发 酵 乳 果 汁 先 生 木 瓜 苹 果 汁 河 东 水 果 批 发 市 场 ( 从 化 市 ) 6 阿 莎 力 木 瓜 牛 奶 阜 康 木 瓜 干 ( 中 国 台 湾 ) 芳 村 水 果 批 发 市 场 ( 荔 湾 区 ) 1 燕 塘 食 膳 养 生 木 瓜 牛 奶 泰 奥 琪 木 瓜 干 市 桥 水 果 批 发 市 场 ( 番 禺 区 ) 1 燕 塘 木 瓜 酸 奶 卡 弗 木 瓜 干 华 润 万 家 超 市 ( 龙 洞 店 ) 1 多 美 鲜 水 果 坚 果 奶 酸 春 光 速 溶 木 瓜 粉 百 佳 超 市 ( 正 佳 广 场 店 ) 2 伊 利 味 可 滋 木 瓜 奶 昔 乳 饮 品 素 玛 哥 木 瓜 味 果 冻 ( 马 来 西 亚 ) 卜 蜂 莲 花 超 市 ( 长 兴 店 ) 3 果 享 学 生 奶 粉 南 国 木 瓜 糕 吉 之 岛 超 市 ( 天 河 城 店 ) 1 - 恒 寿 堂 密 炼 木 瓜 茶 世 纪 联 华 超 市 ( 九 洲 店 ) 1 - 多 美 乐 蜂 蜜 木 瓜 茶 家 乐 福 超 市 ( 康 王 店 ) 2 - 统 一 木 瓜 椰 子 饮 品 人 人 乐 超 市 ( 增 城 店 ) 2 - - 沃 尔 玛 超 市 ( 龙 口 西 店 ) 1 - - 大 润 发 超 市 ( 番 禺 店 ) 2 - - 总 计 191 14 17 表 3 抗 病 毒 转 基 因 番 木 瓜 及 内 源 基 因 的 扩 增 引 物 Tab. 3 Primer sequences of GM papaya specific genes and endogenous reference genes for PCR amplification PCR 体 系 引 物 名 称 引 物 序 列 (5-3 ) 检 测 基 因 产 物 长 度 /bp 内 源 基 因 Papain f Papain r CaMV 35S f PRSV cp r CaMV 35S f tgcttgactgcgacagac ctttctcccttgagcgac acgcacaatcccactatc cacatc(a/g)tttccgtcacta acgcacaatcccactatc Papain gene 144 特 异 性 检 测 55-1/GM YK 品 系 特 异 基 因 322/243 PRSV rep r gcttcctcattacactcc 华 农 一 号 品 系 特 异 基 因 213 与 CTAB 缓 冲 液 共 同 加 入 2 ml 冷 冻 管 再 置 于 FastPrep- 24 仪 上 研 磨 至 粉 末 状 ; 处 理 三 : 样 品 加 入 2 ml 冷 冻 管 后 直 接 在 FastPrep-24 仪 上 研 磨 木 瓜 皮 至 粉 末 状 后 加 试 剂 盒 中 的 Buffer LP1 试 剂 ; 处 理 四 : 将 样 品 与 试 剂 盒 中 的 Buffer LP1 试 剂 共 同 加 入 2 ml 冷 冻 管, 置 于 FastPrep-24 仪 上 研 磨 至 粉 末 状 ; 处 理 五 : 采 用 液 氮 手 工 研 磨 木 瓜 皮 至 粉 末 状 后 加 CTAB 缓 冲 液 (FastPrep-24 仪 震 荡 时 间 为 60 s, 震 荡 强 度 为 6) 后 [16] 续 的 DNA 抽 提 步 骤 按 照 赵 琳 娜 改 进 CTAB 法 或 新 型 植 物 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 ( 康 为 世 纪 生 物 科 技 有 限 公 司 ) 使 用 说 明 书 进 行 操 作 所 得 的 总 DNA 以 w=1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 (0.5 TAE) 检 测 所 提 取 DNA 的 质 量 从 中 选 出 最 适 合 的 方 法 用 作 其 余 番 木 瓜 样 品 阳 性 参 照 与 阴 性 参 照 的 DNA 提 取 将 提 取 的 番 木 瓜 总 DNA 溶 液 放 置 于 80 冰 箱 中 保 存 备 用 2.2.2 设 置 对 照 阳 性 参 照 以 含 有 转 基 因 序 列 的 番 木 瓜 叶 DNA 为 模 板, 阴 性 参 照 以 非 转 基 因 番 木 瓜 叶 的 DNA 为 模 板, 并 设 有 PCR 反 应 的 空 白 对 照 ( 以 蒸 馏 水 代 替 DNA 模 板 )
