前 言 本 标 准 代 替 GB/T 4789.5-2003 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 志 贺 氏 菌 检 验 本 标 准 与 GB/T 4789.5-2003 相 比, 主 要 变 化 如 下 : 修 改 了 标 准 名 称 ; 修 改 了 培 养 基 和 试 剂 ; 修 改 了 操

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB 4789.5 2012 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 志 贺 氏 菌 检 验 2012-05-17 发 布 2012-07-17 实 施 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布

前 言 本 标 准 代 替 GB/T 4789.5-2003 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 志 贺 氏 菌 检 验 本 标 准 与 GB/T 4789.5-2003 相 比, 主 要 变 化 如 下 : 修 改 了 标 准 名 称 ; 修 改 了 培 养 基 和 试 剂 ; 修 改 了 操 作 步 骤 中 增 菌 部 分 和 生 化 试 验 及 附 加 生 化 试 验 部 分 ; 修 改 了 表 2; 修 改 了 表 4 I

食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 志 贺 氏 菌 检 验 1 范 围 本 标 准 规 定 了 食 品 中 志 贺 氏 菌 (Shigella) 的 检 验 方 法 本 标 准 适 用 于 食 品 中 志 贺 氏 菌 的 检 验 2 设 备 和 材 料 除 微 生 物 实 验 室 常 规 灭 菌 及 培 养 设 备 外, 其 他 设 备 和 材 料 如 下 : a) 恒 温 培 养 箱 :36 ±1 ; b) 冰 箱 :2 ~5 ; c) 膜 过 滤 系 统 ; d) 厌 氧 培 养 装 置 :41.5 ±1 ; e) 电 子 天 平 : 感 量 0.1 g; f) 显 微 镜 :10 ~100 ; g) 均 质 器 ; h) 振 荡 器 ; i) 无 菌 吸 管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻 度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻 度 ) 或 微 量 移 液 器 及 吸 头 ; j) 无 菌 均 质 杯 或 无 菌 均 质 袋 : 容 量 500 ml; k) 无 菌 培 养 皿 : 直 径 90 mm; l) ph 计 或 ph 比 色 管 或 精 密 ph 试 纸 ; m) 全 自 动 微 生 物 生 化 鉴 定 系 统 3 培 养 基 和 试 剂 3.1 志 贺 氏 菌 增 菌 肉 汤 - 新 生 霉 素 : 见 附 录 A 中 A.1 3.2 麦 康 凯 (MAC) : 见 附 录 A 中 A.2 3.3 木 糖 赖 氨 酸 脱 氧 胆 酸 盐 (XLD) : 见 附 录 A 中 A.3 3.4 志 贺 氏 菌 显 色 培 养 基 3.5 三 糖 铁 (TSI) : 见 附 录 A 中 A.4 3.6 营 养 斜 面 : 见 附 录 A 中 A.5 3.7 半 固 体 : 见 附 录 A 中 A.6 3.8 葡 萄 糖 铵 培 养 基 : 见 附 录 A 中 A.7 3.9 尿 素 : 见 附 录 A 中 A.8 2

3.10 β- 半 乳 糖 苷 酶 培 养 基 : 见 附 录 A 中 A.9 GB 4789.5-2012 3.11 氨 基 酸 脱 羧 酶 试 验 培 养 基 : 见 附 录 A 中 A.10 3.12 糖 发 酵 管 : 见 附 录 A 中 A.11 3.13 西 蒙 氏 柠 檬 酸 盐 培 养 基 : 见 附 录 A 中 A.12 3.14 粘 液 酸 盐 培 养 基 : 见 附 录 A 中 A. 13 3.15 水 靛 基 质 试 剂 : 见 附 录 A 中 A.14 3.16 志 贺 氏 菌 属 诊 断 血 清 3.17 生 化 鉴 定 试 剂 盒 4 检 验 程 序 志 贺 氏 菌 检 验 程 序 见 图 1 3

检 样 25 g( 或 25 ml) 样 品 + 志 贺 氏 菌 增 菌 肉 汤 225 ml 41.5 ±1, 16 h~20 h 厌 氧 培 养 XLD MAC 或 志 贺 氏 菌 显 色 培 养 基 挑 取 可 疑 菌 落 36 ±1,20 h~48 h TSI, 半 固 体, 营 养 斜 面 血 清 学 分 型 生 化 鉴 定 志 贺 氏 菌 属 分 群 及 分 型 结 果 报 告 图 1 志 贺 氏 菌 检 验 程 序 5 操 作 步 骤 5.1 增 菌 以 无 菌 操 作 取 检 样 25 g(ml), 加 入 装 有 灭 菌 225 ml 志 贺 氏 菌 增 菌 肉 汤 的 均 质 杯, 用 旋 转 刀 片 式 均 质 器 以 8 000 r/min~10 000 r/min 均 质 ; 或 加 入 装 有 225 ml 志 贺 氏 菌 增 菌 肉 汤 的 均 质 袋 中, 用 拍 击 式 均 质 器 连 续 均 质 1 min~2 min, 液 体 样 品 振 荡 混 匀 即 可 于 41.5 ±1, 厌 氧 培 养 16 h~20 h 5.2 分 离 取 增 菌 后 的 志 贺 氏 增 菌 液 分 别 划 线 接 种 于 XLD 平 板 和 MAC 平 板 或 志 贺 氏 菌 显 色 培 养 基 平 板 上, 于 36 ±1 培 养 20 h~24 h, 观 察 各 个 平 板 上 生 长 的 菌 落 形 态 宋 内 氏 志 贺 氏 菌 的 单 个 菌 落 直 径 大 于 其 他 志 贺 氏 菌 若 出 现 的 菌 落 不 典 型 或 菌 落 较 小 不 易 观 察, 则 继 续 培 养 至 48 h 再 进 行 观 察 志 贺 氏 菌 在 不 同 选 择 性 平 板 上 的 菌 落 特 征 见 表 1 4

选 择 性 平 板 MAC XLD 志 贺 氏 菌 显 色 培 养 基 5.3 初 步 生 化 试 验 表 1 志 贺 氏 菌 在 不 同 选 择 性 平 板 上 的 菌 落 特 征 志 贺 氏 菌 的 菌 落 特 征 无 色 至 浅 粉 红 色, 半 透 明 光 滑 湿 润 圆 形 边 缘 整 齐 或 不 齐 粉 红 色 至 无 色, 半 透 明 光 滑 湿 润 圆 形 边 缘 整 齐 或 不 齐 按 照 显 色 培 养 基 的 说 明 进 行 判 定 GB 4789.5-2012 5.3.1 自 选 择 性 平 板 上 分 别 挑 取 2 个 以 上 典 型 或 可 疑 菌 落, 分 别 接 种 TSI 半 固 体 和 营 养 斜 面 各 一 管, 置 36 ±1 培 养 20 h~24 h, 分 别 观 察 结 果 5.3.2 凡 是 三 糖 铁 中 斜 面 产 碱 底 层 产 酸 ( 发 酵 葡 萄 糖, 不 发 酵 乳 糖, 蔗 糖 ) 不 产 气 ( 福 氏 志 贺 氏 菌 6 型 可 产 生 少 量 气 体 ) 不 产 硫 化 氢 半 固 体 管 中 无 动 力 的 菌 株, 挑 取 其 5.3.1 中 已 培 养 的 营 养 斜 面 上 生 长 的 菌 苔, 进 行 生 化 试 验 和 血 清 学 分 型 5.4 生 化 试 验 及 附 加 生 化 试 验 5.4.1 生 化 试 验 用 5.3.1 中 已 培 养 的 营 养 斜 面 上 生 长 的 菌 苔, 进 行 生 化 试 验, 即 β- 半 乳 糖 苷 酶 尿 素 赖 氨 酸 脱 羧 酶 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 以 及 水 杨 苷 和 七 叶 苷 的 分 解 试 验 除 宋 内 氏 志 贺 氏 菌 鲍 氏 志 贺 氏 菌 13 型 的 鸟 氨 酸 阳 性 ; 宋 内 氏 菌 和 痢 疾 志 贺 氏 菌 1 型, 鲍 氏 志 贺 氏 菌 13 型 的 β- 半 