6 期 罗 琪 宇, 等. 转 基 因 番 木 瓜 PCR 快 速 检 测 体 系 的 优 化 39 2.2.3 PCR 检 测 方 法 比 较 采 用 TaKaRa 公 司 的 PCR 试 剂, 使 用 引 物 papain f/papain r CaMV 35S f/prsv cp r 和 CaMV 35S f/prsv rep r 为 引 物 ( 表 2) 进 行 PCR 特 异 性 扩 增 检 测, 比 较 单 重 PCR 和 双 重 PCR( 利 用 两 种 引 物 组 合 Papain f/papain r 与 GM YK 35S f/prsv CP r Papain f/papain r 与 GM YK 35S f/prsv Rep r) 检 测 方 法, 确 定 番 木 瓜 基 因 组 中 是 否 含 有 转 基 因 成 分 PCR 扩 增 检 测 体 系 总 体 积 为 25 ul 所 用 的 PCR 反 应 条 件 均 为 : 94 预 变 性 5 min; 94 变 性 45 s, 54 退 火 60 s( 预 备 实 验 采 用 退 火 温 度 为 50-60, 最 后 确 定 最 佳 退 火 温 度 为 54 ), 72 延 伸 60 s, 29 个 循 环 ; 72 延 伸 5 min 经 比 较 选 择 出 较 优 的 方 法 用 于 其 余 样 品 的 PCR 检 测 PCR 产 物 经 1.5% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 EB 染 色 后, 在 凝 胶 成 像 仪 上 观 察 结 果 2.2.4 PCR 产 物 的 序 列 测 定 取 上 述 PCR 产 物 7 份 送 至 Invitrogen 公 司 进 行 克 隆 序 列 测 定 将 获 得 的 序 列 在 NCBI 中 进 行 序 列 同 源 性 比 对 3 结 果 3.1 番 木 瓜 的 总 DNA 提 取 番 木 瓜 总 DNA 提 取 方 法 的 结 果 比 较 见 图 1 从 图 中 可 以 看 出 : (1) 研 磨 方 法 采 用 FastPre-24 仪 器 研 磨 比 液 氮 手 工 研 磨 更 好, 处 理 四 4 比 处 理 五 获 得 的 总 DNA 量 更 多, DNA 降 解 更 少, 更 大 缩 短 实 验 时 间 (2) 先 加 CTAB 缓 冲 液 或 试 剂 盒 中 的 Buffer LP1 后 研 磨 比 直 接 研 磨 更 好, 处 理 二 处 理 四 比 处 理 一 处 理 三 获 得 的 总 DNA 更 集 中, 拖 带 更 少, 效 果 更 好 (3) 试 剂 盒 法 比 CTAB 法 更 好, 处 理 三 处 理 四 比 处 理 一 处 理 二 与 处 理 五 提 取 出 的 基 因 组 的 完 整 性 更 好, 稳 定 性 更 高 3.2 番 木 瓜 样 品 的 双 重 PCR 分 析 转 基 因 番 木 瓜 单 重 PCR 和 双 重 PCR 检 测 结 果 见 图 2 单 重 PCR 结 果 表 明 : (1) 以 阳 性 参 照 GM YK 华 农 一 号 和 阴 性 参 照 非 转 基 因 番 木 瓜 的 DNA 为 模 板, 利 用 引 物 papain f/papain r 能 扩 增 出 清 晰 条 带, 且 片 段 大 小 与 预 期 相 符, 表 明 用 于 番 木 瓜 内 源 基 因 (Papain) 检 测 的 引 物 具 有 良 好 的 特 异 性, 可 用 于 PCR 反 应 的 质 量 控 制 ( 图 2); (2) 以 待 测 样 品 的 DNA 为 模 板, 用 引 物 CaMV 35S f/prsv rep r 扩 增 华 农 一 号, 华 农 一 号 转 基 因 品 系 均 出 现 了 条 带, 条 带 大 致 位 于 200 bp 到 300 bp 之 间, 片 段 大 小 与 预 期 相 符 ( 克 隆 序 列 测 定 后 确 定 为 213 bp), 表 明 引 物 具 有 良 好 的 特 异 性 ( 图 2); (3) 同 理, 引 物 CaMV 35S f/prsv cp r 用 于 GM YK 扩 增 品 系 转 基 因 番 木 瓜 时 也 具 有 良 好 的 特 异 性 ( 图 2)( 克 隆 序 列 测 定 后 确 定 为 243 bp) 已 有 报 道 显 示 引 物 CaMV 35S f/prsv cp r 同 样 也 适 用 于 55-1 品 系 转 基 因 番 木 瓜 ( 扩 增 片 段 大 小 应 为 322 bp) [15] 图 1 5 种 方 法 提 取 的 番 木 瓜 果 皮 总 DNA 电 泳 图 Fig. 1 