乳 糖 苷 酶 为 阳 性 以 外, 其 余 生 化 试 验 志 贺 氏 菌 属 的 培 养 物 均 为 阴 性 结 果 另 外 由 于 福 氏 志 贺 氏 菌 6 型 的 生 化 特 性 和 痢 疾 志 贺 氏 菌 或 鲍 氏 志 贺 氏 菌 相 似, 必 要 时 还 需 加 做 靛 基 质 甘 露 醇 棉 子 糖 甘 油 试 验, 也 可 做 革 兰 氏 染 色 检 查 和 氧 化 酶 试 验, 应 为 氧 化 酶 阴 性 的 革 兰 氏 阴 性 杆 菌 生 化 反 应 不 符 合 的 菌 株, 即 使 能 与 某 种 志 贺 氏 菌 分 型 血 清 发 生 凝 集, 仍 不 得 判 定 为 志 贺 氏 菌 属 志 贺 氏 菌 属 生 化 特 性 见 表 2 表 2 志 贺 氏 菌 属 四 个 群 的 生 化 特 征 生 化 反 应 A 群 : 痢 疾 志 贺 氏 菌 B 群 : 福 氏 志 贺 氏 菌 C 群 : 鲍 氏 志 贺 氏 菌 D 群 : 宋 内 氏 志 贺 氏 菌 ß- 半 乳 糖 苷 酶 - a - - a + 尿 素 - - - - 赖 氨 酸 脱 羧 酶 - - - - 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 - - - b + 水 杨 苷 - - - - 七 叶 苷 - - - - 靛 基 质 -/+ (+) -/+ - 甘 露 醇 - + c + + 棉 子 糖 - + - + 甘 油 (+) - (+) d 注 :+ 表 示 阳 性 ;- 表 示 阴 性 ;-/+ 表 示 多 数 阴 性 ;+/- 表 示 多 数 阳 性 ;(+) 表 示 迟 缓 阳 性 ;d 表 示 有 不 同 生 化 型 a 痢 疾 志 贺 1 型 和 鲍 氏 13 型 为 阳 性 b 鲍 氏 13 型 为 鸟 氨 酸 阳 性 c 福 氏 4 型 和 6 型 常 见 甘 露 醇 阴 性 变 种 5.4.2 附 加 生 化 实 验 由 于 某 些 不 活 泼 的 大 肠 埃 希 氏 菌 (anaerogenic E.coli) A-D(Alkalescens-D isparbiotypes 碱 性 - 异 型 ) 菌 的 部 分 生 化 特 征 与 志 贺 氏 菌 相 似, 并 能 与 某 种 志 贺 氏 菌 分 型 血 清 发 生 凝 集 ; 因 此 前 面 生 化 实 验 符 合 志 贺 氏 菌 属 生 化 特 性 的 培 养 物 还 需 另 加 葡 萄 糖 胺 西 蒙 氏 柠 檬 酸 盐 粘 液 酸 盐 试 验 (36 培 养 24 h~48 h) 志 贺 氏 菌 属 和 不 活 泼 大 肠 埃 希 氏 菌 A-D 菌 的 生 化 特 性 区 别 见 表 3 5

生 化 反 应 表 3 志 贺 氏 菌 属 和 不 活 泼 大 肠 埃 希 氏 菌 A-D 菌 的 生 化 特 性 区 别 A 群 : 痢 疾 志 贺 氏 菌 B 群 : 福 氏 志 贺 氏 菌 C 群 : 鲍 氏 志 贺 氏 菌 D 群 : 宋 内 氏 志 贺 氏 菌 大 肠 埃 希 氏 菌 GB 4789.5-2012 葡 萄 糖 铵 - - - - + + 西 蒙 氏 柠 檬 酸 盐 - - - - d d 粘 液 酸 盐 - - - d + d 注 1:+ 表 示 阳 性 ;- 表 示 阴 性 ;d 表 示 有 不 同 生 化 型 A-D 菌 注 2: 在 葡 萄 糖 铵 西 蒙 氏 柠 檬 酸 盐 粘 液 酸 盐 试 验 三 项 反 应 中 志 贺 氏 菌 一 般 为 阴 性, 而 不 活 泼 的 大 肠 埃 希 氏 菌 A-D( 碱 性 - 异 型 ) 菌 至 少 有 一 项 反 应 为 阳 性 5.4.3 如 选 择 生 化 鉴 定 试 剂 盒 或 全 自 动 微 生 物 生 化 鉴 定 系 统, 可 根 据 5.3.2 的 初 步 判 断 结 果, 用 5.3.1 中 已 培 养 的 营 养 斜 面 上 生 长 的 菌 苔, 使 用 生 化 鉴 定 试 剂 盒 或 全 自 动 微 生 物 生 化 鉴 定 系 统 进 行 鉴 定 5.5 血 清 学 鉴 定 5.5.1 抗 原 的 准 备 志 贺 氏 菌 属 没 有 动 力, 所 以 没 有 鞭 毛 抗 原 志 贺 氏 菌 属 主 要 有 菌 体 (O) 抗 原 菌 体 O 抗 原 又 可 分 为 型 和 群 的 特 异 性 抗 原 一 般 采 用 1.2%~1.5% 培 养 物 作 为 玻 片 凝 集 试 验 用 的 抗 原 注 1: 一 些 志 贺 氏 菌 如 果 因 为 K 抗 原 的 存 在 而 不 出 现 凝 集 反 应 时, 可 挑 取 菌 苔 于 1 ml 生 理 盐 水 做 成 浓 菌 液,100 煮 沸 15 min~60 min 去 除 K 抗 原 后 再 检 查 注 2:D 群 志 贺 氏 菌 既 可 能 是 光 滑 型 菌 株 也 可 能 是 粗 糙 型 菌 株, 与 其 他 志 贺 氏 菌 群 抗 原 不 存 在 交 叉 反 应 与 肠 杆 菌 科 不 同, 宋 内 氏 志 贺 氏 菌 粗 糙 型 菌 株 不 一 定 会 自 凝 宋 内 氏 志 贺 氏 菌 没 有 K 抗 原 5.5.2 凝 集 反 应 在 玻 片 上 划 出 2 个 约 1cm 2cm 的 区 域, 挑 取 一 环 待 测 菌, 各 放 1/2 环 于 玻 片 上 的 每 一 区 域 上 部, 在 其 中 一 个 区 域 下 部 加 1 滴 抗 血 清, 在 另 一 区 域 下 部 加 入 1 滴 生 理 盐 水, 作 为 对 照 再 用 无 菌 的 接 种 环 或 针 分 别 将 两 个 区 域 内 的 菌 落 研 成 乳 状 液 将 玻 片 倾 斜 摇 动 混 合 1 min, 并 对 着 黑 色 背 景 进 行 观 察, 如 果 抗 血 清 中 出 现 凝 结 成 块 的 颗 粒, 而 且 生 理 盐 水 中 没 有 发 生 自 凝 现 象, 那 么 凝 集 反 应 为 阳 性 如 果 生 理 盐 水 中 出 现 凝 集, 视 作 为 自 凝 这 时, 应 挑 取 同 一 培 养 基 上 的 其 他 菌 落 继 续 进 行 试 验 如 果 待 测 菌 的 生 化 特 征 符 合 志 贺 氏 菌 属 生 化 特 征, 而 其 血 清 学 试 验 为 阴 性 的 话, 则 按 5.5.1 注 1 进 行 试 验 5.5.3 血 清 学 分 型 ( 选 做 项 目 ) 先 用 四 种 志 贺 氏 菌 多 价 血 清 检 查, 如 果 呈 现 凝 集, 则 再 用 相 应 各 群 多 价 血 清 分 别 试 验 先 用 B 群 福 氏 志 贺 氏 菌 多 价 血 清 进 行 实 验, 如 呈 现 凝 集, 再 用 其 群 和 型 因 子 血 清 分 别 检 查 如 果 B 群 多 价 血 清 不 凝 集, 则 用 D 群 宋 内 氏 志 贺 氏 菌 血 清 进 行 实 验, 如 呈 现 凝 集, 则 用 其 Ⅰ 相 和 Ⅱ 相 血 清 检 查 ; 如 果 B D 群 多 价 血 清 都 不 凝 集, 则 用 A 群 痢 疾 志 贺 氏 菌 多 价 血 清 及 1~12 各 型 因 子 血 清 检 查, 如 果 上 述 三 种 多 价 血 清 都 不 凝 集, 可 用 C 群 鲍 氏 志 贺 氏 菌 多 价 检 查, 并 进 一 步 用 1~18 各 型 因 子 血 清 检 查 福 氏 志 贺 氏 菌 各 型 和 亚 型 的 型 抗 原 和 群 抗 原 鉴 别 见 表 4 表 4 福 氏 志 贺 氏 菌 各 型 和 亚 型 的 型 抗 原 和 群 抗 原 的 鉴 别 表 型 和 亚 型 型 抗 原 群 抗 原 在 群 因 子 血 清 中 的 凝 集 3,4 6 7,8 1a Ⅰ 4 + - - 1b Ⅰ (4),6 (+) + - 2a Ⅱ 3,4 + - - 2b Ⅱ 7,8 - - + 6