Gel electrophoresis of papaya peel total DNA extracted with five methods 注 : M 为 200 bp DNA ladder 泳 道 1-5 来 自 样 品 1, 泳 道 6-10 来 自 样 品 2 泳 道 1 6 为 处 理 一 : 样 品 (FastPrep-24 仪 研 磨 )+CTAB 缓 冲 液 ; 泳 道 2 7 为 处 理 二 : CTAB 缓 冲 液 + 样 品 ( 共 同 在 FastPrep-24 仪 研 磨 ); 泳 道 3 8 为 方 处 理 三 : 样 品 (FastPrep-24 仪 研 磨 )+ 试 剂 盒 Buffer LP1; 泳 道 4 9 为 处 理 四 : 试 剂 盒 Buffer LP1+ 样 品 ( 共 同 在 FastPrep-24 仪 研 磨 ); 泳 道 5 10 为 处 理 五 : 样 品 ( 液 氮 手 工 磨 样 )+CTAB 缓 冲 液
40 34 卷 生 态 科 学 图 2 抗病毒转基因番木瓜单重 PCR 和双重 PCR 检测结果 Fig. 2 Single and double PCR amplifiable results of virus-resistant GM papaya 注: M 为 100 bp DNA ladder 图 2-A: 引物 Papain f/papain r 的扩增结果(泳道 1 4 为 GM YK 华农一号 非转基因番木瓜 空白对照); 图 2-B: 引物 GM YK 35S f/prsv CP r 的扩增结果(泳道 5 8 为 GM YK 华农一号 非转基因番木瓜 空白对照); 图 2-C: 引物 GM YK 35S f/prsv Rep r 的扩增结果(泳道 9 12 为 GM YK 华农一号 非转基因番木瓜 空白对照); 图 2-D: 双重 PCR 检测结果(泳道 13 14 为引物组合 Papain f/papain r 与 GM YK 35S f/prsv CP r 扩增 GM YK 和非转基因番木瓜, 泳道 15-17 为引物组合 Papain f/papain r 与 GM YK 35S f/prsv Rep r 扩 增华农一号 非转基因番木瓜 空白对照) 在此基础上, 利用两种引物组合Papain f/papain r与gm YK 35S f/prsv CP r Papain f/papain r与gm YK 35S f/prsv Rep r 建立双重PCR定性检测方法 瓜样品的快速检测 4 讨论 结果表明, 双重PCR产物的电泳条带清晰, 根据引 已有报道表明番木瓜的不同组织 不同公司的 物扩增产物的大小能区分各片段, 能鉴定出GM DNA提取试剂盒对番木瓜总DNA获得量也有影响 YK 华农一号2种品系转基因番木瓜(待测样品没有 本研究曾对番木瓜果皮 果肉和番木瓜加工品的总 检测到55-1品系) 进一步对抽取的样品扩增产物进 D N A 提 取 进 行 对 比, 也 对 比 使 用 C TA B 法 行克隆测序分析, 结果表明所获得的样品序列与阳 FOREGENE试剂盒法(成都福际生物技术有限公 性参照序列同源性达到100%, 并且经NCBI的 司) CWBIO试剂盒法[13 17] 结果也显示了与前人 BLAST同源性比对证实所获得的序列为GM YK和 类似的结果, 即在相同的总DNA提取方法下, 番木 华农一号品系的转基因番木瓜品种 图3进一步表明 瓜果皮比果肉的总DNA含量更高 而不同总DNA提 该双重PCR定性检测方法适用于本研究中其余番木 取方法下, 赵琳娜的改进CTAB法和CWBIO试剂 图 3 部分样品的双重 PCR 电泳图 Fig. 3 Gel electrophoresis of double PCR 注: M 为 100 bp DNA ladder 图 3 A: 市售 GM YK 品系转基因番木瓜的电泳结果(泳道 1 4 为 1 号阳性参照 3 4 5 号番木瓜样品); 图 3 B: 市售华农一号品系转基因番木瓜的电泳结果(泳道 1-4 为 2 号阳性参照 6 7 8 号番木瓜样品)