表 4( 续 ) 福 氏 志 贺 氏 菌 各 型 和 亚 型 的 型 抗 原 和 群 抗 原 的 鉴 别 表 在 群 因 子 血 清 中 的 凝 集 型 和 亚 型 型 抗 原 群 抗 原 3,4 6 7,8 3a Ⅲ (3,4),6,7,8 (+) + + 3b Ⅲ (3,4),6 (+) + - 4a Ⅳ 3,4 + - - 4b Ⅳ 6 - + - 4c Ⅳ 7,8 - - + 5a Ⅴ (3,4) (+) - - 5b Ⅴ 7,8 - - + 6 Ⅵ 4 + - - X - 7,8 - - + Y - 3,4 + - - 注 :+ 表 示 凝 集 ;- 表 示 不 凝 集 ;() 表 示 有 或 无 5.6 结 果 报 告 综 合 以 上 生 化 试 验 和 血 清 学 鉴 定 的 结 果, 报 告 25 g(ml) 样 品 中 检 出 或 未 检 出 志 贺 氏 菌 7

附 录 A 培 养 基 和 试 剂 A.1 志 贺 氏 菌 增 菌 肉 汤 - 新 生 霉 素 (Shigella broth) A.1.1 志 贺 氏 菌 增 菌 肉 汤 A.1.1.1 成 分 胰 20.0 g 葡 萄 糖 磷 酸 氢 二 钾 2.0 g 磷 酸 二 氢 钾 2.0 g 吐 温 80(Tween 80) 1.5 ml A.1.1.2 制 法 将 以 上 成 分 混 合 加 热 溶 解, 冷 却 至 25 左 右 校 正 ph 至 7.0±0.2, 分 装 适 当 的 容 器,121 灭 菌 15 min 取 出 后 冷 却 至 50 ~55, 加 入 除 菌 过 滤 的 新 生 霉 素 溶 液 (0.5 μg/ml), 分 装 225 ml 备 用 注 : 如 不 立 即 使 用, 在 2 ~8 条 件 下 可 储 存 一 个 月 A.1.2 新 生 霉 素 溶 液 A.1.2.1 成 分 新 生 霉 素 25.0 mg A.1.2.2 制 法 将 新 生 霉 素 溶 解 于 中, 用 0.22 µm 过 滤 膜 除 菌, 如 不 立 即 使 用, 在 2 ~8 条 件 下 可 储 存 一 个 月 A.1.3 临 用 时 每 225 ml 志 贺 氏 菌 增 菌 肉 汤 (A.1.1) 加 入 5 ml 新 生 霉 素 溶 液 (A.1.2), 混 匀 A.2 麦 康 凯 (MAC) A.2.1 成 分 20.0 g 乳 糖 3 号 胆 盐 1.5 g 中 性 红 0.03 g 结 晶 紫 0.001 g 1 A.2.2 制 法 将 以 上 成 分 混 合 加 热 溶 解, 冷 却 至 25 左 右 校 正 ph 至 7.2±0.2, 分 装,121 高 压 灭 菌 15 min 冷 却 至 45 ~50, 倾 注 平 板 注 : 如 不 立 即 使 用, 在 2 ~8 条 件 下 可 储 存 二 周 A.3 木 糖 赖 氨 酸 脱 氧 胆 盐 (XLD) A.3.1 成 分 8

酵 母 膏 3.0 g L- 赖 氨 酸 木 糖 3.75 g 乳 糖 7.5 g 蔗 糖 7.5 g 脱 氧 胆 酸 钠 硫 代 硫 酸 钠 6.8 g 柠 檬 酸 铁 铵 0.8 g 酚 红 0.08 g 1 A.3.2 制 法 除 酚 红 和 外, 将 其 他 成 分 加 入 400 ml 中, 煮 沸 溶 解, 校 正 ph 至 7.4±0.2 另 将 加 入 600 ml 中, 煮 沸 溶 解 将 上 述 两 溶 液 混 合 均 匀 后, 再 加 入 指 示 剂, 待 冷 至 50 ~55 倾 注 平 皿 注 : 本 培 养 基 不 需 要 高 压 灭 菌, 在 制 备 过 程 中 不 宜 过 分 加 热, 避 免 降 低 其 选 择 性, 贮 于 室 温 暗 处 本 培 养 基 宜 于 当 天 制 备, 第 二 天 使 用 使 用 前 必 须 去 除 平 板 表 面 上 的 水 珠, 在 37 ~55 温 度 下, 面 向 下 平 板 盖 亦 向 下 烘 干 另 外 如 配 制 好 的 培 养 基 不 立 即 使 用, 在 2 ~8 条 件 下 可 储 存 二 周 A.4 三 糖 铁 (TSI) A.4.1 成 分 20.0 g 牛 肉 浸 膏 乳 糖 蔗 糖 葡 萄 糖 硫 酸 亚 铁 铵 (NH4)2Fe(SO4)2 6H2O 0.2 g 硫 代 硫 酸 钠 0.2 g 酚 红 0.025 g 12.0 g A.4.2 制 法 除 酚 红 和 外, 将 其 他 成 分 加 于 400 ml 中, 搅 拌 均 匀, 静 置 约 10 min, 加 热 使 完 全 溶 化, 冷 却 至 25 左 右 校 正 ph 至 7.4±0.2 另 将 加 于 600 ml 中, 静 置 约 10 min, 加 热 使 完 全 溶 化 将 两 溶 液 混 合 均 匀, 加 入 5% 酚 红 水 溶 液 5 ml, 混 匀, 分 装 小 号 试 管, 每 管 约 3 ml 于 121 灭 菌 15 min, 制 成 高 层 斜 面 冷 却 后 呈 桔 红 色 如 不 立 即 使 用, 在 2 ~8 条 件 下 可 储 存 一 个 月 A.5 营 养 斜 面 A.5.1 成 分 牛 肉 膏 3.0 g 1 9

A.5.2 制 法 将 除 以 外 的 各 成 分 溶 解 于 内, 加 入 15% 氢 氧 化 钠 溶 液 约 2 ml, 冷 却 至 25 左 右 校 正 ph 至 7.0±0.2 加 入, 加 热 煮 沸, 使 溶 化 分 装 小 号 试 管, 每 管 约 3 ml 于 121 灭 菌 15 min, 制 成 斜 面 注 : 如 不 立 即 使 用, 在 2 ~8 条 件 下 可 储 存 二 周 A.6 半 固 体 A.6.1 成 分 牛 肉 膏 0.3 g 0.5 g 0.3g~0.7g 100.0 ml A.6.2 制 法 按 以 上 成 分 配 好, 加 热 溶 解, 并 校 正 ph 至 7.4±0.2, 分 装 小 试 管,121 灭 菌 15 min, 直 立 凝 固 备 用 A.7 葡 萄 糖 铵 培 养 基 A.7.1 成 分 硫 酸 镁 (MgSO4 7H2O) 0.2 g 磷 酸 二 氢 铵 磷 酸 氢 二 钾 葡 萄 糖 2.0 g 20.0 g 0.2% 溴 麝 香 草 酚 蓝 水 溶 液 40.0 ml A.7.2 制 法 先 将 盐 类 和 糖 溶 解 于 水 内, 校 正 ph 至 6.8±0.2, 再 加 加 热 溶 解, 然 后 加 入 指 示 剂 混 合 均 匀 后 分 装 试 管,121 高 压 灭 菌 15 min 制 成 斜 面 备 用 A.7.3 试 验 方 法 用 接 种 针 轻 轻 触 及 培 养 物 的 表 面, 在 盐 水 管 内 做 成 极 稀 的 悬 液, 肉 眼 观 察 不 到 混 浊, 以 每 一 接 种 环 内 含 菌 数 在 20~100 之 间 为 宜 将 接 种 环 灭 菌 后 挑 取 菌 液 接 种, 同 时 再 以 同 法 接 种 普 通 斜 面 一 支 作 为 对 照 于 36 ±1 培 养 24 h 阳 性 者 葡 萄 糖 铵 斜 面 上 有 正 常 大 小 的 菌 落 生 长 ; 阴 性 者 不 生 长, 但 在 对 照 培 养 基 上 生 长 良 好 如 在 葡 萄 糖 铵 斜 面 生 长 极 微 小 的 菌 落 可 视 为 阴 性 结 果 注 : 容 器 使 用 前 应 用 清 洁 液 浸 泡 再 用 清 水 冲 洗 干 净, 并 用 新 棉 花 做 成 棉 塞, 干 热 灭 菌 后 使 用 如 果 操 作 时 不 注 意, 有 杂 质 污 染 时, 易 造 成 假 阳 性 的 结 果 A.8 尿 素 A.8.1 成 分 葡 萄 糖 磷 酸 二 氢 钾 2.0 g 0.4% 酚 红 溶 液 3.0mL 10

20.0 g 20% 尿 素 溶 液 100.0mL 900.0 ml A.8.2 制 法 除 酚 红 和 尿 素 外 的 其 他 成 分 加 热 溶 解, 冷 却 至 25 左 右 校 正 ph 至 7.2±0.2, 加 入 酚 红 指 示 剂, 混 匀, 于 121 灭 菌 15 min 冷 至 约 55, 加 入 用 0.22 µm 过 滤 膜 除 菌 后 的 20% 尿 素 水 溶 液 100 ml, 混 匀, 以 无 菌 操 作 分 装 灭 菌 试 管, 每 管 约 3 ml~4 ml, 制 成 斜 面 后 放 冰 箱 备 用 A.8.3 试 验 方 法 挑 取 培 养 物 接 种, 在 36 ±1 培 养 24 h, 观 察 结 果 尿 素 酶 阳 性 者 由 于 产 碱 而 使 培 养 基 变 为 红 色 A.9 β- 半 乳 糖 苷 酶 