6 期 罗 琪 宇, 等. 转 基 因 番 木 瓜 PCR 快 速 检 测 体 系 的 优 化 41 盒 法 提 取 的 果 皮 总 DNA 质 量 较 好, 能 为 后 续 PCR 特 异 性 检 测 提 供 质 量 保 障 因 此, 本 研 究 推 荐 使 用 FastPrep-24 仪 结 合 试 剂 盒 法 ( 先 加 试 剂 盒 中 的 Buffer LP1 再 用 仪 器 研 磨 ) 提 取 番 木 瓜 总 DNA 目 前 番 木 瓜 加 工 品 多 为 木 瓜 乳 制 品 ( 在 广 州 连 锁 超 市 中 占 45.16%), 但 本 研 究 实 验 表 明 以 上 方 法 匀 不 适 用 于 木 瓜 奶 加 工 品 中 的 番 木 瓜 总 DNA 的 提 取, 这 将 是 今 后 的 番 木 瓜 转 基 因 品 系 鉴 定 需 要 重 点 突 破 的 技 术 问 [22] 题 阮 小 蕾 等 建 立 了 对 转 基 因 番 木 瓜 进 行 三 重 PCR 和 四 重 PCR 定 性 检 测 本 研 究 表 明 同 一 反 应 体 系 中 采 用 双 重 PCR 检 测 即 可 以 区 分 出 GM YK 华 农 一 号 2 种 品 系 的 转 基 因 番 木 瓜, 既 缩 短 了 检 测 时 [23] 间 降 低 了 成 本 提 高 了 检 测 效 率 杨 永 存 等 检 测 出 深 圳 市 主 要 的 转 基 因 番 木 瓜 品 系 为 华 农 一 号 和 GM YK 而 本 研 究 的 其 余 待 测 样 品 也 没 有 检 测 到 55-1 品 系 的 转 基 因 番 木 瓜 综 上 所 述, 本 研 究 获 得 的 最 优 番 木 瓜 总 DNA 提 取 法 是 预 先 加 入 CWBIO 试 剂 盒 中 的 Buffer LP1 后 再 用 FastPrep-24 仪 器 研 磨 果 皮 样 品 本 研 究 所 建 立 的 转 基 因 番 木 瓜 的 双 重 PCR 定 性 检 测 体 系 适 用 于 目 前 国 内 市 场 上 的 番 木 瓜 品 系 鉴 定 的 需 要 致 谢 : 感 谢 华 南 农 业 大 学 农 学 院 李 华 平 教 授 提 供 阳 性 参 照 与 阴 性 参 照 的 样 品 材 料 本 研 究 由 大 学 生 国 家 级 创 新 训 练 项 目 ( 编 号 : 201310564050) 基 金 提 供 资 助, 特 此 感 谢 参 考 文 献 [1] 饶 雪 琴, 李 华 平. 转 基 因 番 木 瓜 研 究 进 展 [J]. 中 国 生 物 工 程 杂 志, 2004, 24(6): 38 42. [2] YEH S D, GONSALVES D. Translation of papaya ringspot virus RNA in vitro: Detection of a possible polyprotein that is processed for capsid protein, cylindrical-inclusion protein, and amorphous-inclusion protein[j]. Journal of Virology, 1985(143): 260 271. [3] COOK A A, ZETTLER F W. Susceptibility of papaya cultivars to papaya ringspot and papaya mosaic virus[j]. Plant Disease Reporter, 1970(54): 893 895. [4] WANG H L, WANG C C, CHIU R J, eta. Preliminary study on papaya ringspot virus in Taiwan[J]. Plant Protection Bulletin, 1978(20): 133 140. [5] SANFORD J C, JOHNSTON S A. The concept of parasite-derived resistance-deriving resistance genes from the parasite s own genome[j]. Journal of Theoretical Biology,1985(113): 395 405. [6] FITCH M M M, MANSHARDT R M, GONSALVES D, eta. Stable transformation of papaya via microprojectile bombardmen[j]. Plant Cell Reports, 1990,9(4): 189 194. [7] GONSALVES C, LEE D, GONSALVES D. Transgenic Virus Resistant Papaya: The Hawaiian Rainbow was rapidly adopted by farmers and is of major importance in Hawaii today[eb/ol]. 