培 养 基 A.9.1 液 体 法 (ONPG 法 ) A.9.1.1 成 分 邻 硝 基 苯 β-d- 半 乳 糖 苷 (ONPG) 60.0 mg 0.01 mol/l 磷 酸 钠 缓 冲 液 (ph7.5±0.2) 10.0 ml 1% 水 (ph7.5±0.2) 30.0 ml A.9.1.2 制 法 将 ONPG 溶 于 缓 冲 液 内, 加 入 水, 以 过 滤 法 除 菌, 分 装 于 10 mm 75 mm 试 管 内, 每 管 0.5 ml, 用 橡 皮 塞 塞 紧 A.9.1.3 试 验 方 法 自 斜 面 挑 取 培 养 物 一 满 环 接 种, 于 36 ±1 培 养 1 h~3 h 和 24 h 观 察 结 果 如 果 β-d- 半 乳 糖 苷 酶 产 生, 则 于 1 h~3 h 变 黄 色, 如 无 此 酶 则 24 h 不 变 色 A.9.2 平 板 法 (X-Gal 法 ) A.9.2.1 成 分 20.0 g 3.0 g 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 -β-d- 半 乳 糖 苷 (X-Gal) 200.0 mg 1 A.9.2.2 制 法 将 各 成 分 (A.9.2.1) 加 热 煮 沸 于 1 L 水 中, 冷 却 至 25 左 右 校 正 ph 至 7.2±0.2,115 高 压 灭 菌 10 min 倾 注 平 板 避 光 冷 藏 备 用 A.9.2.3 试 验 方 法 挑 取 斜 面 培 养 物 接 种 于 平 板, 划 线 和 点 种 均 可, 于 36 ±1 培 养 18 h~24 h 观 察 结 果 如 果 β-d- 半 乳 糖 苷 酶 产 生, 则 平 板 上 培 养 物 颜 色 变 蓝 色, 如 无 此 酶 则 培 养 物 为 无 色 或 不 透 明 色, 培 养 48 h~72 h 后 有 部 分 转 为 淡 粉 红 色 A.10 氨 基 酸 脱 羧 酶 试 验 培 养 基 A.10.1 成 分 酵 母 浸 膏 3.0 g 葡 萄 糖 1.6% 溴 甲 酚 紫 - 乙 醇 溶 液 1.0 ml L 型 或 DL 型 赖 氨 酸 和 鸟 氨 酸 0.5 g/100 ml 或 /100 ml 11

A.10.2 制 法 除 氨 基 酸 以 外 的 成 分 加 热 溶 解 后, 分 装 每 瓶 100 ml, 分 别 加 入 赖 氨 酸 和 鸟 氨 酸 L- 氨 基 酸 按 0.5% 加 入,DL- 氨 基 酸 按 1% 加 入, 再 校 正 ph 至 6.8±0.2 对 照 培 养 基 不 加 氨 基 酸 分 装 于 灭 菌 的 小 试 管 内, 每 管 0.5 ml, 上 面 滴 加 一 层 石 蜡 油,115 高 压 灭 菌 10 min A.10.3 试 验 方 法 从 斜 面 上 挑 取 培 养 物 接 种, 于 36 ±1 培 养 18 h~24 h, 观 察 结 果 氨 基 酸 脱 羧 酶 阳 性 者 由 于 产 碱, 培 养 基 应 呈 紫 色 阴 性 者 无 碱 性 产 物, 但 因 葡 萄 糖 产 酸 而 使 培 养 基 变 为 黄 色 阴 性 对 照 管 应 为 黄 色, 空 白 对 照 管 为 紫 色 A.11 糖 发 酵 管 A.11.1 成 分 牛 肉 膏 3.0 g 磷 酸 氢 二 钠 (NA2HPO4 12H2O) 2.0 g 0.2% 溴 麝 香 草 酚 蓝 溶 液 12.0 ml A.11.2 制 法 A.11.2.1 葡 萄 糖 发 酵 管 按 上 述 成 分 配 好 后, 按 0.5% 加 入 葡 萄 糖,25 左 右 校 正 ph 至 7.4±0.2, 分 装 于 有 一 个 倒 置 小 管 的 小 试 管 内,121 高 压 灭 菌 15 min A.11.2.2 其 他 各 种 糖 发 酵 管 可 按 上 述 成 分 配 好 后, 分 装 每 瓶 100 ml,121 高 压 灭 菌 15 min 另 将 各 种 糖 类 分 别 配 好 10% 溶 液, 同 时 高 压 灭 菌 将 5 ml 糖 溶 液 加 入 于 100 ml 培 养 基 内, 以 无 菌 操 作 分 装 小 试 管 注 : 蔗 糖 不 纯, 加 热 后 会 自 行 水 解 者, 应 采 用 过 滤 法 除 菌 A.11.3 试 验 方 法 从 斜 面 上 挑 取 小 量 培 养 物 接 种, 于 36 ±1 培 养, 一 般 观 察 2 d~3 d 迟 缓 反 应 需 观 察 14 d~30 d A.12 西 蒙 氏 柠 檬 酸 盐 培 养 基 A.12.1 成 分 硫 酸 镁 (MgSO4 7H2O) 0.2 g 磷 酸 二 氢 铵 磷 酸 氢 二 钾 柠 檬 酸 钠 20 g 0.2% 溴 麝 香 草 酚 蓝 溶 液 40.0 ml A.12.2 制 法 先 将 盐 类 溶 解 于 水 内, 调 至 ph 6.8±0.2, 加 入, 加 热 溶 化 然 后 加 入 指 示 剂, 混 合 均 匀 后 分 装 试 管,121 灭 菌 15 min 制 成 斜 面 备 用 A.12.3 试 验 方 法 挑 取 少 量 培 养 物 接 种, 于 36 ±1 培 养 4 d, 每 天 观 察 结 果 阳 性 者 斜 面 上 有 菌 落 生 长, 培 养 基 从 绿 色 转 为 蓝 色 A.13 粘 液 酸 盐 培 养 基 A.13.1 测 试 肉 汤 12

A.13.1.1 成 分 酪 溴 麝 香 草 酚 蓝 溶 液 0.024 g 粘 液 酸 A.13.1.2 制 法 慢 慢 加 入 5 N 氢 氧 化 钠 以 溶 解 粘 液 酸, 混 匀 其 余 成 分 加 热 溶 解, 加 入 上 述 粘 液 酸, 冷 却 至 25 左 右 校 正 ph 至 7.4±0.2, 分 装 试 管, 每 管 约 5 ml, 于 121 高 压 灭 菌 10 min A.13.2 质 控 肉 汤 A.13.2.1 成 分 酪 溴 麝 香 草 酚 蓝 溶 液 0.024 g A.13.2.2 制 法 所 有 成 分 加 热 溶 解, 冷 却 至 25 左 右 校 正 ph 至 7.4±0.2, 分 装 试 管, 每 管 约 5 ml, 于 121 高 压 灭 菌 10 min A 13.3 试 验 方 法 将 待 测 新 鲜 培 养 物 接 种 测 试 肉 汤 (A.13.1) 和 质 控 肉 汤 (A.13.2), 于 36 ±1 培 养 48 h 观 察 结 果, 肉 汤 颜 色 蓝 色 不 变 则 为 阴 性 结 果, 黄 色 或 稻 草 黄 色 为 阳 性 结 果 A.14 水 靛 基 质 试 剂 A.14.1 成 分 ( 或 胰 ) 20.0 g ph7.4 A.14.2 制 法 按 上 述 成 分 配 制, 分 装 小 试 管,121 高 压 灭 菌 15 min 注 : 此 试 剂 在 2 ~8 条 件 下 可 储 存 一 个 月 A.14.3 靛 基 质 试 剂 A.14.3.1 柯 凡 克 试 剂 : 将 5 g 对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 溶 解 于 75 ml 戊 醇 中 然 后 缓 慢 加 入 浓 盐 酸 25 ml A.14.3.2 欧 - 波 试 剂 : 将 1 g 对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 溶 解 于 95 ml 95% 乙 醇 内 然 后 缓 慢 加 入 浓 盐 酸 20 ml A.14.4 试 验 方 法 挑 取 少 量 培 养 物 接 种, 在 36 ±1 培 养 1 d~2 d, 必 要 时 可 培 养 4 d~5 d 加 入 柯 凡 克 试 剂 约 0.5 ml, 轻 摇 试 管, 阳 性 者 于 试 剂 层 呈 深 红 色 ; 或 加 入 欧 - 波 试 剂 约 0.5 ml, 沿 管 壁 流 下, 覆 盖 于 培 养 液 表 面, 阳 性 者 于 液 面 接 触 处 呈 玫 瑰 红 色 注 : 中 应 含 有 丰 富 的 色 氨 酸 每 批 买 来 后, 应 先 用 已 知 菌 种 鉴 定 后 方 可 使 用, 此 试 剂 在 2 ~8 条 件 下 可 储 存 一 个 月 13