2004. http://www.apsne.torg/education/ feature/papaya /. [8] 任 君 安. 玉 米 和 番 木 瓜 等 产 品 中 转 基 因 成 分 检 测 技 术 研 究 [D]. 北 京 : 北 京 林 业 大 学, 2013. [9] 陈 红 运, 黄 峰, 陈 青, 等. 抗 病 毒 转 基 因 木 瓜 的 分 子 检 测 [J]. 植 物 检 疫, 2009, 23(5): 19 22. [10] 韩 建 勋, 陈 红 运, 邓 婷 婷, 等. 抗 病 毒 转 基 因 番 木 瓜 的 实 时 PCR 检 测 [J]. 检 验 检 疫 学 刊, 2010, 20(1): 15 20. [11] RUAN Xiaolei, LI Huaping, ZHOU Guohui. Evaluation of PRSV resistance of T2 transgenic papaya with replicase gene[j]. Journal of South China Agricultural University, 2004(4): 12 15. [12] 姜 大 刚, 周 峰, 姚 涓, 等. 转 基 因 番 木 瓜 华 农 一 号 事 件 特 异 性 定 性 PCR 检 测 方 法 的 建 立 [J]. 华 南 农 业 大 学 学 报, 2009, 30(1): 37 41. [13] 赵 琳 娜, 胡 凤 月, 吴 孝 槐, 等. 用 于 转 基 因 检 测 的 番 木 瓜 基 因 组 DNA 提 取 方 法 的 比 较 [J]. 现 代 食 品 科 技, 2010, 26(2): 188 191. [14] 杨 冬 燕, 杨 永 存, 邓 平 建. 抗 环 斑 病 毒 转 基 因 番 木 瓜 55-1 的 PCR 检 测 [J]. 中 国 公 共 卫 生, 2007, 23(1): 91 92. [15] 杨 冬 燕, 杨 永 存, 邓 平 建. 转 基 因 番 木 瓜 55-1 的 多 重 PCR 鉴 定 方 法 研 究 [J]. 中 国 卫 生 检 验 杂 志, 2006, 16(10): 1156 1192. [16] 庄 逸 林, 相 大 鹏, 蔡 颖. 转 基 因 番 木 瓜 及 其 深 加 工 制 品 的 PCR 检 测 方 法 [J]. 食 品 研 究 与 开 发, 2007, 28(1): 126 129. [17] 康 林, 陈 枝 楠, 陈 东 美, 等. 截 获 的 木 瓜 中 转 基 因 成 分 的 检 测 [J]. 植 物 检 疫, 2007, 21(6): 349 351. [18] 张 志 红, 谈 凤 笑, 何 航 航, 等. 红 树 植 物 海 漆 ISSR 条 件 的 优 化 [J]. 中 山 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版, 2004, 43(2): 63 66. [19] 张 颖 聪, 周 常 清, 冯 瑞 祥, 等. 番 木 瓜 种 质 资 源 圃 转 基 因 成 分 快 速 检 测 体 系 的 建 立 与 应 用 [J]. 中 国 热 带 农 业, 2012(3): 64 66. [20] COHEN L W, COGHLAN V M, DIHEL L C. Cloning and sequencing of papain-encoding cdna[j]. Gene, 1986(48): 219 227. [21] 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 木 瓜 中 转 基 因 成 分 定 性 PCR 检 测 方 法 (SN/T 2653 2010) [S]. 中 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局, 2010. [22] 阮 小 蕾, 马 丽 娟, 李 华 平. 转 番 木 瓜 环 斑 病 毒 复 制 酶 基 因 番 木 瓜 的 多 重 定 性 检 测 [J]. 湖 南 农 业 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版, 2010, 36(6), 627 682. [23] 杨 永 存, 李 浩, 杨 冬 燕, 等. 2012 年 深 圳 市 市 售 转 基 因 番 木 瓜 检 测 [J]. 中 国 食 品 卫 生 杂 志, 2013, 25(5): 419 423.